Name: 단일 입자 극저온 전자 현미경 검사법을 위한 사용자 친화적이고 높은 처리량 및 완전 자동화된 데이터 수집 소프트웨어 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-29T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: 학습하세요 단일 입자 극저온 전자 현미경을 위한 Latitude-S 자동 데이터 수집 소프트웨어 사용법을. 생물학적 대분자의 구조 특성화를 위한 고효율 파이프라인을 구축하여 병원체 생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

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우리는 생명공학부, 과학기술부(DST) 및 과학기술부, 인도 인사개발부(MHRD) 및 IISc-방갈로르의 냉동 EM 시설에 대한 지원을 인정합니다. 우리는 DBT 빌더 프로그램 (BT / INF / 22 / SP22844/2017) 및 DST-FIST (SR / FST / LSII-039/2015) IISc, 방갈로르에있는 국립 Cryo-EM 시설에 대한 인정. 우리는 과학 공학 연구 위원회 (SERB)(보조금 No.SB / S2 / RJN-145/2015, SERB-EMR/2016/000608 및 SERB-IPA/2020/000094), DBT (그랜트 번호)의 재정 지원을 인정합니다. BT/PR25580/BRB/10/1619/2017). 극저온-EM 그리드를 준비하고, 냉동 EM 데이터 수집을 준비하고, 재료 테이블을 준비해 주신 이시카 프라마닉 씨께 감사드립니다. 또한, 스만 미쉬라 씨가 저온-EM 이미지 처리와 수치를 준비할 수 있도록 도와준 것에 대해 서도 감사드립니다. 우리는 이 연구를 위한 정제된 스파이크 단백질 견본을 얻기 위하여 저희를 돕는 라가반 바라다얀 교수에게 감사드립니다.

