Name: 무세포 자동 유도 워크플로우를 사용하여 24시간 이내에 세포에서 무세포 단백질 합성까지 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: 학습하세요 대장균을 이용한 무세포 자동 유도 단백질 합성 방법으로 24시간 이내에 고수율 세포 추출물을 생산하는 기술입니다. 이 프로토콜은 연구자의 개입을 최소화하여 생명공학 연구의 접근성을 높입니다.

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저자는 Jennifer VanderKelen 박사와 Andrea Laubscher가 기술 지원을 받고 있음을 인정하고 싶습니다. 저자는 또한 니콜 그레고리오, 맥스 레빈, 알리사 멀린, 병철 소, 어거스트 브룩웰, 엘리자베스 (리지) 보이보다, 로건 버링턴, 질리언 카스만에게 도움이 된 토론에 감사드립니다. 저자는 또한 빌 앤 린다 프로스트 펀드, 생명 공학의 셰브론 생명 공학 응용 연구 기부 보조금 센터, 칼 폴리 연구, 학술 및 국립 과학 재단 (NSF-1708919)의 자금 지원을 인정합니다.

1. 미디어 성장
<ol><li>표 1에 기재된 바와 같이 CFAI 배지 960 mL를 제조하고 KOH를 사용하여 pH를 7.2로 조정하였다.</li>
	<li>배양 배지를 2.5 L 배플 플라스크에 옮기고 121°C에서 30분 동안 오토클레이브한다.</li>
	<li>표 1에 기재된 바와 같이 당 용액 40 mL를 제조하였다. 용액을 별도의 오토클레이브 유리 용기에 여과 멸균하십시오. 참고: 설탕 용액은 추가 사용 시까지 30°C 인큐베이터에 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>오토클레이빙 후 매체를 40°C 이하로 완전히 냉각시키십시오.</li>
	<li>CFAI 배지를 접종하기 전에 설탕 용액을 CFAI 배지에 직접 첨가하십시오.</li>
	<li>배지를 접종하기 위해, 이전에 줄무늬가 있는 대장균 BL21 스타(DE3) 플레이트로부터 루프풀한 콜로니를 스와이프하고 배지에 직접 삽입한다. 루프를 미디어에 소용돌이 치지 만 컨테이너의 측면을 만지지 마십시오. 줄무늬 플레이트가 생존 가능한 세포와 함께 신선한지 확인하십시오.</li>
	<li>접종된 배지가 있는 플라스크를 30°C 인큐베이터에 놓고 200 rpm으로 진탕시킨다. 문화가 하룻밤 사이에 자라도록 허용하십시오. 세포가 저녁에 접종되는 경우, 배양물은 다음 날 아침 10의 600 nm (OD600)에서 측정된 대략적인 광학 밀도에 도달할 것이다. 접종 및 수확 시간은 필요에 따라 조정할 수 있습니다.</li>
</ol>2. 세포 수확
<ol><li>S30 버퍼를 미리 준비하고 차갑게 유지하십시오. 표 2에 따라 S30 버퍼를 준비하고, 최종 pH를 8.2로 하였다. 참고: S30 버퍼는 셀 수확 며칠 전에 준비할 수 있습니다. 이것이 완료되면, 디티오트레이톨 없이 준비하고 4°C에서 보관한다. 사용 직전에 디티오트레이톨을 첨가하십시오.</li>
	<li>이 시점부터 모든 솔루션과 재료를 얼음 위에 보관하십시오. 1 L의 배지를 1 L 원심분리 병에 옮기고 4-10°C 사이에서 5,000 x g 에서 10분 동안 원심분리한다. 상청액을 데칸트하고 폐기하십시오. 멸균 주걱을 사용하여, 펠릿을 미리 냉각되고 이전에 칭량된 50 mL 코니컬 튜브로 옮긴다.</li>
	<li>차가운 S30 버퍼 30-40 mL로 한 번 세척하여 얼음 위에서 휴식 기간과 함께 30 초 파열로 볼텍싱을 통해 펠렛을 재현탁하십시오. 참고: 펠릿의 부피가 많기 때문에 세포 펠릿을 두 개의 50mL 원뿔형 튜브로 분할하면 세척 단계에 도움이 될 수 있습니다. 더 작은 분취량에 세포를 저장하는 것은 또한 다운스트림 처리를 위한 유연성을 제공한다.</li>
	<li>세포를 5000 x g 에서 4-10°C 사이에서 10분 동안 재현탁시키는 원심분리기.</li>
	<li>상청액을 폐기하고 깨끗한 조직을 사용하여 50 mL 원뿔형 튜브의 내벽에서 과량의 물을 닦아내고 펠릿 자체를 만지지 않도록하십시오. 무게를 재고 플래쉬하면 펠렛을 액체 질소에서 동결시킵니다. 추가 사용 시까지 -80°C에서 보관하십시오. 참고: 사용자가 추출 준비 프로토콜을 계속할 계획인 경우 펠렛은 플래시 동결이 필요하지 않을 수 있습니다.</li>
