Name: 광학 핀셋을 사용하여 감금된 세포 전 역학의 직접 힘 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: 배우세요 광학 핀셋을 이용한 Danio rerio 배아 세포의 핵 역학 직접 힘 측정 방법입니다. 세포막 손상 없이 핵 경도와 세포 내 구조를 정밀 분석하여 세포 극성 및 이동 연구에 활용할 수 있습니다.

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MK는 계획 Nacional (PGC2018-097882-A-I00), FEDER (EQC2018-005048-P), R&D 우수 센터세베로 오초아 프로그램 (CEX2019-0009-S009.S009)을 통해 스페인 경제 및 경쟁력부의 재정 지원을 인정합니다. RYC-2016-21062), Fundació Privada 셀렉스, 펀다시오 미르 푸이그, 그리고 CERCA 및 연구 프로그램(2017 SGR 1012)을 통해 일반타트 드 카탈루냐에서 ERC(메카노시스템즈) 및 HFSP(CDA00023/2018)를 통한 자금 지원. V.R.은 스페인 과학 혁신부로부터 EMBL 파트너십, 센트로 드 엑셀렌시아 세베로 오초아, 마네코의 계획 나시오날(BFU2017-86296-P, PID2020-117011GB-I00) 및 일반 타말루냐(CERCACA)의 지원을 인정합니다. V.V.는 마리 스크와도우스카-퀴리 보조금 협정665884에 따라 유럽 연합의 호라이즌 2020 연구 및 혁신 프로그램에 의해 투자된 ICFOstepstone 박사 프로그램의 지원을 인정합니다. 우리는 원고의 비판적 독서에 대한 Arnau Farré 감사합니다; 마리아 마르살의 이미징 및 장착에 도움을 위한 24 hpf 배아; 센다 지메네즈-델가도는 제브라피시 미크로제스로 지원합니다.

저자는 공개 할 것이 없습니다.

