Name: 생체 안전 수준 3 (BSL-3) 조건 하에서 병원체 감염 및 단일 세포 염기서열분석에 대한 위장 오르가노이드 적응 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: 배우세요 BSL-3 조건에서 단일 세포 RNA 시퀀싱을 활용한 인간 장 오르가노이드 바이러스 감염 프로토콜. 이 방법은 숙주-병원체 상호작용을 단일 세포 수준에서 연구하는 데 필수적입니다.

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메건 스타니퍼와 스티브 불란트는 도이치 포르스충스게마인샤프트(DFG)의 연구 보조금으로 지원되었다: (프로젝트 번호 240245660, 278001972, 415089553, 272983813 베이브 불란트와 메건 스타니퍼로 416072091), 바덴뷔르템베르크 와 분데스장관 빌둥 und Forschung BMBF 01KI20239B와 MS 및 01KI20198A 및 (NUM-COVID 19, 오가노-0 Strat1KX201) 바이오 프로틱스에 설립되었다.

<ol><li>Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids%3A+Modeling+development+and+the+stem+cell+niche+in+a+dish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Organoids: Modeling development and the stem cell niche in a dish.</a> Developmental Cell. 38, 590-600 (2016).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li>
<li>Tekes, G., Ehmann, R., Boulant, S., Stanifer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+feline+ileum-+and+colon-derived+organoids+and+their+potential+use+to+support+feline+coronavirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Development of feline ileum- and colon-derived organoids and their potential use to support feline coronavirus infection.</a> Cells. 9, (2020).</li>
<li>Derricott, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+a+3D+intestinal+epithelium+model+for+livestock+species%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Developing a 3D intestinal epithelium model for livestock species.</a> Cell and Tissue Research. 375, 409-424 (2019).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+bat+and+human+intestinal+organoids+by+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Infection of bat and human intestinal organoids by SARS-CoV-2.</a> Nature Medicine. 26, 1077-1083 (2020).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell%3A+mechanism+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340, 1190-1194 (2013).</li>
<li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470, 105-109 (2011).</li>
<li>de Graaf, M., van Beek, J., Koopmans, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+norovirus+transmission+and+evolution+in+a+changing+world%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Human norovirus transmission and evolution in a changing world.</a> Nature Reviews Microbiology. 14, 421-433 (2016).</li>
<li>Leshem, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-world+effectiveness+of+pentavalent+rotavirus+vaccine+among+bedouin+and+jewish+children+in+southern+Israel%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases+%3A+An+Official+Publication+of+the+Infectious+Diseases+Society+Of+America%22%5BJournal%5D)">Real-world effectiveness of pentavalent rotavirus vaccine among bedouin and jewish children in southern Israel.</a> Clinical Infectious Diseases : An Official Publication of the Infectious Diseases Society Of America. 62, Suppl 2 155-160 (2016).</li>
<li>Karst, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+commensal+bacteria+on+infection+with+enteric+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The influence of commensal bacteria on infection with enteric viruses.</a> Nature Reviews Microbiology. 14, 197-204 (2016).</li>
<li>Ettayebi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+human+noroviruses+in+stem+cell-derived+human+enteroids%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids.</a> Science. 353, 1387-1393 (2016).</li>
<li>de Wit, E., van Doremalen, N., Falzarano, D., Munster, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS+and+MERS%3A+recent+insights+into+emerging+coronaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">SARS and MERS: recent insights into emerging coronaviruses.</a> Nature Reviews Microbiology. 14, 523-534 (2016).</li>
<li>Scaldaferri, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thrilling+journey+of+SARS-CoV-2+into+the+intestine%3A+From+pathogenesis+to+future+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+Bowel+Diseases%22%5BJournal%5D)">The thrilling journey of SARS-CoV-2 into the intestine: From pathogenesis to future clinical implications.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 26, 1306-1314 (2020).</li>
<li>Kipkorir, V., Cheruiyot, I., Ngure, B., Misiani, M., Munguti, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+SARS-CoV-2+RNA+detection+in+anal%2Frectal+swabs+and+stool+specimens+in+COVID-19+patients+after+negative+conversion+in+nasopharyngeal+RT-PCR+test%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">Prolonged SARS-CoV-2 RNA detection in anal/rectal swabs and stool specimens in COVID-19 patients after negative conversion in nasopharyngeal RT-PCR test.</a> Journal of Medical Virology. 92, 2328-2331 (2020).</li>
<li>Lamers, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+productively+infects+human+gut+enterocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes.</a> Science. 369, 50-54 (2020).</li>
<li>Stanifer, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+type+III+interferon+in+controlling+SARS-CoV-2+Infection+in+human+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Critical role of type III interferon in controlling SARS-CoV-2 Infection in human intestinal epithelial cells.</a> Cell Reports. 32, 107863(2020).</li>
<li>Triana, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomics+reveals+immune+response+of+intestinal+cell+types+to+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomics reveals immune response of intestinal cell types to viral infection.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Triana, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analyses+reveal+SARS-CoV-2+interference+with+intrinsic+immune+response+in+the+human+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-cell analyses reveal SARS-CoV-2 interference with intrinsic immune response in the human gut.</a> Molecular Systems Biology. 17, 10232(2021).</li>
<li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6, 377-382 (2009).</li>
<li>Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+technologies+and+bioinformatics+pipelines%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+%26+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines.</a> Experimental & Molecular Medicine. 50, 1-14 (2018).</li>
<li>García-Rodríguez, I., Sridhar, A., Pajkrt, D., Wolthers, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Put+some+guts+into+it%3A+Intestinal+organoid+models+to+study+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Put some guts into it: Intestinal organoid models to study viral infection.</a> Viruses. 12, 1288(2020).</li>
<li>Stanifer, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+distribution+of+TLR3+leads+to+a+polarized+immune+response+in+human+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Asymmetric distribution of TLR3 leads to a polarized immune response in human intestinal epithelial cells.</a> Nature Microbiology. 5, 181-191 (2020).</li>
<li>Lees, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+intestinal+organoids+to+study+and+modify+epithelial+cell+protection+against+salmonella+and+other+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Using human induced pluripotent stem cell-derived intestinal organoids to study and modify epithelial cell protection against salmonella and other pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59478(2019).</li>
<li>Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+human+epithelial+enteroids+and+colonoids+from+whole+tissue+and+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (97), e52483(2015).</li>
<li>Fujii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Intestinal+organoids+maintain+self-renewal+capacity+and+cellular+diversity+in+niche-inspired+culture+condition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human Intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).</li>
<li>Bartfeld, S., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+as+model+for+infectious+diseases%3A+Culture+of+human+and+murine+stomach+organoids+and+microinjection+of+Helicobacter+Pylori%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Organoids as model for infectious diseases: Culture of human and murine stomach organoids and microinjection of Helicobacter Pylori.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53359(2015).</li>
<li>Hernandez, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-lambda+and+interleukin+22+act+synergistically+for+the+induction+of+interferon-stimulated+genes+and+control+of+rotavirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Interferon-lambda and interleukin 22 act synergistically for the induction of interferon-stimulated genes and control of rotavirus infection.</a> Nature Immunology. 16, 698-707 (2015).</li>
</ol>

