Name: 확인된 모터 뉴런을 위한 신경근육 정션에서 변경을 검출하기 위하여 Drosophila 성인 다리의 해부 및 면역 조직 화학 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: 배우세요 Drosophila 성인 다리 해부 및 면역 조직 화학 기법을 사용하여 신경근육 정션의 구조를 보존하고 운동 뉴런의 퇴행성 변화를 장기간 추적하는 방법을. 이 기법은 다양한 유전형 질병 모델 연구에 활용됩니다.

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우리는 이미징에 대한 조언을 에릭 로버츠 감사합니다. 우리는 또한 로드 아일랜드 대학과 특히 마이클 케인과 제이크 더글러스의 정보 기술 서비스에 비디오 그래피에 감사드립니다. 단일 클론 항체 안티 dlg 및 안티 브롭은 UC-버클리와 유니버시티클리니킴 우에르츠부르크에 의해 각각 개발되었으며, NIH의 NICHD에 의해 생성되고 아이오와 대학, 아이오와 시, IA 52242, 미국에서 유지 개발 연구 하이브리드 종은행에서 얻었다. 여기에보고 된 연구는 부여 번호 [P20GM103430]의 국립 보건 원의 국립 의학 연구소에서 로드 아일랜드 기관 개발 상 (IDeA) 생물 의학 연구 우수성의 네트워크에 의해 완전히 지원되었다.

