Name: RNA 압타머 및 리보스위치를 인코딩하는 DNA 플라스미드가 로딩된 다기능 실크 기반 마이크로캡슐의 제조 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: 학습하세요 실크 섬유소 마이크로캡슐을 이용한 DNA 플라스미드 고정화 기술로 RNA 압타머 및 리보스위치 기능을 유지하는 방법을. 이 생체적합 바이오센서는 다중 리간드 감지와 유전자 활성화 동역학 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 공군 과학 연구실의 LRIR 16RH3003J 보조금과 미국 국방부 연구 및 공학 차관실의 ARAP (Synthetic Biology for Military Environments Applied Research for the Advancement of S & T Priorities) 프로그램의 지원을 받았습니다.
ThyRS에 대한 플라스미드 벡터 서열(pSALv-RS-GFPa1, 3.4kb)은 J. Gallivan 박사에 의해 아낌없이 제공되었습니다. Bombyx mori 의 누에 고치는 매사추세츠주 터프츠 대학교의 D.L. Kaplan 박사가 아낌없이 기증했습니다.

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여기에 제시된 견해와 의견은 저자의 견해이며 반드시 DoD 또는 그 구성 요소의 견해를 나타내는 것은 아닙니다

다양한 유형의 DNA-인코딩된 센서 설계로 로딩된 선택적 투과성 하이드로겔 마이크로캡슐은 이 프로토콜에 따라 제조될 수 있다. LbL 접근법의 특징 중 하나는 상향식 조립 동안 마이크로 캡슐의 복잡성을 조정할 수 있다는 것인데, 이는 일반적으로 희생 템플릿에 분자 종의 흡착으로 시작됩니다. 초기 성분의 농도, pH 조건 및 층수를 조심스럽게 조절함으로써, 상이한 DNA 로딩 파라미터, 기능성 및 조정 가능한 투과성을 갖는 마이크로캡슐을 제조할 수 있다23. 캡슐의 다용성을 증폭시키기 위해, AuNPs 및 IgG를 이용한 쉘 표면의 추가 기능화가 달성될 수 있으며, 생체 내 진단을 위한 생체 적합성 센서 캐리어를 구현할 수 있다. 이 두 가지 대체 경로는 모두 실크 피브로인의 독특한 분자 구조에 의존합니다. Au3+ 이온의 계내 환원은 최적의 환원 완충액의 존재 하에서 금속 이온을 환원시킬 수 있는 티로신 잔기(5.3% mol.)의 존재로 인해 달성될 ...

