Name: 결핵에 대한 숙주 유도 요법의 전임상 테스트에 사용하기 위한 자동화된 배양 시스템 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: 배우세요 자동화된 액체 배양 시스템을 사용하여 대식세포 내 Mycobacterium tuberculosis 성장을 정량화하는 방법을. 이 기술은 FDA 승인 약물을 빠르게 선별하여 결핵 치료를 위한 숙주 유도 요법으로 재활용하는 연구를 지원합니다.

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이 연구는 Science Foundation Ireland (SFI 08 / RFP / BMT1689), 아일랜드의 Health Research Board [HRA-POR / 2012 / 4 및 HRA-POR-2015-1145] 및 Royal City of Dublin Hospital Trust가 자금을 지원했습니다.

이 프로토콜에 설명된 실험은 봉쇄 레벨 37 실험실에서 처리할 수 있는 Mtb의 약독화된 H2Ra 균주를 사용하여 수행되었습니다. 살아있는 마이코 박테리아의 모든 조작은 클래스 II 생물학적 안전 캐비닛 (BSC)에서 수행되었습니다. 실험 절차는 에어로졸 생성을 최소화하도록 설계되었습니다. 진핵 세포 배양 (THP-1 세포)은 또한 클래스 II BSC에서 수행되었다. 실험실은 위험 평가를 수행하고 모든 절차가 기관 및 국가 생물 안전 규정에 따라 수행되었는지 확인했습니다. 인간 단핵구 THP-1 세포주를 사용하여 기재된 바와 같은 방법을 수행하였다(단계 1). 세포는 마이코박테리아에 감염되기 전에 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA)로 자극한 후 대식세포로 분화됩니다.
1. 세포 배양
<ol><li>알부민-덱스트로스-카탈라아제(ADC) 농축(10%) 및 0.05% 폴리소르베이트 80이 보충된 미들브룩 7H9(MB) 브로쓰에서 H37Ra 종자 스톡을 로그 단계로 전파합니다. H37Ra 재고를 1mL 분취량에 담아 -80°C 냉동고에 최대 1년 동안 보관하십시오.</li>
	<li>Mtb-H37Ra 1mL 바이알을 해동하고 계획된 실험 약 25주 전에 MB 보충 국물 9mL가 들어 있는 필터 캡이 있는 T1 플라스크로 옮깁니다. 정적 인큐베이터에서 5-7일 동안 37°C에서 배양합니다.</li>
	<li>5% CO2/37°C의CO2 가습 인큐베이터의 T75 플라스크에서 비열 사멸 10% 태아 송아지 혈청(완전한 (c)RPMI)이 보충된 RPMI-1640에서 THP-1 세포를 성장시키고 1 x 106 cells/mL 미만의 밀도를 유지하기 위해 일주일에 두 번 계대 배양합니다.</li>
	<li>감염 3일 전에 T75 플라스크에 혈청학적 피펫을 사용하여 세포를 여러 번 부드럽게 피펫팅하여 THP-1 세포를 대식세포로 분화시켜 덩어리를 분산시키고 50mL 원뿔형 튜브에 넣습니다.</li>
	<li>실온에서 10분 동안 300 x g 에서 세포를 원심분리하고, 상청액을 디캔트하고, 펠릿을 2mL의 RPMI에 부드럽게 재현탁시킵니다. 세포 수를 수행하여 세포/mL를 추정합니다.</li>
	<li>100 ng/mL PMA를 사용하여 cRPMI에서 100,000 세포/mL의 밀도로 12웰 조직 배양 플레이트에 THP-1 대식세포 2mL를 72시간 동안 시드합니다. 세포에서 PMA 함유 배지를 제거하고 Mtb 감염 전에 새로운 cRPMI로 보충합니다.</li>
	<li>필요한 각 시점에 대해 개별 플레이트를 설정합니다.</li>
	<li>2웰 유리 챔버 슬라이드에서 동일한 밀도(100,000개 세포/mL)의 종자 세포를 사용하여 감염의 다양성(MOI)을 결정합니다.</li>
	<li>5%CO2 가습 인큐베이터에 37°C에서 3일 동안 두었다.</li>
</ol>2. Mtb 흡수의 정량화
<ol><li>대식세포(MOI)에 의한 Mtb 흡수 측정
	<ol><li>감염 당일에 클래스 II 생물 안전 캐비닛 (BSC)을 설치하고 두 겹의 티슈 페이퍼에서 작업하여 유출을 포착하십시오. 현지 규정에 따라 폐기물 폐기 용기를 설치하십시오.</li>
		<li>T25 플라스크에서 6-8mL의 마이코박테리아 배양액을 제거하고 15mL 폴리프로필렌 튜브로 옮깁니다. 참고: 더 작은 부피의 튜브는 더 작은 실험에 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>튜브를 실온에서 2890 x g에서 10분 동안 벤치탑 원심분리기로 원심분리합니다.</li>
		<li>원심 분리기에서 튜브를 조심스럽게 제거하고 생물학적 안전 캐비닛으로 옮깁니다. 박테리아가 가라앉을 때까지 1분 정도 기다립니다.<ol><li>상청액을 소독제 폐기 용기에 붓고 튜브를 다시 덮고 튜브의 측면을 두드려 나머지 배지에 박테리아를 재현탁합니다. 박테리아가 가라앉을 때까지 1분 정도 기다립니다.</li>