저자는 경쟁 적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

장내 병원균은 가장 자주 장의 루멘을 마주보고 있는 그들의 정액 측에서 장 상피 세포를 감염시킴으로써 그들의 수명 주기를 시작합니다. 오르가노이드는 장 상피의 세포 복잡성과 조직을 재현하는 좋은 모델로 잘 인식되지만, 3차원, 폐쇄형 구조로 조직된 조직은 항문 막을 병원균에 접근할 수 없게 만듭니다. 이 프로토콜은 그들의 apical 측, 그들의 basolateral 측, 또는 BLS-3 병원체둘다에서 장 기관가노이드를 감염시키는 방법을 기술했습니다. 이러한 프로토콜은 BSL-2 또는 BLS-3 봉쇄 또는 아래에 강조되는 몇 가지 중요한 단계를 수행하여 다른 오르가노이드 모델 하에서 모든 장내 병원균을 연구하도록 쉽게 적응할 수 있습니다. 상술한 방법은 독일의 규정에 따라 단세포 물방울의 격리 및 준비를 위한 것입니다. 면책 조항으로, 이 프로토콜은 BSL-3 조건하에서 작업하는 동안 취해야 할 생물 안전 처리 조치 (표준 운영 절차)를 설명하지 않습니다. 또한 규제가 다른 나라에서 다를 수 있으며 모든 현지 규정이 존중되도록 지방 당국에 연락해야 한다고 주장하는 것도 중요합니다.
apical 감염을 위한 2개의 차원에서 유기체를 종자하는 중요한 단계의 한개는 세포가 고전적인 3차원 오르가노이드로 성장할 때와 비교될 것이라는 것을 통제하고 있습니다. 장 내 병원체에 따라, 트로피즘은 매우 희소한 세포 또는 높게 분화될 필요가 있는 세포에 제한될 수 있었습니다. 이 경우 완전히 분화하지 않은 2차원 오르가노이드를 사용하면 이 장 병원체가 장 가구를 감염시킬 수 없다는 잘못된 결론을 초래할 수 있습니다. 가능하면 이 프로토콜의 세 가지 구성을 사용하여 감염을 수행하는 것이 좋습니다: apical 감염을 위한 2D 오르간성 (섹션 2), apical 및 basolateral 감염을 위한 오픈 3D 오르노이드 (섹션 3), 그리고 바소포 감염전용 전체 3D 오르가노이드 (섹션 3). 이 접근법은 병원체 (apical 대 바소포탈)의 진입 경로를 분별하는 데 도움이되며 유사한 수준의 차별화가 달성되었음을 제어 할 것입니다. 2D 정형 감염에 대한 대안은 3D 오르간로이드를 사용하지만 병원균을 apical 측으로 직접 전달하는 미세 주입입니다 (자세한 내용은 Bartfeld 외27 참조). 이 방법은 병원체가 제대로 배치되고 오르가노이드가 그대로 유지되도록 숙련 된 인젝터가 필요합니다. 미세 주입은 일반적으로 BSL-2 봉쇄에서 사용되며 BSL-3 봉쇄에 적합하지 않을 수 있습니다.
2D 시드 오르가노이드에서 감염 실험을 수행할 때 추가적인 중요한 고려 사항은 최종 세포 밀도입니다. 2.3 단계에서 언급했듯이, 100-150 개의 오르가노이드는 48 웰 플레이트 또는 8 웰 유리 바닥 챔버 슬라이드의 한 우물에서 시드됩니다. 오르가노이드 라인과 오르가노이드를 처리하는 사람에 따라, 이러한 오르가노이드의 크기는 크게 다를 수 있습니다. 이것은 48 웰 플레이트 또는 8 웰 유리 바닥 챔버 슬라이드에서 매우 다른 세포 밀도귀착될 수 있습니다. 장 내 바이러스에 따라, 일부 바이러스는 더 희소 한 세포를 선호, 다른 사람은 또한 confluent 세포를 감염시킬 수 있을 것입니다 동안. 다른 세포 합류에 대한 감염성의 이러한 차이의 분자 기원은 명확하지 않다; 따라서, 선택의 장내 병원체에 대한 최상의 세포 밀도를 찾는 것을 목표로 하는 파일럿 실험은 추가 하류 특성화를 수행하기 전에 수행되어야 한다.
종종 FACS 정렬은 단일 셀 액적 에멀젼을 수행하기 전에 수행됩니다. 이 단계는 종종 이중에서 살아있는 세포 및 단하나 세포에서 죽은 분리하는 데 사용됩니다. BSL-3 병원균과 함께 작업할 때, 시설에 적절한 FACS 선별기가 장착되어 있어야 하는데, 이는 종종 그렇지 않습니다. 또한, 오르가노이드의 모든 세포가 동일한 크기를 갖는 것은 아니며, 종종 이중 또는 더 큰 세포 를 구별하기 어렵기 때문에 특정 세포 유형에 대해 부정적으로 선택할 위험이 있습니다. 또한, 각 샘플에 대해 5,000-10,000 사이의 정렬에 필요한 시간이 개별 세포의 성적 증명서 프로파일을 크게 수정할 수 있는지 여부에 대해 여전히 논의되고 있다. 단일 셀 시퀀싱(예를 들어, 메탄올 및 RNAassist)과 호환되는 세포 고정 방법이 기재되었지만, 이는 시퀀싱18의품질 저하로 이어지는 것으로 관찰되었다. 마지막으로, 세포 사멸 마커를 사용하여 세포를 분류하는 것도 편견으로 이어질 수 있다고 의심된다. 지하실-빌리 축을 통해 세포의 방향 증식 및 분화를 감안할 때, 가장 분화 된 세포, 창고 및 방출 될 것 이다, villi의 끝에 위치 하 고 있습니다. 이 세포는 세포 죽음 통로의 다른 마커에 대 한 종종 긍정적인 (예를들어, 세포 사 멸, 괴 사, 그리고 necroptosis); 그러나, 마우스 장의 로타바이러스 감염을 볼 때, 빌리의 끝은 가장 감염된영역(28)이다. 따라서, 죽음 마커에 대 한 긍정적인 보일 수 있는 세포를 필터링 생리 감염을 나타낼 수 있는 감염 된 세포의 부정적인 선택 귀착 될 것 이다. 현재 단일 셀 시퀀싱 전에 오르가노이드를 분류하고 고정하는 데 좋은 솔루션이 없습니다. 적합한 대체 프로토콜을 찾기 위해 추가 연구가 필요하므로 라이브, 분류되지 않은 세포를 사용하는 것이 좋습니다.
단세포 시퀀싱은 세포 반응을 평가하는 방법에 혁명을 일으켰습니다. 이 기술은 기저 조건 과 병원체 감염의 밑에 세포 혈통 특정 반응의 확인을 허용합니다. 이 메서드는 이전에 대량 판독에 의해 제한 된 많은 필드에 문을 열었습니다. 이 방법은 매우 강력하지만 한계가 있습니다. 주요 제한사항은 시퀀싱의 하류에 필요한 광범위한 생물정보 분석입니다. 조직을 분석하고 현재 주석이없는 세포 유형을 할당 할 때 이것은 특히 중요합니다. 숙련 된 생물 정보 학자를 갖는 것은 모든 단세포 연구를 지원하기 위해 필요합니다.
이 프로토콜은 인간 장 가구를 종자 및 처리하는 방법을 설명하고, 장 내 병원균으로 감염시키고, scRNAseq을 수행하는 방법을 설명합니다. 오르가노이드 모델 시스템이 대부분의 장기를 위해 개발되었기 때문에 다른 장기에 이 접근법을 적응시킬 수 있습니다. 폐와 간 오르가노이드는 장 가내장에 비해 유사하게 조직되며, 유사하게 이 오르가노이드로 전이될 수 있습니다. 중요한 제어는 2차원으로 성장하거나 금이 간 때 이러한 오르가노이드가 3D 오르가노이드와 유사한 분화를 달성한다는 것을 확인하는 것입니다. 분화된 상태를 정의하는 특정 특징 및 유전자는 각 기관 모형에 대해 특이합니다. 신장 과 혈관 오르가노이드, 큰 조밀 한 구조와 같은 다른 오르간성 모델은 이러한 구조를 단일 세포로 연속적으로 해리하는 추가 방법이 필요합니다.