이 프로토콜에서, 우리는 살아있는 세포 안쪽에 세포 핵의 기계적 특성을 심문하는 유일한 방법을 기술합니다. 다른 힘 분광법 기술과는 달리, 비침습적 광학 포획은 세포막과 세포골격의 기여를 세포 핵 강성으로부터 분리할 수 있게 해 주었다. 중요한 것은, 광학 현미경 조작은 다중 모달 현미경 검사법과 호환됩니다, 이는 실험자가 세포 핵 메카노생물학에 관련있는 다른 프로세스를 공부할 수 있게 합니다. 대표적인 결과로, 우리는 수백 개의 피코뉴턴 의 질서의 힘에 의해 수행된 들여쓰기시 핵 변형을 측정하기 위해 DNA-Hoechst 염색을 사용했습니다.
이 프로토콜에 설명된 예제를 넘어 당사 방법의 잠재적 응용 프로그램 외부 의 동요없이 살아있는 세포 내부의 측정에서 정량적 기계적 정보를 추출 할 수있는 가능성은 탐구하기 시작한 전례없는 기회의 과다를 가능하게합니다. 따라서 광학 미세 조작 플랫폼의 제시된 프로토콜은 다재다능한 보다 복잡한 실험으로 확장될 수 있습니다. Acousto-optic 디플렉터(AOD)는 다양한 셀 위치에 걸쳐 동기력 측정을 위한 여러 광학 트랩을 생성할 수 있을 뿐만 아니라 넓은 주파수 범위에서 활성 미세화학에 사용될 수 있다51,61. 언급했듯이, 들여쓰기시 힘 반응은 최대 포획력을 극복할 수 있으며, 이는 광학 트랩에서 비드의 탈출으로 이어진다. 이 경우, 광학력을 클램프하기 위해 AOD로 힘 피드백을 구성할 수 있다. 모두 모두, 이러한 프로토콜에 기재된 응력 이완과 같은 다중 미세화학적 접근법은 또한 활성 미세화학 또는 크리프 컴플라이언스, 이 플랫폼을 통해 실험적으로 획득하고 새로운 소프트웨어 패키지61,62,63,64,65에 의해 철저히 분석될 수 있다. . 더욱이, 힘의 적용은 핵에 국한되지 않고, 손상되지 않은 혈관 내부에 흐르는 적혈구를 트래핑하거나 엽록소세포와 미토콘드리아68을 트래핑 및 변형시키기 위해 입증된 바와 같이 다양한 세포내 구조 및 복잡한 조직에서 측정하기 위해 원칙적으로 수행될 수 있다. . 광운동 보정은 갇힌 물체의 모양과 크기와 무관하므로 임의의 모양으로 임의의 힘 프로브에 대한 직접 력 측정을 가능하게 합니다38,39. 주입된 마이크로스피어를 사용하면 세포 구조의 직접 조작에 비해 레이저 전력이 상대적으로 낮은 핵에 높은 힘을 적용할 수 있었습니다69,70,71. 그러나 굴절률 차이가 충분히 높다는 점을 감안할 때, 외부적으로 적용된 힘 프로브는 필요하지 않으며 세포내 세포기관들은 주입된 비드(미공개 관측 및 참조70)없이 직접 조작할 수 있다.
응용 프로그램을 확장하는 방법의 잠재적 수정 마이크로비드의 크기는 실험에 따라 주입될 수 있지만 상대적 컨트롤은 수행해야 합니다. 예를 들어, 나중에 세포를 연구하기 위해 더 작은 구슬을 주입할 수 있다. 이렇게 하면 광학 트랩에 의해 가해질 수 있는 최대 힘이 줄어듭니다(예: 참조55에 도시됨). 더 큰 구슬은 더 높은 힘을 발휘하기 위하여 주입될 수 있습니다, 그러나 이들은 그들의 규모 또는 관심의 단계에 따라서 태아 발달에 영향을 미칠 수 있습니다. 미생물 분사가 옵션이 아닌 실험에서, 세포질에 비해 굴절성 지수 차이를 나타내는 다양한 세포기관은 여전히 광학적으로 조작될 수 있어 광모멘텀 변화로부터 측정가능한 광학력을 야기한다42. 위에서 언급했듯이, 이러한 방법은 Drosophila 배아70에서 세포 세포 접합을 변형시키기 위해 Bambardekar 외에 의해 사용되었습니다. 마찬가지로, 세포의 핵은 주변 매체44보다 굴절률이 낮으며, 이는 낮은 트래핑 강도에도 불구하고 구슬없는 들여쓰기(미공개 관측 및 참조72)를 허용합니다. 따라서 핵은 쉽게 포획될 수 없으며 함정을 탈출합니다.
스핀 코팅 PDMS 스페이서는 편리하고 빠른 방법을 통해 제작되지만 마이크로 /나노 제조 시설 이나 엔지니어링 실험실에 액세스하지 않고 실험실에 대한 손이 닿지 않을 수 있습니다. 따라서, 스페이서는 실험실 테이프 또는 파라필름(step 4)으로부터 쉽게 조립될 수 있다. 또한 이 프로토콜은 단일 세포의 전달을 미리 정의된 측정 우물또는 정의된 높이로 챔버로 자동화하는 미세유체 채널을 제조하여 동일한 시편 내에서 감금 효과를 추정할 수 있습니다. 그러나, 이러한 미세유체 장치는 현미경 목표와 광력 센서의 수집 렌즈 사이의 공간에 맞게 설계되어야 하며, 약 2mm(3단계 참조). 분산으로 인한 광학 수차가 광자 모멘텀 측정에 영향을 미치지 않도록 광학 력 센서를 적절한 높이에 배치해야 합니다.
다른 수정은 생물학적 기자의 변화를 포함 할 수있다. 우리는 Hoechst 형광이 GFP 채널로 관상적으로 출혈한다는 것을 것을을 발견하고 우리는 이렇게 두 개의 형광 채널에서 동시 측정을위한 핵 마커로 mCherry 태그 히스톤과의 조합을 선호합니다. 대안적으로, 핵 변형은 Lap2b-GFP와 같은 내부 핵막을 대상으로 하는 라벨로 쉽게 추적될 수 있다(도 2).
세포 핵에 들여쓰기는 2-3 미크론의 순서였으며, 회절 제한 방사 디스크 공초점 현미경 검사법의 이미지 분석에 의해 정확하게 측정할 수 있었습니다. 더 단단한 핵 또는 더 작은 힘의 경우, 들여쓰기는 이 접근을 사용하여 거의 측정할 수 없을 것입니다. 그러나, 절대힘 보정 광학 핀셋은 나노미터 정확도를 가진 BFP 간섭요법을 사용하여 시상에서 갇힌 비드의 위치 측정을 위해 보정될 수도 있다51. 이러한 접근법을 이용하여 전압 신호와 광학력 센서는 매개변수 β [nm/V]를 통해 트랩된 프로브의 위치로 변환될 수 있으며, 불변 매개변수는 [pN/V]α 전술한 광 모멘텀 보정을 통해 강제로 값을 산출합니다(자세한 내용은 아래 참조).
문제 해결 실험 중에 다음과 같은 문제가 발생할 수 있음을 발견했습니다.