</ol>3. 추출물 제조
<ol><li>동결된 펠렛을 세포 펠릿 1g당 1mL의 S30 버퍼와 결합하고 약 30-60분 동안 얼음 위에서 해동되도록 한다. 볼텍싱을 통해 해동된 펠릿을 얼음 위에서 휴식 기간과 함께 30초의 버스트로 재현탁하십시오. 눈에 보이는 세포 덩어리가 남지 않을 때까지 소용돌이. 참고: 더 작은 덩어리는 피펫을 사용하여 혼합하여 재현탁할 수 있습니다.</li>
	<li>세포 용해를 위해 1.4 mL의 세포 재현탁물의 분취량을 1.5 mL 마이크로퍼지 튜브 내로 옮긴다. 20kHz의 주파수와 50% 진폭의 각 튜브를 초음파 처리하여 45초의 세 번의 버스트를 처리하고 사이클당 59초의 휴식 시간을 얼음 욕조로 둘러싸고 있습니다. 사이클 사이에 튜브를 반전시키고 마지막 초음파 처리 사이클 후에 즉시 4.5 μL의 1 M 디티오트레이톨을 첨가하십시오. 참고 : 초음파 처리에서 방출되는 열로 인해 초음파 처리되지 않을 때 모든 분취량을 얼음 위에 보관하는 것이 매우 중요합니다. 얼음 욕조는 지속적으로 보충되거나 전체 초음파 처리 과정에서 시원하게 유지되기에 충분히 커야합니다.</li>
	<li>각 튜브를 18,000 x g 및 4°C에서 10분 동안 원심분리한다. 상청액 및 분취량을 600 μL 분취량의 1.5 mL 마이크로퍼지 튜브 내로 회수한다. 플래시 동결 분취량을 추가 사용 때까지 -80°C에서 보관한다. 상층액 만 피펫에주의해야합니다.</li>
</ol>4. 무세포 단백질 합성
<ol><li>이전 단계로부터의 추출물의 1분취량을 해동하여 1.5 mL 마이크로퍼지 튜브에서 무세포 단백질 합성 반응의 15 μL를 사분면으로 수행한다.</li>
	<li>240 ng의 DNA (16 μg/mL 최종 농도), 2.20 μL의 용액 A, 2.10 μL의 용액 B, 5.0 μL의 추출물 및 다양한 부피의 분자 등급 물을 결합하여 각 반응을 준비하여 15 μL로 반응물을 채운다. 이 반응은 더 높은 부피로 스케일링될 수 있다. 비율에 대해서는 표 3 을 참조한다.<ol>
<li>표 4에 따라 용액 A 및 B를 준비한다. 각 용액은 100 μL 내지 1 mL의 배치로 제조되고, 분취될 수 있고, 추가 사용 시까지 -80°C에서 저장될 수 있다. 참고: DNA 양은 관심있는 단백질에 따라 달라질 수 있습니다. 이 경우, 사용된 플라스미드인 pJL1-sfGFP는 16μg/mL 또는 597μM에서 수행하도록 최적화되었습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>반응을 37°C에서 적어도 4시간 동안 실행시킨다.</li>
</ol>5. 리포터 단백질, 슈퍼 폴더 녹색 형광 단백질 (sfGFP)의 정량
<ol><li>절반 면적 96-웰 검정 폴리스티렌 플레이트를 사용하여, 2 μL의 각 무세포 단백질 합성 반응 생성물을 pH 7.2에서 0.05 M HEPES 완충액 48 μL와 결합한다. 각 반응 튜브의 서너 번의 반복실험이 권장됩니다.</li>
	<li>485nm의 여기 파장과 528nm의 방출 파장으로 sfGFP의 형광 강도를 정량화합니다.</li>
	<li>상대 형광 단위를 sfGFP의 부피 수율(μg/mL)로 전환하려면 정제된 pJL1-sfGFP를 사용하여 표준 곡선을 수립하십시오.</li>
</ol>

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<li>Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+biological+applications+using+cell-free+metabolic+engineering%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Expanding biological applications using cell-free metabolic engineering: An overview.</a> Metabolic Engineering. 50, 156-172 (2018).</li>
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</ol>

저자들은 경쟁적인 재정적 이해 상충이 없다고 선언합니다.