인간 장바이러스에 대한 세포 유형별 트로피즘 및 세포 유형 별 면역 반응을 연구하는 것은 1 차적인 인간 적인 세포 모형의 부족 때문에 역사적으로 도전적이고 있습니다. 이러한 제한은 이제 오가노이드1의개발로 부분적으로 근절되었습니다. 위장관의 경우, 위 및 장 가구형 모델은 인간 및 여러 다른 종(예:murine, 소, 고양이, 박쥐)2,3,4,5,6을위해 개발되었다. 장 내 오르가노이드는 인간의 장 상피의 구조 구조를 재현하고 토굴과 사악한 구조, 기능성 장 계보를 포함하고 심지어 이전에 알려지지 않은 세포 혈통을 식별하는 데 사용되었습니다. 두 가지 접근 법은 장 오르가노이드를 성장하기 위하여 이용될 수 있습니다. 첫째, 토굴을 함유한 장줄기 세포는 조직 절제술또는 생검으로부터 분리되고 특정 배양 조건(예를 들어, Wnt3A, R-spondin, Noggin, EGF)에서 재배하여 확장한 다음 줄기 세포를 대부분의 장내 세포 계보(예를들어, 장내 세포 계보, Paneth세포, 파네트세포)로분화하여 세포에 진입한다. 이 방법은 위장관의 모든 섹션에서 오르가노이드의분리를허용합니다 (예 : 위, 십이지장, 제주넘, 일레움 및 결장). 두 번째 방법은 인간 유도 만능 또는 배아 줄기 세포에 의존하며, 이는 후장 상피 세포로 단계적으로 분화된다8. 이러한 유도된 줄기 세포 기지를 둔 오르가노이드는 수시로 환자 유래 유기인에 비교된 자연에서 더 많은 배아인 것으로 기술됩니다. 이 모든 organoid 모형은 장관을 형성하는 데 필요한 발달 단서를 해명하는 데 중요했지만, 전염병 연구에서의 사용은 아직 초기 단계에 있습니다.
장내 바이러스는 피코나바이러스(예를들어, EV-71), 레오바이러스(예를 들어, 로타바이러스), 칼리시바이러스(예를 들어, 노로바이러스)9와같은 위장관을 통해 감염되는 모든 바이러스를 포함하는 광범위한 용어이다. 장내 바이러스는 오염된 음식과 물의 섭취를 통해 전염성 수명 주기를 개시하여 개발도상국의 사람들이 치료되지 않은 폐기물을 환경으로 배출하고감염 10이발병한 후 의료 서비스 부족으로 인해 고위험에 처하게 된다. 병원균의 종류에 따라, 감염은 장 안대기의 누설로 인한 위장염, 구토 및 /또는 물 설사로 이어질 수 있습니다. 인간 노로바이러스는 전세계적으로6억 건 이상의 감염과 1,500만 건의 입원으로 이어지는 매우 널리 퍼지고 전염성이 높은 장병원성 병원체입니다. 오르가노이드는 이전에 표준 세포 배양모델(12)에서배양될 수 없었던 인간 노로바이러스의 감염 및 복제를 지원하면서 노로바이러스 연구의 핵심이었다.
지난 2 년 동안, 코로나 바이러스는 주요 인간 병원체로등장했다 13. 이 가족은 고병원성 MERS, SARS-CoV-1 및 SARS-CoV-2를 포함하며, 이러한 바이러스에 대한 연구를 수행할 때 엄격한 안전 수준 봉쇄가 필요합니다. 흥미롭게도, 이 병원체의 세 가지 모두 주로 유도 된 호흡 증상과 고민에 대 한 인식 하는 동안, 그것은 지금 이 바이러스는 전적으로 호흡기를 감염 하지 않습니다 뿐만 아니라 다른 장기. SARS-CoV-2 감염환자에서 유도된 중요한 병리학은 호흡 곤란 이외에 위장증상(14)의존재이다. SARS-CoV-2 감염한 환자의 분수는 매우 온화한에서 가혹한 설사에 구역 수색하는 그 같은 현상을 표시합니다. 추가적으로, SARS-CoV-2 게놈은 감염된 환자의 대변 및 위장관 생검에서 검출될 수 있다15. 중요한 것은 위장 증상의 존재는 또한 MERS 및 SARS-CoV-1 감염된 환자에서 관찰되었기 때문에 SARS-CoV-2에 국한되지 않습니다. SARS-CoV-2가 위장관 고민을 유도하고 정확하게 위장에서 SARS-CoV-2의 트로피주의를 식별하는 방법을 이해하기 위해, 인간 장 내장 은 주요 도구였으며 이제이 병원체 에 대한 세포 유형 별 반응을 해명하기 위해 악용된다16,17.
세포 집단의 전사 프로파일링 (벌크 RNA 시퀀싱)은 유기체뿐만 아니라 불멸의 세포주 모두의 병원균 감염을 평가 할 때 표준 관행이었습니다. 이것은 우리가 병원체에 응하여 글로벌 변경을 결정하는 것을 허용하는 동안 (예를 들면, 사이토카인의 강화 조절), 벌크 RNAseq는 왜 인구에 있는 특정 세포가 그 외 보다는 감염하기 쉬운지 결정하는 것을 허용하지 않습니다. 단세포 RNA 시퀀싱(scRNAseq)은 세포 혈통 특이적 전사 프로그램을 해명하는 강력한 도구가 되었으며, 이러한 프로그램이 바이러스감염(18,19)을지원하거나 억압하는 방법을 결정하는 데 사용될 수 있다. scRNAseq의 첫 번째 설명은 2009년에 있었고 마우스 blastomere20에서찾아낸 다른 세포의 전사 프로파일을 평가하는 데 사용되었다. 이러한 기술은 이제 확장되었으며 여러 플랫폼을 통해 구현할 수 있습니다. 이 기술의 초기 버전은 형광 활성화 세포 선별기(FACS)를 적용하여 시퀀싱을 위해 개별 세포를 분리하여 종종 96- 또는 384웰 플레이트로 제한되어 300개의 개별 세포가 샘플21당분석하도록 하였다. 이러한 방법은 이제 단일 셀 시퀀싱 플랫폼에 의해 진행되었으며, 이는 미세 유체 장치를 사용하여 단일 세포를 구슬이 포함된 바코드가 포함된 개별 물방울로 캡슐화합니다. 이 기술을 통해 샘플 조건당 최대 10,000개의 셀을 포획할 수 있습니다.
오르가노이드 기술과 scRNAseq를 결합하면 장내 병원체가 세포 유형별 방식으로 위장관에 미치는 영향을 연구할 수 있습니다. 그러나 몇 가지 기술적 및 생물 안전 고려 사항을 고려해야 합니다. 무엇보다도, 고전적인 오르가노이드 배양 방법(3차원(3D) 오르가노이드, 세포외 매트릭스(ECM)에 내장된) 상피 세포의 바칼탈측을 오르가노이드의 바칼측을 외부에 노출한다. 장내 병원균이 오염된 음식/물의 섭취를 통해 감염을 시작하면 감염은 세포의 정면에서 가장 자주 시작되며, 이 3D 장 오르가노이드에서는 접근할 수 없습니다. 따라서, 오르가노이드는 2D 파종을 통해 병원체 감염에 접근할 수 있도록 준비되어야 하며, 이에 따라 세포의 액피티컬 측면을 직접 노출시키거나,마이크로주입(22,23)을통해서이다. 둘째, 감염된 생물학적 시료의 scRNAseq를 수행하기 위해, 그들의 전염성 특성을 고려하는 것이 중요하다. 후속 RNAeq에 대한 단일 세포 격리 이전에 세포를 고치고 병원균을 비활성화하는 방법이 제안되었지만, 이러한 방법은 종종 시퀀싱 품질18의감소로 이어진다. 아래 의정서는 감염측(apical 대 바소포탈 감염)을 고려한 장 내 유기성 기관지(asolateral 감염)를 고려한 장 기관가를 감염시키는 몇 가지 접근법을 설명할것이다(그림 1). 추가적으로, 프로토콜은 scRNAseq를 위한 고병원성 바이러스에 감염된 오르가노이드에서 단 하나 세포를 해리하고 격리하는 워크플로우를 포함할 것입니다. 이 프로토콜은 에어로졸 생성 및 잠재적 오염을 방지하기 위해 생물 안전 수준-3(BSL-3) 봉쇄 조건하에서 작업할 때 구현해야 하는 주요 단계를 강조합니다.