합성 생물학 분야는 미생물에 의해 진화된 자연적 메커니즘을 활용하여 환경과 잠재적 위협을 모니터링함으로써 감지 기능을 개발할 수 있는 독특한 기회를 제공합니다. 중요하게도, 이러한 감지 메커니즘은 일반적으로 이러한 미생물을 유해한 노출로부터 보호하고 유전자 발현을 조절하여 부정적인 영향을 완화하거나 독성 물질의 섭취를 방지하는 반응과 관련이 있습니다. 이러한 자연 반응을 활용하지만 새로운 표적을 인식하거나 정량화 목적으로 측정할 수 있는 측정 가능한 신호(일반적으로 형광)를 생성하도록 방향을 바꾸도록 전체 세포 센서를 만들기 위해 이러한 미생물을 설계하려는 상당한 노력이 있었습니다1,2. 현재, 유전자 변형 미생물(GMO)의 사용에 대한 우려, 특히 환경이나 인체에서 방출될 때, 전체 세포 또는 일부 유전 물질의 누출로 인해, 폴리머 매트릭스에 캡슐화되어 있더라도 이러한 감지 접근법을 활용하기 위한 대안적인 방법이 필요함을 시사한다3.
GMO 배포에 대한 걱정 없이 미생물 기반 감지의 이점을 활용하는 강력한 접근 방식은 체외 전사/번역(IVTT) 시스템을 사용하는 것입니다. 실용적인 관점에서 IVTT 시스템은 초음파 처리, 비드 박동 또는 기타를 포함한 다양한 수단으로 세포에서 "추출"된 활성 상태의 대부분의 세포 구성 요소를 포함하는 혼합물로 구성됩니다4. 이 공정의 최종 산물은 전사 및 번역을 수행하도록 이미 최적화된 생화학 반응 혼합물로, 전체 세포 사용과 관련된 제약 없이(막 확산, 형질전환 효율, 세포 독성 등) "개방형 용기" 형식으로 다양한 센서를 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 중요한 것은, 서로 다른 센서 구성 요소를 정량적으로 추가할 수 있고, 우리가 설명한 바와 같이 서로 다른 광학 및 분광 기술로 그 효과를 연구할 수 있다는것입니다 5. IVTT 시스템의 성능이 일관되지 않을 수 있음이 밝혀졌습니다. 그러나 최근 연구에서는 준비 및 특성화를 표준화하는 접근 방식을 보여주었으며, 이는 센서 설계6에서 성능을 연구할 때 큰 도움이 됩니다. 최근에, 중금속 이온, 약물, 정족수 감지 요소및 기타의 검출을 포함하여, 종이 매트릭스에서 그 성분들의 동결건조를 통해 종이-기반 분석법을 생성하기 위해 사용되는 IVTT 시스템의 많은 예들이 입증되었다 7,8,9. IVTT 기반 센서의 흥미로운 응용 분야는 토양, 물, 인체를 포함한 다양한 유형의 환경에서 감지 응용 분야에 사용된다는 것입니다. 이러한 IVTT 시스템을 이러한 까다로운 환경에 배포하려면 IVTT 구성 요소를 포함하고 성능 저하로부터 보호하기 위한 캡슐화 접근 방식을 구현해야 합니다.
IVTT 시스템에 대한 가장 일반적인 캡슐화 접근법은 지질 캡슐, 미셀, 폴리머솜 및 기타 밀접하게 밀폐된 마이크로컨테이너(10,11,12)의 사용을 포함한다. 이 접근 방식의 한 가지 단점은 외부 환경과의 통신을 허용하고 감지 기능을 제공하기 위해 컨테이너 안팎으로 재료를 운반하기 위해 수동 또는 능동 메커니즘을 통합해야 한다는 것입니다. 이러한 문제 중 일부를 극복하기 위해 이 연구에서는 IVTT 시스템에서 표현할 다양한 센서 설계에 대한 인코딩 재료를 캡슐화하는 간단하면서도 효과적인 접근 방식을 제공하는 방법을 보고합니다. 이 접근법은 관심 플라스미드의 존재 하에 바이오폴리머의 층별(LbL) 증착을 사용하여 높은 다공성을 가진 중공 마이크로캡슐을 생성함으로써 보호된 유전 물질이 선택한 IVTT의 다양한 구성 요소와 상호 작용할 수 있도록 합니다. 이 연구는 캡슐화된 플라스미드가 플라스미드 인코딩된 앱타머 및 해당 표적에 대한 리보스위치의 반응에서 볼 수 있듯이 이 고분자 매트릭스 내에서 활성화될 때 전사 및 번역을 지시할 수 있음을 입증했습니다. 또한 이 LbL 코팅은 특별한 보관 조건 없이 몇 달 동안 플라스미드를 보호합니다.