연구원의 감독은 전통적으로 세포 성장 동안 두 가지 주요 작용, 즉 T7 RNAP의 유도와 특정OD600에서 세포를 수확하는 데 필요합니다. CFAI는 고품질의 세포 추출물을 제조하기 위해 필요한 연구자의 시간과 기술 교육을 줄이기 위해 이러한 요구 사항을 모두 제거합니다. T7 RNAP의 자동 유도는 배지 내의 일차 당으로서 글루코스를 락토오스로 대체함으로써, 세포 성장 동안 정확한 지점에서 IPTG로 유도한 후 성장을 능동적으로 모니터링해야 하는 이전의 필요성을 없애고 달성된다. 특정OD600에서 수확하기 위해 세포 배양물을 적극적으로 모니터링해야 할 필요성 또한 사라지고, 연구자를 세포 배양물로부터 떼어낸다. 이것은 또한 비 전통적 시간13,25,26에서 수확 된 양질의 추출물의 생산을 입증 한 최근의 연구에 추가됩니다...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62866">From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow</a>. The Authors&#160;section was&#160;updated.
The Authors section was updated from:
Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2,&#160;Javin P. Oza1,2 
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University 
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University
to:
Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2, Mona Dabbas 1,2, Javin P. Oza1,2 
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University 
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62866">From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow</a>. The Authors&#160;section was&#160;updated.

Erratum: From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow

생명 공학 응용 분야를위한 무세포 단백질 합성 (CFPS)의 사용은 지난 몇 년 동안 1,2,3 년 동안 크게 증가했습니다. 이러한 개발은 부분적으로 CFPS에서 발생하는 프로세스와 각 구성 요소 4,5의 역할을 이해하려는 노력이 증가했기 때문일 수 있습니다. 또한 최적화 된 설정 및 대체 에너지 원으로 인한 비용 절감으로 인해 새로운 사용자 6,7,8,9를 위해 무세포 기술을 쉽게 구현할 수있었습니다. 단백질 합성에 필요한 전사 및 번역 인자를 구현하기 위해, 세포 추출물은 종종 무세포 반응(10)을 구동하는데 사용된다. 최근 출판 된 사용자 가이드는 기능 추출을 생성하기위한 간단한 프로토콜을 제공하여 신규 및 숙련 된 사용자 모두에게 구현하기가 더 쉬워졌습니다1,11,12,13,14. 세포 추출물은 일반적으로 세포 배양물의 용해를 통해 얻어지며, 이는 원하는 특정 용도1,15,16에 따라 다른 유기체를 사용하여 성장할 수 있다.
대장균(E. coli)은 기능성 추출물(17)을 생산하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 숙주 유기체 중 하나가 되었다. 상기 BL21 스타(DE3) 균주는 외막으로부터 프로테아제(OmpT 프로테아제) 및 세포질(Lon protease)을 제거하여, 재조합 단백질 발현을 위한 최적의 환경을 제공하기 때문에 바람직하다. 추가적으로, DE3은 lacUV5 프로모터의 제어 하에 T7 RNA 폴리머라제 (T7 RNAP)에 대한 유전자를 운반하는 λDE3을 함유하고; 스타 성분은 mRNA4,14,18,19의 절단을 방지하는 돌연변이된 RNaseE 유전자를 함유한다. lacUV5 프로모터 하에서, 이소프로필티오갈락토피라노시드 (IPTG) 유도는 T7 RNAP20,21의 발현을 허용한다. 이 균주는 세포를 재배하고 수확하는 데 사용되며, 이는 추출물 준비를위한 원료를 제공합니다. 세포 용해는 비드 박동, 프렌치 프레스, 균질화, 초음파 처리 및 질소 캐비테이션1,11,12,22를 포함한 다양한 방법을 사용하여 수행 할 수 있습니다.
박테리아 배양 및 수확 과정은 대장균을 사용할 때 대부분의 플랫폼에서 일관되지만 며칠이 걸리고 강렬한 연구자 감독1,11,13이 필요합니다. 이 과정은 일반적으로 LB 국물에서 하룻밤 종자 배양으로 시작되며, 이는 밤새 성장시 다음날 2xYTPG (효모, 트립톤, 인산염 완충액, 포도당)의 더 큰 배양물에 접종된다. 이러한 더 큰 배양물의 성장은 2.514,20의 광학 밀도 (OD)에서 초기 내지 중간 로그 단계에 도달할 때까지 모니터링된다. 전사 및 번역의 구성 요소가 이전에 초기 내지 중간 로그 단계23,24에서 고도로 활성인 것으로 입증되었기 때문에 지속적인 측정이 요구된다. 이 과정이 재현 가능한 추출물을 만들 수 있지만, 우리 연구실은 최근 연구원의 감독을 줄이고 주어진 1 리터의 세포 배양에 대한 추출물의 전반적인 수율을 높이며 숙련 된 사용자와 신규 사용자 모두를위한 대장균 기반 추출물 제제에 대한 액세스를 향상시키는 무세포 자동 유도 (CFAI) Media를 사용하는 새로운 방법을 개발했습니다 (그림 1 ). 여기서 우리는 CFAI 워크플로우를 구현하기 위한 단계별 가이드를 제공하며, 줄무늬가 있는 세포 플레이트에서 24시간 이내에 완료된 CFPS 반응으로 이동합니다.