<ol><li>Li, Y., Cash, J. N., Tesmer, J. J. G., Cianfrocco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+cryo-EM+enabled+by+user-free+preprocessing+routines%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">High-throughput cryo-EM enabled by user-free preprocessing routines.</a> Structure. 28 (7), 858-869 (2020).</li>
<li>Carragher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leginon%3A+An+automated+system+for+acquisition+of+images+from+vitreous+ice+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens.</a> Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).</li>
<li>Stagg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+cryoEM+data+acquisition+and+analysis+of+284+742+particles+of+GroEL%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated cryoEM data acquisition and analysis of 284 742 particles of GroEL.</a> Journal of Structural Biology. 155 (3), 470-481 (2006).</li>
<li>Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+in+electron+microscopy-30+years%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Single-particle reconstruction of biological macromolecules in electron microscopy-30 years.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 42 (3), 139-158 (2009).</li>
<li>Biyani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focus%3A+The+interface+between+data+collection+and+data+processing+in+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM.</a> Journal of Structural Biology. 198 (2), 124-133 (2017).</li>
<li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+cryo-EM+at+atomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-particle cryo-EM at atomic resolution.</a> Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).</li>
<li>Kühlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+resolution+revolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The resolution revolution.</a> Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).</li>
<li>McMullan, G., Chen, S., Henderson, R., Faruqi, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detective+quantum+efficiency+of+electron+area+detectors+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Detective quantum efficiency of electron area detectors in electron microscopy.</a> Ultramicroscopy. 109 (9), 1126-1143 (2009).</li>
<li>Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MotionCor2%3A+Anisotropic+correction+of+beam-induced+motion+for+improved+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">MotionCor2: Anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).</li>
<li>Grant, T., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+optimal+exposure+for+single+particle+cryo-EM+using+a+2.6+%C3%85+reconstruction+of+rotavirus+VP6%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 Å reconstruction of rotavirus VP6.</a> eLife. 4, 06980(2015).</li>
<li>Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RELION%3A+Implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li>
<li>Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FREALIGN%3A+High-resolution+refinement+of+single+particle+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">FREALIGN: High-resolution refinement of single particle structures.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).</li>
<li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CryoSPARC%3A+Algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li>
<li>Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CisTEM%2C+user-friendly+software+for+single-particle+image+processing%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">CisTEM, user-friendly software for single-particle image processing.</a> eLife. 7, 35383(2018).</li>
<li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMAN2%3A+An+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li>
<li>Zhang, P., Beatty, A., Milne, J. L. S., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+data+collection+with+a+Tecnai+12+electron+microscope%3A+Applications+for+molecular+imaging+by+cryomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated data collection with a Tecnai 12 electron microscope: Applications for molecular imaging by cryomicroscopy.</a> Journal of Structural Biology. 135 (3), 251-261 (2001).</li>
<li>Lei, J., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+acquisition+of+cryo-electron+micrographs+for+single+particle+reconstruction+on+an+FEI+Tecnai+electron+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated acquisition of cryo-electron micrographs for single particle reconstruction on an FEI Tecnai electron microscope.</a> Journal of Structural Biology. 150 (1), 69-80 (2005).</li>
<li>Potter, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leginon%3A+A+system+for+fully+automated+acquisition+of+1000+electron+micrographs+a+day%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Leginon: A system for fully automated acquisition of 1000 electron micrographs a day.</a> Ultramicroscopy. 77 (3-4), 153-161 (1999).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li>
<li>Suloway, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+molecular+microscopy%3A+The+new+Leginon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated molecular microscopy: The new Leginon system.</a> Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).</li>
<li>Korinek, A., Beck, F., Baumeister, W., Nickell, S., Plitzko, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+controlled+cryo-electron+microscopy+-+TOM2+a+software+package+for+high-throughput+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Computer controlled cryo-electron microscopy - TOM2 a software package for high-throughput applications.</a> Journal of Structural Biology. 175 (3), 394-405 (2011).</li>
<li>Shi, J., Williams, D. R., Stewart, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Script-Assisted+Microscopy+%28SAM%29+package+to+improve+data+acquisition+rates+on+FEI+Tecnai+electron+microscopes+equipped+with+Gatan+CCD+cameras%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">A Script-Assisted Microscopy (SAM) package to improve data acquisition rates on FEI Tecnai electron microscopes equipped with Gatan CCD cameras.</a> Journal of Structural Biology. 164 (1), 166-169 (2008).</li>
<li>Marsh, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+software+platform+for+low-dose+electron+microscopy+and+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Modular software platform for low-dose electron microscopy and tomography.</a> Journal of Microscopy. 228, Pt 3 384-389 (2007).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JADAS%3A+A+customizable+automated+data+acquisition+system+and+its+application+to+ice-embedded+single+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">JADAS: A customizable automated data acquisition system and its application to ice-embedded single particles.</a> Journal of Structural Biology. 165 (1), 1-9 (2009).</li>
<li>Pramanick, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+flexibility+and+structural+variability+of+SARS-CoV2+S+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Conformational flexibility and structural variability of SARS-CoV2 S protein.</a> Structure. , (2021).</li>
<li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+neutralization+of+SARS-CoV-2+by+an+antibody+from+a+convalescent+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the neutralization of SARS-CoV-2 by an antibody from a convalescent patient.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 27 (10), 950-958 (2020).</li>
<li>Hillen, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+replicating+SARS-CoV-2+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of replicating SARS-CoV-2 polymerase.</a> Nature. 584 (7819), 154-156 (2020).</li>
<li>Wrapp, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+of+the+2019-nCoV+spike+in+the+prefusion+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation.</a> Science. 367 (6483), 1260-1263 (2020).</li>
<li>Thoms, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+translational+shutdown+and+immune+evasion+by+the+Nsp1+protein+of+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural basis for translational shutdown and immune evasion by the Nsp1 protein of SARS-CoV-2.</a> Science. 369 (6508), 1249-1255 (2020).</li>
<li>Kumar, A., Sengupta, N., Dutta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+approach+for+preparing+graphene+oxide+tem+grids+for+stained+and+vitrified+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomaterials%22%5BJournal%5D)">Simplified approach for preparing graphene oxide tem grids for stained and vitrified biomolecules.</a> Nanomaterials. 11 (3), 1-22 (2021).</li>
</ol>

저자는 선언할 경쟁또는 재정적 이해 상충이 없습니다.