안정된 트랩이 형성되지 않고 마이크로스피어가 쉽게 빠져나가지 않습니다. 현미경 목표 또는 잘못 정렬 된 보정 칼라에 어떤 먼지는 안정적인 함정의 실패로 이어질 수 있습니다. 즉각적인 솔루션을 찾을 수 없는 경우 목표 렌즈의 포인트 스프레드 기능을 측정합니다. 관심있는 표본이 광학적으로 조밀 한 조직 내부에 깊은 경우, 레이저 초점은 불안정한 트래핑으로 이어지는 심각한 광학 수차를 경험할 수 있습니다 (이 효과는 일반적으로 고립 된 세포에서 무시할 수 있지만 두꺼운 조직에서 더 분명해집니다). 높은 강성의 경우, 핵의 복원력은 마이크로피어가 손실되고 들여쓰기 루틴이 실패하도록 트랩의 탈출력을 초과할 수 있다. 처음에, 광학 트랩에 핵 막 가장자리 근위체는 거의 들여쓰기되지 않습니다 (그림 S2A). 이 경우 트래핑 레이저는 더 이상 힘 및 브라운 모션의 영향을 받지 않으며, 이는 힘 저하를 0으로 유도하고 신호 노이즈의 감소(도S2B). 이 경우 레이저 파워가 증가하여 더 강한 트랩을 가질 수 있고, 비드를 핵으로 밀어넣는 사다리꼴 궤적의 진폭이 감소될 수 있거나, 또는 갇힌 미생물의 초기 위치는 핵에서 더 멀리 설정될 수 있다.
세포가 자극 중에 움직이고 있습니다. 세포가 충분히 부착되지 않으면, 광학 그라데이션 트랩은 세포 내 들여쓰기 루틴을 수행하면서 세포를 이동하여 핵의 힘과 기본 역학이 관절이 될 수 있도록 합니다. 전체 세포의 변위를 방지하기 위해, 우리는 표면에 세포 접착 분자의 농도를 증가하는 것이 좋습니다, 예를 들어, ConA.
초기 모멘텀 보상 초기 모멘텀 보상 루틴이 OT 플랫폼(6.5단계)에서 사용할 수 없는 경우, 인위적이고 독립적인 기준 선신호가 수정되어야 합니다. 이는 구슬이 갇혀 있지 않더라도 힘 곡선의 경사로 볼 수 있습니다(그림 S1E). 보정을 수행하려면, 정확히 동일한 위치에서 셀의 외부, 구드없이 동일한 궤도를 수행 할 필요가있다. 이를 위해 스테이지 컨트롤을 사용하여 셀을 트랩에서 멀리 이동합니다. 참조로, 힘 오프셋은 우리 시스템의 200 mW에서 FOV에 걸쳐 5 pN을 변경합니다. 따라서, 그것은 짧은 궤적을 위해 무시할 된다. 대안적으로, 압착기 스캔 스테이지는 레이저 위치를 일정하게 남기고 시료상에서 세포를 이동하는 데 사용될 수 있다.
제시된 프로토콜의 중요한 단계 마이크로스피어는 배아에 대한 최대 분포를 보장하기 위해 오른쪽, 1세포 단계에서 주입되어야 한다. 구슬은 이미징에 사용되는 형광 채널로 빛이 누출되지 않도록 형광이 되어서는 안됩니다. 예를 들어, 일반적인 적색 형광 구슬조차도 휘도 (여기: 405 nm; 방출 : 445 nm)로 인해 Hoechst 염색 후 세포 핵을 이미징하는 데 사용되는 파란색 채널에서 명확하게 볼 수 있습니다. 기판에 셀의 안정적인 부착은 들여쓰기 루틴 동안 측면 변위를 방지하는 것이 중요합니다. 루틴 중에 셀이 이동하는 경우 힘이 과소 평가됩니다. 이러한 일이 자주 발생하면 첨부 프로토콜을 최적화합니다. 조직 배양 세포의 경우, 다른 세포 접착 단백질, 섬유넥틴, 콜라겐, 또는 폴리 L-리신과 같은 만족스러운 부착(미공개 관찰)이 발생합니다. 감금 하는 동안, 세포는 갑작스럽고 심각한 기계적 스트레스를 받게 됩니다. 이것은 세포에 손상을 일으키는 원인이 될 수 있고 절차가 신중하게 수행되지 않는 경우에 실험자가 파열한 세포를 자주 만날 것입니다. 또한 감금 높이가 너무 작으면 모든 세포가 핵 포위 파손 또는 돌이킬 수없는 손상으로 고통받을 수 있습니다. 이를 완화하기 위해 상부 커버슬립을 더 느리게 낮추고 커버슬립 사이의 간격을 늘립니다.
이를 극복하기 위한 기술과 제안의 한계 이 기술의 명확한 한계는 수차와 불안정한 트래핑으로 이어지는 조직의 깊은 부분으로 레이저 광을 침투시키는 것입니다. 따라서, 침투 깊이의 하한은 시료의 선명도, 사용될 수 있는 수차 보정에 따라 달라집니다73 및 적용된 레이저 전력. 더 높은 레이저 전력이 마이크로스피어 부근의 시료의 열 흥분으로 이어진다는 점을 고려해야 합니다. 그러나, 1064nm 파장 레이저 스팟에서 유래한 시료의 가열은 우리의 생물학적 샘플에 그럴듯한 열 관련 응을 피하기 위해 최소화된다74.
또 다른 제한사항은 측정할 수 있는 최대 힘입니다. 직접 광-모멘텀 검출은 광학 트랩40,41의 선형 응답 체제를 훨씬 뛰어넘는 힘 측정을 가능하게 하지만, 최대 적용 힘은 수백 picoNewtons의 순서입니다. 이는 일반적으로 0.1 또는 0.344보다 크지 않은 연생물학적 물질의 레이저 전력 및 결과적 손상 임계값 및 굴절률 차이에 의해 제한됩니다. 예를 들어 구조화 된 light75, 반사 방지 코팅 된 마이크로스피어76, 고굴성 지수 입자77 또는 고도로 도핑된 퀀텀닷78을 사용하여 힘 검출 한계를 높이기 위한 몇 가지 방법이 제안되었다.
OT는 BFP 간섭측정을 통해 나노미터 규모의 위치 측정에 사용될 수 있으며, 이러한 트랩 내의 비드의 위치는 Δx = β Sx이며, 여기서 Sx는 센서의 전압 신호이며, β [μm/V]는 서로 다른 프로토콜에 따라 즉석에서 교정될 수 있다35,54. 광학 력 센서의 경우, 전압-힘 불변 변환 계수 [pN/V]α 직접 β 및 트랩 강성, k [pN/μm], α =kβ 37을 통해 광학 이미징에서 검출하기에는 너무 작은 비드 변위를 실험하는 데 사용할 수 있으며, 이 전략은 작은 검출 위치로 힘 측정을 보완하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 여기에 제시된 실험 루틴을 매우 뻣뻣한 핵에 적용하여 합리적인 레이저 힘(200-500 mW)에서 힘을 충분히 크게 들여쓰기 값을 유도하기에 충분하지 않다. 이 경우, 비드는 핵과 접촉하여 가져와야 하며 트래핑 강성은 측정 전에 교정되어야 한다(단계 8.6). 힘의 함수로서 핵의 들여쓰기 D는 간접적으로 다음과 같이 결정될 수 있다:
d = xtrap - F /k
여기서 xtrap은 트랩 위치입니다. [pN/V]α 불변광 모멘텀 계수와 는 달리, 입자 크기, 광학 트랩 스팟 크기 및 상대 굴절률과 같은 트래핑 역학을 결정하는 많은 로컬 변수에 따라 달라지므로 각 실험 전에 [μm/V]β 인자 β 보정해야 합니다.