		</ol></li>
		<li>예열된 cRPMI 2mL를 넣고 부드럽게 혼합한 다음 50mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.</li>
		<li>25G 바늘과 5mL 주사기를 사용하여 마이코박테리아를 매우 조심스럽게 재현탁시킵니다. 다시 부유하려면 마이코박테리아 현탁액을 주사기에 넣고 튜브의 측벽 아래로 매우 부드럽게 배출하여 에어로졸 생성을 최소화합니다. 6-8 번 반복하십시오. 알림: 이것은 마이코박테리아의 고밀도 배양이므로 최대한 주의하십시오. 바늘 스틱 부상의 위험을 방지하려면 가능하면 무딘 바늘을 사용하고 루어 잠금 주사기를 사용하십시오.</li>
		<li>바늘과 주사기를 BSC의 날카로운 물건 용기에 폐기하십시오.</li>
		<li>현탁액을 2mL 미세원심분리 튜브(나사식 캡 포함)로 옮기고 실온에서 100 x g 에서 3분 동안 원심분리하여 남은 덩어리를 펠릿화합니다. 튜브를 안전 캐비닛에 다시 넣고 박테리아가 정착할 때까지 1분 동안 기다립니다.</li>
		<li>상청액의 상단 1-1.5mL를 새 튜브로 옮깁니다. 소독제가 들어있는 쓰레기통에 원래 튜브를 폐기하십시오. 잘 혼합하고, 다양한 양의 마이코박테리아 현탁액(예를 들어, 5, 25, 50, 150 μL)을 2-웰 유리 챔버 슬라이드에 첨가하고, 37°C의CO2 인큐베이터에서 3시간 동안 인큐베이션한다.</li>
	</ol></li>
	<li>산성 패스트 박테리아(AFB)에 대한 염색 참고: 3시간 배양 후, 대식세포를 세척하고 파라포름알데히드로 고정하여 마이코박테리아를 비활성화합니다. 그런 다음 슬라이드는 변형된 Auramine O 키트( 재료 표 참조)를 사용하여 염색되어 세포당 식균된 마이코박테리아를 추정합니다. 밀랍 세포벽으로 인해 마이코박테리아는 산-알코올 세척 후에도 오라민 염료를 유지합니다. 그런 다음 대식세포 핵을 Hoechst로 대조 염색합니다. 이 방법을 사용하면 세포당 식균 박테리아의 수를 계산할 수 있으며 대식세포의 감염 다양성(MOI)을 결정하는 데 사용됩니다.<ol><li>피펫팅을 위아래로 3회 한 후 유리 챔버 슬라이드에서 배지를 제거하여 식균되지 않은 박테리아를 제거합니다.</li>
		<li>2mL의 실온 PBS로 한 번 세척하십시오.</li>
		<li>PBS에 용해된 4% 파라포름알데히드의 재고를 -20°C에서 최대 6개월 동안 분취량으로 저장합니다. 사용 직전에 4% 파라포름알데히드의 분취량을 해동합니다. PBS로 2% 파라포름알데히드로 희석하고 웰당 2mL를 추가합니다.</li>
		<li>실온에서 10분 동안 배양합니다. 유리 챔버 슬라이드는이 단계에서 염색을 위해 안전 캐비닛에서 제거 할 수 있습니다.</li>
		<li>부드러운 수돗물로 슬라이드를 씻으십시오.</li>
		<li>플라스틱 전사 피펫을 사용하여 세포를 덮을 수 있도록 슬라이드에 충분한 Auramine을 분배하고 어두운 곳에서 실온에서 1분 동안 배양합니다(알루미늄 호일로 덮음).</li>
		<li>슬라이드에서 과도한 염료를 수돗물로 씻어내고 탈색제/담금질을 어두운 곳에서 1분 동안 추가합니다.</li>
		<li>여분을 수돗물로 씻어 내고 어두운 곳에서 Hoechst 33342 (PBS에서 10 μg / mL)로 실온에서 15 분 동안 배양하십시오.</li>
		<li>Hoechst 얼룩을 수돗물로 씻어 내고 챔버를 제거하고 슬라이드에서 과도한 물을 배출하고 페이드 방지 및 커버 슬립 한 방울을 추가하고 자연 건조하십시오.</li>
		<li>100x 오일 대물렌즈를 사용하여 형광 현미경으로 슬라이드를 검사합니다. 마이코박테리아는 FITC 필터 아래에서 녹색 형광을 발합니다. 핵은 DAPI 필터 아래에서 파란색 형광을 발합니다(그림 1C).</li>
		<li>세포당 식균된 마이코박테리아의 수와 감염된 세포의 백분율을 계산하여 MOI를 결정합니다.</li>
		<li>플레이트에 있는 웰의 표면적을 기준으로 필요한 MOI를 달성하는 데 필요한 마이코박테리아 현탁액의 부피를 계산합니다. 예를 들어, 본 실험에 사용된 유리 챔버 슬라이드의 표면적은 4cm2이다. 낮은 MOI (약 1-2 간균 / 세포)는 며칠 (예 : 5 일)에 걸쳐 수행 된 실험에 바람직합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>대 식세포의 감염
	<ol><li>마이코박테리아 현탁액을 잘 혼합하고 원하는 MOI를 달성하는 데 필요한 부피가 결정되면 12웰 플레이트의 세포에 필요한 양을 추가합니다.</li>
		<li>마이코박테리아가 식균될 수 있도록 37°C에서 3시간 동안 배양합니다.</li>
		<li>따뜻한 RPMI 또는 HBSS로 우물을 여러 번 씻어 세포 외 박테리아를 제거하십시오.</li>