Latitude-S는 직관적인 사용자 인터페이스로, 이틀 만에 수천 개의 고해상도 현미경 또는 영화 파일을 자동으로 설정하고 수집할 수 있는 환경을 제공합니다. 그리드 를 가로 질러 쉽게 탐색할 수 있으며 낮은 배율에서 높은 배율로 이동하는 동안 현미경 단계의 위치를 유지합니다. Latitude-S를 사용하여 데이터 수집의 각 단계는 시간 효율적이며 간단한 사용자 인터페이스, 최대 4.5GB/s 속도로 데이터의 빠른 스트리밍, 수집 하는 동안 데이터의 동시 표시와 같은 기능을 제공합니다. 또한, 미리 보정된 용량 분획, 용량 속도, 포커스 및 배율 매개 변수는 자동 데이터 수집의 새로운 세션을 시작하고 시간을 절약하기 위해 쉽게 재장전되었습니다.
지속적인 모니터링이 없고 데이터 세트의 품질을 손상시키지 않으면서 데이터를 자동으로 수집하는 것은 어렵고 시간이 많이 소요되는 작업입니다. 특히 이 전염병 동안 시간과 리소스가 주요 제약 조건이 될 때 Latitude-S 소프트웨어를 사...

단일 입자 저온 -EM은 생물학적 거대 분자1의 고해상도 구조 측정을위한 주류 구조 생물학 기술이되었다. 단일 입자 재구성은 생물학적 거대 분자2,3의 3차원 (3D) 구조를 재구성하는 데 사용되는 2차원 (2D) 입자 이미지를 추출하기 위해 유리화 된 샘플의 광대 한 수의 현미경 그래프를 획득하는 데 달려 있습니다. DED를 개발하기 전에 단일 입자 재구성에서 달성된 해상도는 4에서 30 Å4,5 사이로 다양했습니다. 최근에는 단일 입자 저온-EM의 달성 가능한 해상도가 1.8 Å6을 넘어왔습니다. DED 및 자동화된 데이터 수집 소프트웨어는 데이터 수집에 대한 인간의 개입이 최소화된 이 해상도 revolution7에 주요 기여를 했습니다. 일반적으로, 저온-EM 이미징은 저전자 용량 율(20-100 e/Å2)에서 수행되어 생물학적 샘플의 전자 빔 유도 방사선 손상을 최소화하며, 이는 이미지내 낮은 신호 대 잡음 비(SNR)에 기여한다. 이 낮은 SNR은 단일 입자 분석을 사용하여 생물학적 거대 분자의 고해상도 구조의 특성화를 방해합니다.
차세대 전자 검출기는 CMOS(상보금속-산화물-반도체) 기반 검출기로, 이러한 낮은 SNR 관련 장애물을 극복할 수 있습니다. 이러한 직접 감지 CMOS 카메라는 카메라가 생물학적 거대 분자에 대한 더 나은 포인트 확산 기능, 적합한 SNR 및 우수한 탐정 양자 효율(DQE)에 기여하기 때문에 신호를 빠르게 판독할 수 있습니다. 직접 감지 카메라는 기록된 이미지에서 높은 SNR8 및 낮은 노이즈를 제공하므로 검출기가 이미지에 추가되는 소음의 양을 측정하는 DQE(형사 양자 효율)의 정량적 증가가 발생합니다. 이 카메라는 초당 수백 프레임의 속도로 영화를 기록하여 빠른 데이터 수집9,10을 가능하게 합니다. 이러한 모든 특성은 빠른 직접 감지 카메라를 저용량 응용 분야에 적합하게 만듭니다.
동작 보정 스택 이미지는 RELION11, FREALIGN12, 극저온SPARC13, 시스템14 및 EMAN215와 같은 다양한 소프트웨어 패키지를 사용하여 2D 분류를 계산하고 거대 분자의 3D 밀도 맵을 재구성하는 데 데이터 처리에 사용됩니다. 그러나 단일 입자 해석의 경우 고해상도 구조를 달성하기 위해서는 엄청난 데이터 집합이 필요합니다. 따라서 자동 데이터 수집 통행료는 데이터 수집에 매우 필수적입니다. 대규모 cryo-EM 데이터 세트를 기록하기 위해 지난 10년 동안 여러 소프트웨어 패키지가 사용되었습니다. AutoEM16, AutoEMation17, 레기논18, 시리얼EM19, UCSF-Image420, TOM221, SAM22, JAMES23, JADAS24, EM-TOOLS 및 EPU와 같은 전용 소프트웨어 패키지가 자동화된 데이터 수집을 위해 개발되었습니다.
이 소프트웨어 패키지는 저배율 이미지를 고배율 이미지와 상호 연결하여 자동으로 구멍 위치를 찾기 위해 일상적인 작업을 사용하여 저용량 조건에서 이미지 수집을 위한 유리체 얼음 두께의 구멍을 식별하는 데 도움을 주습니다. 이러한 소프트웨어 패키지는 작업자의 중단 및 물리적 존재 없이 며칠 동안 엄청난 양의 양질의 데이터를 지속적으로 수집하여 반복적인 작업 수를 줄이고 cryo-EM 데이터 수집의 처리량을 증가시켰습니다. Latitude-S는 단일 입자 분석을 위해 자동 데이터 수집에 사용되는 유사한 소프트웨어 패키지입니다. 그러나 이 소프트웨어 패키지는 K2/K3 DED에만 적합하며 이러한 검출기와 함께 제공됩니다.
이 프로토콜은 200 keV 극저온-EM을 장착한 직접 전자 검출기로 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 자동화된 이미지 획득에서 위도-S의 잠재력을 보여줍니다( 재료표 참조). 이 데이터 수집 도구를 사용하여 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 3,000개의 영화 파일이 자동으로 획득되고, 추가 데이터 처리는 3.9-4.4 Å 해상도 스파이크 단백질 구조를 얻기 위해 수행됩니다.