<table><tbody><tr><td>1.5mL 마이크로퓨지 튜브,</td><td>Phoenix</td><td>MPC-425Q</td><td></td>,</tr><tr><td>1L 원심분리기 튜브</td><td>, Beckman Coulter,</td><td>A99028</td><td></td></tr>, <tr><td>Avanti, J-E 원심분리기</td><td>, Beckman Coulter</td><td>369001</td><td></td></tr>, <tr><td>CoA</td>, <td>Sigma-Aldrich</td>, <td>C3144-25MG</td><td></td></tr>, <tr><td>Cytation, 5 세포 이미징, 다중 모드 리더,</td><td>Biotek</td><td>BTCYT5F</td><td></td></tr>, <tr><td>D-글루코스</td><td>피셔</td><td>D16-3</td><td></td></tr>, <tr><td>D-유당</td><td>알파 Aesar</td><td>J66376</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>ThermoFisher</td><td>15508013</td><td></td></tr><tr><td>폴린산</td><td>시그마-알드리치</td><td>F7878-100MG</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>피셔</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>시그마-알드리치</td><td>G7126-100G</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>ThermoFisher</td><td>11344041</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>시그마 알드리치</td><td>I6758-1G</td><td></td></tr><tr><td>JLA-8.1000 로터</td><td>벡크만 쿨터</td><td>366754</td><td></td></tr><tr><td>K(글루)</td><td>시그마-알드리치</td><td>G1501-500G</td><td></td></tr><tr><td>K(OAc)</td><td>시그마-알드리치</td><td>P1190-1KG</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>시그마-알드리치</td><td>P5958-500G</td><td></td></tr><tr><td>L-알라닌</td><td>시그마-알드리치</td><td>A7627-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-아르기닌</td><td>시그마-알드리치</td><td>A8094-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-아스파라긴</td><td>시그마-알드리치</td><td>A0884-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-아스파르트산</td><td>시그마-알드리치</td><td>A7219-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-시스테인</td><td>시그마-알드리치</td><td>C7352-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-글루탐산</td><td>시그마-알드리치</td><td>G1501-500G</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>시그마-알드리치</td><td>G3126-250G</td><td></td></tr><tr><td>L-히스타딘</td><td>시그마-알드리치</td><td>H8000-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-이소류신</td><td>시그마-알드리치</td><td>I2752-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-류신</td><td>시그마-알드리치</td><td>L8000-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-라이신</td><td>시그마-알드리치</td><td>L5501-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-메티오닌</td><td>시그마-알드리치</td><td>M9625-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-페닐알라닌</td><td>시그마-알드리치</td><td>P2126-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-프롤린</td><td>시그마-알드리치</td><td>P0380-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-세린</td><td>시그마-알드리치</td><td>S4500-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-트레오닌</td><td>시그마-알드리치</td><td>T8625-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-트립토판</td><td>시그마-알드리치</td><td>T0254-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-티로신</td><td>시그마-알드리치</td><td>T3754-100G</td><td></td></tr><tr><td>Luria Broth</td><td>ThermoFisher</td><td>12795027</td><td></td></tr><tr><td>L-Valine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V0500-25G</td><td></td></tr><tr><td>Mg(Glu)2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49605-250G</td><td></td></tr><tr><td>Mg(OAc)2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5661-250G</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 20</td><td>Beckman Coulter</td><td>B30134</td><td></td></tr><tr><td>분자 등급 물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7732-18-5</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12313</td><td></td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N8535-15VL</td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Innova 42/42R 인큐베이터</td><td>Eppendorf</td><td>M1335-0000</td><td></td></tr><tr><td>NH4(Glu)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>09689-250G</td><td></td></tr><tr><td>NTP ThermoFisher</td><td></td><td>R0481</td><td></td></tr><tr><td>Oxalic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0963-100G</td><td></td></tr><tr><td>PEP</td><td>시그마-알드리치</td><td>860077-250MG</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨 이염기성</td><td>아크로스, 유기물</td><td>A0382124</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨 일염기성</td><td>아크로스, 유기물</td><td>A0379904</td><td></td></tr><tr><td>PureLink HiPure 플라스미드 준비 키트</td><td>ThermoFisher</td><td>K210007</td><td></td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>시그마-알드리치</td><td>D13208-25G</td><td></td></tr><tr><td>스페르미딘</td><td>시그마-알드리치</td><td>S0266-5G</td><td></td></tr><tr><td>트리스(OAc)</td><td>시그마-알드리치</td><td>T6066-500G</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>시그마-알드리치</td><td>10109541001</td><td></td></tr><tr><td>트립톤</td><td>피셔 바이오시약</td><td>73049-73-7</td><td></td></tr><tr><td>투네르 2.5L 배플 쉐이크 플라스크</td><td>시그마-알드리치</td><td>Z710822</td><td></td></tr><tr><td>초음파 프로세서</td><td>QSonica</td><td>Q125-230V/50HZ</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>1/2/8013</td><td></td></tr></tbody></table>