이 프로토콜과 함께 사용되는 작업 솔루션을 준비하기 위한 절차는 표 1에 설명되어 있습니다.
<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>시약</td>
			<td colspan="3">준비</td>
			<td colspan="2">보관</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td colspan="3">증류수에서 희석하여 10배 PBS 스톡 솔루션에서 1배 PBS의 작업 재고를 만드십시오.  작업 PBS 주식의 pH는 7.2- 7.4이어야한다</td>
			<td colspan="2">세균 오염이 보일 때까지 1 개월 이상 4 °C.</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBT</td>
			<td colspan="3">0.1% 비이온 계면활성제의 1x PBS 용액.</td>
			<td colspan="2">세균 오염이 보일 때까지 1 개월 이상 4 °C.</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">파</td>
			<td colspan="3">3.7% 포름알데히드 용액은 37% 포름알데히드 주식으로 만들어졌으며 1배 PBS로 희석됩니다.</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">실온. 해부의 매일 신선한 만들기</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">주의: 37%의 주식 용액으로 공급되는 포름알데히드는 잠재적인 발암물질이며 연기 후드에 희석되어야 합니다.</td>
		</tr>
<tr>
<td>5% NGS</td>
			<td colspan="3">PBT에서 희석된 일반 염소 혈청의 5%  사용되는 혈청은 사용될 이차 항체의 종과 일치해야 한다.</td>
			<td colspan="2">세균 오염이 보일 때까지 몇 주 동안 4 °C</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1. 성인 Drosophila 다리 의 면역 세포 화학을 수행하기위한 솔루션.
1. 조직의 초기 고정
<ol><li>각 유전자형과 나이에 대해 약 10개의 파리를 선택합니다. 이산화탄소 아래 플라이 패드에서 마취(그림 1A, B). 참고: 해부 후 충분한 샘플 크기를 보장하기 위해 필요한 것보다 더 많은 파리로 시작합니다.</li>
	<li>페인트 브러시를 사용하여 유리 우물또는 접시에 차가운 메탄올로 파리를 약 30초에서 1분 동안 옮춥니다(그림 1C). 메탄올은 큐티큘러 탄화수소를 용해시키고 파리는 수성 용액에 떠 다니기보다는 침수될 수 있습니다.</li>
	<li>집게로 조심스럽게 PBS로 이동합니다. 얼음처럼 차가운 PBS에서 3x를 헹구고 과잉 메탄올을 제거하고 해부및 고정이 될 때까지 PBS에서 얼음으로 날아갑니다. 이 시점에서, 해부 파리와 가능한 짧은 시간 (&lt;30 분) 이내에 수정.</li>
	<li>다리를 분리하려면 차가운 PBS로 채워진 실리콘 탄성 탄성 방부 접시로 파리를 옮기고, #5 Dumont 집게 두 쌍을 사용하여 coxa에서 메타토라시 다리를 제거하거나 Vanna 가위로 다리를 잘라냅니다 (그림 1D). 1mL의 PBS로 채워진 플라스틱 24 웰 플레이트에서 다리를 우물로 옮기고 모든 다리가 제거되고 우물로 옮겨질 때까지 접시를 얼음 위에 놓습니다. 참고: 각 우물은 적어도 20개의 다리를 보유할 수 있습니다.</li>
	<li>PBS 솔루션을 FA 용액 1mL로 교체하고 30분 동안 누에이터에서 회전합니다(그림 1E). 누에이터 설정은 중간 속도(17rpm)로 설정해야 합니다. 적절한 고정을 위해이 시간 동안 다리가 FA 솔루션에 완전히 잠겨 있는지 확인하십시오.</li>
	<li>FA 용액을 제거하려면 PBS 3x의 1mL로 빠르게 세척한 다음 PBS 1mL로 5분 동안 3개의 세척을 추가로 세척합니다. 아래에 설명된 해부 단계 동안 PBS1mL의 조직을 얼음 에 보관하십시오.</li>
</ol>2. 다리 큐티클 및 항체 염색 제거
<ol><li>다리 큐티클 제거<ol>
<li>해부 포셉은 성공에 매우 중요합니다. #5 슈퍼 미세 포셉의 끝에 있는 두 갈래에 약간의 병렬 굴곡을 도입하여 큐티클을 찌르지 않고 피상적으로 잡을 수 있는 벨을 제공하여 조직을 망칠 수 있습니다(그림 1F, G). 참고: 병렬로 구부러진 프롱은 닫을 때 프롱 길이 전체에 걸쳐 서로 접촉해야 합니다(그림 2).</li>
		<li>해부를 위해 PBS의 실리콘 엘라스토머 접시에 다리를 옮기습니다. 전방 측이 위를 향하도록 다리를 방향을 지정합니다(다리 해부학 및 방향 정보는 그림 3 참조). 한 쌍의 집게를 사용하여 실리콘 엘라스토머 접시에 경골 세그먼트를 잡습니다. 다른 집게를 사용하여 베벨 쪽을 아래로 잡고, 대퇴골의 말단 끝에 큐티클 조각을 잡고 트로 챈터를 향해 근위 방향으로 당깁니다.</li>
		<li>대퇴골의 근위 쪽 끝에 걸쳐 벌거벗은 근육이 보일 때까지 체계적으로 큐티클을 제거하십시오(도 1F, G, H). 참고: 근육을 당기는 것을 피하기 위해 집게의 경사진 면을 사용하여 다리와 피상적으로만 접촉합니다.</li>