조직 형태 발생은 생화학적 신호와 물리적 힘이 현시적으로 조정되는 복잡한 과정입니다. 개발 배아에서 생화학 신호 인자의 그라데이션은 운명 사양을 지시하고 올바른 조직 패터닝1,2을 보장합니다. 동시에 본질적이고 외적인 힘은 배아의 건축을 구축하는 데 역할을한다3,4. 이 맥락에서 세포 피질 역학의 영향은 광범위하게 공부했습니다5,6. 형태 발생 시 메카노 화학 공정 간의 엄격한 상호 연결은 조직 미세 환경에서 기계적 힘을 감지하고 반응하기 위해 단일 세포의 특성에 의존합니다. 세포는, 그로 기계적 신호를 세포 거동, 세포 운명 및 세포 역학을 제어하는 특정 신호 경로로 기계적 정보를 변환하는 힘에 민감한 세포 및 분자 원소의 존재를 통해 디코딩한다.
발달 과정의 특징은 세포가 다세포 구조를 구축하기 위해 그룹으로 조직한다는 것입니다. 이와 같이, 단 하나 세포는 거의 재배열하고 혼자 이동하지만 그들은 supracellular 마이그레이션등 집단 행동을 표시하는 단단한 사회토프에 연관된다7, (un) 방해 전환8,9 또는 배반구 제10. 세포 안팎에서 생성된 기계적 힘은 집단 세포 역학을 지시하는 중요한 단서역할을 한다7,11. 그러나 세포가 조직 시트 또는 좁은 조직 틈새 시장 사이그들의 방법을 짜내는 전구 세포와 같은 혼자 움직일 때조차, 3차원 환경을 탐색할 때 광대한 이소성 기계력을 경험합니다. 세포에 이러한 기계적 스트레스는 세포 행동에 깊은 결과를 가지고12,13. 조밀한 3D 조직 환경 내에서 이동 하는 동안 수동 또는 활성 기계적 요소로 주요 메카노 트랜스유도 원소14,15로 핵에 수렴 하는 몇 가지 메커니즘을 조사 되었습니다15,16.
우리는 최근에 탄성 세포 내 메카노 게이지12로 핵을 사용하여 모양 변형을 측정하기 위하여 세포를 장비하는 기계장치를 제안했습니다. 핵은 세포에서 가장 큰 세포기관인 세포가 기계적 스트레칭, 감금 또는 삼투압하에서 형성을 편광, 이동 또는 변경할 때 큰 변형을 겪습니다16,17,18,19. 우리는 핵의 세포 내 포지셔닝과 함께 핵 봉투가 세포 변형의 크기와 유형에 대한 정보를 세포에 제공한다는 것을 발견했습니다 (예 : 세포 압축 대 세포 팽윤). 핵의 스트레칭은 내부 핵막 (INM)의 전개와 관련이 있으며, 이는 INM에서 칼슘 의존cPLA2 (세포 성 인지질A) 리파제 활성을 촉진하고 아라치도니아산 (AA)의 방출 과 세포 피질에서 myosin II의 신속한 활성화와 관련이 있습니다. 이것은 피질 수축의 임계값 이상 증가한 세포 수축 및 아모에보이드 세포 이동으로 이끌어 냅니다6. 세포 변형에 대한 기계적 반응은 1분 이내에 발생하며 감금 시 가역되며, 이는 핵이 기계적 응력 조건 하에서 적응세포 거동을 조절하는 세포 프로트리오셉션에 대한 스트레인 게이지역할을 한다는 것을 시사한다. 이 메카노감성 통로는 다능성 및 계보 전념 세포12모두에서 제브라피시 배아로부터 유래된 전구줄기 세포에서 활성화되어 있으며 상이한 종 및 세포주에서 보존된다20.
세포-메카노센서로서의 핵특성 외에도 핵구조와 역학은 개발 중 및 세포 운명 사양에 대한 대응으로 본질적으로 조절되며, 따라서 세포 메카노-감도22,23을 튜닝한다. 그 결과는 변주에서 철새로의 전환과 그 반대의 경우도 마찬가지인 핵 준수의 변화일 수 있습니다.
세포 핵 역학을 측정하는 몇 가지 기술이 적용되었습니다, 원자력 현미경 과 같은 24,25, 마이크로 파이펫 포부 26,27, 미세 유체 기술28, 마이크로 니들29. 그러나, 이러한 기술의 대부분은 전체 세포가 변형되어야 한다는 점에서 침략적이며, 핵 자체의 기계적 특성 및 힘 의존 반응의 측정을 제한한다. 세포 표면과 메카노감감성 세포 피질30의 동시 변형을 우회하기 위해, 분리된 핵은 다양한 문맥31,32에서 연구되었다. 그러나 핵 고립은 기계적 핵 특성의 변화와 그 규정(참조24 및 공개되지 않은 관측)과 관련이 있다는 것을 배제할 수 없습니다.
광학 핀셋(OT)은 세포 기계에서 과다한 실험을 허용한 다목적 기술로 분자 기계가 화학 물질을 기계적 에너지로 변환하는 방법에 대한 우리의 이해에 중요한 역할을 해왔습니다. 광학 핀셋은 단단히 초점을 맞춘 레이저 빔을 사용하여 주변 매체33보다 굴절률이 높은 유전체 입자에 광학력을 발휘합니다. 이러한 힘은 수백 개의 피코-뉴턴의 순서일 수 있으며 레이저 트랩 초점 내에서 입자를 효과적으로 감금하여 갇힌 입자를 3차원으로 조작할 수 있습니다. 빛의 사용은 측정이 살아있는 세포 내부에서 비침습적으로 수행 될 수 있다는 점에서 중요한 장점이 있습니다. 광학 조작은 레이저 빔의 트랩 초점으로 더욱 제한됩니다. 따라서, 조작은 주변 세포막을 자극하지 않고 수행될 수 있으며 이온 채널의 힘에 의존하는 활성화와 같은 플라즈마 멤브레인에서 액틴 피질 또는 메카노감성 공정을 교란시키지 않는다.
광학 트위저 접근법의 난이도는 근접 분할 정리 또는 정의된 스토크스-드래그 력의 사용에 기초하여 간접력 보정에 의존하는 고전적인 접근 방식을 사용하여 마이크로스피어에 적용된 힘을 정밀하게 판단하여 레이저 전력 의존탈출력35를 측정하는 것이다. 이러한 방법은 체외 실험에서 구현하는 것이 간단하지만 일반적으로 셀룰러 환경으로 변환할 수 없습니다. 모멘텀 보존의 첫 번째 원칙에서 파생 된 직접 힘 보정에 의존하는 분야에 몇 가지 전략이 도입되었습니다36,37. 다른 힘 분광법 접근법과 달리, 힘 측정은 임의로 모양의 갇힌 입자38,39와 빛 모멘텀의 로컬 교환에서 추론된다38,39. 실험용 셋업에서는 광학력으로 인한 광모멘텀의 변화는 시투 트랩 보정40,41,42,43의 필요 없이 직접 측정됩니다. 따라서, 세포 내부 또는 조직 내와 같은 점성 환경에서 측정이 가능해지고, 힘은 pN 수준으로 쉽게 정량화될 수 있다.
이 프로토콜에서는 세포내 세포기관 이나 구조를 기계적으로 조작하고 광학 트위저 설정으로 기계적 특성을 정량적으로 평가하는 분석방법을 설명합니다. 이 설정은 회전 디스크 형광 현미경으로 통합되어 세포 거동 또는 세포 내 역학의 병렬 이미징을 가능하게 합니다. 분석법은 핵과 같은 특정 세포 구획의 기계적 특성의 특성화를 동시에 연구하면서 변형 자체의 결과로 분자 신호 경로의 가능한 메카노반응 및 활성화를 가능하게 합니다. 더욱이, 세포 내에 주입된 마이크로비드의 광학 트래핑은 폴리스티렌 비드(n=1.59)의 굴절률(n=1.59)의 상당히 높은 굴절률 덕분에 들여쓰기력의 증가를 허용한다444 핵의 본질굴절성 대조444 에 비해 세포질(n~1.38). 