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; 재조합 마우스 노긴</td><td>Peprotech</td><td>Cat#250-38</td><td></td></tr><tr><td>[Leu15]-Gastrin I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# G9145</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 트립신-EDTA</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Cat#25300054</td><td></td></tr><tr><td>24-well non-cell culture treated plate</td><td>Corning</td><td>Cat#3738</td><td></td></tr><tr><td>8-well glass bottom chamber slide</td><td>iBIDI</td><td>Cart#80827</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>Cat#2939</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Cat# 12634010</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Cat#17504-044</td><td></td></tr><tr><td>크롬 컨트롤러 및 다음 GEM 액세서리 키트</td><td>10X Genomics</td><td>Cat#1000202</td><td>단일 세포 용액 준비 및 Gel beads-in-emulsion(GEM) 준비에 사용됨</td></tr> <tr><td>Chromium 다음 GEM Chip G 단일 세포 키트</td><td>10X Genomics</td><td>Cat #1000127</td><td>단일 세포 용액 준비 및 Gel beads-in-emulsion(GEM) 준비에 사용됨</td></tr> <tr><td>Chromium Next GEM Single Cell 3&prime; Kit v3.1</td><td>10X Genomics</td><td>Cat#1000268</td><td>단세포 용액 준비 및 Gel beads-in-emulsion(GEM) 준비에 사용됨</td></tr> <tr><td>인간 태반의 콜라겐</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat#C5533-5MG</td><td></td></tr><tr><td>CYP34A forward</td><td>Eurofins</td><td>GATGGCTCTCATCCCAGACTT</td><td>분화를 확인하는 데 사용되는 Primers</td></tr><tr><td>CYP3A4 reverse</td><td>Eurofins</td><td>AGTCCATGTGAATGGGTTCC</td><td>분화를 확인하는 데 사용되는 프라이머</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Cat#11320074</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Car#E9884</td><td></td></tr><tr><td>Fast Read 102 counting slides</td><td>Biosigma</td><td>Cat# BVS100</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovein Serum (FBS)</td><td>Capricorn</td><td>Cat#FBS-12A</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Cat# 35050061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Cat3 15630080</td><td></td></tr><tr><td>L-WRN 세포</td><td>ATCC</td><td>CRL-3276</td><td>이 세포주는 Wnt 3A, R-Spondin 및 Noggin을 포함하는 컨디셔닝 배지를 만드는 데 사용됩니다. 컨디셔닝된 배지 생산을 위한 프로토콜은 제조 현장에서 찾을 수 있습니다.</td></tr><tr><td>매트리겔. GFR, LDEV 무료</td><td>Corning</td><td>Cat#354230</td><td></td></tr><tr><td>MUC-2 전방</td><td>유로핀</td><td>TGTAGGCATCGCTCTTCTCA</td><td>차별화를 확인하는 데 사용되는 프라이머</td></tr><tr><td>MUC-2 역방향</td><td>유로핀</td><td>GACACCATCTACCTCACCCG</td><td>차별화를 확인하는 데 사용되는 프라이머</td></tr><tr><td>N-아세틸-시스테인</td><td>시그마 알드리치</td><td>Cat# A9165</td><td></td></tr><tr><td>OLMF4 포워드</td><td>유로핀</td><td>분화 확인에 사용되는 ACCTTTCCCGTGGACAGAGT</td><td>프라이머</td></tr><tr><td>OLMF4 역</td><td>유로핀</td><td>TGGACATATTCCCTCACTTTGGA</td><td>분화 확인에 사용되는 프라이머</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Cat#15140122</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 FGF 기본</td><td>Peprotech</td><td>Cat#100-18B</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 IGF-1</td><td>BioLegend</td><td>Cat#590904</td><td></td></tr><tr><td>재조합 마우스 EGF</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Cat# PMG8043</td><td></td></tr><tr><td>SI forward</td><td>Eurofins</td><td>AATCCTTTTGGCATCCAGATT</td><td>분화 확인에 사용되는 Primers</td></tr><tr><td>SI reverse</td><td>Eurofins</td><td>GCAGCCAAGAATCCCAAT</td><td>분화 확인에 사용되는 Primers</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Cat#12605036</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>케이만 화학 Cat</td><td>#10005583</td><td></td></tr></tbody></table>