		<li>모든 다리가 해부되면 PBS를 FA로 교체하여 중간 속도로 누에이터를 흔들어 30 분 동안 다리를 수정합니다 (그림 1I). PBS 1mL로 샘플을 3배 빠르고 PBT에서 각각 5분간 3회 세척합니다(그림 1J). 참고: 단일 클론 항체 NC82 (항 브루치 파일럿)로 염색하여 활성 영역에 라벨을 붙이는 경우,이 항원이 더 긴 고정에 민감하기 때문에 20 분 동안 수정 후 수정하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62844/62844fig02v2.jpg"> 그림 2. 성인 다리를 해부하는 데 사용되는 수정 된 집게. (A) 집게의 끝이 구부러진 다음 바닥(화살표)에서 평평해져 서두르는 돌에 제출하여 bevel을 만듭니다. (B) 반대로 수정되지 않은 집게의 갈래는 구부러지지 않습니다. 스케일 표시줄 = 1mm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62844/62844fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<ol start="2"><li>항체 염색<ol>
<li>항체 염색을 위한 조직을 차단하기 위하여는, PBT의 1mL를 PBT에서 희석한 5% NGS의 1mL로 구성된 블로킹 용액으로 대체하십시오. 해부된 다리를 실온에서 4시간 또는 4°C에서 하룻밤 동안 배양하고 중간 속도(17rpm)로 누에이터에 흔들리고 있습니다. 모든 인큐베이션 동안 플라스틱 커버 (그림 1J)뿐만 아니라 밀봉 테이프로 우물을 덮습니다. 참고: 24개의 웰 플레이트는 미세원심분리기 튜브를 사용하려는 이전의 시도가 다리가 부러지고 조직이 손상되기 때문에 1.5mL 또는 2mL 마이크로센트심분리기보다는 면역 세포화학에 사용됩니다.</li>
		<li>차단 용액을 제거하고 신선한 차단 용액에 희석 된 1 차 항체의 300 mL을 추가하십시오. 사용되는 항체의 소량은 조직을 커버하기에 충분해야합니다. 실험실 밀봉 테이프와 플라스틱 뚜껑으로 우물을 다시 밀봉하고 중간 속도로 누에이터에 흔들어 4 °C에서 하룻밤 배양 (그림 1J). 이러한 연구를 위해 사용되는 작동 항체 시약 정보 및 농도는 표 2에 설명되어 있습니다.</li>
		<li>1차 항체를 PBT 1mL로 3회 간간 세척한 다음 각각 15분 동안 3회 세척한다(그림 1J). 참고: 희석된 1차 항체는 최대 2주 동안 4°C에 저장하면 저장하고 재사용할 수 있다.</li>
		<li>실온에서 2시간 이상 또는 4C(그림 1J)에서 1mL의 5% NGS로 조직을 다시 차단합니다.</li>
		<li>5% NGS 차단 용액을 제거하고 적절한 희석 형광 공주 이차 항체의 300 μL을 추가합니다. 또한, 추가 1:2000 형광 -컨쥬게이트 남근의 희석 을 라벨 근육에 (그림 1J).</li>
		<li>이차 항체 인큐베이션의 경우 실험실 밀봉 테이프와 뚜껑으로 우물을 밀봉하십시오. 또한 알루미늄 호일에 플레이트를 싸서 빛으로부터 형광을 보호합니다. 실온에서 6-8시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.</li>
		<li>상기 2.2.3 단계에서 설명된 바와 같이 이차 항체 및 프할로이드신을 세척한다. 알루미늄 호일로 플레이트를 세정 사이에 덮어 빛으로부터 형광을 보호합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 다리 장착
<ol><li>다리를 집게와 오리엔트 전방 측면을 사용하여 슬라이드로 옮기십시오. 장착 미디어로 다리를 덮습니다(그림 1K, L). 참고: 해부된 다리는 면도날로 절단하여 바닥 보어가 넓어지면 P1000 파이펫 팁으로 흡인될 수 있습니다.</li>
	<li>22x22 mm2 커버슬립(#1.5 두께)에 클레이 스페이서를 추가하여 작은 모델링 클레이 볼을 가로질러 커버슬립 모서리를 긁어냅니다. 각 모서리에는 소량의 점토가 1-2mm 두께여야 합니다(그림 1K).</li>
	<li>슬라이드를 덮려면 진흙 스페이서가 슬라이드를 향하고 있는 커버슬립을 추가하고 커버슬립이 대퇴골 표면에 닿을 때까지 조심스럽게 모서리를 밀어 넣습니다.</li>
	<li>증발을 방지하기 위해, 매니큐어로 커버 슬립의 가장자리를 밀봉하고 이미징 까지 4 ° C에 저장하기 전에 어두운 장소 (약 10 분)에서 건조하게.</li>
</ol>4. 이미징
<ol><li>공초점 현미경에 의한 이미지 (그림 1M). 해부의 품질을 더 잘 평가하기 위해 전달된 광 채널을 포함하고 관심 영역에서 눈에 띄게 중단된 근육 섬유를 가진 시료를 폐기해야 합니다.<ol>
<li>2배 줌으로 20배 배율로 이미징 z 스택을 시작하고 대퇴골의 두께에 해당하는 총 심도 ~40mm입니다. 형광 신호 감지의 경우 나이퀴스트 샘플링과 일치하는 해상도로 이미지를 캡처합니다(8-10 μs/픽셀의 거주 설정이 있는 1024 x 1024 픽셀을 사용하고 있음). 신호 강도는 고전압 게인 설정을 조정하여 달성되는 선형 범위에 있어야 합니다. 실험 내의 일련의 샘플에 대한 게인 설정이 설정되면 샘플 간에 신호 강도를 비교할 수 있도록 변경해서는 안 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>시냅스 boutons 및 기타 세포 전체 구조를 이미징하기 위해 ≥60배율로 공초점 이미지를 캡처합니다. 검출기 설정은 선형 범위에 있어야 하며 픽셀 밀도, 거주 설정 및 z 깊이는 낮은 배율(단계 4.1)에서 캡처된 이미지와 유사해야 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