제시된 전략은 그밖 세포내 구조 및 세포기관의 연구 결과, 뿐만 아니라 액티브 한 미세 학을 관련시키는 그밖 접근, 동시에 동일/상이한 세포 체형 구조물을 탐구하기 위하여 다중 광학 트랩의 사용 및 살아있는 태아에 있는 세포 역학을 표적으로 하는 측정에 쉽게 적응될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>#1.5 22mm 커버 안경</td><td>Ted Pella</td><td>260148</td><td></td></tr><tr><td>#1.5 22x60mm 커버 안경</td><td>Ted Pella</td><td>260152</td><td></td></tr><tr><td>#1.5H 유리 바닥 접시</td><td>Willco</td><td>GWST-5040</td><td></td></tr><tr><td>10-um 구슬</td><td>Supelco</td><td>72986</td><td></td></tr><tr><td>1mm 유리 모세관</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0020 GC100F-15</td><td></td></tr><tr><td>1-um 폴리스티렌 마이크로비즈</td><td>Sigma</td><td>89904</td><td></td></tr><tr><td>1-um 적색 형광 구슬</td><td>ThermoFisher</td><td>F8816</td><td></td></tr><tr><td>한천</td><td>ThermoFisher</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>Aqcuisition 카메라 sCMOS</td><td>Andor</td><td>Sona-4BV11-UNI</td><td></td></tr><tr><td>보조 카메라(그림 3, AUX)</td><td>Blackfly, FLIR</td><td>BFS-U3-200S6M-C</td><td></td></tr><tr><td>Calbryte 520</td><td>AAT Bioquest</td><td>520 AM</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5453000011</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>Sigma</td><td>C5275</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D2906</td><td></td></tr><tr><td>DNA-Hoechst</td><td>ThermoFisher</td><td>33342</td><td></td></tr><tr><td>더블 스카치 테이프</td><td>Biesse Adesivi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>E3</td><td>5 mM NaCl. 0.17 mM KCl. 0.33 mM CaCl2. 0.33 mM MgSO4</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti2</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>집게</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>GPI-GFP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>H2A-mCh</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>이미지 수집 소프트웨어</td><td>Fusion-Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immersion Oil</td><td>Cargille</td><td>Type B : 16484</td><td></td></tr><tr><td>IR 보호 googles</td><td>Thorlabs</td><td>LG1</td><td></td></tr><tr><td>Lap2b-eGFP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로 로더 피펫</td>, <td>Eppendorf</td><td>GELoader</td><td></td></tr><tr><td>Microinjector</td><td>, World Precision Instruments</td><td>SYS-PV820</td><td></td></tr>, <tr><td>MicroManager 2.0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromiter slide</td><td>, ID5243, GXMGRAT-5, 5mm/100 divisions,</td><td></td><td></td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td>, Sigma</td><td>M3616</td><td></td></tr><tr><td>전동 스테이지</td><td>ASI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>니들 풀러</td><td>셔터 기기 Co.</td><td>모델 P-97</td><td></td></tr><tr><td>광학 핀셋 플랫폼</td><td>Impetux Optics</td><td>Sensocell</td><td></td></tr><tr><td>OTs 소프트웨어(LightAce)</td><td>Impetux Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Sigma</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>PDMS 경화제</td><td>Sigma</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>후처리 소프트웨어(Matlab)</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAse free water</td><td>Thermofisher</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>단역 통과 이색성 거울 (그림 3, IR-F)</td><td>Semrock</td><td>FF01-950/SP-25</td><td></td></tr><tr><td>스핀 코팅기</td><td>특수 코팅 시스템</td><td>Spincoat G3P-8</td><td></td></tr><tr><td>회전 디스크 컨포칼 현미경</td><td>Andor</td><td>DragonFly 502</td><td></td></tr><tr><td>실체 현미경</td><td>Leica M80</td><td></td><td></td></tr><tr><td>삼각형 미세 사출 금형</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>TU1</td><td></td></tr><tr><td>범용 오븐</td><td>Memmert</td><td>UNB 200</td><td></td></tr><tr><td>침수 대물</td>렌즈 <td>Nikon</td><td>MRD07602</td><td></td></tr></tbody></table>