		<li>하나의 웰(3시간 샘플)에서 대식세포를 용해시켜 아래 3단계에 요약된 바와 같이 초기 접종물(3시간 샘플)의 양성 시간(TTP)까지의 백분율을 결정합니다.</li>
		<li>새로운 cRPMI 및 필요한 약물 용량 또는 비히클 대조군을 나머지 웰에 추가하고, 플레이트를 필요한 시간 동안 37°C의CO2 인큐베이터에서 인큐베이션합니다(실험 설계에 따라 다르지만 일반적으로 1 내지 8일 사이의 여러 간격으로).</li>
	</ol></li>
</ol>3. 액체 배양 검출 시스템을위한 샘플 수확
참고: 감염 당일, 세포외 마이코박테리아는 세척에 의해 제거되고, 세포내 마이코박테리아는 대식세포의 한 웰(3시간 샘플)의 용해에 의해 수확되어 감염의 기준선 대조군으로 식균된 초기 양을 결정합니다. 후속 시간에 배지, 세포 용해물 및 세척물을 결합하여 총 마이코박테리아 성장을 측정합니다. 원하는 경우 세포외 및 세포내 성장도 별도로 평가할 수 있습니다.
<ol><li>TTP를 결정하기 위해 3시간 샘플 수확
	<ol><li>2.3.3단계에 설명된 대로 감염 초기 3시간 후에 모든 웰에서 세포외 마이코박테리아를 씻어냅니다. 1mL의 새 배지를 3시간 대조군 웰에 추가하여 용해물 부피를 나중 시점의 용해물 부피와 균등하게 합니다. 알림: 세포 외 마이코 박테리아를 분석에서 제외해야하는 경우 3.2.7 단계를 참조하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>샘플 수집
	<ol><li>MB 국물과 악기 배양 병을 따뜻하게하여 실온으로 가져옵니다.</li>
		<li>배지를 12웰 플레이트에서 해당 라벨이 붙은 원추형 튜브로 옮깁니다.</li>
		<li>500μL의 멸균 용해 완충액(멸균 0.2μm 필터를 통해 여과된 PBS 중 0.1% Triton x-100)을 각 웰에 10분 동안 추가합니다.</li>
		<li>멸균 스크레이퍼로 웰에서 세포를 부드럽게 긁어 내고 적절한 원추형 튜브의 배지와 결합하십시오.</li>
		<li>0.5mL의 멸균 PBS로 웰을 세척하고 적절한 튜브로 옮깁니다.</li>
		<li>각 샘플을 바늘과 주사기 (25G)에 6-8 번 부드럽게 통과시켜 덩어리를 분해합니다. MB 국물에 샘플을 1:10으로 희석하십시오. 100 μL 샘플 + 900 μL MB 배지.</li>
		<li>필요한 시간/일(보통 1일에서 8일 사이)에 위의 3.2.1-3.2.6단계에 따라 나머지 샘플을 수확합니다. 참고: 조사자는 세포외 마이코박테리아를 분석에서 제외하는 것을 선호할 수 있으며, 이 경우 위의 3.2.2단계에서 각 웰의 배지를 버리고 용해 완충액을 추가하기 전에 대식세포를 여러 번 세척합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>기구 배양 병 접종 및 적재 알림: 액체 배양 기기 및 관련 소모품에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나와 있습니다.<ol><li>기구 배양 병의 고무 캡을 70 % 알코올에 적신 티슈 페이퍼로 소독하고 자연 건조시킵니다. 알림: 이 단계는 BSC에서 수행해야 합니다.</li>
		<li>모든 샘플에 대해 충분한 영양 보충제를 원추형 튜브(0.5mL/병)에 옮겨 병을 준비합니다. 바늘과 주사기를 사용하여 0.5mL의 영양소 보충제를 기기 배양 병에 주입합니다.</li>
		<li>희석된 샘플 500μL(1:10)를 1mL V 바닥 튜브에 피펫팅합니다.</li>
		<li>바늘과 주사기를 사용하여 500μL의 샘플을 지정된 기기 배양 병에 주입합니다.</li>
		<li>기구 배양 병의 고무 캡을 70 % 알코올에 적신 티슈 페이퍼로 소독하고 자연 건조시킵니다. BSC에서 제거하기 전에 70% 알코올에 적신 티슈 페이퍼로 병을 닦으십시오.</li>
		<li>적재를 위해 생물 안전 캐비닛에서 기기로 병을 조심스럽게 운반하십시오.</li>
		<li>자동 미생물 검출 시스템의 로딩 버튼을 누릅니다.</li>
		<li>기기 배양 병의 바코드를 스캔하고 병을 37°C의 검출 시스템 인큐베이터에 최대 42일 동안 두십시오. 기기 화면에서 양성에 도달하는 데 걸린 시간을 읽고 기록합니다. 알림: 바코드를 사용하면 기기가 병을 식별하고 반사율 판독값을 특정 병과 연결할 수 있습니다.</li>
		<li>초기 세포내 접종물(Day 0)의 TTP를 표시된 시간 동안 배양된 대식세포의 TTP와 비교하여 양성까지의 시간(TTP)을 백분율로 계산합니다. 백분율 TTP의 긍정적 인 변화는 마이코 박테리아 성장을 의미합니다13. 예를 들어, 3일차의 경우: 양성 시간의 백분율 변화 = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62838/62838eq01.jpg"></li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