Drosophila 성인 다리는 신경 아세포 계보와 고정 관념 식소 패턴에서 매핑 잘 특징적인 MN과 상대적 단순성을 주어진 신경 변성을 연구하는 이상적인 모델입니다. 몇몇 보고는 이전에 신경 퇴행성 질병의 연구 를 위해 다리 MN을 사용했습니다21,22. 이러한 연구는 억압가능한 세포 마커(MARCM)와 모자이크 분석과 결합된 GFP 표현 라인을 사용하여 큐티클을 통해 이미지화하고 일련의 형태학적 변화를 문서화했습니다. 절제된 자화로 면역 세포화학에 의한 성인 NMJ를 이미징하면 사용 가능한 항체의 툴박스를 사용하여 복잡한 분자 변화를 추적할 수 있는 기능을 통해 추가 특성화가 가능합니다.
이 프로토콜의 면역 세포화학 부분은 상대적으로 표준이며 유전자형에 독립적으로 구현될 수 있습니다(예를 들어 Drosophila와 함께 사용하기 위한 일반적인 항체 염색 방법에 대한 우수한 설명을 위한 참조23). 더욱이, 형광 강도, 축슨 분기 길이 및 부톤 수 및 크기와 같은 파라미터는 이미지가 캡처되고 정량적 분석을 위한 상세한 방법이 게시된 후 다양한 ImageJ 매크로를 사용하여 결정될 수 있다(예를 들어, see24,25,26). 따라서, 해부 기술은 여기에 설명된 주요 혁신이다. 해부 전에 파리는 알코올에 잠기면 자쿠리탄화수소를 제거합니다. 에탄올과 메탄올 은 이 목적을 위해 일반적으로 사용됩니다. 그러나, 우리는 메탄올만 사용했습니다. 성공을 해부하는 데 중요한 요소는 여러 가지 요소입니다: 첫째, 벨이 있는 수정된 집게를 사용하면 표피와 매우 피상적인 접촉을 할 수 있습니다. 둘째, 60-100x 총 배율이 가능한 해부 현미경을 사용하여 표피의 표면이 선명하게 보이게 된다. 최대 배율이 낮은 현미경의 경우, 2배 의 목표는 가장 일반적인 브랜드에 사용할 수 있으며 기존 렌즈와 결합될 때 충분해야 합니다. 셋째, 초기 고정 단계는 큐티클이 부서지기 쉽고 밑에 근육을 손상시키지 않고 쉽게 멀리 당겨. 이 단계에서 과도하게 고정하면 전체 다리가 너무 뻣뻣하여 효과적인 해부를 만듭니다. 따라서 초기 고정은 30분으로 제한되어야 합니다. 포름알데히드 고정은 이 짧은 기간 동안 기본 조직을 효과적으로 교차연결하는 데 충분히 침투하지 않으므로 두 번째 고정 단계가 필요합니다. 두 번째 고정 전에 조직은 형태학의 저하와 변화를 방지하기 위해 얼음위에 보관해야 합니다. 넷째, 우리는 감기가 중요하지만 해부 샘플을 발견했으며, 큐티클이 부서지기 쉽고 작은 조각을 더 쉽게 제거할 수 있습니다.
연습을 통해 해분의 50%가 눈에 띄는 조직 손상 없이 사용할 수 있다는 것을 발견합니다. 이 백분율은 몇몇 그밖 조직에 비해 낮은 보일 수 있더라도, 해부 절차는 급속하고, 많은 다리는 30- 60 분에서 처리될 수 있습니다. 따라서 처음에는 성공률이 낮더라도 각 실험 군에 대해 4-5개의 좋은 샘플을 얻을 수 있습니다. 그러나, 유전자형 및/또는 나이가 상당한 치사증을 초래하는 경우 주어진 시간에 사용할 수 있는 파리의 수에 제한이 있을 수 있습니다.
또 다른 제한사항은 크기때문에 대퇴골의 근위 영역을 넘어 다리의 다른 영역을 해부할 수 없다는 것입니다. 따라서, 우리는 TILM을 안정적으로 내면으로 내면화하는 MN 아버를 연구할 수 있으며, 해부시 다리가 방향을 바꾸는 방식에 작은 변화와 함께 경골 우울근 위에 표피를 해부할 수 있다. 그러나 다리의 다른 영역에 액세스하는 것은 해부 동안 축축건축을 방해하지 않고 더 어려워 입증되었습니다.
여기서, 우리는 면역 세포화학을 사용하여 틸름을 내면화하는 정의된 MNs에 대한 성인 NMJ에서의 변화를 검출하는 해부 방법을 제시한다. 다리는 단순한 시스템으로 유용하며, ~50MN에 의해 내면화되고 잘 설명된 해부학을 가진 14개의 근육을 함유하고 있습니다. 해부된 다리 제제는 유전자형 전반에 걸쳐 사용될 수 있으며 돌연변이 배경에서 기자 유전자 구조의 유전자 생성물의 유전자 전형적으로 복잡한 주식을 구축할 필요 없이 NMJ 시각화에 사용할 수 있다. 이 접근법은 MN 질병 및 기타 연령 관련 조건에 대한 NMJ의 변화에 대한 보다 상세한 특성화를 가능하게 할 것입니다.