<table><tbody><tr><td>(Z)-4-(3,5-디플루오로-4-하이드록시벤질리덴)-2-메틸-1-(2,2,2-트리플루오로에틸)-1H-이미다졸-5(4 H)-온 (DFHBI-1T)</td><td>Lucerna</td><td>DFHBI-1T</td><td></td></tr><tr><td>5x T4 DNA 리가제 완충액</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>46300-018</td><td></td></tr><tr><td>6x 블루 겔 로딩 염료</td><td>New England BioLabs</td><td>B7021S</td><td></td></tr><tr><td>96웰 플레이트, 검은색 원형</td><td>Corning</td><td>3601</td><td></td></tr><tr><td>아가로스</td><td>시그마-알드리치</td><td>A9539</td><td>바이오 시약, 분자 생물학용, 낮은 EEO</td></tr><tr><td>암피실린 나트륨 염</td><td>시그마-알드리치</td><td>A0166</td><td>분말 또는 결정, 세포 배양</td></tr><tr><td>BlpI 제한 효소</td>에 적합한 바이오 시약 <td>뉴잉글랜드 BioLabs</td><td>R0585S</td><td></td></tr><tr><td>코닝 일회용 진공 필터/저장 시스템</td><td>FisherScientific</td><td>09-761-1</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭 사이드, DMSO</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>472301</td><td>ACS 시약, &ge; 99.9%</td></tr><tr><td>DNA 플라스미드, pET28c-F30-2x 브로콜리 (5.4 kb), BrocApt.</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #66788</td><td></td></tr><tr><td>DyLightTM550 항체 라벨링 키트(Invitrogen)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>84530</td><td></td></tr><tr><td>원형 DNA용 E. coli S30 추출물 시스템</td><td>Promega</td><td>L1020</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Conical 원심분리기 튜브, 15 mL</td><td>FisherScientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 원추형 원심분리기 튜브, 50 mL</td><td></td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 마이크로 원심분리기 튜브, 1.5mL</td><td>FisherScientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>불화수소산, HF</td><td>시그마-알드리치</td><td>695068</td><td>ACS 시약, 48%</td></tr><tr><td>카나마이신 황산염</td><td>시그마-알드리치</td><td>60615</td><td>카나마이신 A(주성분) 및 카나마이신 B 및 C</td></tr><tr><td>KpnI 제한 효소</td><td>혼합물 New England BioLabs</td><td>R0142S</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro로 보충된 LB 한천 플레이트; g / mL 암피실린</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5667</td><td>100 &micro로 미리 주입 된 한천 플레이트; g/mL 암피실린</td></tr><tr><td>LB 한천 플레이트에 50 &micro 보충; g / mL 카나 마이신</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>L0543</td><td>50 &micro와 사전 부어 한천 플레이트; g/mL 카나마이신</td></tr><tr><td>LB 국물(레녹스 등급)</td><td>시그마-알드리치</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>리튬 브로마이드, LiBr</td><td>시그마-알드리치</td><td>213225</td><td>시약플러스, &ge; 99%</td></tr><tr><td>Max 효율 DH5-&alpha; 유능한 대장균 균주</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18258012</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>MilliporeSigma</td><td>322415</td><td>무수, 99.8%</td></tr><tr><td>MilliQ-water</td><td>EMD MilliPore</td><td></td><td>Milli-Q 기준 정수 시스템</td></tr><tr><td>MinElute PCR 정제 키트</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td></td></tr><tr><td>N-(3-디메틸아미노프로필)-N&prime;-에틸카르보디이미드 염산염, EDC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1769</td><td></td></tr><tr><td>PBS(인산염 완충 식염수)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010023</td><td>1x PBS, pH 7.4</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌이민, 분지형</td><td>시그마-알드리치</td><td>408727</td><td>평균 Mw ~25,000</td></tr><tr><td>PURExpress In Vitro 단백질 합성 키트</td><td>New England BioLabs</td><td>E6800S</td><td></td></tr><tr><td>QIAEX II 젤 추출 키트</td><td>Qiagen</td><td>20021</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>&nbsp; 27104</td><td></td></tr><tr><td>퀵로드 2-Log DNA 사다리 (0.1-10.0 kb)</td> <td>New England BioLabs</td><td>N0469S</td><td></td></tr><tr><td>SiO? 실리카 마이크로 스피어, 4.0 &micro; m</td><td>폴리사이언스, Inc.</td><td>24331-15</td><td>10% 수용액</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer G2 투석 카세트, 3.5K MWCO, 15 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>87724</td><td></td></tr><tr><td>탄산나트륨, Na?CO?</td><td>시그마-알드리치(Sigma-Aldrich</td><td></td>) <td>222321 ACS 시약, 무수, &ge; 99.5%, powder</td></tr><tr><td>Spectrum Spectra/Por Float-A-Lyzer G2 투석 장치</td><td>FisherScientific</td><td>08-607-008</td><td>Spectrum G235058</td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA gel stain</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase (5 U/&micro; L)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>테오필린</td><td>시그마-알드리치</td><td>T1633</td><td>무수, &ge; 99 %, 분말</td></tr><tr><td>트리스 아세테이트 -EDTA 완충액 (TAE 완충액)</td> <td>시그마 알드리치</td><td>T6025</td><td>40 mM 트리스 아세테이트 및 1 mM EDTA, pH 8.3을 포함합니다.</td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase-Free 증류수</td><td>FisherScientific</td><td>10-977-023</td><td></td></tr><tr><td>ZymoPURE II 플라스미드 MaxiPrep 키트</td><td>ZymoResearch</td><td>D4202</td><td></td></tr></tbody></table>

rna 압타머 및 리보스위치를 인코딩하는 dna 플라스미드가 로딩된 다기능 실크 기반 마이크로캡슐의 제조

Preparation of Multifunctional Silk-Based Microcapsules Loaded with DNA Plasmids Encoding RNA Aptamers and Riboswitches