저자들은 이 프로토콜에 설명된 액체 배양 방법을 사용하여 PMA11,16,17로 분화된 단핵구 유래 대식세포 및 폐포 대식세포 및 THP-1 세포에서 Mtb 성장을 모니터링했습니다. 이 기술은 또한 비부착성 세포(12)와 함께 사용하기 위해 변형될 수 있다. 보다 최근에이 기기는 TB17에 대한 HDT로서 흡입 된 모든 트랜스 레티노 산 (AtRA)을 평가하기위한 전임상 연구에도 사용되었습니다. 프로토콜의 중요한 단계에는 (1) 약물 전처리로 인한 차등 식균 작용과 같은 요인을 완화하고 더 낮은 MOI에서 발생할 가능성이 적은 세포 사멸을 최소화하기 위해 AFB 염색에 의한 Mtb 흡수를 제어하는 것, (2) MOI에 따라 세포 용해물을 희석하여 분석의 동적 범위를 최대화해야 할...

결핵의 원인균인 결핵균(Mtb)은 2019년 전 세계적으로 가장 심각한 전염병 사망자였습니다1. 숙주 방어를 피하기 위해 Mtb는 대식세포 및 수지상 세포(DC)와 같은 선천성 면역 세포의 진균 살균 활성을 파괴하여 세포 내에서 지속되고 복제할 수 있도록합니다2. 성인 폐결핵을 예방하는 효과적인 백신의 부족과 약물 내성 균주의 출현 증가는 새로운 치료법의 긴급한 필요성을 강조합니다.
보조 숙주 지시 요법(HDT)은 치료 시간을 단축하고 내성을 극복하는 데 도움이 될 수 있습니다3. 대식세포 내에서 진균살균 활성을 결정하기 위한 시험관 내 HDT 후보의 전임상 평가는 종종 고체 한천 플레이트에서 콜로니 형성 단위(CFU)에 의한 Mtb 성장의 정량화에 의존합니다. 이것은 약물의 신속한 스크리닝에 적합하지 않은 느리고 노동 집약적 인 분석입니다. 상업적으로 이용 가능한 자동화된 브로스 기반 미생물 검출 시스템은 임상 표본에서 Mtb 및 기타 마이코박테리아 종의 검출 및 약물 감수성 테스트를 위해 임상 미생물학 실험실에서 더 일반적으로사용됩니다4. 이러한 기기는 시간 경과에 따라 모니터링되는 배양 배지의 물리적 변화(CO2 또는O2 수준 또는 압력의 변화)로 이어지는 박테리아 대사 활동을 기반으로 간접적으로 성장을 측정합니다5. 판독은 이전에 치료 6,7에 대한 반응으로 결핵 환자의 객담 표본과 감염된 쥐 폐 및 비장의 용해물8에서 Mtb CFU와 상관관계가 있는 것으로 나타난 양성 시간(TPP)입니다. 또한, 액체 배양 검출 시스템은 축삭 배양 및 배양된 대식세포에서 마이코박테리아의 성장에 대한 종래의 병원체 지시 요법의 효과를 측정하기 위해 사용되었다 9,10. 이 기기는 또한 Mtb11,12의 세포 내 성장을 제어하는 수지상 세포 및 폐포 대 식세포의 타고난 능력을 조사하는 데 사용되었습니다. 이 실험 프로토콜은 액체 배양 진단 시스템이 배양된 대식세포에서 결핵에 대한 HDT의 전임상 스크리닝을 수행하도록 조정될 수 있음을 보여줍니다. CFU 열거와 비교할 때 이 기술의 주요 장점은 세포 내 마이코박테리아 성장/생존을 정량화하는 데 필요한 실험 노동력과 시간을 상당히 줄인다는 것입니다. 이 기술은 숙주 면역을 강화하기 위해 세포 기능을 표적으로 하는 광범위한 약리학적 시약으로 처리된 면역 세포에서 세포 내 마이코박테리아 생존을 평가하는 데 사용할 수 있는 자동화된 배양 기기에 대한 액세스에 의존합니다.