생체 안전 수준 3 (bsl-3) 조건 하에서 병원체 감염 및 단일 세포 염기서열분석에 대한 위장 오르가노이드 적응

Adapting Gastrointestinal Organoids for Pathogen Infection and Single Cell Sequencing under Biosafety Level 3 (BSL-3) Conditions

인간 장 가구는 위장관의 병원균 감염을 연구하는 가장 좋은 세포 모델을 구성합니다. 이러한 오르가노이드는 기관의 모든 섹션(위, 제주, 십이지장, 일레움, 결장, 직장)에서 파생될 수 있으며, 분화시, 각 개별 섹션에서 자연적으로 발견되는 대부분의 세포 유형을 함유하고 있다. 예를 들어, 장 내 오르가노이드에는 영양 흡수 장세포, 분비 세포(잔, 창, 및 장내 분비), 줄기 세포뿐만 아니라 모든 계보별 분화 중간체(예: 조기 또는 미성숙 세포 유형)가 포함됩니다. 위장관 유래 오르가노이드를 사용하여 전염병을 연구하는 데 있어 가장 큰 장점은 장내 병원체가 어떤 세포 유형을 표적으로 하는지 정확하게 식별하고 위장관및 특정 세포 유형의 다른 섹션이 병원균 문제에 유사하게 반응하는지 여부를 해결할 수 있다는 것입니다. 지난 몇 년 동안, 위장 모델, 뿐만 아니라 다른 조직에서 organoids, 바이러스 성 트로피즘과 병인의 메커니즘을 공부 하기 위해 사용 되었습니다. 그러나 병원성 바이러스를 사용할 때 오르가노이드를 사용하는 모든 장점을 활용하는 것은 기술적 인 과제를 나타내며 엄격한 생물 안전 고려 사항이 필요합니다. 또한, 오르가노이드는 종종 3차원에서 재배되기 때문에 세포의 바소포측은 오르가노이드의 바깥쪽을 향하고 있으며, 그들의 압정면은 오르가노이드의 내부(lumen)를 향하고 있다. 이 조직은 많은 장내 감염이 섭취 다음 세포의 정모/발광 측에서 시작으로 장 내 병원체에 대 한 도전을 제기. 다음 원고는 세포 형 특정 숙주 / 병원균 상호 작용을 특성화하기 위해 단세포 RNA 염기서열분석을 수행하는 감염 측 (apical 대 basolateral)을 고려하여 장 내 병원체감염에 대한 인간 장 기관가노이드를 준비하는 포괄적 인 프로토콜을 제공합니다. 이 방법은 유기체의 준비뿐만 아니라 생물 안전 수준 3 (BSL-3) 봉쇄 조건하에서이 작업을 수행하는 데 필요한 고려 사항을 자세히 설명합니다.