우리는 희생 구형 코어에서 층별(LbL) 조립 방법을 통해 DNA가 함유된 실크 피브로인 마이크로캡슐을 제조하기 위한 프로토콜을 소개합니다. 프라임층 및 DNA 플라스미드의 흡착에 이어, 단일 실크층의 급성 탈수 동안 실크 2차 구조에서 β-시트를 유도함으로써 견고한 마이크로캡슐의 형성을 촉진하였다. 따라서 층상은 다중 수소 결합과 소수성 상호 작용을 통해 발생했습니다. 다층 쉘의 흡착 시, 코어-쉘 구조는 원격 감지 및/또는 표적 전달에 사용되는 금 나노입자(AuNP) 및/또는 항체(IgG)로 추가로 기능화될 수 있습니다. 폴리머 프라이머의 존재, DNA 및 실크 단백질의 농도, 다수의 흡착된 층과 같은 실리카 코어에 주요 거대분자를 순차적으로 증착하는 동안 몇 가지 주요 매개변수를 조정하면 다양한 투과성 및 DNA 로딩을 갖는 생체 적합성, DNA 함유 마이크로캡슐이 생성되었습니다. 실리카 코어의 용해 시, 프로토콜은 캡슐 멤브레인의 내부 표면에 고정된 DNA 플라스미드를 갖는 중공 및 견고한 마이크로캡슐의 형성을 입증하였다. DNA 플라스미드와 외부 환경 사이에 선택적으로 투과할 수 있는 생체적합성 막을 만들어 장기 보관 시 DNA를 보존하고 공간적으로 제한된 플라스미드의 출력 반응을 개선하는 데 중요한 역할을 했습니다. DNA 템플릿의 활성과 접근성은 시험관 내 전사 및 번역 반응(cell-free system) 동안 테스트되었습니다. RNA 라이트업 앱타머 및 리보스위치를 암호화하는 DNA 플라스미드는 쉘 막에서 형광 표지된 RNA 전사체 또는 GFPa1 단백질의 국소화 중에 시각화된 바와 같이 해당 분석물과 함께 성공적으로 활성화되었습니다.

여기에서 이 연구는 실크 단백질 캡슐에 캡슐화한 후 다양한 센서 디자인(두 가지 유형의 RNA 조절 전사/번역 요소)을 인코딩하는 DNA 템플릿의 기능을 다룹니다. 마이크로캡슐은 주요 구성 요소인 프라임층, 센서 설계를 인코딩하는 DNA 플라스미드 및 실크 피브로인 바이오폴리머의 템플릿화된 층별(LbL) 조립을 통해 제조되었습니다(그림 2). 층상 방식으로 거대분자를 증착하면 흡수된 층과 쉘 두께 사이의 분자간 및 분자내 상호작용을 기반으로 캡슐막의 투과성을 제어할 수 있습니다. 시스템의 조정 가능한 투과성은 캡슐 막(20)을 통한 크고 바람직하지 않은 거대분자의 확산을 제한하면서 필수 분자의 확산을 제어할 수 있는 잠재력을 제공했습니다.
수화 상태에서 크기가 균질하고 껍질 두께가 ~500nm(20층)인 견고한 실크 피브로인 마이크로캡슐은 프로토콜을 적절하게 따를 때 생산할 수 있습니...

이 프로토콜은 여러 리간드를 추적할 수 있는 다중화된 시험관 내 바이오센서로서 견고하고 생체적합성 DNA가 함유된 마이크로캡슐의 형성을 설명합니다.

RNA 압타머 및 리보스위치를 인코딩하는 DNA 플라스미드가 로딩된 다기능 실크 기반 마이크로캡슐의 제조

We introduce a protocol for the preparation of DNA-laden silk fibroin microcapsules via the Layer-by-Layer (LbL) assembly method on sacrificial spherical ...