광학 핀셋을 사용하여 감금된 세포 전 역학의 직접 힘 측정

Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers

다세포 유기체의 발달 도중, 단 하나 기름지게 한 세포는 분할하고 다양한 기능을 가진 다중 조직을 초래합니다. 조직 형태 발생은 세포 외 기계적 특성의 변화를 초래하는 단일 세포 수준에서 분자 및 구조적 변화와 함께 진행됩니다. 결과적으로 동일한 셀 내에서도 다른 세포기관과 구획은 기계적 스트레스에 다르게 저항합니다. 그리고 메카노트랜스덕션 경로는 기계적 특성을 적극적으로 조절할 수 있습니다. 따라서 조직 틈새 시장의 미세 환경에 적응하는 세포의 능력은 부분적으로 기계적 스트레스를 감지하고 반응할 수있는 능력 때문입니다. 우리는 최근에 핵 변형과 포지셔닝이 세포가 물리적 인 3D 환경을 측정할 수 있게 하고 세포 모양의 변화를 해독하기 위해 proprioception의 감각으로 세포를 부여하는 새로운 메카노센성 패러다임을 제안했습니다. 이 문서에서는, 우리는 신봉세포 및 기계적으로 제한된 세포에 예시된 살아있는 세포 안쪽에 세포 핵을 형성하는 힘 및 물질적 특성을 측정하는 새로운 방법을 설명합니다. 측정은 세포 내부의 광학 트랩으로 비침습적으로 수행 될 수 있으며, 힘은 빛 모멘텀의 교정없는 검출을 통해 직접 접근 할 수 있습니다. 이를 통해 핵의 역학을 세포 표면 변형과 독립적으로 측정하고 외식 및 중식 메카노트랜스듀션 경로의 해부를 허용할 수 있습니다. 중요한 것은, 포획 실험은 세포골격, 칼슘 이온 또는 핵 형태학의 형광 화상 진찰을 사용하여 세포 반응 및 세포 역학을 조사하기 위하여 광학 현미경 검사법과 결합될 수 있습니다. 제시된 방법은 강제 측정을 위한 상용 솔루션과 호환되며, 미토콘드리아, 스트레스 섬유 및 내구와 같은 다른 세포전구의 역학을 쉽게 조사하기 위해 쉽게 확장할 수 있습니다.

여기서, 우리는 광학 트랩에 의한 직접 힘 측정을 통해 3차원 감금에서 격리된 배아 제브라피쉬 세포의 세포내 기계적 특성을 조사하는 프로토콜을 제시한다.

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue ...