무세포 자동 유도 워크플로우를 사용하여 24시간 이내에 세포에서 무세포 단백질 합성까지

From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow

무세포 단백질 합성(CFPS)은 시험관 내에서 전사 및 번역 기계를 포획하는 생명공학 플랫폼으로 성장했습니다. 수많은 개발로 인해 CFPS 플랫폼은 새로운 사용자가 더 쉽게 액세스 할 수있게되었으며 응용 프로그램의 범위를 확장했습니다. 용해물 기반 CFPS 시스템의 경우, 세포 추출물은 다양한 유기체로부터 생성될 수 있으며, 단백질 합성을 증강시키기 위해 숙주의 독특한 생화학을 이용한다. 지난 20 년 동안 대장균 (E. coli) 은 경제성과 다양성으로 인해 CFPS를 지원하는 데 가장 널리 사용되는 유기체 중 하나가되었습니다. 수많은 주요 발전에도 불구하고, 대장균 세포 추출물 제조를 위한 워크플로우는 신규 사용자가 자신의 애플리케이션에 CFPS를 구현하는 데 있어 중요한 병목 현상으로 남아 있습니다. 추출물 준비 작업 과정은 시간이 많이 걸리며 재현 가능한 결과를 얻기 위해 기술적 전문 지식이 필요합니다. 이러한 장벽을 극복하기 위해 우리는 이전에 사용자 입력 및 필요한 기술 전문 지식을 줄이는 24 시간 무세포 자동 유도 (CFAI) 워크 플로의 개발을보고했습니다. CFAI 워크플로우는 세포 추출물을 생성하는 데 필요한 노동력과 기술 기술을 최소화하는 동시에 획득한 세포 추출물의 총 양을 증가시킵니다. 여기에서는 접근성을 향상시키고 대장균 기반 CFPS의 광범위한 구현을 지원하기 위해 단계별로 워크 플로우를 설명합니다.