<table><tbody><tr><td>블로팅 페이퍼</td><td>Ted Pella, INC.</td><td>47000-100</td><td>EM 검체 준비 항목</td></tr><tr><td>캡슐</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>9432 909 97591</td><td>EM 표본 준비 장치</td></tr><tr><td>카세트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1020863</td><td>EM 표본 준비 장치</td></tr><tr><td>C-Clip</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1036171</td><td>EM 표본 준비 항목</td></tr><tr><td>C-Clip 삽입 도구</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>9432 909 97571</td><td>EM 검체 준비 도구</td></tr><tr><td>C-Clip Ring</td><td>Thermo Fisher Scientific 1036173</td><td></td><td>EM 검체 준비 항목</td></tr><tr><td>EM 그리드(Quantifoil)</td><td>전자 현미경 과학</td><td>Q3100AR1.3</td><td>R 1.2/1.3 300 Mesh, Gold</td></tr><tr><td>Glow 방전 기계</td><td>Quorum</td><td>N/A</td><td>Quorum GlowQube 글로우 방전 기계</td></tr><tr><td>K2 DED</td><td>Gatan Inc.</td><td>N/A</td><td>Cryo-EM 데이터 수집 장치(카메라)</td></tr><tr><td>Latitude S Software</td><td>Gatan Inc.</td><td></td><td>이미징 소프트웨어</td></tr><tr><td>로딩 스테이션</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1130698</td><td>EM 표본 준비 장치</td></tr><tr><td>Talos 200 kV Arctica</td><td>Thermo Scientific&trade;</td><td>N/A</td><td>극저온 전자 현미경</td></tr><tr><td>Vitrobot Mark IV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td>EM 검체 준비 장치</td></tr></tbody></table>