단세포 시퀀싱을 위한 오르가노이드 준비 단일 셀 염기 서열 결과는 양질의 셀 사용에 크게 의존합니다. 오르가노이드가 양호한 지 확인하려면, 분할할 준비가 되었는지 결정하기 위해 매일 제대로 유지 관리되고 관찰되어야한다(그림 2). 분리 오르가노이드의 타이밍은 기증자 의존적입니다. 일부 기증자는 더 빨리 성장하고 5 일마다 분할될 필요가 있는 반면, 다른 기증자는 느리고 10 일마다 분할될 필요가 있습니다. 평균적으로, 오르가노이드는 센터가 어두워지면 일주일에 한 번 분할됩니다(그림 2B). 오르가노이드가 너무 커지고 중앙에 너무 많은 죽은 세포를 축적할 수 있다면 오르가노이드가 죽게 됩니다.
오르가노이드는 Wnt3A의 높은 양을 포함하는 매체에서 유지됩니다. 이것은 줄기 세포 틈새 시장을 지원하고 성장하고 확산하기 위하여 오르가노이드를 승진시다. 이러한 성장 조건 하에서, 오르가노이드는 고량의 줄기 세포와 통과 증폭 세포와 성숙한 장신구, 잔성 세포 및 장내 세포와 같은 분화세포 집단의 더 적은 양을 함유하고 있다. 그러나, 인간 장 내에서 발견 되는 세포 복잡성을 모방 하기 위해, 세포 분화를 밀어 이러한 세포의 더 많은 생산 하는 것이 중요 하다. 이는 미디어 조건을 변경하고 Wnt3A를 제거하고 R-스폰딘과 노긴(표1)을줄임으로써 달성된다. 일반적으로, 장신구, 잔성 세포 및 장내 분비 세포를 향한 세포 분화는 4일간의 분화매체(도 3)를필요로 한다. 좋은 차별화를 얻는 것이 핵심입니다. 그렇지 않으면 병원체 트로피즘 과 세포 유형 별 반응을 평가하는 것이 어려워집니다.
BSL-3 병원균 불활성화 확인 완전한 불활성화는 선택의 병원체로 확인되어야 하며 BSL-3에서 cDNA를 제거하는 것이 안전하다는 것을 검증해야 합니다. SARS-CoV-2의 경우, SARS-CoV-2의 100 μL을 복용하고 85°C에서 5분 동안 PCR 기계로 배양함으로써 바이러스의 완전한 비활성화가 검증되었다. 바이러스는 그 때 순진한 Vero 세포에 다시 추가되고, 바이러스 감염은 모든 입자가 더 이상 전염되지 않았는지 확인하기 위하여 24 시간, 48 시간 및 72 시간 감염에 면역 형광 및 플라크 분석에 의해 비열 처리된 바이러스와 비교되었습니다. 이러한 결과는 현지 규제 기관에 보내졌으며, 승인시 단일 세포 실험 및 cDNA 처리가 수행되었다.
단일 셀 염기서열 분석 결과 SARS-CoV-2가 인간 결장 및 ileum organoids를 어떻게 감염시키는지 평가하기 위해 단세포 시퀀싱이 수행되었습니다. 오르가노이드는 위에서 설명한 대로 제조되었고 SARS-CoV-2에 의한 정압 감염을 허용하기 위해 2D 형식으로 감염되었다. 감염된 세포는 감염 후 12시간 및 24시간에서 수확되었고 위에서 설명한 바와 같이 단일 세포 염기서열분석용으로 처리되었다. 단세포 염기서열 분석으로 인간 장상피세포의 하위집단(미성숙 장신구 2)만이 SARS-CoV-2(도4)의감염을 지원한다는 것을 확인할 수 있었습니다. 또한, 인구내의 모든 세포가 감염되지 않았기 때문에 감염된 세포와 비감염방관세포(도 5)를분석하였다. 이러한 결과는 SARS-CoV-2가 감염된 세포에서 프로 염증 신호 캐스케이드를 유도한 반면 비감염방관 세포는 인터페론 매개 면역 반응을 보였다는 것을 보여주었다. 또한, scRNA-Seq는 감염된 세포가 통로의 바이러스 매개 막힘으로 인해 인터페론을 감지할 수 없음을보여주었다(도 5). 벌크 RNA 염기서열 분석 사용 시 이 정보를 얻을 수 없었다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62857/62857fig01.jpg"> 도 1: 장내 병원균감염에 대한 인간 장 가구노이드를 준비하는 세 가지 방법을 묘사한 회로도. Apical 감염은 2D에 있는 장 기관가노이드를 파종하여 달성될 수 있습니다. 3D 오르간노이드를 방해하여 기형 및 바식자 감염이 수행될 수 있습니다. 마지막으로, 바소포탈 전용 감염은 3D 장 내장 내장을 감염시킴으로써 수행될 수 있다. 이러한 각 메서드는 단일 셀 시퀀싱을 위한 샘플을 생성하는 데 사용할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62857/62857fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62857/62857fig02.jpg"> 그림 2: 오르가노이드 유지 보수 회로도 및 대표적인 브라이트 필드 이미지. (A)인간 장 가구의 유지 보수 및 패시징을위한 회로도. (B).대표 브라이트필드 이미지 1일, 3, 5, 7 후 분할. 7일째가 되면 오르가노이드는 죽은 세포의 축적으로 인해 크고 어두워지고 분할될 준비가 되어 있습니다. 스케일 바는 25 μm을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62857/62857fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62857/62857fig03.jpg"> 그림 3: 인간 장 가구형의 대표적인 qPCR 4일 후 분화 매체로 전환. 장 내 오르가노이드는 성장 매체에서 유지되거나 4일 동안 분화 매체로 전환되었다. RNA는 줄기 세포(OLFM4), 창세포(LYZ), 잔류 세포(MUC2), 및 장신구(SI)의 마커를 위해 기재되었다. N = 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62857/62857fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62857/62857fig04.jpg"> 그림 4: SARS-CoV-2에 의해 감염된 세포 집단의 식별. 인간 결장 및 일루 유래 오르가노이드는 SARS-CoV-2에 감염되었다. 12 및 24 h 후 감염 후 세포가 수확되고 SARS-CoV-2 감염을 지원하는 세포 집단을 확인하기 위해 단세포 RNA 염기서열분석을 실시하였다. 바이러스 감염은 시간이 지남에 따라 증가하고 주로 미성숙 장내 2를 감염시키는 것으로 나타났습니다. 이 수치는 트리아나 외19에서수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62857/62857fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62857/62857fig05.jpg"> 그림 5: 본질적인 타고난 면역 반응의 결정. 인간 결장 유래 오르가노이드는 SARS-CoV-2에 감염되었다. 12 및 24h 감염 후 세포가 수확되고 바이러스 감염 및 비감염 방관자 세포 모두에서 본질적인 타고난 면역 반응을 결정하기 위해 단일 세포 RNA 시퀀싱을 실시하였다. SARS-CoV-2 감염된 세포는 강력한 프로 염증 반응을 보였고 비감염방관 세포는 인터페론 매개 반응을 표시하였다. 트리아나 외19에서수정된 그림. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62857/62857fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">성장 미디어</td>
		</tr>
<tr>
<td>화합물</td>
			<td>최종 농도</td>
		</tr>
<tr>
<td>광고 DMEM/F12</td>
			<td>글루타맥스 (1X)</td>
		</tr>
<tr>
<td>+글루타맥스</td>
			<td>헤페스 1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>+헤페</td>
			<td>펜 10 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>+P/S</td>
			<td>스트렙 10 μg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-WRN</td>
			<td>볼륨별 50%</td>
		</tr>
<tr>
<td>B27</td>
			<td>01:50</td>
		</tr>
<tr>
<td>N-아세틸 시스테인</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGF</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>A83-01</td>
			<td>500 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>IGF-1</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>FGF 기본</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>가스트린</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">차별화 미디어</td>
		</tr>
<tr>
<td>화합물</td>
			<td>최종 농도</td>
		</tr>
<tr>
<td>광고 DMEM/F12</td>
			<td>글루타맥스 (1x)</td>
		</tr>
<tr>
<td>+글루타맥스</td>
			<td>헤페스 1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>+헤페</td>
			<td>펜 10 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>+P/S</td>
			<td>스트렙 10 μg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>B27</td>
			<td>01:50</td>
		</tr>
<tr>
<td>N-아세틸 시스테인</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-스폰딘</td>
			<td>볼륨별 5%</td>
		</tr>
<tr>
<td>머리</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGF</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>가스트린</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>A83-01</td>
			<td>500 nM</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 성장 및 차별화 미디어를 위한 미디어 구성.

이 프로토콜은 단세포 RNA 염기서열분석(scRNAseq) 기술을 사용하여 단세포 수준에서 숙주/병원균 상호 작용을 특성화하기 위해 자신의 apical 또는 바식측에서 인간 장 기관가를 감염시키는 방법을 설명합니다.

생체 안전 수준 3 (BSL-3) 조건 하에서 병원체 감염 및 단일 세포 염기서열분석에 대한 위장 오르가노이드 적응

Human intestinal organoids constitute the best cellular model to study pathogen infections of the gastrointestinal tract. These organoids can be derived ...