운동 뉴런(MN) 질환은 1차 임상 표현형으로서 근육 낭비및 마비로 이어지는 점진적 변성을 포함하는 이종성 질환의 그룹을 포함한다. 100,000당 4.5의 글로벌 보급으로 드물지만, 이 보급은 고령화 인구2와 함께 증가할 것으로 예상됩니다. 근위축성 측삭 경화증 (ALS)은 가장 흔한 MN 질병 (MND)이며 기존의 질병 수정 치료없이 진단의 짧은 시간 이내에 일반적으로 치명적입니다3. MNDs는 환자에서 볼 수있는 초기 분자 바이오 마커 변경 및 기능적 이미징 변화와 함께 장기간 전증상 단계를 공유합니다4. 초기 전증상 세포 병리학은 또한 비인간 질병 모형에서 관찰됩니다5,6,7,8. 신경 근육 접합에 초기 변화의 연구는 MN 질병 병 인을 이해 하는 데 중요 하 고 초기 진단 및 잠재적인 치료 개발에 도움이 될 수 있습니다.
Drosophila에 풍부한 유전 및 분자 도구가 존재하여 신경 근육 접합의 구조와 기능을 해부합니다 (NMJ, see9는 잘 특징적인 애벌레 NMJ의 검토를 위해). 이러한 도구는 짧은 수명과 결합하여 Drosophila는 NMJ에서 신경 퇴행성 변화를 연구하는 훌륭한 모델입니다. 구체적으로, MNs 내분 성인 근육은 ~90일 성인 수명 전반에 걸쳐 존재하며 정상적인 노화 과정10,11,12,13의 적용을 받습니다. 따라서 성인 MN은 변형 14,15 전에 짧은 ~ 1 주 기간 동안 만 존재하는 애벌레 NMJ와 는 대조적으로 느린 퇴행성 변화를 연구 할 수있는 기회를 제공합니다.
여기서는 성인 다리에서 MN의 면역 세포화학 적 분석을 수행 할 수있는 해부 절차를 설명합니다. 각 성인 다리는 ~ 50 MNs에 의해 내면화되며, 이는 운동과 관련된 다리 근육에 시냅스합니다. 다리 해부학, 기계 생리학 및 신경 생물학은 잘 설명되어 있다16,17,18. 다리 MNs의 축삭 아버는 이전에 이중 partite Gal4/UAS 시스템을 사용하여 백 필기 또는 유전으로 표지된 세포 집단에 있는 큐티클을 통해 화상 진찰에 의해 특징지어졌으며 화상 진찰 방법은 이전에 간행되었습니다19. 여기에 제시된 해부 방법은 축축산 분기 형태를 보존하고 우리가 NMJ의 다른 분자 성분을 표지하기 위하여 항체의 다양한 범위를 이용하는 것을 허용합니다. 우리의 이전 작품은 경골 레바터 근육 (tilm)을 내면화하고 일관된 식소 패턴과 부톤 숫자를 보여주는 metathoracic (3 번째) 다리에 정의된 MN의 투영에 초점을 맞추고 있습니다. 처음에 우리는 Drosophila superoxide dismutase 1 (dsod1) 돌연변이에 있는 나이 의존적인 변경을 공부하고 NMJ20의 해체와 일치하는 변경을 찾아냈습니다. 이러한 해부 방법은 다른 ALS 모델, 노화 및 기타 MN 관련 질병에 대한 NMJ의 느린 퇴행성 변화를 더 잘 특성화 할 수있는 기회를 제공합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62844/62844fig01.jpg"> 그림 1. 다리를 해부하기 위한 워크플로 요약입니다. 자세한 단계에 대한 프로토콜을 참조하십시오. (A,B) 파리를 선택하고 마취합니다. (C) 파리는 메탄올로 옮겨지고 PBS로 세척됩니다. (D) 메타토라시브 다리는 해부 현미경(~30배감)으로 시각화되는 동안 coxa의 기지에서 제거됩니다. 스케일 바 = 500 μm. (E) 다리는 24웰 플레이트의 우물 내에서 30분 동안 3.7% 포름알데히드/PBS(FA) 용액으로 고정된 다음 FA는 PBS를 통해 헤이즈에 의해 제거됩니다. (F, G, H) 다리는 실리콘 엘라스토머 해부 트레이로 옮겨지고 80x에서 해부하는 현미경으로 시각화되는 동안 beveled 포셉을 사용하여 근위 대퇴골에서 큐티클 조각이 제거됩니다. 스케일 바 = 50 μm. (I) 다리는 FA에서 고정된 후 PBS및 PBT(PBS+ 0.1% 비이온 계면활성제)로 세척됩니다. (J) 다리는 면역 세포화학 염색을 받습니다. (K,L) 다리는 유리 슬라이드로 옮겨지고, 장착 매체에서 지워지고, 점토 스페이서가 들어 있는 커버슬립으로 덮여 있습니다. 스케일 바 = 2mm 및 500 μm. (M) 다리는 공초점 현미경 검사법에 의해 이미지됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62844/62844fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>10x 인산염 완충 식염</td>수 <td>Fisher Scientific</td><td>BP3991</td><td></td></tr><tr><td>24 웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>3473</td><td>소수성, 초저 부착 표면</td></tr><tr><td>2x 대물렌즈 액세서리</td><td>Olympus</td><td>110AL2X</td><td>나사식 부착</td></tr>물 <tr><td>Anti-ATP5A 일차 항체</td><td>Abcam</td><td>ab14748</td><td>마우스 단클론</td></tr><tr><td>Anti-bruchpilot 일차 항체</td><td>발달 연구 Hybridoma Bank</td><td>nc82</td><td>마우스 단클론</td></tr><tr><td>안티 디스크 대형 1 차 항체</td><td>개발 연구 Hybridoma Bank</td><td>4F3</td><td>마우스 단클론</td></tr><tr><td>Anti-hrp 1 차 항체</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>123-605-021</td><td>Alexa Fluor 647 conjugated polyclonal</td></tr><tr><td>Anti-polyubiquitin (FK2) 1 차 항체</td><td>Millipore Sigma</td><td>04-263</td><td>마우스 monoclonal</td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td>대물렌즈(NA):&nbsp; 10x(0.4), 20x(0.85), 40x(1.20), 60x(1.42), 100x(1.40)</td></tr><tr><td>커버슬립</td><td>Corning</td><td>285022</td><td>160-190 mm 두께</td></tr><tr>해<td>부 겸</td>자 <td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>Dumont #5SF</td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP531-500</td><td>37% 메탄올</td></tr><tr><td>염소 항마우스 2차 항체</td>로 안정화 <td>Jackson Immuno Research</td><td>115-545-146</td><td>Alexa Fluor 488 접합</td></tr><tr><td>염소 혈청</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB036768</td><td>0.2mm 여과</td></tr><tr><td>실험실 밀봉 테이프</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-448-254</td><td>Parafilm M</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Fisher Scientific</td><td>A413</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-123</td><td>76mm x 25mm</td></tr><tr><td>마운팅 미디어</td><td>분자 프로브</td><td>S36972</td><td>Slowfade 다이아몬드 마운팅 미디어</td></tr><tr><td>비이온 성 계면 활성제</td><td>Acros Organics</td><td>215680010</td><td>Triton-X 100</td></tr><tr><td>Nutator</td><td>Fisher Scientific</td><td>S06622</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A34055</td><td>Alexa Fluor 555- 활용</td></tr><tr><td>숫돌</td><td>Fine Science Tools</td><td>29008-01</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 엘라스토머</td><td>전자 현미경 과학</td><td>2423610</td><td>Sylgard 184</td></tr></tbody></table>