이 프로토콜은 세포 편광, 분화 및 마이그레이션을 위한 기계적 게이지로 만드는 세포 핵의 개별 기계적 특성을 해부합니다. 이 기술의 주요 장점은 기계적 특성을 측정하고 멤브레인 또는 피질 순환 골격의 외부 교란없이 세포 전구에 힘을 적용할 수 있다는 것입니다. 프로토콜은 다른 세포주 또는 동물 모델에서 핵 역학을 연구하기 위해 다른 유기체의 다른 세포 내부의 구슬을 조작하기 위해 쉽게 적응할 수 있다.직접 힘 센서의 정렬은 광학 트랩을 생성하고 떠나는 모든 빛을 포착하는 데 중요합니다. 이렇게 하면 셀의 점탄성 배지에서 정확한 광 운동량 측정을 보장합니다. 플라스틱 파스퇴르 파이펫을 사용하여 E3 매체를 함유한 유리 접시에 구 단계 배아를 4시간 후 수정하여 단일 세포 준비를 시작합니다.그런 다음 구슬에 양성배들을 선택하고 mRNA 주입시 형광 단백질을 발현한다. 집게를 사용하여 배아를 수동으로 데큐게하고 유리 파스퇴 르 피펫의 도움으로 약 10 에서 15 개의 감산 배아를 1.5 밀리리터 반응 용기로 옮기. 튜브에서 E3 미디어를 제거하고 사전 온난화 된 이산화탄소 독립적 인 조직 배양 배지의 500 마이크로 리터를 추가합니다.거품 형성을 피하는 튜브를 부드럽게 흔들고 세포가 눈에 보이는 큰 덩어리없이 해리됨에 따라 튜브의 내용이 탁상되도록합니다. 그런 다음 튜브를 200배 G로 3분간 원심분리합니다. 원심 분리 후, 상체를 제거하고 펠릿을 수집하여 세포 염색을 진행한다.핵을 표지하려면 새로 준비된 DNA Hoechst 염색 용액의 500 마이크로리터를 튜브에 추가하여 세포를 다시 중단합니다. 얼룩진 세포를 어둠 속에서 7분간 배양합니다. 다음으로, 앞에서 설명한 바와 같이 세포를 원심분리하고 현탁액시 시료에 대한 DMEM의 50 마이크로리터 또는 감금된 세포를 위한 DMEM의 20 마이크로리터에서 펠릿을 재연한다.서스펜션에서 세포를 실험하기 위한 광학 트랩 또는 OT 챔버의 제조를 위해, 중앙에 약 10밀리미터 x 10밀리미터 평방 홀로 양면 스카치 테이프 조각을 잘라냅니다. 테이프의 보호 층 중 하나를 벗겨 번호 1.5 H 유리 바닥 접시의 중앙에 테이프의 발견 된 측면을 배치합니다. 테이프를 부드럽게 눌러 테이프의 모든 표면이 유리에 부착되고 기포를 피하고 테이프의 나머지 보호 층을 벗겨냅니다.30 분 동안 밀리리터 당 0.5 밀리그램에서 Concanavalin A의 100 마이크로 리터로 표면을 배양하십시오. 그런 다음 Concanavalin A의 방울을 제거하고 DMEM으로 표면을 헹군다. 세포를 포함하는 용액의 마이크로리터 30대를 캐비티 표면에 추가합니다.그런 다음 22 by 22 mm 커버 유리로 챔버를 매우 부드럽게 닫습니다. 필요한 경우 메스 나 집게를 사용합니다. 다음으로, 실험 전에 최소 30분 동안 레이저를 상당히 높은 전력으로 켜서 광학 핀셋 스타트업을 시작하여 출력 전력 안정성을 최적화합니다.완료되면 광학 마이크로 조작 및 힘 측정 장치의 전자 모듈을 켭니다. 광학 력 센서를 정렬하기 전에 60X 1.2 수분 침수 목표에 물방울을 넣고 세포가 함유된 챔버를 무대에 놓습니다. 셀 샘플이 배치될 챔버의 하부 표면에 초점을 맞춥니다.시료를 덮는 커버 글래스 슬라이드 위에 침지 오일의 액적을 추가 한 후, 오일 액적에 닿을 때까지 힘 센서 장치의 수집 렌즈를 낮춥춥다. 광학 력 센서 정렬에 대한 표준 절차에 따라, OT를 배치하는 데 사용되는 보조 카메라의 샘플 평면 이미지를 본 다음 현장 정지가 샘플 평면에 공표 될 때까지 광학 힘 센서를 낮춥니다. 버트 랜드 렌즈로 기포를 확인하려면 보조 카메라를 통해 이미징 경로를 관찰하십시오.먼지나 기포가 보이면 설명된 대로 시술을 반복하기 전에 먼지가 없는 렌즈 조직으로 렌즈와 챔버를 청소하여 더 많은 침지 오일을 추가합니다. 광학 력 센서의 홀더에 배치된 측면 나사를 사용하여 필드 스톱을 시야로 중앙에 배치합니다. 정확도를 위해 보조 카메라에 보이는 시야를 차지하기 위해 필드 정지를 거의 엽니다.현미경에 샘플을 배치하고 광학 힘 센서를 정렬 한 후, 핵 또는 세포 간 구조의 강성이 알려지지 않은 경우 초기 트랩 전력을 200 밀리와트로 설정하기 위해 회전 반파 판을 사용합니다. 일단 완료되면, 현미경 단계 소프트웨어 컨트롤러를 사용하여 전송 된 브라이트 필드 현미경 검사를 통해 하나 또는 두 개의 구슬이있는 세포를 찾습니다. 숫자 시트에 각 후속 궤적 단계의 변위와 시간을 적는다.또는 보조 재료로부터 테이블 S1을 로드합니다. 스트레스/이완 실험을 위해 사다리꼴 하중을 적용하도록 프로그래밍합니다. OT 소프트웨어에서 광학 트랩을 활성화합니다.마이크로스피어를 트래핑하려면 현미경 스테이지 소프트웨어 컨트롤러로 이미지 평면을 비드 위에 약간 설정합니다. 보정된 보조 카메라 이미징 창에서 폴리스티렌 마이크로비드를 클릭합니다. 광학 트랩에 의한 비드의 성공적인 감금은 비드의 움직임을 강력하게 감소시다.비드를 클릭하고 세포질을 가로질러 드래그하여 핵 봉투에서 약 2미크론의 거리에 놓습니다. 구드 들여쓰기가 핵멤브레인에 수직이 되도록 궤도가 설정되어 있는지 확인합니다. 설정이 준비되면 이미징 소프트웨어로 이동하여 수집 버튼을 클릭하여 이미지 수집을 시작합니다.실시간 힘 읽기 창을 열고 데이터를 클릭하고 저장하려면 실시간 힘 읽기 창에 저장합니다. 트랩 위치 및 강제 측정 데이터를 시작합니다. 구드를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 시작 궤적을 선택하여 이전에 로드된 궤적을 시작합니다.궤적이 완성되고 시스템이 안정될 때까지 기다렸다가 트랩 력 측정 데이터의 기록을 완료합니다. 이미지 수집을 중지하고 후처리 소프트웨어에서 결과를 플롯합니다. 대표적인 분석에서, 핵에 가까운 단일 마이크로피어를 가진 단단제피 전구 줄기세포가 전시된다.태아 내부의 5시간 후 주입 후 폴리스티렌 마이크로스피어의 분포를 모니터링했다. 브라이트필드와 형광 이미지는 구슬이 배아 조직 전체에 분산되어 있음을 보여줍니다. 공초점 형광 Z 스택의 최대 투영 및 동일한 영역에서 서브 스택의 최대 투영은 깊은 세포의 큰 분수가 1 ~ 2 개의 구슬을 포함한다는 것을 확인합니다.수정 후 24시간, 비드는 배아의 전신에 분포되었다. 하나 또는 두 개의 주입 된 비드와 제한된 세포에 서스펜션 세포의 브라이트 필드 현미경 그래프를 얻어졌다. 더욱이, 다중 형광 라벨은 핵막, 혈장막, DNA 및 형질대사와 같은 세포의 상이한 양상에 대한 조사를 용이하게 하였다.대표적인 스냅샷은 관상에 갇힌 마이크로스피어를 들여쓰기 5초 전/도중 5초 전에 Hoechst 표지된 핵을 기술했습니다. 일시 중단 및 제한된 세포의 들여쓰기 실험 동안 핵의 해실 및 근근 경계의 세 가지 상이한 프레임 및 궤적을 위한 들여쓰기 세그먼트를 따라 강도 프로파일을 연구하였다. 반복핵 들여쓰기 실험 중에 광학적으로 갇힌 마이크로피어에 의해 경험된 갇힌 궤적과 힘을 측정하였다.현탁액 및 감금 하에 있는 세포의 핵 역학은 감금이 예상 된 영역의 확장과 핵 강성의 사소한 변화를 초래했다는 것을 확인했습니다. 구슬이 1세포 단계 배아에 주입되는 경우, 그들은 대부분 나중에 균등하게 분배할 것입니다. 비드는 안정적으로 갇혀 있어야 한다는 것을 기억하십시오.비드가 광학 트랩을 탈출하면 궤적을 재정의하거나 레이저 전력을 증가시면 됩니다. 이러한 실험은 한 세포 내부의 여러 마이크로비드에서 쉽게 수행되고 활성 미세 화학 측정으로 확장 될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 문서에서 우리는 높은 parallelizable 방식으로 단일 분자 수준에서 효소 proteolysis에 대한 힘의 효과를 공부하는 자기 족집게의 사용을 설명합니다.