CFAI 배지를 제조할 때, 글루코스는 배지 내의 주요 에너지 기질로서 락토오스 및 글리세롤의 증가를 위해 교환되었다. 또한 CFAI 매체의 버퍼링 용량도 증가했습니다. 이들 특정 성분은 표 1에 제시되어 있다.
이어서, 세포를 CFAI 배지에서OD600 10 및 표준 2.5 둘 다로 성장시켜 다양한 추출물 양에도 불구하고 추출물 품질과의 일관성을 보여주었다. 상기 2.5 OD600 CFAI 배지를 LB 배양액에 접종한 후 37°C, 200 rpm으로 증식시킨 후,OD600 10 배양물을 플레이트로부터 직접 접종하였다. 이어서, CFAI 배지의 각 배치를 모니터링하고, 각각의OD600에서 수확하였다. 10의 OD600으로의 성장은 2.5OD600으로 성장함으로부터 수득된 추출물 2.10 mL에 비해 9.60 mL의 추출물을...

이 연구는 에스케리치아 콜라이 (E. coli )에서 세포 추출물을 제조한 후 24 시간 이내에 무세포 단백질 합성 (CFPS) 반응을 설명합니다. 무세포 자동 유도 (CFAI) 프로토콜에 대한 설명은 연구자의 감독을 줄이고 얻은 세포 추출물의 양을 늘리기 위해 개선 된 내용을 자세히 설명합니다.

Cell-free protein synthesis (CFPS) has grown as a biotechnology platform that captures transcription and translation machinery in vitro. Numerous ...

무세포 자동 유도 방법은 기능성 세포 추출물을 생산하는 데 필요한 연구자의 감독과 시간을 줄여줍니다. 이것은 더 많은 시간과 집약적이었던 이전의 시험관내 단백질 합성 프로토콜을 단순화합니다. 이 기술은 덜 복잡하고 수율이 높기 때문에 더 많은 청중이 세포없는 표현을 구현할 수 있습니다.이 방법은 세포 성장 중 및 무세포 반응 내에서 에너지 대사의 중요성을 강조합니다. 960 밀리리터의 무세포 자동 유도 배지를 준비하여 시작하십시오. 그런 다음 섭씨 121도에서 30 분 동안 오토클레이빙하여 2.5 리터 배플 플라스크에서 미디어를 멸균하십시오.다음으로, 40 밀리리터의 설탕 용액을 준비한 후, 별도의 오토클레이브 유리 용기에 필터-멸균한다. 오토클레이빙 후, 배양 배지가 섭씨 40도 이하로 냉각되었을 때, 필터-멸균된 설탕 용액을 배지에 직접 첨가한다. 다음으로, 이전에 줄무늬가 있는 신선한 E.coli BL21 별판으로부터 콜로니로 가득 찬 루프를 스와이프하고 루프를 배지에 직접 삽입하여 배지를 접종한다.루프를 컨테이너의 측면을 만지지 않고 미디어로 소용돌이치십시오. 이어서, 접종된 배지를 섭씨 30도 배양기에 밤새 놓고 200 RPM에서 진탕시킨다. 다음날, 배지 1리터를 1리터 원심분리기 병으로 옮기고 섭씨 4~10도 사이에서 5, 000배 G에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 수확한다.상청액을 버린 후, 멸균 주걱을 사용하여 펠렛을 미리 냉각되고 이전에 칭량된 50밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 다음에, 펠릿을 30 내지 40 밀리리터의 차가운 S30 버퍼로 한번 세척하고, 얼음 위에서 휴식 기간으로 30초 파열로 볼텍싱을 통해 펠릿을 재현탁시킨다. 펠렛이 완전히 재현탁된 후, 세포를 재현탁시키고, 상청액을 버리고, 깨끗한 조직을 사용하여, 펠릿을 건드리지 않고 50밀리리터 튜브의 내벽으로부터 과량의 상청액을 닦아낸다.그런 다음 플래시 냉동 전에 펠렛을 액체 질소에서 칭량하고 추가 사용 될 때까지 영하 80도에 보관하십시오. 세포 추출물을 제조하기 위해, 동결된 세포 펠릿의 그램 당 1 밀리리터의 S30 버퍼를 첨가하고, 펠릿이 30 내지 60분 동안 얼음 위에서 해동되도록 한다. 그런 다음, 가시적 인 세포 덩어리가 남지 않을 때까지 얼음 위에 휴식 기간으로 30 초의 버스트에서 볼텍싱을 통해 해동 된 펠릿을 재현탁하십시오.세포 용해를 위해, 세포 현탁액의 1.4 밀리리터 분취량을 1.5 밀리리터 마이크로퍼지 튜브로 옮긴다. 그런 다음 얼음 욕조에서 사이클 당 59 초의 휴식으로 45 초의 세 번의 버스트에 대해 20 킬로 헤르츠 및 50 % 진폭의 주파수로 각 튜브의 세포 현탁액을 초음파 처리하십시오 사이클 사이에 튜브를 반전시키고 마지막 초음파 처리 사이클 후에 즉시 4.5 마이크로 리터의 원몰 디티오 트레이톨을 첨가하십시오. 세포 현탁액을 모든 튜브에서 초음파 처리한 후, 튜브를 원심분리하고, 600-마이크로리터 분취액에서 상청액을 신선한 1.5-밀리리터 마이크로퍼지 튜브로 수집한다.플래시 동결 및 추가 사용 될 때까지 영하 80도에서 분취량을 저장합니다. 15 마이크로리터의 무세포 단백질 합성 반응을 사분면의 1.5 밀리리터 마이크로퍼지 튜브에서 수행하려면, 세포 추출물의 1 분취량을 해동시킨다. 각 15-마이크로리터 반응 혼합물을 준비한 후, 섭씨 37도에서 적어도 네 시간 동안 반응을 실행시킨다.리포터 단백질을 정량화하려면 pH 7.2에서 48마이크로리터의 50밀리몰 HEPES 버퍼를 검은색 폴리스티렌 96웰 플레이트에서 각 무세포 단백질 합성 반응 생성물 2마이크로리터와 결합한다. 초폴더 녹색 형광 단백질 또는 sfGFP의 형광 강도를 여기파장 485 및 방출 파장 528 나노미터를 사용하여 정량한다. 이어서, 정제된 pJL1 sfGFP 플라스미드를 사용하여 표준 곡선을 생성함으로써 상대적 형광 단위를 sfGFP의 부피 수율로 전환시킨다.여기에 나타낸 것은 600 나노미터에서 측정된 상이한 광학 밀도에서 세포 수확 후 무세포 자동 유도 배지 펠릿이다. 광학 밀도 10으로 성장한 배지는 광학 밀도 2.5로 성장한 배지보다 전체 추출물에서 더 많은 양의 세포 펠릿을 생성하였다. 총 단백질 농도의 추가 분석은 두 추출물 사이의 전체 단백질에서 유의 한 차이가 없음을 입증했다.배지가 상이한 광학 밀도 수준으로 성장했음에도 불구하고, 두 추출물 모두 sfGFP를 발현하는 무세포 반응에서 유사한 결과를 입증하였다. 배지와 설탕 용액을 준비하면서 멸균 상태를 유지하는 것이 중요합니다. 이 CFAI 세포-추출 방법은 무세포 발현의 대부분의 적용에 사용될 수 있다.이들은 생명 공학 교육에서 단백질 공학뿐만 아니라 진료 시점 진단에 이르기까지 다양합니다. 이 방법은 필요한 시간과 기술 기술을 줄이고 재현성을 향상 시키며 더 많은 양의 추출물을 생산합니다.