확인된 모터 뉴런을 위한 신경근육 정션에서 변경을 검출하기 위하여 drosophila 성인 다리의 해부 및 면역 조직 화학

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

Drosophila 멜라노가스터 는 신경 구조와 기능을 연구하는 유전적 인 학문 모델을 나타내며 질병 상태의 후속 변화. 잘 특징의 애벌레 신경 근육 접합은 종종 이러한 연구에 사용됩니다. 그러나, 급속한 애벌레 발달은 근위축성 측삭 경화증에서 생기는 것과 같이 느린 나이 의존적인 퇴행성 변경의 연구 결과에 대한 이 모형을 문제적으로 만드는 변성 도중 근육 조직분해 및 신경계 리모델링에 선행합니다. 또는 성인 파리는 90일 동안 살며 성인 다리는 성기 의 수명 동안 운동 신경 변화를 연구하는 데 사용할 수 있으며, 이는 큐티클을 통해 생체 내 형광화상 영상을 사용하여 사용된다. 여기에서, 우리는 확인된 성인 다리 운동 신경세포의 신경 근육 접합에 분자 변경의 연구를 허용하는 면역 세포화학과 결합된 다리 해부 기술을 기술합니다. 이러한 기술은 시냅스 전 및 시냅스 후 구조를 모두 라벨링하는 무수한 항체와 결합될 수 있다. 이러한 절차는 성인 파리의 느린 연령 의존 적 변화의 보다 완전한 특성을 허용하고 여러 운동 신경 질환 모델에 걸쳐 적용 될 수있다.

도 4 는 안티 hrp, 안티 dlg 및 phalloidin로 염색 된 메타토라시드 다리의 대표적인 예를 나타낸다. 대퇴골의 근위 부에서 표피를 제거하는 해부의 경우, 스테레오형 식목은 자동 불발성에 의해 쉽게 검출되는 힘줄 근처에서 명백해질 것이다. 다리에 항체 침투는 표절이 제거된 영역을 넘어 짧은 거리에서 발생합니다(도 4A). 이 지역은 강한 형광 신호가 존재할 때 효과적으로 심을 수 있다. 낮은 배율(2x 줌을 가진 20배)에서 이미징을 사용하면 1의 쉬운 측정을 허용하며, 해부 중에 손상이 발생했는지 여부는 2) 됩니다. 배율 증가(60x)는 틸름에 고정 고정 투영을 나타낸다(도 4B). 우리의 작품은 근위 대퇴골 (상자, 그림 4B 및 그림 4C)에서 틸름을 내면으로 하는 I-MN 혈통에서 파생 된 하나의 MN에 초점을 맞추고 있습니다. 배율을 더 증가시(2x 줌 100x)를 통해 시냅스 부톤의 효과적인 시각화를 가능하게 합니다(그림 4D).
시간이 지남에 따라 성인 NMJ에서 형태학적 변화를 연구하기 위해 이전에 는 ALS의 모델로 dsod1 돌연변이를 사용했습니다. 부톤 붓기는 dsod1nulland dsod1+ (그림 5A, B)에 비해 숙성 dsod1H71Y 돌연변이체에서 발생합니다. 애벌레 NMJ에서, 단클론 항체 NC82는 종종 활성 영역을 표지하는 데 사용되며 이러한 구조는 성인 NMJ (도 5C)에서 쉽게 시각화 될 수 있습니다. 약한 긍정적 인 HRP 축삭 가지는 dsod1H71Y 돌연변이체가 풍부하며 이러한 분기는 종종 BRP 지역화 (화살표)가 약하고 확산됩니다.
신경 변성에 중요한, 시판되는 항체는 골재에서 수시로 찾아낸 유비쿼터스단백질을 검출할 수 있고, 우리는 숙성돌연변이 dsod1 파리뿐만 아니라 근육 내의 MNs의 말단 축축 내의 유비쿼터티드 골재를 검출했습니다 (그림 6A). 또한, 미토콘드리아를 표지하는 항체는 또한 나이를 가진 형태학적 변화를 검출할 수 있다(도 6B).
일부 제제의 경우 해부 중 근육 손상으로 인해 샘플을 사용할 수 없게 됩니다. 처음에는 이러한 손상이 일반적일 수 있지만 연습과 함께 개선이 발생합니다. 좋은 해분의 예는 그림 7A, C 를 표시하고 불량 해부는 그림 7B, D에 표시됩니다. 불쌍한 해부는 위상 대비 현미경 검사법(도 7B) 또는 형광-컨쥬게이트 된 남근에 의해 시각화 된 누락 된 근육 섬유에 의해 검출된 바와 같이 근육 섬유의 해체를 일으킨다 (도 7D, 화살표). 근육에 라벨을 붙이기 위해 phalloidin을 사용하는 조합, 그리고 전달 된 빛 이미지는 해부 현미경에서 볼 때 명백하지 않을 수 있습니다 이러한 근육 손상을 감지하는 데 도움이 될 수 있습니다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62844/62844fig03.jpg"> 그림 3. 드로소필라 다리의 해부학. (A) 후방 쪽에 존재하는 눈에 띄는 벌거 벗은 큐티클과 는 대조적으로 강모의 존재를 특징으로하는 메타 토라시크 다리의 전방 측면의 다이어그램. 분할된 다리는 근교(Pr)에서 탈약(Di)에 이르는 콕사(Cx), 트로챈터(Tr), 대퇴골(Fe), 경골(Ti), 5타르탈 세그먼트(Ta1-5), 발톱(Cl)으로 구성됩니다. 대퇴골의 등쪽(D) 및 복부(V) 측면도 표시됩니다. 배율 막대 =100 μm. (B) 경골 레바이터(tilm), 경골 우울기(tidm), 긴 힘줄 근육 2(ltm2) 및 경골 환원기(tirm) 근육 및 축축 투영을 함유하는 대퇴골의 다이어그램이 틸름을 내면으로 휘둘린다. 이러한 고정 관념 축 축 프로젝션I-리니지 neuroblasts16에서 파생 될 것으로 추정 되며, 두 번째 중단은 해부 (박스)에 의해 액세스 하는 가장 쉬운. 스케일 바 = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62844/62844fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62844/62844fig04.jpg"> 그림 4. 해부 된 메타토라시 대퇴골은 틸름을 내면에 고정 된 MN 아키텍처를 공개했다. 면역 세포 화학신경 (HRP), 디스크 대형 (DLG) 및 근육 (phalloidin)을 표시하기 위해 사용되었다. Z-스택은 전체 대퇴골을 통해 공초점 현미경 이미징에 의해 포착되고 최대 시리즈 프로젝션으로 표시되었다. (A) 전염된 광 채널도 해부 중에 검출 가능한 근육 손상이 발생하지 않음을 설명하기 위해 포함되었다. 이미지는 20배율, 스케일 바 =50 μm로 촬영되었다. (B) 틸름(박스 면적, 중앙), 스케일 바 =20 μm과 관련된 수목을 확인; 및 (C) 60x 배율에서, 스케일 바 = 20 μm. (D) DLG 주변 의 boutons야생 형 동물에서 2 배 확대와 100 x 배율로 이미지 할 때 명백했다; 스케일 바 = 2 μm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62844/62844fig04large.jpg" target="_blank">이 그림을 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62844/62844fig05.jpg"> 그림 5. 다리 해부 기술을 사용하여 검출할 수 있는 bouton morphology에 있는 나이 의존적인 변경의 보기. 부톤 붓기는 노화 dsod1H71Y 돌연변이에서 볼 수 있습니다. (A) 젊은 (새로 폐쇄, 일 0 성인) 및 오래 된 (10 일) 파리, 스케일 바 = 1 μm에서 HRP 스테인드 boutons의 대표적인 이미지. (B) Bouton 크기는 ImageJ 내의 측정 기능을 사용하여 각 유전자형으로부터 정량화되었다. p&lt;0.0001 (후 Hoc 투키 테스트와 2 방향 ANOVA). (C) 단일 클론 항체 NC82 (항 브루치파일럿)로 표시된 시냅스 boutons 내의 활성 영역; 스케일 바 = 1 μm. 에서 수정 된 그림20<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62844/62844fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62844/62844fig06.jpg"> 그림 6. Drosophila 다리 준비에 사용 되는 신경 퇴행 성 질환과 관련 된 일반적인 마커. (A) 세포전 형량 화합은 종기 축삭과 숙성 dsod1H71Y 파리의 근육에서 검출된다. 항폴리비키틴(FK2)을 이용한 면역세포화학은 숙성된 dsod1H71Y/H71Y, 스케일 바 = 20 μm(왼쪽) 및 5 μm(오른쪽)에서 말크타(화살표)를 검출한다. (B) 부은 미토콘드리아는 항 ATP5A, 스케일 바 = 1 μm을 사용하여 검출될 수 있다. 에서 수정 된 그림20<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62844/62844fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62844/62844fig07v2.jpg"> 그림 7. 선하고 가난한 해부의 예. (A) 근본적인 근육 아키텍처를 방해하지 않은 해부. (B) 마모된 근육 섬유(arrow)를 보여주고 분석에 사용할 수 없었던 가난한 해부의 예. 두 샘플 모두 위상 대비 현미경 검사법에 의해 이미지화되었습니다. 스케일 바 = 50 μm. (C) HRP(녹색) 및 프할로이딘(blue)을 가진 공초점 현미경 검사법에 의해 이미지된 양해분의 예. (D) TILM 누락 (화살표)의 가난한 해부 누락 등쪽 근육 섬유. 스케일 바 = 50 μm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62844/62844fig07large.jpg" target="_blank">이 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>항체/얼룩</td>
			<td>희석*</td>
		</tr>
<tr>
<td>안티 ATP5A</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>안티 브루치파일럿 (nc82)</td>
			<td>1:20</td>
		</tr>
<tr>
<td>항 시스테인 문자열 단백질 (ab49)</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
<tr>
<td>디스크 방지 대형(4F3)</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
<tr>
<td>안티 hrp</td>
			<td>1:550</td>
		</tr>
<tr>
<td>폴리비비퀴틴 방지 (FK2)</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>안티리포지(8D12)</td>
			<td>1:5</td>
		</tr>
<tr>
<td>염소 항 마우스 이차 항체</td>
			<td>1:800</td>
		</tr>
<tr>
<td>파로딘</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>*5% NGS로 희석</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2. 항체 및 희석제. 이러한 연구에서 사용되는 항체의 상업적 공급 업체는 재료 목록에 나열되어 있습니다.