이 프로토콜의 중요성은 DNA 플라스미드 템플릿을 반투과성 생체 적합성 마이크로캡슐로 고정시켜 DNA로 인코딩된 센서의 기능을 유지하는 수단을 제공한다는 것입니다. 제안된 DNA 고정화 기술은 다재다능합니다. 이를 통해 다양한 체외 활성화 메커니즘을 가진 다기능 바이오센서를 제작할 수 있습니다.우리는 적절한 감지 요소와 결합된 이러한 마이크로캡슐이 생물막 및 장기와 같은 다양한 환경에서 신호 분자의 방출을 포함하여 다양한 생물학적 과정을 연구하는 데 사용될 수 있을 것으로 예상합니다. 이 기술은 미시적 규모에서 생물학적 시스템, 특히 DNA의 고정화 및 분자 군집화가 유전자 활성화의 동역학 및 메커니즘에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 2밀리리터 마이크로원심분리기 튜브에 있는 300마이크로리터의 마이크로입자에 1밀리리터의 폴리에틸렌이민 용액을 첨가하여 희생 실리카 또는 SiO2 마이크로입자에 폴리에틸렌이민 프라임 층을 증착하는 것으로 시작합니다.주변 조건에서 ThermoMixer에서 분당 800회 회전으로 혼합물을 교반합니다. 미립자를 실온에서 0.2g으로 1분간 원심분리하여 채취한 후, 조심스럽게 상층액을 제거한다. 15분 후, 실온에서 0.2g의 원심분리를 통해 1ml의 DNase 및 RNase-free 탈이온수로 미립자를 4회 세척하고 각 원심분리 후 상등액을 버립니다.다음으로, DNase 및 RNase가 없는 증류수로 DNA 플라스미드의 농도를 마이크로리터당 50-200나노그램으로 조정하고, 준비된 용액 1ml를 사용하여 폴리에틸렌이민 프라이밍된 미립자에 DNA를 증착합니다. ThermoMixer에서 섭씨 4도 및 800rpm에서 15분 동안 미세 입자 혼합물을 부드럽게 교반한 다음 0.2g에서 1분 동안 원심분리하여 미세 입자를 수집합니다. GFPa1을 ThyRS-GFPa1로 결합하고 Broccoli aptamer를 BrocApt로 인코딩하는 DNA 플라스미드를 테오필린 리보스위치로 인코딩하는 DNA 플라스미드를 튜브에 표시합니다.상층액을 조심스럽게 제거하고 이전에 시연된 바와 같이 1ml의 DNase 및 RNase가 없는 증류수로 미립자를 4회 세척하고 각 원심분리 후 상등액을 버립니다. 실크 피브로인 층을 증착하기 위해 DNA 흡수 미립자에 1ml의 재구성된 수성 실크 피브로인 용액을 첨가하고 ThermoMixer에서 750rpm으로 섭씨 10도에서 15분 동안 혼합물을 부드럽게 와류로 교반합니다. 원심분리로 미립자를 모은 다음 앞에서 설명한 대로 1ml의 DNase 및 RNase가 없는 증류수로 한 번 세척합니다.원심분리를 반복하고 상층액을 버립니다. 0.5ml의 DNase 및 RNase 증류수를 넣고 와류로 미세 입자를 혼합합니다. 그런 다음 ThermoMixer에서 섭씨 10도에서 5분 동안 0.5ml의 100% 메탄올로 미립자를 처리합니다.원심분리를 통해 미세입자를 포집한 후, 베타 시트 형성을 위해 섭씨 10도에서 10분 동안 분당 750회 회전하면서 ThermoMixer에서 입자를 100% 메탄올로 처리합니다. 혼합물을 섭씨 4도에서 1분 동안 0.2g으로 원심분리하여 미립자를 수집한 후 앞에서 설명한 바와 같이 1ml의 DNase 및 RNase가 없는 증류수로 입자를 두 번 세척합니다. 펠릿 코어 쉘 미립자에 8% 불화수소산 용액을 첨가하여 미세입자의 SiO2 코어를 용해시킵니다.