<table><tbody><tr><td>IX51 형광 현미경</td><td>Olympus, 일본</td><td>N/A</td><td>AFB 검출 및 이미징</td></tr><tr><td>2mL 마이크로튜브, 평평한 바닥, 나사 캡, 멸균</td><td>Sarstedt, North Carolina, USA</td><td>72.694.006</td><td>Mtb 감염 macropahges</td></tr><tr><td>5mL 주사기, Luer lock</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td><td>SZR-150-031K</td><td>Macropahges/CFU</td></tr><tr><td>50mL 튜브</td>의 Mtb 감염, 멸균 <td>Sarstedt, North 미국 캐롤라이나,</td><td>62.547.254</td><td>Mtb 감염 macropahges</td></tr><tr><td>all-trans-Retinoic Acid (ATRA) &ge; 98% (HPLC)</td><td>Sigma Aldrich, Missouri, USA</td><td>R2625</td><td>호스트 지시 치료 후보</td></tr><tr><td>BacT/ALERT 3D 미생물 검출 시스템</td><td>Biomerieux ( Hampshire, UK)</td><td>247001</td><td>국물 기반 비색 검출 시스템</td></tr><tr><td>BACT/ALERT MP&nbsp; BACT/ALERT MP 영양 보충제</td><td>Biomerieux (영국 햄프셔)</td><td>414997</td><td>국물 기반 비색 검출 분석</td></tr><tr><td>BACT/ALERT MP 배양 병</td><td>Biomerieux (영국 햄프셔)</td><td>419744</td><td>국물 기반 비색 검출 분석</td></tr><tr><td>BD BBL Middlebrook ADC Enrichment, 20 mL</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td><td>M0553</td><td>Mycobacterium 액체 배양</td></tr><tr><td>BD BBL Middlebrook OADC 농축, 20mL</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td><td>M0678</td><td>콜로니 형성 단위</td></tr><tr><td>세포 스크레이퍼, 25cm</td><td>Sarstedt, North Carolina, USA</td><td>83.1830</td><td>대식 세포 용해물</td></tr><tr><td>수확 Corning 주사기 필터, 0.2 &마이크로; m</td><td>Corning Incorporated, Germany</td><td>431219</td><td>용해 완충액</td></tr><tr><td>살균 커버 유리(붕규산), 24 x 50mm, #1.5 두께</td><td>VWR International Limited</td><td>631 - 0147</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximide, from microbial</td><td>Sigma Aldrich, Missouri, USA</td><td>C7698</td><td>Colony Forming Units</td></tr><tr><td>Dako Fluorescent Mounting Medium</td><td>Agilent Technologies Ireland Limited</td><td>S3023</td><td>Antifade 장착 매체</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma Aldrich, Missouri, USA</td><td>D8537</td><td>Mtb infection of macropahges</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, Gibco</td><td>Thermo Fisher, Massachusetts, USA</td><td>10270106</td><td>대식세포 세포 배양</td></tr><tr><td>글리세롤, Difco</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td><td>228220</td><td>Colony Forming Units</td></tr><tr><td>Hoescht 33342 (bisBenzimide H 33342 trihydrochloride)</td><td>Sigma Aldrich, Missouri, USA</td><td>B2261</td><td>핵 염색</td></tr><tr><td>IFN&gamma;, 재조합 인간</td><td>R& D Systems Inc, Minnesota, USA</td><td>285-IF</td><td>호스트 지시 치료 후보</td></tr><tr><td>Labtek 2-well 챔버 슬라이드, sterile, Nunc</td><td>Thermo Fisher, Massachusetts, USA</td><td>TKT-210-150R</td><td>macropahges</td></tr><tr><td>L-Asparagine의</td> Mtb 감염, 무수 <td>Sigma Aldrich, Missouri, USA</td><td>A4159</td><td>콜로니 형성 유닛</td></tr><tr><td>Linezolid</td><td>Sigma Aldrich, Missouri, USA</td><td>PZ0014</td><td>항생제</td></tr><tr><td>Microlance Hypodermic Needle 25 G</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td><td>300400</td><td>Mtb 감염 macropahges/CFU</td></tr><tr><td>Middlebrook 7H10 Agar Base</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td><td>M0303</td><td>Colony Forming</td></tr><tr><td>Units Middlebrook 7H9 Broth Base</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td><td>M0178</td><td>Mycobacterium 액체 배양</td></tr><tr><td>변성 Auramine O Stain 및 탈색제</td><td>Scientific Device Laboratory, IL, USA</td><td>345-250</td><td>AFB stain</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma Aldrich, Missouri, USA</td><td>158127</td><td>macropahges Petri dish의 Mtb 감염</td></tr><tr><td>, 92 x 16mm (20/bag)</td><td>Sarstedt, North Carolina, USA</td><td>82.1473.001</td><td>Colony Forming Units</td></tr><tr><td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td><td>Sigma Aldrich, Missouri, USA</td><td>P8139</td><td>대식세포 배양</td></tr><tr><td>Polysorbate 80, Difco</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td><td>231181</td><td>Mycobacterium liquid culture</td></tr><tr><td>RPMI-1640, Gibco</td><td>Thermo Fisher, Massachusetts, USA</td><td>52400025</td><td>대식세포 배양</td></tr><tr><td>멸균 세포 스프레더, L-Shaped</td><td>Fisherbrand, Thermo Fisher, MA, USA</td><td>RB-44103</td><td>콜로니 형성 유닛</td></tr><tr><td>T25 TC 플라스크, 앵글형 넥, 필터 캡, 멸균, Nunc</td><td>Thermo Fisher, 미국 매사추세츠</td><td>156367</td><td>Mycobacterium 액체 배양</td></tr><tr><td>THP-1 세포주</td><td>ATCC, 미국 버지니아</td><td>ATCC TIB-202</td><td>대식세포 배양</td></tr></tbody></table>