단일 입자 극저온 전자 현미경 검사법을 위한 사용자 친화적이고 높은 처리량 및 완전 자동화된 데이터 수집 소프트웨어

User-friendly, High-throughput, and Fully Automated Data Acquisition Software for Single-particle Cryo-electron Microscopy

지난 몇 년 동안 단일 입자 극저온 전자 현미경 검사법 (cryo-EM)의 기술적 및 방법론적 발전은 생물학적 거대 분자의 고해상도 구조 측정을위한 새로운 길을 열었습니다. 저저온-EM의 놀라운 발전에도 불구하고 단일 입자 분석 워크플로우의 다양한 측면에서 여전히 개선범위가 남아 있습니다. 단일 입자 분석은 고처리량 자동 데이터 수집을 위한 적합한 소프트웨어 패키지를 요구합니다. 지난 8년 동안 단일 입자 저저온-EM용 자동 이미징을 위해 여러 개의 자동 데이터 수집 소프트웨어 패키지가 개발되었습니다. 이 논문은 저용량 조건하에서 생체 분자를 생체화하기 위한 완전 자동화된 이미지 수집 파이프라인의 적용을 제시합니다. 
cryo-EM 데이터를 완전하고 자동으로 정확하게 수집할 수 있는 소프트웨어 패키지를 보여 줍니다. 또한 이 소프트웨어 패키지에 의해 다양한 미세 한 매개 변수를 쉽게 제어 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 직접 전자 검출기 (DED)가 장착 된 200 keV 극저온 전자 현미경을 갖춘 중증 급성 호흡기 증후군 -코로나 바이러스 2 (SARS-CoV-2) 스파이크 단백질의 자동화 된 이미징에서이 소프트웨어 패키지의 잠재력을 보여줍니다. 약 3,000개의 극저온-EM 영화 이미지가 단일 세션(48h)의 데이터 수집에서 획득되어 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질의 원자 분해능 구조를 산출했습니다. 더욱이, 이러한 구조 연구는 스파이크 단백질이 두 가지 주요 적합성, 1-RBD(수용체 결합 도메인)를 열어 놓고 모든 RBD를 폐쇄된 적합성을 채택한다는 것을 나타낸다.

현재 전염병 상황에서, 극저온-EM은 SARS-CoV-226,27,28,29로부터 다양한 단백질의 구조를 특성화하는 데 중요한 역할을 하며, 이는 바이러스에 대한 백신 및 약물을 개발하는 데 도움이 될 수 있다. 2019년 코로나바이러스 질병에 대처하기 위해 제한된 인적 자원을 갖춘 신속한 연구 노력이 절실히 필요합니다. 단일 입자 저온-EM의 데이터 수집은 거대 분자의 구조 결정에 시간이 많이 걸리지만 중요한 단계입니다. Cryo-EM 자동 데이터 수집의 최근 개발은 데이터 수집에 제한된 인간의 간섭을 가능하게했다. Latitude-S 소프트웨어는 정제된 SARS-CoV2 스파이크 단백질의 자동화된 데이터 수집에 사용되는 중요한 자동 데이터 수집 소프트웨어 패키지입니다.
<p class="jo...

단일 입자 냉동 전자 현미경 검사법은 고처리량 자동 데이터 수집을 위한 적합한 소프트웨어 패키지 및 사용자 친화적인 파이프라인을 요구합니다. 여기서는 완전 자동화된 이미지 수집 소프트웨어 패키지인 Latitude-S의 적용과 저용량 조건에서 유리화된 생체 분자의 데이터 수집을 위한 실용적인 파이프라인을 소개합니다.

In the past several years, technological and methodological advancements in single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) have paved a new avenue for ...