용해된 입자 용액을 투석 장치로 옮기고 비커에서 탈이온수에 대해 투석합니다. 그런 다음 1ml 피펫을 사용하여 투석 장치의 실크 마이크로캡슐 현탁액을 새로운 2ml 마이크로 원심분리기 튜브로 수집합니다. 100마이크로리터의 마이크로캡슐 샘플을 8웰 챔버 유리 슬라이드의 단일 웰로 옮기고, 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)을 사용하여 이미징하기 전에 캡슐이 20-30분 동안 침전되도록 합니다.피펫 100 마이크로 리터의 캡슐을 챔버 유리 슬라이드의 각 웰에 현탁액. 각 웰에 가장 낮은 것부터 가장 높은 것까지 다양한 분자량을 가진 300마이크로리터의 형광단 용액을 순차적으로 첨가합니다. 위아래로 피펫팅하여 혼합물을 혼합하고 형광단 용액의 확산이 평형에 도달할 때까지 실온에서 1시간 동안 혼합물을 배양합니다.나중에 슬라이드를 CLSM으로 전송하여 488나노미터의 여기 파장에서 100x 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용하여 각 웰을 이미지화합니다. 초점면을 조정하여 관심 영역을 식별하고 가장 큰 직경의 원 형태로 나타나는 캡슐에 초점을 맞춥니다. cell-free 성분을 마이크로캡슐 샘플에 순차적으로 첨가하고 튜브를 섭씨 30도에서 4시간 동안 배양하여 체외 전사/번역 반응을 수행합니다.488나노미터의 여기 파장과 약 510나노미터의 GFP/FITC 필터 방출을 사용하여 플레이트 리더에서 형광을 확인합니다. 마지막으로, 488 및 561 나노미터의 레이저를 사용하여 CLSM 시스템에서 실크 마이크로캡슐을 이미지화합니다. 이 연구에서는 약 4.5마이크로미터의 균일한 크기와 약 500나노미터의 쉘 두께를 가진 견고한 실크 피브로인 마이크로캡이 생산되었습니다.중공 실크 피브로인 캡슐 쉘의 투과성은 분자량 차단 방법에 따라 분석되었습니다. 폴리에틸렌이민 프라임 층의 농도가 증가하면 투과성이 더 높은 쉘을 가진 마이크로캡슐의 콜로이드 안정성이 증가하고, 프라임 층을 제거하면 투과성이 낮은 쉘 멤브레인을 가진 캡슐의 응집이 발생합니다. ThyRS 활성화 중 GFPa1 발현 동역학은 캡슐화되지 않은 DNA를 대조하는 것보다 실크 마이크로캡슐에 적재된 DNA 플라스미드에서 GFPa1 유전자 활성화가 더 높다는 것을 보여주었습니다.대표적인 분석에서는 in vitro transcription, translation system에서 인큐베이션 전후에 캡슐당 32개의 DNA copy가 적재된 silk fibroin 캡슐의 CLSM 이미지가 표시됩니다. 실크 피브로인 캡슐의 단면 강도 프로파일은 GFPa1의 발현을 입증했습니다. 캡슐당 30개의 DNA 사본이 적재된 20개의 층상 실크 마이크로캡슐의 전사 동역학을 대조군 비캡슐화 DNA와 비교했습니다.등가 농도의 캡슐화되지 않은 DNA 샘플보다 실크 마이크로캡슐의 더 높은 출력 신호는 실크 마이크로캡슐의 효과를 확인했습니다. 이 프로토콜에 따라 여러 고해상도 현미경 기술을 적용하여 고정되지 않은 상태의 이미지 DNA 얽힘과 체외에서 분리된 유전자 활성화 과정에 적용할 수 있습니다. 이 기술은 최소한의 인공 세포에서 분자 수준의 역학에 응답하는 데 적용할 수 있습니다.특히, 적절한 유전자 요소와 결합하면 마이크로캡슐을 사용하여 세포 간 통신을 연구할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