이 프로토콜은 우리가 바이러스 성 감염에 인간 장 상피 반응에 존재하는 개별 세포 모형이 어떻게 이해하는 것을 허용합니다. 우리는 여기에서 감염의 경로가 세포가 어떻게 반응하는지 에 영향을 미칠 수 있는 방법을 다루기 위하여 인간 장 기관가노이드를 종자하는 3개의 독립적인 쪽을 제시합니다. 우리는 카테고리 3 병원균과 함께 작업 할 때 존중해야 할 생물 안전 규정을 고려하여 단일 세포 RNA 시퀀싱을위한 샘플을 준비하는 방법을 강조합니다.이 방법은 다른 병원체 및 오르가노이드 배양에 쉽게 적응할 수 있습니다. 가장 중요한 고려 사항은 오르가노이드 모델이 선택한 종자 방법으로 완전히 차별화되고 바이러스 감염을 지원할 수 있는지 확인하는 것입니다. 감염된 오르가노이드를 수확하기 전에 단일 세포 젤 구슬을 영하 80도에서 제거하고 실온으로 데워집니다.또한 RT 시약을 평형화하여 에이전트 B 및 RT 효소 C를 실온으로 줄이고 제조업체의 지침에 설명된 대로 템플릿 스위치 올리고를 다시 일시 중단합니다. 다음으로, BSL-3 병원체에 감염된 3D 오르가노이드를 수집하고, 인큐베이터로부터 세포 배양판을 제거하고 세포 배양 후드에 배치한다. 그런 다음 P1000 파이펫을 사용하여 24웰 플레이트의 각 웰에서 분화 매체를 제거하고, 500 마이크로리터의 얼음 차가운 PBS를 각 우물에 추가하고 실온에서 3 분 동안 배양합니다.다음으로, 세포외 매트릭스 용액을 완전히 방해하기 위해, 파이펫을 10배 위아래로 기울여 PBS, 세포외 매트릭스 및 오르가노이드를 재중단한 다음, 재중단된 오르가노이드를 15밀리리터 원추형 튜브로 옮기고 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 별도의 15 밀리리터 원판 튜브에서 각 감염 상태를 수집합니다. 장갑을 교체한 후 튜브 의 외부를 청소하고 세포 배양 후드에서 튜브를 제거합니다.샘플을 5분간 회전시합니다. 튜브를 다시 세포 배양 후드로 옮기고 PBS를 제거하여 튜브 바닥에서 오르가노이드 펠릿의 재발을 피하십시오. 다음으로, 해리 효소의 1 밀리리터에 펠릿을 다시 놓습니다.그런 다음 장갑을 교체하고 튜브를 청소하고 샘플을 섭씨 37도에서 30 분 동안 배양합니다. 인큐베이션 하는 동안, 10 분마다 다시 세포 배양 후드로 튜브를 이동하고 위아래로 파이펫하여 오르가노이드를 다시 중단합니다. 오르가노이드가 단일 세포로 해리되는지 확인하려면 P10 파이펫을 사용하여 일회용 플라스틱 셀 카운터 슬라이드에 오가노이드 서스펜션 10 마이크로리터를 배치한 다음 명확한 테이프로 샘플 입력 포트를 밀봉하십시오.장갑을 변경한 후, 셀 카운터의 외부를 청소하고 브라이트 필드 현미경을 사용하여 단일 세포 현탁액이 생성되는지 확인합니다. 단일 셀 서스펜션의 확인에 따라 10%의 FBS와 파이펫을 10배 위아래로 포함하는 DMEM F12 미디어의 1밀리리터를 추가하여 소화를 중지합니다. 그런 다음 장갑을 교체하고 튜브를 청소하고 샘플을 회전시합니다.원심분리 후, 절단 효소를 함유한 매체를 주의 깊게 제거하고, 하단의 세포 펠릿을 방해하지 않도록 주의하십시오. 그런 다음 0.1%BSA를 포함하는 PBS의 최소 부피로 단일 셀을 다시 중단합니다. 큰 덩어리를 제거하기 위해 필터를 통해 FACS 튜브에 세포 서스펜션을 전달 한 후, 얼음에 튜브를 배치합니다.다음으로, 마이크로리터당 세포 수를 결정하기 위해, 일회용 플라스틱 셀 카운팅 챔버에 셀 현탁액의 10 마이크로리터를 추가한다. 그런 다음 세포 배양 후드에서 샘플을 제거하기 전에 명확한 테이프로 샘플 입력 포트를 밀봉합니다. 장갑을 변경하고, 세포 카운팅 챔버를 청소한 다음, 브라이트필드 현미경을 사용하여 세포 수를 계산합니다.다음으로, 세포 배양 후드 내부에서 실험시 샘플 수에 따라 제조업체의 지침에 따라 RT 시약, 템플릿 스위치 올리고, 감소제 B 및 RT 효소 C의 마스터 믹스를 제조한다. 각 샘플에 대해, PCR 튜브에 마스터 믹스의 33.4 마이크로리터를 알리쿼트한 다음, 대상 세포 수에 따라 마스터 믹스에 세포와 물을 추가한다. 장갑을 변경한 후 단일 셀 컨트롤러를 세포 배양 후드로 이동하고 칩을 준비합니다.다음으로 단일 셀 칩을 칩 홀더에 넣고 사용하지 않은 차선을 50% 글리세롤로 채웁니다. 제조업체의 지침에 따라 샘플을 포함하는 레인에 마스터 믹스, 구슬 및 분할 오일을 추가하고 칩을 개스킷으로 덮습니다. 칩을 컨트롤러에 로드한 후 프로그램을 시작합니다.프로그램이 완료되면 칩과 개스킷을 제거한 다음 멀티 채널 파이펫을 사용하여 에멀젼의 100 마이크로리터를 전송하여 PCR 튜브를 청소합니다. 각 에멀젼에 완전한 에멀젼이 발생했음을 나타내는 흰색색이 균일한지 확인합니다. 장갑을 교체하고 튜브를 청소한 후 PCR 튜브를 PCR 기계로 옮기고 프로그램을 시작합니다.PCR 실행이 끝나면 대부분의 봉투에 둘러싸인 바이러스가 비활성화됩니다. 대표적인 브라이트필드 이미지는 1일, 3일, 5일, 7개의 분할 후 오르가노이드를 볼 수 있습니다. 평균적으로 오르가노이드는 중심이 어두워지면 일주일에 한 번 분할됩니다.미디어 조건을 변경하여 Wnt-3a를 제거하고 R-spondin 및 noggin을 줄임으로써 인간 장 내에서 발견되는 세포 복잡성을 모방할 수 있습니다. 일반적으로, 창세포, 잔 세포 및 장내 세포를 향한 세포 분화는 4일간의 분화 매체를 필요로 한다. SARS-CoV-2 감염된 인간 결장 및 ileum 유래 오르가노이드로부터 의 단일 세포 염기서열 분석결과 인간 장 상피 세포의 하위 집단만이 12 시간 및 24 시간 후에 SARS-CoV-2의 감염을 지원한다는 것을 보여주었습니다.SARS-CoV-2 감염된 대장 유래 오르가노이드에서 의 타고난 면역 반응의 분석은 SARS-CoV-2가 감염된 세포에서 프로 염증 신호 폭포를 유도한 반면 비감염방관 세포는 인터페론 중재 면역 반응을 보였다는 것을 보여주었다. 추가적으로, 단하나 세포 RNA 염기서열분석은 감염된 세포가 통로의 바이러스 매개 막힘으로 인해 인터페론을 감지할 수 없다는 것을 보여주었다. 오르가노이드는 잘 분화되고 건강해야합니다.이는 감염 전에 qPCR에 의한 세포 분화 마커의 수준을 결정함으로써 조절될 수 있다. 세포가 잘 분화되지 않는 경우에, 그(것)들은 바이러스성 감염을 지원하지 않으며 유익한 결과로 이끌어 낼 것입니다. 이 기술은 우리가 발광과 조직 측 둘 다에서 점막을 감염시킬 수 있습니다.이것은 우리가 한쪽에 더러운 환경을 용인하고 다른 쪽에 멸균 을 용인하기 위해 점막 표면에 의해 사용되는 메커니즘을 해명 할 수 있기 때문에 매우 중요합니다.