우리는 신경 근육 접합의 건축을 보존하고 성인 Drosophila 다리에 있는 운동 신경의 상세한 면역 세포화학 연구 를 가능하게 하는 해부 기술을 기술합니다.

확인된 모터 뉴런을 위한 신경근육 정션에서 변경을 검출하기 위하여 Drosophila 성인 다리의 해부 및 면역 조직 화학

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The ...

이 절차의 전반적인 목표는 Drosophila의 성인 다리에 대한 해부 방법을 설명하는 것입니다. 이 기술은 큐티클의 일부를 제거, 신경 및 근육 아키텍처를 보존 하는 방식으로 기본 조직을 노출. 이 절차는 우리가 표준 면역 세포 화학 기술을 사용하여 식별 된 운동 신경 식소에 대한 신경 근육 접합을 특성화 할 수 있습니다.해부는 비교적 오랜 기간 동안 발생하는 느린 퇴행성 변화의 연구에 특히 유용합니다. 시간 측면은 중요한 고려 사항입니다, Drosophila 애벌레의 잘 특징적인 신경 근육 접합은 변태의 개시 의 앞에 대략 5 7 일 동안 안정하기 때문에. 반대로, 성인 뉴런은 성인 비행의 일생 내내 존재하며, 야생 식, 실험실 에서 자란 드로소필라 멜라노가스터의 경우 약 90 일 동안 존재합니다.이 기술은 유연하며 상이한 질병 모델에 대한 다양한 유전자형에 적용될 수 있으며, 드로소필라에 사용할 수 있는 다양한 항체를 모델 시스템으로 활용한다. 이 절차의 전반적인 목표는 Drosophila의 성인 다리에 대한 해부 방법을 설명하는 것입니다. 이 기술은 큐티클의 일부를 제거, 신경 및 근육 아키텍처를 보존 하는 방식으로 기본 조직을 노출.페인트 브러시를 사용하여 유리 우물또는 접시에 차가운 메탄올로 파리를 약 30초에서 1분 동안 옮춥시다. 메탄올은 큐티큘러 탄화수소를 용해시키고, 파리는 수성 용액에 떠 다니기보다는 침수될 수 있습니다. 집게로 조심스럽게 PBS로 이동합니다.얼음 차가운 PBS에서 세 번 헹구어 과잉 메탄올을 제거하고 해부 및 고정 될 때까지 PBS에서 얼음에 파리를 유지합니다. 이 시점에서 파리는 가능한 가장 짧은 시간 내에 해부되고 고정되어야하며, 바람직하게는 30 분 이내에 고정해야합니다. 차가운 PBS로 채워진 실리콘 엘라스토머 해부 접시로 날아갑니다.5번 듀몬트 집게 2쌍을 사용하여 콕스의 메타토라시 다리를 제거하거나 반나스 가위로 다리를 자른다. 다리를 플라스틱으로 잘 옮기고, 24개의 웰 플레이트는 PBS 1마일로 채워져 있으며, 모든 다리가 제거되어 우물로 옮겨질 때까지 접시를 얼음 위에 보관합니다. 우리는 일반적으로 잘 당 20 다리를 사용합니다.PBS 솔루션을 1밀리리터 FA 솔루션으로 교체하고 30분 동안 누에이터에서 회전합니다. 누에이터 설정은 중간 속도로 설정됩니다. 이 시간 동안 다리가 용액에 완전히 침수되었는지 확인합니다.FA 용액을 제거하려면 1mil PBS에서 3번 빠르게 세척한 다음 1mil PBS에서 각각 5분 동안 3개의 세척을 추가합니다. 해부 단계 전과 중에 얼음 에 하나의 밀 PBS에 조직을 개최합니다. Drosophila 다리 해부학의 간략한 개요를 제공하기 위해, 다리 세그먼트는 coxa, 트로챈터, 대퇴골, 경골 및 5 개의 타르 살 세그먼트를 포함하여 표시됩니다.여기서 우리는 뒤쪽 쪽에 존재하는 벌거 벗은 표피와 는 반대로 감각 강모의 존재에 의해 인식 다리의 전방 보기를 볼 수 있습니다. 근위축축과 등쪽-복부축의 방향도 표시됩니다. 이 해부 절차는 근위 대퇴골에서 작은 표피 조각을 제거하여 경골 레바터 근육을 안쪽으로 내포하는 축삭 아버를 연구 할 수 있도록합니다.우리의 이전 작품은 추정 신경 아세포 눈 혈통에서 유래 표시 된 식소에 초점을 맞추고있다. 절차의이 부분에서, 우리는 대퇴골의 전방 측면에서 큐티클을 제거합니다. 해부 집게는 성공에 매우 중요하며, 5번 슈퍼 미세 포셉끝에 약간의 굴곡을 도입하면 큐티클을 피상적으로 잡을 수 있는 경사를 제공하여 조직을 망칠 수 있습니다.해부를 위해 PBS의 실리콘 엘라스토머 접시에 다리를 옮기습니다. 한 쌍의 집게를 사용하여, 오른쪽에 표시된 것처럼 실리콘 엘라스토머 접시에 경골 세그먼트를 고정합니다. 다른 집게를 사용하여 베벨 쪽을 아래로 잡고, 대퇴골의 말단 끝에 큐티클 조각을 잡고 트로 챈터를 향해 근위 방향으로 당깁니다.대퇴골의 근위 쪽 끝에 걸쳐 벌거 벗은 근육이 보일 때까지 체계적으로 큐티클을 제거하십시오. 모든 다리가 해부되면 PBS를 FA 솔루션으로 교체하여 중간 속도로 누두기를 흔들어 30 분 동안 다리를 포스트픽스하십시오. 그 후, 샘플을 1mil PBS에서 3배 빠르게 세척한 다음 PBT 용액에서 각각 5분 동안 세 번 세척합니다.조직을 차단하려면 1mil PBT를 PBT에서 희석한 1밀 5%일반 염소 세럼으로 구성된 블로킹 솔루션으로 교체하십시오. 해부된 다리를 실온에서 4시간 또는 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 차단 용액을 제거하고 차단 용액에서 희석된 1차 항체로 교체하십시오.여기서는 1~200개의 희석에 큰 디스크를 사용하고 있습니다. 접시를 셰이커에 다시 넣고 하룻밤 사이에 4도에서 배양하십시오. 1차 항체 배양에 이어, 1차 항체를 1mil PBT에서 3회 간 간략하게 세척한 다음 각각 15분 동안 3회 세척한다.실온에서 적어도 2 시간 동안 또는 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 한 공장에서 5 % 일반 염소 혈청에서 조직을 다시 차단하십시오. 차단 용액을 제거하고 적절한 희석 형광 공주 이차 항체의 300 마이크로 리터를 추가합니다. 또한, 1에 추가 2000 형광 컨쥬게이트 남근의 희석 근육 라벨.인큐베이션을 위해 실험실 밀봉 테이프와 뚜껑으로 우물을 밀봉하십시오. 또한 알루미늄 호일에 플레이트를 싸서 빛으로부터 형광을 보호합니다. 실온에서 6~8시간 또는 섭씨 4도에서 하룻밤을 배양합니다.언바운드 이차 항체를 제거하려면, 1차 항체를 세척할 때 이전에 설명한 유사한 방식으로 PBT로 세척을 수행한다. 이 단계를 마친 후 샘플을 장착하고 이미지화할 준비가 되었습니다. 다리를 앞쪽으로 위로 놓고 필요한 경우 추가 마운팅 미디어로 덮습니다.덮개의 모서리를 점토 공을 가로질러 부드럽게 긁어냅니다. 결과 점토는 슬라이드와 커버 슬립 사이의 스페이서 역할을하므로 조직이 분쇄되지 않습니다. 다리 의 상단에 닿을 때까지 덮개 슬립을 누릅니다.매니큐어로 가장자리를 밀봉하고 이미징까지 4도에 보관하십시오. 서면 프로토콜의 섹션 4에 설명된 이미징 매개 변수를 사용하여 공초점 현미경 검사법에 의한 이미지. 해부 프로토콜의 유효성을 검사하기 위해, 우리는 낮은 배율에서 위상 대비 현미경 검사법에 의해 먼저 다리를 이미지합니다.다음은 왼쪽에 좋은 해부의 패널 A에 대한 예이며, 근육 섬유가 중단된 오른쪽의 나쁜 해부입니다. 패널 C는 근육이 중단되지 않은 좋은 해부의 공초점 이미지를 보여줍니다. 대조적으로, 패널 D는 화살에 의해 표시된 대로 근육 섬유가 없는 해부 도중 손상된 다리를 보여줍니다.여기서, 우리는 항 고추냉이 과산화증을 가진 이미지된 다리를 염색하여 뉴런 과정을 검출하고, 여기에 녹색, 안티 디스크로 표시되어, 빨강으로 표시된 기둥 글루타민산 수용체 클러스터링을 용이하게 하고, 근육에 라벨을 붙이는 프할로이딘을 블루로 표시했습니다. 전송된 라이트 채널로 20X 배율로 캡처하면 해부된 영역을 쉽게 볼 수 있습니다. 항체는 부분적으로 훼손된 부위로 침투하며, 백색 화살표에 의해 표시된 대로 표피를 통해 볼 수 있다.각 다리 운동 뉴런은 근육을 내면으로 만들 때 고정 관념투영을합니다. 우리의 작품은 경골 레바터 근육을 내면으로 운동 뉴런에 초점을 맞추고, 여기에 박스 형 영역으로 표시하고 흰색 화살표로 표시. 오른쪽 상단에 2X 줌이 있는 더 높은 배율 60X에서는 녹색으로 표시된 부폰을 효과적으로 이미지화하고 빨간색으로 표시된 주변 DLG를 효과적으로 이미지할 수 있습니다.줌을 더 늘리거나 100X 목표로 단계적하면 오른쪽 아래와 같이 판튼 크기와 형태의 정량화를 할 수 있습니다. 면역 세포화학과 결합된 이 해부 기술을 사용하여, 우리는 화살표에 의해 표시된 야생 모형 통제에 비해, 노화 H71Y 다리에 여기에서 도시된 ALS의 sod1 돌연변이 모형에 있는 H 의존적인 bouton 팽윤이 있다는 것을 것을을 발견했습니다. 부튼 크기는 오른쪽에 꿀벌 떼 플롯에 정량화된다.우리는 또한 H71Y 돌연변이체의 녹색으로 표시된 약하게 염색된 HRP 축삭 내에서 빨간색으로 표시된 액티브 존 마커 Bruchpilot의 감소를 발견했습니다. 신경변성을 연구하기 위해, 유비퀴티드 단백질 응집체는 항체 FK2에 의해 종종 검출되고, FK2 양성 말장난으로 여기에 표시되고, 노화된 소드 H71의 축축악및 근육에서, 화살표로 표시된다. 마지막으로, 미토콘드리아는 경골 레바터 근 내의 빨간색으로 도시된 바와 같이 항 ATP5a 단일 클론 항체를 사용하여 면역 세포화학에 의해 시각화될 수 있다.우리는 미토콘드리아가 H71Y 돌연변이체의 나이로 확대된다는 것을 발견했습니다. 일단 마스터되면, 해부 된 다리 준비 및 관련 된 항체 염색 다양 한 시점에서 선호 하는 돌연변이에 대 한 성인 신경 근육 접합에서 분자 변화를 분석 할 수 있습니다.

