허혈성 심장에서 유전자 치료의 효능을 평가하기 위한 거대 동물 모델
2021년 9월 2일
허혈성 심장 질환에 대한 심근 유전자 치료는 미래 치료법에 대한 큰 가능성을 가지고 있습니다. 여기에서는 허혈성 심장에서 유전자 치료의 효능을 평가하기 위한 거대 동물 모델을 소개합니다.
이 프로토콜에 사용된 방법 및 이미징 양식은 임상 시험을 진행하기 전에 허혈성 심장에서 유전자 치료의 안전성과 효능에 대한 우수한 이미지를 구성합니다. 이 기술의 주요 장점은 허혈 모델의 낮은 침습성뿐만 아니라 저운동성이지만 여전히 실행 가능한 심장 영역에 대한 유전자 요법의 정확한 표적화입니다. 허혈 수술, 유전자 전달 및 안락사 전에 경흉부 심초음파를 수행하여 검출 가능한 심낭액을 평가하고 심근 변형을 결정하는 것으로 시작합니다.
승모판 수준, 유두 근육 및 정점 수준에서 흉골주위 단축 보기에 접근하기 위해 돼지의 흉골을 가리키는 마커가 있는 돼지 겨드랑이 아래의 세 번째 또는 네 번째 늑간 공간에 변환기를 배치합니다. 그런 다음 acquire를 눌러 클립을 저장합니다. 허혈 수술 직전에 관상동맥 조영술을 수행하기 위해 요오드 조영제와 함께 형광 투시 유도 하에 6-F 카테터를 사용하여 우측 관상동맥, 좌측 상행 관상동맥 및 좌측 전하행 동맥을 영상화합니다.
자가주사기의 시네 이미징의 경우 볼루스 지속 시간을 3초로 설정하고 총 부피를 21밀리리터로 설정한 다음 단일 및 예를 눌러 5F 피그테일 카테터를 통해 요오드 조영제를 좌심실에 투여합니다. 휴식 중인 동물의 시네 이미징을 수행한 다음 도부타민을 정맥 주사하고 스트레스 유도를 위해 용량을 증량합니다. 분당 160회라는 목표 심박수에 도달하면 시네 이미징을 수행하고 피그테일 카테터를 제거합니다.
박출률을 계산하려면 측정 소프트웨어를 열고 해당 이미지의 심실 분석을 선택합니다. 이미지를 스크롤하여 이완기와 수축기의 기간을 선택한 다음 각 기간의 심실 윤곽을 그리는 도구를 선택합니다. 만성 심근 허혈을 유도하기 위해, 유전자 전달 14일 전에 좌측 관상동맥에 코일을 배치하고, 병목성 스텐트를 좌관상동맥으로 미끄러지듯 이동시키고, 스텐트를 제1 대각선까지 말단부로 배치한다.
병목 현상을 제자리에 고정하기 위해 스텐트 대 루멘 비율이 1.3인 인디플레이터를 사용하여 동맥의 공칭 압력으로 스텐트를 팽창시킵니다. 추가로 15초 후 스텐트를 수축시키고 동맥에서 장비를 집어넣은 다음 혈관 조영술을 통해 병목 스텐트를 올바르게 배치합니다. 형광투시 유도하에 혈관조영술 및 기능 측정 후 전기 해부학적 매핑을 위해 대퇴골초를 통해 좌심실에 매핑 카테터를 삽입하고 좌심실에서 최소 100점을 수집하고 수락을 클릭하여 점을 승인합니다.
최종 맵에서는 생존 가능성을 위해 5밀리볼트 이상의 단극 전압을 기준으로 사용합니다. 그리고 저산소증의 경우 가능한 한 낮게, 최소 12%에서 바람직하게는 6% 미만으로 국소 선형 단축을 선택하십시오동물을 안락사시킨 후 흉강에서 심장을 채취합니다. 적출된 심장을 헹구고 대동맥 판막 위에 18게이지 바늘을 놓고 바늘을 관류 펌프에 부착합니다.
750 밀리리터의 1 % 파라 포름 알데히드로 심장을 관류하십시오. 날카로운 칼을 사용하여 심장을 1cm 두께의 조각으로 자르고 유전자 전달 영역에서 샘플을 4% 파라포름알데히드와 액체 질소로 수집합니다. 염색을 위해 샘플을 섭씨 4도에서 48시간 동안 4% 파라포름알데히드에 보관합니다.