결핵에 대한 숙주 유도 요법의 전임상 테스트에 사용하기 위한 자동화된 배양 시스템

An Automated Culture System for Use in Preclinical Testing of Host-Directed Therapies for Tuberculosis

결핵(TB)의 원인균인 결핵균(Mtb)은 COVID-19가 출현하기 전까지 전 세계적으로 가장 심각한 전염병 사망자였습니다. Mtb는 세포 내 환경에서 지속되고 숙주 방어를 피하며 많은 항 결핵 약물에 대한 내성을 개발하도록 진화했습니다. 내성을 해결하는 한 가지 접근법은 Mtb에 대한 숙주 면역 반응을 증가시키는 기존의 승인 된 약물을 식별하는 것입니다. 그런 다음 이러한 약물을 보조 숙주 유도 요법(HDT)으로 용도를 변경하여 치료 시간을 단축하고 항생제 내성을 극복하는 데 도움이 될 수 있습니다.
대식세포에서 세포내 Mtb 성장의 정량화는 잠재적인 HDT를 평가하는 중요한 측면입니다. Mtb 성장을 측정하기 위한 황금 표준은 한천 플레이트에서 집락 형성 단위(CFU)를 계산하는 것입니다. 이것은 약물의 신속한 스크리닝에 적합하지 않은 느리고 노동 집약적 인 분석입니다. 이 프로토콜에서는 임상 표본에서 Mtb를 검출하는 데 더 일반적으로 사용되는 자동화된 브로스 기반 배양 시스템이 숙주 지시 요법의 전임상 스크리닝에 맞게 조정되었습니다. HDT로 처리된 대식세포에서 세포내 Mtb 성장을 조사하기 위한 액체 배양 분석 시스템의 용량을 평가하였다. Mtb 성장을 억제하는 능력에 대해 테스트된 HDT는 용액에 담겨 있고 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA) 미립자와 인터페론-감마와 리네졸리드의 조합으로 캡슐화된 올-트랜스 레티노산(AtRA)이었습니다. CFU 방법에 비해 이 자동화된 액체 배양 기반 기술의 장점은 설정이 간단하고, 노동 집약적인 준비가 적고, 결과 도출 시간이 더 빠르다는 것입니다(한천 플레이트의 경우 21일 이상에 비해 5-12일).

이 연구에 사용 된 자동화 된 액체 배양 기기는 10 분마다 CO2 수준을 모니터링합니다. 계기 병 바닥에 있는 센서의 색상 변화는 비색으로 측정되고 반사율 단위로 표시됩니다. 그런 다음 기기 소프트웨어는 검출 알고리즘을 적용하여 양성까지의 시간(TTP), 즉 접종 후 배양이 양성으로 플래그가 지정될 때까지의 일수를 계산합니다(그림 1A). 초기 접종물에서 TTP와 log10CFU(한천 플레이트 방법으로 결정)12 사이의 반비례 관계가 그림 1B에 나와 있습니다. 약리학적 억제제의 존재 또는 부재 하에 1-2에서 5-10 범위의 MOI에서 감염된 대식세포 내 Mtb 성장(그림 1C)을 설명된 자동 배양 방법 또는 고형 한천 상의 콜로니 열거에 의해 비교했을 때, 두 방법 모두에 의해 얻어진...