세포의 빠른 기계적인 변형은 고분자 나노 물질의 세포 내 전달을위한 약속, 벡터없는 방법으로 떠오르고있다. 이 프로토콜은 다양한 애플리케이션을 위해 시스템을 사용하는 방법에 대한 자세한 정보를 제공.

강력한, 미세 유체 세포 내 전달 플랫폼으로 휴대 뒤쪽에서

배달은 작은 간섭 RNA (siRNA의)의 치료 구현을위한 주요 과제로 남아. 이 프로토콜은 아르기닌 및 폴리에틸렌 이민 다공성 실리콘 그래프트 미립자로 구성된 다기능 및 생체 적합성의 siRNA 전달 플랫폼의 사용을 포함한다.

siRNA를 치료제의 전달을위한 다공성 실리콘 미세 입자

우리는 광 반응성 블록 공중 합체를 사용하는 새로운 방법을 제시한다.이 방법은 검출 불가능한 오프 - 타겟 효과없이 유전자 침묵을보다 효율적으로 공간적으로 제어 할 수있다. 또한 유전자 발현의 변화는 간단한 siRNA 방출 분석 및 간단한 운동 모델링을 사용하여 예측할 수 있습니다.

광 반응성 고분자 나노 캐리어로부터의 siRNA 방출의 시공간 조절을 통한 유전자 침묵 예측

여기 우리가 드라이 필름 방식에 기반 하 고 안전에 대 한 사용할 수 있습니다 양이온 nanoliposomes의 생성에 대 한 프로토콜을 설명 하 고 효율적인 전달 체 외에 문자 메신저 RNA.

체 외에서 의 효율적인 배달 양이온 Nanoliposomes의 세대 문자 메신저 RNA

이 작품은 가역적 첨가 단편화 사슬 전달(RAFT) 방법을 통해 메티오닌 기능화된 생체 적합성 블록 공중합체(mBG)의 제조를 제시한다. 얻어진 mBG및 이들의 형질감염 효율의 플라스미드 DNA 복합성도 조사되었다. RAFT 방법은 특수 작용기 포함 단량체를 중합하는 데 매우 유용합니다.

표적 플라스미드 DNA 전달을 위한 메티오닌 기능화 생체 적합성 블록 공중합체

여기, 키토 산 천연 양이온 다 당 류 및 합성 선형 polyethyleneimine (LPEI) 코팅을 사용 하 여 Mg 고갈 및 nuclease 리치 미디어에서 DNA 종이 접기 nanostructures의 보호를 위한 프로토콜 제공 됩니다.

유전자 치료 DNA 종이 접기 Nanostructures의 보호를 위한 Polycation 코팅을 영감

우리는 효과적인 생체 외에서 그리고 vivo에서 oligonucleotide 배달 fusogenic 다공성 실리콘 나노 입자의 합성을 보여 줍니다. 다공성 실리콘 나노 껍질을 형성 하기 위하여 압출을 통해 fusogenic 지질에 의해 코팅은 핵심을 형성 하는 siRNA와 함께 로드 됩니다. 타겟팅 moiety 기능화 및 입자 특성화 포함 되어 있습니다.

합성과 기능화, Oligonucleotide 배달에 대 한 Fusogenic 다공성 실리콘 나노 입자의 특성

우리는 시험관 내 전사 반응을 조절하기 위해 새로운 DNA 테더T7 RNA 폴리머라제의 엔지니어링을 설명합니다. 우리는 단백질 합성 및 특성화를 위한 단계를 논의하고, 개념 증명 전사 적 조절을 검증하며, 분자 컴퓨팅, 진단 및 분자 정보 처리에 대한 응용 분야에 대해 논의합니다.

시험관 내 전사 및 분자 계산을 위한 DNA 테더드 RNA 폴리머라제

여기서, 폴리(베타 아미노에스) 폴리머를 기반으로 mRNA 나노입자를 제조하기 위한 간단한 프로토콜이 제시되고, 캡슐화된 mRNA를 변경하여 맞춤화되기 쉽다. 중합체, 나노입자 및 체외 필수 특성화를 합성하기 위한 워크플로우도 설명되어 있습니다. 예방 접종에 관한 개념 증명도 추가됩니다.

mRNA로 로드된 폴리(베타 아미노에스) 나노입자의 합성 및 특성화

우리는 구성 DNA 올리고뉴클레오티드에서 시작하여 양친매성 DNA 나노스타로 구성된 합성 생체 분자 응축물을 제조하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 응축물은 단일 nanostar 구성 요소 또는 두 가지 구성 요소로 생성되며 내장된 DNA 템플릿에서 RNA의 시험관 내 전사를 유지하도록 변형됩니다.

양친매성 DNA 나노 구조의 합성 응축물 및 세포와 같은 구조

여기에는 누에 Bombyx mori 유충에서 키토산/dsRNA 나노입자 전달을 통해 유전자 침묵을 유도하기 위한 프로토콜이 제시되어 있습니다.

키토산/dsRNA 나노입자 전달을 통한 누에 Bombyx mori 의 유충 RNA 간섭

학습하세요 실크 섬유소 마이크로캡슐을 이용한 DNA 플라스미드 고정화 기술로 RNA 압타머 및 리보스위치 기능을 유지하는 방법을. 이 생체적합 바이오센서는 다중 리간드 감지와 유전자 활성화 동역학 연구에 활용됩니다.

RNA 압타머 및 리보스위치를 인코딩하는 DNA 플라스미드가 로딩된 다기능 실크 기반 마이크로캡슐의 제조

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