유전자 치료의 효능은 15O-water PET 스캔으로 원주 변형률, 박출률 및 심근 관류를 측정하여 분석하였다. 조직 샘플은 심장을 전기 해부학적 지도와 비교하여 유전자 전달 영역에서 직접 수집할 수 있습니다. Beta-galactosidase 염색 후 양성 세포 수를 분석하고, 혈소판/내피세포 부착 분자-1 염색 후 심근 모세혈관 면적을 분석하여 면역조직학적 분석을 통해 이식유전자 발현 및 치료적 혈관신생을 평가하였다.
혈관 조영술을 통해 병목 스텐트를 배치하고 유전자 전달 영역에서 샘플을 채취하는 것이 중요하며, 이는 심장을 전기 해부학적 지도와 비교하여 확인할 수 있습니다. 전반적으로 모든 측정을 가장 재현 가능한 방식으로 수행하는 것이 중요합니다.
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개요
이 논문은 허혈성 심질환의 심근 유전자 치료 효능을 평가하기 위한 대동물 모델에 대해 논의합니다. 여기에 설명된 방법들은 임상 시험 전 유전자 치료의 안전성과 유효성에 대한 통찰을 제공합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 심혈관 연구
- 유전자 치료
- 허혈성 심장 질환
배경
- 심근 유전자 치료는 허혈성 심장 질환 치료에 있어 가능성을 보여줍니다.
- 전임상 평가를 위해서는 대동물 모델이 필수적입니다.
- 인체 임상 시험 전 유전자 치료의 효능을 이해하는 것이 매우 중요합니다.
- 낮은 침습성과 정밀한 표적화는 제안된 방법들의 주요 장점입니다.
연구 목적
- 허혈성 심장 질환에서 유전자 치료의 안전성과 효능을 평가하기 위함입니다.
- 향후 연구를 위해 신뢰할 수 있는 대동물 모델을 구축하기 위함입니다.
- 심근 변형 및 심낭액 검출을 평가하기 위함입니다.
사용된 방법
- 심근 변형률을 평가하기 위한 경흉부 심초음파 검사.
- 투시 조영 가이드 하에 6-F 카테터를 이용한 관상동맥 조영술.
- 관상동맥 영상화를 위한 요오드 조영제 사용.
- 유전자 치료 표적 설정을 위한 심장의 저운동성이나 생존 가능한 영역의 평가.
주요 결과
- 허혈 모델의 낮은 침습성을 입증함.
- 유전자 치료의 안전성과 효능에 대한 명확한 이미지를 제공함.
- 유전자 치료를 위한 효과적인 표적 전략을 규명함.
- 향후 임상 시험을 위한 프레임워크를 구축함.
결론
- 심근 유전자 치료는 허혈성 심장 질환 치료에 상당한 잠재력을 가지고 있습니다.
- 개발된 모델은 전임상 평가에 적합합니다.
- 임상 환경에서 해당 결과를 확인하기 위한 추가 연구가 필요합니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
이 대동물 모델은 임상적으로 유의미한 종말점을 재현하고 치료적 혈관 신생의 정밀한 표적화를 가능하게 함으로써, 허혈성 심질환에 대한 유전자 치료의 전임상 평가를 지원합니다. 이 접근 방식은 표준화된 영상 및 기능 평가를 통해 동물 연구 결과와 인체 임상 시험 기대치를 일치시켜 중개 연구의 위험을 줄여줍니다. 또한, IND 신청 가능 연구(IND-enabling studies) 이전에 유전자 치료 후보 물질의 위험성을 낮출 수 있는 재현 가능한 프레임워크를 제공합니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 질병 관련 돼지 허혈성 심장 모델에서 치료적 혈관 신생 가설의 검증을 가능하게 합니다.
- 운영적 가치: 전기해부학적 매핑을 사용하여 저운동성이나 생존 가능한 심근 영역에 유전자 전달을 정밀하게 타겟팅함으로써 타겟 확인 능력을 향상시킵니다.
- 예측적 가치: 임상 반응을 예측하는 정량적 종점인 원주 방향 변형률, 박출률 및 15O-water PET 관류를 통해 효능을 평가합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 분석 준비도: 초음파 영상, 관상동맥 조영술 및 PET 스캔을 위한 표준화된 프로토콜을 수립하여 연구 코호트 전반에서 재현 가능한 기능적 판독값을 확보합니다.
- 정량적 출력: 분석 표준화 및 실험실 간 비교 가능성을 뒷받침하는 측정 가능한 변형률(strain), 박출률 및 관류 데이터를 생성합니다.