자동화된 데이터 수집 소프트웨어는 생물학적 거대 분자의 구조적 특성화를 위해 엄청난 양의 극저온 데이터를 수집하는 데 매우 필요합니다. 자동화된 데이터 수집 소프트웨어 패키지는 병원균 생물학과 직접 연관되는 다양한 생물학적 거대 분자의 구조를 특성화하기 위해 여기에 사용되었습니다. 예를 들어, 진균, HIV 및 SASCO 2.시작 메뉴에서 DigitalMicrograph를 클릭하여 Latitude-S 자동 데이터 수집 소프트웨어를 시작하십시오. 그런 다음 기술 관리자를 선택한 다음 단일 파티클 자동 데이터 수집을 위한 위도-S 아이콘을 선택합니다. 이전 세션 설정을 기반으로 세션을 만들려면 팔레트의 이전 세션 확인란을 기반으로 선택한 다음 새 단추를 선택하거나 기존 세션을 계속하려면 계속 단추를 누릅니다.완전히 새 세션을 시작하려면 팔레트의 새 탭을 클릭합니다. 계속할 세션이 포함된 폴더를 선택하고 데이터를 저장하도록 폴더를 선택합니다. 그런 다음 설정 아이콘을 클릭하고 관리되는 상태 탐색 상자에서 상태를 추가하고 TEM 상태, 카메라 상태 및 이미지 또는 스톡 옵션을 설정합니다.그런 다음 상태 이름을 지정하거나 상태 설정 요약을 열어 저장 설정을 엽니다. 다음으로, 아틀라스 상태 팔레트를 클릭하여 아틀라스 상태를 구성하고 배율, 조명 조건 및 카메라 노출 시간에 대한 매개 변수를 설정하고 다음 상태로 이동하려면 다음 상태로 이동하려면 다음 상태를 클릭합니다. 그런 다음 그리드 상태 팔레트를 클릭하여 그리드 상태를 구성하고 현미경 이미징 광학, 조명 조건 및 카메라 노출 시간을 위한 매개 변수를 설정하고 다음을 클릭합니다.구멍 팔레트를 클릭하여 구멍 상태를 구성하고 이미징 광학, 조명 조건, 비닝 및 카메라 노출 시간 매개 변수를 설정합니다. 다음을 클릭한 후 포커스 팔레트를 클릭하여 다음 초점 상태를 구성하고 이미징 광학, 조명 조건, 비닝 및 카메라 노출 시간에 대한 현미경 설정을 설정합니다. 그런 다음 구멍 근처의 비정질 탄소 영역에 초점을 맞추고 다음 상태로 이동하려면 다음 상태를 클릭합니다.데이터 팔레트를 클릭하여 데이터 상태를 구성하고 현미경 설정에 대한 매개 변수를 설정한 다음 다음을 클릭합니다. 지정된 탭의 디포커스 값 범위와 단계 크기를 지정하는 포커스 구성 팔레트를 클릭하고 다음 단추를 눌러 다음 단계로 이동합니다. 그리드에 필요한 기능에 초점을 맞추고 캡처 버튼을 클릭합니다.그런 다음 다른 상태의 각 이미지에 동일한 피쳐에 빨간색 크로스 마크를 배치합니다. 뷰 필드가 아틀라스 및 그리드 상태보다 크기 때문에 포커스, 데이터 및 구멍 상태로 시작합니다. 다음으로, 아틀라스와 그리드 상태를 확대하여 동일한 피쳐에 적색 크로스 마크를 배치합니다.5개 상태 간의 위치 및 오프셋을 계산하고 출력 창에 위치와 오프셋을 반영하려면 계산 단추를 클릭합니다. 캡처 팔레트를 클릭하고 요구 사항에 따라 그리드의 전체 그리드 또는 일부를 커버하는 아틀라스의 크기를 선택합니다. 아틀라스를 캡처하려면 아틀라스를 탐색하고 얼음 두께에 따라 그리드 사각형을 선택합니다.원하는 그리드 사각형을 선택하면 일정 단추를 클릭하고 각 그리드 사각형이 캡처될 때 그리드 사각형 채우기의 타일을 관찰합니다. 일정 단추를 클릭하면 구멍의 위치를 추가하여 그리드 사각형의 대표 구멍을 선택합니다. 구멍 이미지를 획득하면 데이터 및 포커스 위치를 정의하고 레이아웃을 템플릿으로 저장합니다.자동 찾기를 클릭하고 구멍 크기를 입력하고 프로그램의 찾기 버튼을 클릭하여 직경에 따라 구멍을 자동으로 찾습니다. 그리드 사각형 및 얼음 오염에서 구멍을 제거하기 위해 강도를 설정합니다. 자동 찾기를 통해 선택한 노란색 표시 도구를 추가한 후 위도 작업의 일정 단추를 클릭합니다.cisTEM 소프트웨어를 사용하여 모션 보정 된 현미경 그래프의 초기 수동 스크리닝에 따라 대부분의 데이터가 원하는 신호 범위 내에 있는 것으로 나타났습니다. 또한 디포커스 범위에서 수집된 이미지도 cisTEM에서 수동으로 검사했습니다. 스파이크 입자는 구조 시각화를 위한 2D 클래스 평균을 계산하기 위해 수동으로 선택되었지만 각각의 데이터 세트를 사용하여 고해상도 구조 특성화가 가능했습니다.3D 분류는 스파이크 단백질이 공개 확인및 아래로 가까운 확인에 있는 1RBD가 있다는 것을 표시했습니다. 스파이크 단백질의 1RBD 오픈 확인은 C1 대칭을 사용하여 재구성되었습니다. 스파이크 단백질 맵은 측면 상단 및 하단 뷰에 표시됩니다.EM 맵에는 측면 체인의 더 나은 시각화를 위한 원자 구조가 장착되어 있습니다. RBD 다운 클로즈마크는 C3 대칭과 스파이크 3D 정제 모델 및 EM 맵으로 정제되었으며, 표시된 대로 원자 구조가 장착되어 있습니다. S2 서브 도메인으로 확인된 스파이크 단백질의 중간 확인은 개별 아미노산 잔류물의 측면 사슬을 나타냈다.결과는 위도-S가 생물학 거대 분자의 고해상도 극저온 EM 데이터를 수집할 수 있다는 것을 건의했습니다. 이 자동화된 데이터 수집 소프트웨어는 다른 전자 현미경 시스템에 사용하여 데이터를 자동으로 수집할 수 있습니다.