세포 내 M. 결핵 성장의 신속하고 효율적인 정량화는 결핵(TB)에 대한 개선된 치료법을 추구하는 데 중요합니다 . 이 프로토콜은 후보 숙주 지시 요법으로 처리된 대식세포에서 Mtb 성장을 정량화하기 위해 자동화된 액체 배양 시스템을 사용하는 브로스 기반 비색 검출 분석을 설명합니다.

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of tuberculosis (TB), was the most significant infectious disease killer globally until the advent ...

이 프로토콜의 주요 장점은 결핵균의 세포 내 성장을 추정하기 위해 집락 형성 단위를 계산하는 전통적인 방법보다 노동 집약적이고 시간이 덜 많이 걸린다는 것입니다. 이 기술을 통해 연구자들은 FDA 승인 약물을 결핵 치료를위한 숙주 지시 요법으로 용도 변경하기 위해 신속하게 스크리닝 할 수 있습니다. 이 방법은 매우 간단하고 간단합니다.마이코박테리아 및 EO 운반체 T 세포 배양 기술에 대한 기본 지식은 프로토콜을 단계별로 따르기에 충분합니다. 시작하려면 T25 플라스크에서 6-8 밀리리터의 약독 화 된 마이코 박테리아 배양 H37Ra를 15 밀리리터 폴리 프로필렌 튜브로 옮깁니다. 벤치탑 원심분리기에서 튜브를 원심분리합니다.튜브를 조심스럽게 제거한 후 튜브를 생물학적 안전 캐비닛으로 옮기고 박테리아가 정착 할 때까지 1 분 정도 기다립니다. 상청액을 소독제 폐기 용기에 붓습니다. 그런 다음 튜브를 다시 덮고 튜브의 측면을 부드럽게 두드리고 박테리아가 1분 동안 가라앉도록 하여 나머지 배지에 박테리아를 현탁시킵니다.예열 된 완전한 RPMI 2 밀리리터를 추가하고 혼합하고 50 밀리리터 원추형 튜브로 옮깁니다. 마이코 박테리아를 재현 탁하려면 25 게이지 바늘이 장착 된 5 밀리리터 주사기에 현탁액을 그립니다. 그런 다음 에어로졸 생성을 최소화하기 위해 튜브의 측벽 아래로 매우 부드럽게 배출하고 이 과정을 6-8회 반복합니다.바늘과 주사기를 생물 안전 캐비닛의 날카로운 물건 용기에 폐기하십시오. 현탁액을 2밀리리터 미세 원심분리 튜브와 원심분리기로 옮겨 남은 덩어리를 펠릿으로 만듭니다. 튜브를 안전 캐비닛에 다시 넣고 박테리아가 1분 동안 가라앉도록 합니다.상청액의 상부 1 내지 1.5 밀리리터를 새로운 튜브로 옮긴다. 소독제가 들어있는 폐기물 통에 원래 튜브를 폐기하십시오. 잘 혼합하고 다양한 양의 마이코박테리아 현탁액을 2개의 웰 유리 챔버 슬라이드에 첨가하고, 슬라이드를 섭씨 37도에서 3시간 동안 인큐베이션합니다.포식되지 않은 박테리아를 제거하기 위해 위아래로 3회 피펫팅한 후, 유리 챔버 슬라이드에서 배지를 제거합니다. 2 밀리리터의 PBS로 한 번 씻으십시오. 섭씨 영하 20도에서 보관된 PBS에서 4%PFA의 분취량을 해동합니다.부분 표본을 2 % PFA로 희석하고 각 웰에 2 밀리리터를 첨가하십시오. 실온에서 10분 동안 배양한 후 염색을 위해 안전 캐비닛에서 슬라이드를 꺼냅니다. PFA 화학 폐기물

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Mycobacterium 결핵의 항균 자화율 시험에 도전하지만, 환자 치료를 위해 중요합니다. 이 microtiter 플레이트 형식 12 antimycobacterial 마약 테스트를 제공하며 적절한 치료에 도움이됩니다 최소 억제 농도 (MIC) 값을 제공합니다.

Microtiter 플레이트 형식의 맛을 희석하여 첫 번째와 두 번째 라인 의약품 Mycobacterium 결핵의 복합 항균 자화율 테스트

특정 조건에서 배양해 때 결핵은 Mycobacterium 마약 허용 biofilms를 형성합니다. 여기 culturing M.하는 방법을 설명 결핵 biofilms 및 약물 관용 persisters의 주파수를 결정. 이러한 프로토콜은 M.의 약물 내성의 메커니즘에 대한 연구를 위해 도움이 될 것입니다 결핵.