마그네틱 족집게를 사용하여 다중 단일 분자 강제 Proteolysis 측정

여기 셀 강성을 측정 할 수있는 빠르고 간단한 방법을 설명합니다. 이 방법의 일반적인 원리는 세포 표면에 micropipette를 통해 적용 잘 정의 된 부정적인 압력에 대한 응답으로 막 변형을 측정하는 것입니다. 이 방법은 기판에 연결된 세포의 biomechanical 속성을 연구 할 수있는 강력한 도구를 제공합니다.

기판에 연결된 전지의 Micropipette의 열망은 셀 강성을 추정하기 위해

우리는 부분적으로 축삭의 세포막에 부착 광학적 포획 프로브에서 수행 동시 힘 분광 측정으로 레이저 해부학자로 lesioned 된 축삭의 긴장 방출을 측정 하였다. 개발 된 실험 프로토콜은 문화 기판에 축삭 접착력을 평가합니다.

레이저 유도 축삭 병변 동안 긴장 릴리스의 측정 Piconewton 및 밀리 초 단위의 해상도로 기판에 축삭 접착을 평가하는

선물이 빛 시트 현미경을 초파리 태아에 구슬 없이 셀 역학을 구현 결합 광학 족집게의 설치.

초파리 배아에 구슬 없는 광학 핀셋으로 셀 역학 조사

여기, 선물이 포스터 공명의 동시 사용에 대 한 프로토콜 에너지 전송 기반 긴장 센서 측정 단백질 역학 힘 민감한 측정을 사용 하는 photobleaching 후 단백질 부하 및 형광 복구를 측정 하 살아있는 세포 내 단백질 역학입니다.

살아있는 세포 형광 기술의 조합을 사용 하 여 힘에 민감한 단백질 역학의 측정

여기에 제시된 것은 공정 myosin-5 모터에 대한 초고속 포스 클램프 실험을 수행하는 포괄적인 프로토콜이며, 이는 다른 등급의 공정 모터 연구로 쉽게 확장될 수 있습니다. 프로토콜은 실험 장치의 설정에서 샘플 준비, 데이터 수집 및 분석에 이르기까지 필요한 모든 단계를 자세히 설명합니다.

초고속 포스 클램프 분광법을 사용한 공정 미오신의 기계적 효소 특성 해부

이 프로토콜은 광학 핀셋을 사용하여 RNA 단백질 상호 작용을 연구하기위한 완벽한 실험 워크플로우를 제공합니다. 공초점 현미경 검사법과 광학 핀셋의 조합을 포함하여 몇 가지 가능한 실험 설정이 설명되어 있습니다.

번역 조절에서 RNA 단백질 상호 작용을 연구하는 광학 핀셋

시험관 내에서 액토미오신 다발의 형성 및 광학 핀셋을 사용한 미오신 앙상블 힘 생성 측정이 제시되고 논의됩니다.

광학 핀셋을 사용하여 액틴 필라멘트 번들에서 미오신 앙상블 역학 조사

여기에서는 시험관 내에서 미세소관 다발을 재구성하고 동시 광학 트래핑 및 전반사 형광 현미경을 사용하여 그 안에 가해지는 힘을 직접 정량화하는 프로토콜을 제시합니다. 이 분석은 활성 미세소관 네트워크 내에서 단백질 앙상블에 의해 생성된 힘과 변위의 나노스케일 수준 측정을 허용합니다.

재구성된 활성 미세소관 다발 내의 힘을 직접 측정

미세 유체 챔버를 통해 연구 된 시각적 단일 분자 생화학은 유리 배럴, 기밀 주사기, 튜브와 플로우 셀의 안정적인 연결 및 주사기와 튜브 사이에 스위칭 밸브를 배치하여 기포 제거를 사용하여 크게 촉진됩니다. 이 프로토콜은 DNA 거래 및 분자간 상호 작용의 시각화를 가능하게 하는 이중 광학 트랩을 설명합니다.

단일 분자 연구를 위한 이중 광학 핀셋 및 미세 유체 공학 사용

여기에서는 최대 1.2kHz의 속도로 힘에 민감한 생체 분자에 대한 나노기계적 측정을 수행하는 고속 자기 핀셋 설정에 대해 설명합니다. 우리는 모델 시스템으로 DNA 헤어핀과 SNARE 복합체에 대한 적용을 소개하지만 기계 생물학적 사건에 관여하는 다른 분자에도 적용 할 수 있습니다.

힘에 민감한 요소에 대한 나노 역학 측정을 위한 고속 자기 핀셋

배우세요 광학 핀셋을 이용한 Danio rerio 배아 세포의 핵 역학 직접 힘 측정 방법입니다. 세포막 손상 없이 핵 경도와 세포 내 구조를 정밀 분석하여 세포 극성 및 이동 연구에 활용할 수 있습니다.

광학 핀셋을 사용하여 감금된 세포 전 역학의 직접 힘 측정

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