user-friendly-high-throughput-fully-automated-data-acquisition

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 논문은 소프트웨어 스위트 인 SPHIRE를 사용하여 저온 EM 이미지를 처리하기위한 프로토콜을 제시합니다. 현재의 프로토콜은 원 자면 해상도를 목표로하는 거의 모든 단일 파티클 EM 프로젝트에 적용될 수 있습니다.

SPHIRE를 사용한 전자 저온 현미경 이미지의 고해상도 단일 입자 분석

극저온 전자 현미경 검사법의 단일 입자 분석은 고해상도에서 생물학적 앙상블의 구조를 결정하는 데 사용되는 주요 기술 중 하나입니다. Scipion은 현미경에 의해 획득된 정보를 처리하고 생물학적 표본의 3D 재구성을 달성하기 위해 전체 파이프라인을 만드는 도구를 제공합니다.

Scipion을 가진 극저온 EM 및 단일 입자 분석

극저온 전자 단층 촬영에서 대규모 데이터 수집에 대한 수요가 증가함에 따라 처리량이 높은 이미지 수집 루틴이 필요합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 지형 데이터 수집의 시간 효율성과 처리량을 최대화하기 위한 고급 인수 전략의 최근 개발을 구현하는 프로토콜입니다.

극저온 전자 단층 촬영 데이터 수집 최적화를 위한 전략

극저온을 이용한 거대 분자 복합체의 구조 결정은 단백질과 복합체의 특정 클래스에 대한 일상이되었습니다. 여기서이 파이프 라인은 요약 (샘플 준비, 스크리닝, 데이터 수집 및 처리) 독자는 더 어려운 표본의 경우 변경 될 수있는 추가 상세한 자원과 변수를 향해 지시된다.