- 확장성: 반복적인 영상 세션(기초선, 허혈 후, 유전자 전달 후)을 지원하여 단일 동물 모델 내에서 종단적 평가를 가능하게 합니다.
중개 및 전임상 연구
- 질환 관련성: 좌관상동맥의 스텐트 유발 허혈을 통해 만성 관상동맥 질환을 모사하여 인간의 병태생리와 일치시킵니다.
- 중개 연속성: 임상적으로 인정되는 영상 기법(심초음파, 혈관 조영술, PET)을 사용하여 전임상 결과와 임상 시험 설계 간의 가교 역할을 합니다.
- 위험 조정된 진행: 다중 모드 영상 및 조직학적 검증을 통해 도출된 사전 정의된 효능 및 안전성 임계값을 바탕으로 진행 또는 중단(go/no-go) 결정을 가능하게 합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
이 모델은 타겟 발굴 이후 및 리드 최적화 이전 단계에서 기능적 검증을 제공함으로써, 특히 in vivo 기전 증명이 필요한 유전자 치료제 후보물질에 대해 발굴부터 전임상까지의 연속적인 과정에 적합합니다.
- 발견 생물학(Discovery Biology): 표적 전달 및 심근 회복의 종단적 모니터링을 가능하게 하여 혈관 신생 인자의 가설 검증을 지원합니다.
- 스크리닝(Screening): 다양한 유전자 치료 구조물의 비교 평가가 가능한 표준화된 정량적 영상 출력물(strain, EF, 관류)을 제공합니다.
- 분석(Analytics): 통합적인 효능 평가를 위해 기능적 영상, 조직학적 모세혈관 밀도 및 외래 유전자 발현이라는 다중 모드 데이터 스트림을 제공합니다.
- 중개 연구(Translational Research): 전임상 엔드포인트를 임상 시험 측정 항목과 일치시켜, 치료적 혈관 신생 접근법에 대한 예측 신뢰도를 높입니다.
- 기업적 재사용(Enterprise Reuse): 허혈성 심장 질환에서 여러 유전자 치료 표적을 평가할 수 있는 재사용 가능한 플랫폼을 구축하여 모델 개발의 중복성을 줄입니다.
운영 및 기업적 영향
- 과학적 가치: 전기해부학적 지도를 통한 유전자 전달 위치와 생존해 있으나 운동 저하 상태인 심근의 기능적 개선 및 모세혈관 성장을 연계함으로써 기전적 모호성을 줄입니다.
- 운영적 가치: 표준화된 영상 프로토콜, 스텐트 배치 확인 및 지도화된 유전자 전달 구역에서의 맹검 조직 샘플링을 통해 재현성을 보장합니다.
- 전략적 가치: 다음 단계 진행 전 기능적 회복, 관류 증가, 조직학적 혈관 신생 사이의 일치성을 요구함으로써 go/no-go 의사결정을 개선합니다.
- 포트폴리오 영향: 임상 예측력이 높은 대동물 모델에서의 전임상 효능을 바탕으로 유전자 치료 프로그램의 위험 조정 우선순위 결정을 가능하게 합니다.
실행 시 고려 사항
- 정밀한 스텐트 및 카테터 배치를 위해 대동물 수술, 중재 심장학 및 전기해부학적 매핑에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 초음파, 투시 조영 장치 및 15O-water 관류 영상 촬영이 가능한 PET/CT 스캐너를 포함한 영상 인프라의 활용 가능 여부에 따라 달라집니다.
- 데이터 재현성을 보장하기 위해 허혈 유도, 유전자 전달 및 다중 모드 엔드포인트 수집에 대한 표준 작동 절차가 필요합니다.
- 해당 모델을 다른 허혈 모델이나 유전자 전달 벡터(예: 바이러스성 vs 비바이러스성)로 확장할 때 적응 고려 사항이 수반됩니다.
- 전문 인력과 장비가 필요하므로 설치 및 운용에 제한이 있으며, 이는 설치류 모델과 비교하여 연구의 복잡성과 비용을 증가시킬 수 있습니다.
바이오 제약 FAQ
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:45
Transthoracic Echocardiography
1:22
Coronary Angiography and Left Ventricle Cine Imaging Under Rest and Dobutamine Stress
2:39
Ischemia Operation
3:22
Gene Transfer
4:00
Sample Collection
4:41
Results: Assessment of Gene Therapy Efficacy
5:26
Conclusion