의 성장 결핵은 Mycobacterium Biofilms

이 동영상은 결핵균(Mtb) 감염에 대한 약물의 효능을 평가하기 위한 분석을 보여줍니다. 생체 내 감염을 모방하는 Mtb/대식세포 응집체를 포함하는 체외 감염 모델이 생성됩니다. 적절한 항생제를 도입하면 약물 농도가 증가하는 박테리아의 생존을 모니터링하기 위해 레수자린 분석을 통해 그 효능을 테스트합니다.

Mycobacterium tuberculosis 감염 모델에 대한 약물 효능을 평가하기 위한 분석

여기서는 작은 간섭 합성 RNA(siRNA), 화학 화합물 및 진균 결핵 돌연변이 라이브러리의 고처리량/고함량 스크린에 적용되는 표현성 분석을 설명합니다. 이 방법은 자동 공초점 현미경 검사를 사용하여 형광으로 표지된 숙주 세포 내의 형광표지 진균 결핵의 검출에 의존합니다.

고처리량/고함량 스크리닝에 적용된 세포내 진균의 정량화를 위한 현미경 표티픽 분석

우리는 세포를, 결핵균에 대해 신규 한 화합물을 발견 타겟팅 및 인스 국물 포유 동물 숙주 세포에 대해 박테리아뿐만 아니라 세포 독성이 증가하는 모듈 높은 처리량 스크리닝 시스템을 개발 하였다.

세포 내 타겟팅 억제제의 효능 및 세포 독성 검사를위한 시스템<em&gt; 결핵균</em

차세대 항결핵 약물을 위한 초기 약물 개발 과정을 개선할 수 있는 새로운 모델과 분석이 매우 바람직합니다. 여기에서는 고처리량 스크리닝에 쉽게 적용할 수 있는 결핵균에 대한 약물 효능을 평가하기 위한 빠르고 저렴한 BSL-2 호환 분석에 대해 설명합니다.

높은 처리량을 지원 분석은 대식 세포 계대에 대한 약물 효능을 평가하기<em&gt; 결핵균</em

콜로니 형성 단위(CFU)의 측정은 눈에 보이는 콜로니를 형성하는 데 몇 주가 걸릴 수 있는 Mycobacterium tuberculosis를 포함하여 박테리아를 정량화하기 위한 황금 표준 기술입니다. 여기서는 시간 효율성 향상, 실험실 공간 및 시약 비용 절감, 중간 및 고처리량 실험으로의 확장성을 갖춘 CFU 측정을 위한 마이크로 CFU에 대해 설명합니다.

결핵에 대한 백신의 효능 평가를 위한 Micro-colony Forming Unit Assay

이 연구는 박테리아 생존력을 신속하게 평가하기 위해 형광 및 발광을 사용하여 최근에 생성된 이중 리포터 균주를 사용하여 Mycobacterium abscessus 에 대한 고처리량 스크리닝을 위한 분석을 개발했습니다. 이 프로토콜은 이 약물 내성 박테리아에 대한 신약을 스크리닝하려는 연구자들과 관련이 있습니다.

Mycobacteria에 대한 고처리량 약물 스크리닝을 위한 분석 개발

여기에서는 박테리아가 분비하는 단백질로 구성된 박테리아 성장 배지인 Mtb 배양 여과액(CF)의 제조를 보여줍니다. Mtb 는 발병에 중요한 숙주 신호 전달 및 면역 반응을 조절하기 위해 단백질을 분비합니다. 준비된 CF는 모든 분비 인자를 식별하기 위해 질량 분석법으로 분석됩니다.

결핵 발병기전을 이해하기 위한 Mycobacterium tuberculosis 배양 여과액의 제조

여기서는 4-아미노퀴놀린 화합물의 화학적 합성, 결핵균에 대한 최소 억제 농도 결정, 포유류 세포주에서의 세포독성 평가를 포함하는 표현형 스크리닝을 통해 잠재적 항결핵 약물 후보를 식별하는 프로토콜을 제시합니다.

잠재적 항결핵 후보 식별: 포유류 세포에서 합성, MIC 결정 및 세포독성 평가에 대한 단계별 가이드

여기서는 BSL-2 승인 마이코박테리움 결핵 증의 감쇠 체내 영상 프로토콜을 제시합니다. 영구 폐 창을 이용한 쥐 폐 내 스트레스. 이 접근법은 동일한 폐 미세환경 내에서 세균 위치, 혈관 역학, 대식세포 흡수 등 초기 숙주-병원체 상호작용의 종단적 단일 세포 분해 분석을 가능하게 합니다.

초기 혈관 내 감염 중 쥐 폐에서 희석된 위영양성 결핵 균의 생명체 내 영상

배우세요 자동화된 액체 배양 시스템을 사용하여 대식세포 내 Mycobacterium tuberculosis 성장을 정량화하는 방법을. 이 기술은 FDA 승인 약물을 빠르게 선별하여 결핵 치료를 위한 숙주 유도 요법으로 재활용하는 연구를 지원합니다.

결핵에 대한 숙주 유도 요법의 전임상 테스트에 사용하기 위한 자동화된 배양 시스템

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