adapting-gastrointestinal-organoids-for-pathogen-infection-single

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 동영상은 위 병원균인 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)를 오가노이드 내강에 미세주입하여 위 오가노이드 감염 모델을 확립하는 방법을 보여줍니다. 이 모델은 위 세포의 감염으로 인한 변화를 연구하는 데 도움이 됩니다.

Establishing an Infection Model Through Infection Model Through Microinjection of Gastric Organoids with Pathogenic Bacteria(위 오가노이드와 병원성 세균의 미세주입을 통한 감염 모델 구축)

이 프로토콜은 기본 Lgr5-positve organoid 문화와 레트로 바이러스 전달의 후속 성능을 설명합니다. 이 시험관의 Organotypic에 소설에서 수행 할 기능 연구를 전달 유전자의 Cre 호텔 유도 과발현 또는 최저을 가능하게하고 있습니다   모델 시스템.

차 소장 Organoid 문화에서 레트로 바이러스 감염의 비디오 프로토콜

줄기세포 유래 배양은 감염병을 모델링할 수 있는 엄청난 잠재력을 가지고 있습니다. 여기에서는 성체 줄기 세포에서 유래한 마우스 및 인간 위 오가노이드의 배양에 대해 설명합니다. 오가노이드에는 위 병원균인 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)가 미세주입됩니다.

감염증에 대한 모델로 Organoids : 헬리코박터 파이로리의 인간의 문화와 쥐 위장 Organoids 및 미세 주입

인간 유도 만능 줄기 세포 (힙 Sc) 유래 장 소기관은 시험관 내 장 질환을 모델링할 수 있는 흥미로운 기회를 제공 합니다. 우리는 장내 유기 체 (iHOs)로의 분화를 입증 하 고, 이러한 iHOs를 사이토 킨과 함께 자극 하 고,이 호 루멘에 살 모 넬 라 티 피 뮤 리 움의 미세 주입을 가능 하 게 하 여 상피 침입에 대 한 연구를 가능케 합니다. 병원 체.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 장 소기관을 사용 하 여 살 모 넬 라 및 기타 병원 균에 대 한 상피 세포 보호 연구 및 수정

여기에서 우리는 소장 오르가노이드의 장벽 무결성을 정량화하는 기술을 기술합니다. 이 방법이 살아있는 오르가노이드를 기반으로 한다는 사실은 시간 해결 방식으로 상이한 장벽 무결성 변조 물질 또는 이들의 조합에 대한 순차적 조사를 가능하게 한다.

살아있는 오르가노이드의 장 장벽 고장 조사

여기서는 장 적정별 상호 작용을 모델링할 수 있는 두 가지 프로토콜을 제시합니다. 오르가노이드 유래 장 단층층 및 공기-액체 인터페이스(ALI) 배양은 발광 및 바생측 모두에서 접근할 수 있는 잘 차별화된 상피생성을 용이하게 하는 반면, 극성 반전장 기관가의 측면은 그들의 정면을 노출시키고 높은 처리량 분석에 적합합니다.

장 관성 오르가노이드 모델을 사용하여 정법별 상호 작용을 연구하는 문화 방법

이 연구는 오가노이드에서 소 장 2D 단층을 생성하기 위한 프로토콜을 제시하여 숙주-병원체 상호 작용 연구를 위한 향상된 접근성을 제공합니다. 여기에는 멤브레인 무결성 및 기능을 평가하는 방법이 포함되며, 소의 위장 생리학을 모방하는 in vitro 모델을 발전시킵니다. 이 접근법은 향상된 치료 전략을 포함하여 상당한 생물 의학 및 농업 이점을 약속합니다.

Small and Large Intestinal Monolayer interface를 사용한 소 오가노이드 기술의 발전

이 연구는 소장과 대장에서 유래한 돼지 오가노이드의 2D 단층을 생성하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 이러한 단층의 성장은 TEER 값의 증가로 표시되며, 이는 견고한 상피 무결성을 나타냅니다. 게다가, 이 단층은 forskolin의 신청에 따르는 Ussing 약실 실험에 있는 생리적인 분비 반응을 전시합니다.

토종 장의 생리학적 특성을 반영하는 2차원 돼지 장 오가노이드(Two-dimensional Porcine Intestinal Organoids)

여기에서는 표준 매트릭스 내장 오가노이드 배양에서 정점 아웃 장 오가노이드를 생성하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 또한 활발하게 증식하는 세포에 EdU를 통합하고 EdU 양성 세포의 반자동 정량화를 간략하게 설명합니다.

정점 아웃 장 오가노이드 생성 및 EdU-라벨링을 사용한 오가노이드 증식 속도 평가

이 연구는 조직 줄기세포에서 유래한 장 오가노이드를 이용한 세균 감염의 시험관 내 조사 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 2차원에서 오가노이드를 배양하고 구분하는 방법, 침착성 대장균으로 감염시키는 방법, 그리고 상피 장벽 돌파, 감염 영상, 상피 RNA 반응 등 주요 측정값을 평가하는 방법을 설명합니다.

숙주-박테리아 상호작용을 연구하기 위한 침입 또는 저저막 추출물에 적용한 2차원 오가노이드 배양

배우세요 BSL-3 조건에서 단일 세포 RNA 시퀀싱을 활용한 인간 장 오르가노이드 바이러스 감염 프로토콜. 이 방법은 숙주-병원체 상호작용을 단일 세포 수준에서 연구하는 데 필수적입니다.

생체 안전 수준 3 (BSL-3) 조건 하에서 병원체 감염 및 단일 세포 염기서열분석에 대한 위장 오르가노이드 적응

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