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연구

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여기에 제시된 것은 대장 균 BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD 및 ΔrecB)의 엑소 뉴 클레아 제 V 녹아웃 균주로부터 세포 추출물의 제조 및 완충액 교정을위한 프로토콜입니다. 이것은 선형 DNA 주형을 사용하는 무세포 단백질 합성 시스템에서 발현을 위한 빠르고 쉽고 직접적인 접근 방식입니다.

선형 DNA 주형을 활용한 엑소뉴클레아제 결핍 세포 추출물의 무세포 단백질 합성

이 프로토콜은 합성 세포를 구성하는 데 사용되는 CFPS(Cell-Free Protein Synthesis) 시스템을 설명합니다. 다양한 마이크로 컴파트먼트에서 대표적인 결과를 제공하는 주요 단계를 간략하게 설명합니다. 이 프로토콜은 합성 세포 커뮤니티의 다양한 실험실에 대한 모범 사례를 수립하여 합성 세포 개발의 진전을 촉진하는 것을 목표로 합니다.

합성 세포 구축을 위한 Cell-Free 단백질 합성 시스템

학습하세요 대장균을 이용한 무세포 자동 유도 단백질 합성 방법으로 24시간 이내에 고수율 세포 추출물을 생산하는 기술입니다. 이 프로토콜은 연구자의 개입을 최소화하여 생명공학 연구의 접근성을 높입니다.

무세포 자동 유도 워크플로우를 사용하여 24시간 이내에 세포에서 무세포 단백질 합성까지

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