단일 입자 저온 전자 현미경 검사법: 샘플에서 구조로

이 문서에서는 3개의 cryo-EM 처리 플랫폼(예: cryoSPARC v3, RELION-3 및 Scipion 3)을 효과적으로 활용하여 고해상도 구조 결정을 위한 다양한 단일 입자 데이터 세트에 적용할 수 있는 단일하고 강력한 워크플로우를 만드는 방법을 설명합니다.

cryoSPARC, RELION 및 Scipion을 사용한 견고한 단일 입자 Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) 처리 워크플로우

거대분자의 고분해능 cryo-EM 맵은 또한 200kV TEM 현미경을 사용하여 달성할 수 있다. 이 프로토콜은 200kV TEM을 사용하여 고해상도 데이터 세트를 성공적으로 수집하는 데 필수적인 정확한 광학 정렬, 데이터 수집 체계 및 이미징 영역 선택을 설정하는 모범 사례를 보여줍니다.

200KV 투과 전자 현미경을 사용한 고해상도 cryo-EM 데이터 세트의 일상적인 수집

본 프로토콜은 Tomo5를 사용한 고분해능 초저온 전자 단층 촬영 원격 데이터 수집과 emClarity를 사용한 후속 데이터 처리 및 서브 단층 촬영 평균화를 설명합니다. 아포페리틴은 2.86 Å 분해능에서 cryo-ET 구조를 달성하기 위한 자세한 단계별 프로세스를 설명하기 위한 예로 사용됩니다.

초저온 전자 단층 촬영 원격 데이터 수집 및 서브 단층 촬영 평균화

본 프로토콜은 Cryo-EM 실험에서 기울어진 단일 입자 데이터 수집을 위한 일반화되고 구현하기 쉬운 체계를 설명합니다. 이러한 절차는 공기-물 계면의 부착으로 인해 우선적인 방향 편향을 겪는 샘플에 대한 고품질 EM 맵을 얻는 데 특히 유용합니다.

Leginon을 사용한 스테이지 틸트를 이용한 단일 입자 Cryo-EM 데이터 수집

프로토콜은 cryo - 전자 tomography와 3 차원 영상 처리를 사용하여 막 단백질의 구조를 결정하기 위해 높은 처리량 접근 방식을 설명합니다. 이것은 시편 준비의 세부 사항, 데이터 수집, 데이터 처리 및 해석을 포함하고, 접근, HIV - 1 봉투 당단백질에 대한 대표적인 대상의 생산 마칩니다. 이러한 계산 절차는 원격 작업 및 데이터 처리 및 구조 분석에 기여하는 연구자와 학생을 수있는 방식으로 설계되었습니다.

Cryo - 전자 Tomography 및 자동 하위 tomogram 평균을 사용하여 HIV의 봉투 Glycoproteins의 분자 구조 결정

이 문서는 cryo - 전자 현미경을 사용하여 나선형으로 조립 분자의 3 차원 (3D) 구조를 구하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 반복 나선형 실제 공간 재건 방법에 의해 밀도지도를 달성하기위한 세부적인 3D 재건 절차를 설명하기 위해 HIV - 1 capsid 어셈블리를 사용합니다.

Cryo - 전자 현미경에 의해 HIV - 1 Capsid 어셈블리의 구조와 반복 나선형 실제 공간 재건

학습하세요 단일 입자 극저온 전자 현미경을 위한 Latitude-S 자동 데이터 수집 소프트웨어 사용법을. 생물학적 대분자의 구조 특성화를 위한 고효율 파이프라인을 구축하여 병원체 생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

단일 입자 극저온 전자 현미경 검사법을 위한 사용자 친화적이고 높은 처리량 및 완전 자동화된 데이터 수집 소프트웨어

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