dissection-immunohistochemistry-drosophila-adult-leg-to-detect

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연구

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신경과학

이 프로토콜은 해부하다하는 방법을...

Drosophila 애벌레 NMJ의 해부

이 프로토콜은 해부 Drosophila의 유충에 immunohistochemistry을 수행하는 방법을 보여줍니다.

Drosophila 애벌레 NMJ Immunohistochemistry

의 활성 영역의 해부 및 이미징 Drosophila 신경근육학 융티온

이 비디오는 초파리의 등쪽 종방향 근육에서 신경근 접합부의 구조적 무결성을 평가하기 위한 프로토콜을 보여줍니다. 이 절차에는 뉴런과 근육을 두 개의 서로 다른 항체로 염색하고 돌연변이 파리와 야생형 파리 사이의 형광 패턴을 비교하는 것이 포함됩니다. 돌연변이 파리에서 신경 염색의 감소는 근육 구조가 손상되지 않은 상태에서 신경 퇴행을 나타냅니다.

Drosophila에서 등쪽 종근 신경근 접합부의 구조적 무결성 평가

초파리 애벌레 수지상 arborization (다) 신경 세포를 사용하여 신경 세포의 형태 형성의 연구는 면역에 의해 신경 세포와 표피 단백질의 현장 시각화 혜택을 누릴 수 있습니다. 우리는 애벌레 몸 벽에서 근육 조직을 제거하여 다 신경 세포와 주변 표피 세포의 면역 형광 분석을 개선하는 절차를 설명합니다.

제거<em&gt; 초파리</em감각 뉴런과 표피 세포의 면역 형광 분석을위한 애벌레 필렛에서&gt; 근육 조직

이 연구는 후기 단계 -16 Drosophila melanogaster 배아의 운동 뉴런 예측을 시각화하기위한 표준 면역 조직 화학 법을 상세히 설명합니다. FasII 항체로 염색 된 고정 배아의 필렛 된 준비는 신경 발달 중에 모터 축삭 돌연변이 및 표적인지에 필요한 유전자를 특성화하는 강력한 도구를 제공한다.

배아 운동 뉴런의 Axonal 투영 패턴의 시각화<em&gt; Drosophila</em

여기에 우리는 세 번째 instar 애벌레의 neuromuscular 접합 (NMJ)에서 모터 뉴런의 신경 퇴화를 시각화하고 계량하기 위해 초파리 유충의 분절 신경을 손상시키는 간단하고 널리 액세스 할 수있는 방법을 설명합니다.

학습 할 간단한 신경계 상해 방법론<em&gt; Drosophila</em&gt; 모터 뉴런 변성

여기는 고정, 설치, 영상, 및 후 이미징 단계 초파리 의 성인 다리에 형광 단백질 axonal 대상으로 시각화 하는 프로토콜에 설명 합니다.

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우리는 친유성 형광 염료를 사용하여 Drosophila 배아 운동 뉴런의 역행 추적방법을 기술한다.

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이 절차의 목표는 Drosophila melanogaster를사용하여 신경 퇴행성 질환 모델에서 DLM 신경 근육 접합 (NMJs)의 구조적 무결성을 평가하기 위해 등쪽 세로 근육 (DLM) 조직을 해부하는 것입니다.

신경변성과 관련하여 성인 Drosophila에서 시냅스 퇴성을 시각화

여기에서는 신경근 접합부와 근육 세포의 미세소관 네트워크를 시각화하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. Drosophila melanogaster의 강력한 유전 도구와 결합된 이 프로토콜은 신경계에서 미세소관 네트워크 조절 단백질의 역할에 대한 유전자 스크리닝 및 미세소관 역학 분석을 크게 용이하게 합니다.

초파리 유충 신경근 접합부 및 근육 세포를 사용하여 미세소관 네트워크 시각화

배우세요 Drosophila 성인 다리 해부 및 면역 조직 화학 기법을 사용하여 신경근육 정션의 구조를 보존하고 운동 뉴런의 퇴행성 변화를 장기간 추적하는 방법을. 이 기법은 다양한 유전형 질병 모델 연구에 활용됩니다.

확인된 모터 뉴런을 위한 신경근육 정션에서 변경을 검출하기 위하여 Drosophila 성인 다리의 해부 및 면역 조직 화학

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