Name: Dural Stimulation and Periorbital von Frey Testing in Mice As a Preclinical Model of Headache (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 40 s
Description: 배우세요 쥐의 경막 자극 및 안면 von Frey 검사를 통해 편두통 유사 행동을 유발하는 최소 침습적 방법을. 이 기법은 유전자 변형 쥐를 활용하여 두통 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

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이 연구는 국립 보건원 (NS104200 및 NS072204에서 GD)에 의해 지원되었습니다.

모든 절차는 달라스 텍사스 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 사전 승인을 받아 수행되었습니다. ICR(CD-1)(30-35 g) 및 C57/BL6(25-30 g) 마우스를 6-8주간 숙성시켜 본 연구에 사용하였다.
1. 듀랄 인퓨저
<ol><li>조정 가능한 비금속 용융 실리카 플라스틱 캡으로 상업적으로 이용 가능한 내부 캐뉼라 및 주입기를 일방적 주사용으로 수정하고 내경(I.D.)이 0.18mm이고 외경(O.D.)이 0.35mm인 28G 가이드 캐뉼라 아래에 삽입/연장하여 마우스 주입기/인젝터를 만듭니다(그림 1A).</li>
	<li>캘리퍼 또는 기타 측정 장치를 사용하여 주입기의 용융 실리카 플라스틱 캡을 0.6mm 길이로 조정하십시오. 주입기의 팁에서 실리카 플라스틱 캡의 가장자리까지 측정되었습니다.<ol>
<li>플라스틱 캡을 조정할 때 주입기를 구부리거나 둔하게 하지 않도록 주의하십시오.</li>
		<li>이전에 경막 주사에 사용되지 않은 다른 마우스 균주의 경우, 길이를 0.6mm로 설정하고 잉크 또는 염료로 파일럿 주사를 실시하고 염료가 뇌나 두개골이 아닌 경막에만 있는 것이 관찰될 때까지 주입기 길이를 조정하여 최적의 주입기 길이를 결정합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>조정된 인퓨저의 긴 단부(또는 0.6 mm로 측정되지 않은 단부)를 플라스틱 튜브(펌프 튜빙, 2-스톱, I.D. 0.19 mm, 길이 406 mm)에 부착한다.<ol>
<li>튜브를 최소 길이 8in으로 절단하여 5 μL의 부피를 유지하기에 충분한 라인이 있는지 확인하십시오.</li>
		<li>튜브가 금속 부분과 인퓨저에있는 플라스틱 스토퍼의 상단을 덮고 있는지 확인하십시오. 이렇게하면 기포가 라인에 축적되는 것을 방지하는 데 도움이됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>튜브의 반대쪽 끝을 10 μL 유리 미세주사기 (가스 기밀, 시멘트 바늘; 10 mm 돌출부가있는 21 G)에 부착하고 주사기의 금속 부분 위에 단단히 밀봉되어 있는지 확인하십시오 (그림 1A).</li>
	<li>라인이 연결되면 기포가 형성되는 것을 방지하기 위해 선택한 5μL의 인산염 완충 식염수(PBS), 합성 간질액(SIF) 또는 기타 비히클로 주사기를 백필합니다.<ol>
<li>라인에서 기포가 관찰되면 거품이 사라질 때까지 차량으로 라인을 넘치게하십시오. 참고 : 주사기를 라인에 부착하기 전에 차량으로 주사기를 채운 다음 연결되면 라인을 통해 유체를 밀어 넣는 것이 도움이 될 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>라인이 5 μL의 차량으로 백필되고 효율적으로 작동 한 후 5 μL의 약물 / 용액을 해밀턴 주사기에 적재하십시오 (이 기술을 배우거나 연습하는 경우 잉크 또는 염료가 약물 / 용액의 대안으로 사용될 수 있음).<ol>
<li>경막 상에 투여된 모든 비히클 용액이 pH 7.4로 유지되고 310의 삼투압으로 측정되도록 한다. 이것은 듀라 내의 산 감지 이온 채널 및 다른 삼투압 감지 채널의 잠재적 활성화를 감소시킨다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>뇌로 누출되지 않은 마우스에서 테스트 된 최대 부피는 약 10 μL입니다. 이 부피를 가진 주사 후 행동 효과는 테스트되지 않았습니다. 이러한 이유로, 단지 5 μL의 용액만을 듀라 상에 투여한다. 참고: 이러한 관찰은 6-8주령 CD1/ICR 마우스의 마우스 균주/연령/체중을 기준으로 합니다.</li>
</ol>2. 듀랄 주사
<ol><li>주사기가 준비되고 약물이로드되면 마우스를 복부에 평평하게 놓고 노즈콘을 통해 0.5-1 L / min의 산소 유량으로 짧은 3 % 이소 플루란으로 마취하십시오.<ol>
<li>마우스가 더 이상 핀치 반사를 표시하지 않으면 마취를 조정하고 1.5 % 이소플루란으로 유지하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>마취가 끝나면 멸균 된 안검 연고를 눈에 바르고 동물의 머리를 면도 한 다음 포비돈 요오드와 에탄올로 피부를 소독하십시오. 이 후, 성공적인 주사에 도움이되는 위치에 서십시오.</li>
	<li>한 손으로 동물의 머리를 안정시키고 다른 손으로 주입기를 잡으십시오.</li>
	<li>조심스럽게 조사하고 마우스의 두개골에있는 시상과 람도이드 봉합사의 접합부를 찾습니다 (그림 1B, C).<ol>
<li>피부를 통해이 신중한 접합부를 찾으려면 두개골의 지형 학적 특징을 사용하고 주입기와의 접합부의 일반적인 위치를 부드럽게 조사하십시오.</li>
		<li>두개골을 따라 주입기를 다시 배치하고 정확한 위치에 대한 느낌을 주어 접합부의 위치를 확인합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>봉합사가 위치하여 주입기가 제자리에 놓이면 피부를 관통하고 플라스틱 마개까지 접합부로 떨어질 때까지 매우 천천히 부드럽게 인퓨저를 앞뒤로 흔든다. 주: 인퓨저의 전체 0.6mm 팁을 접합부에 삽입하십시오.</li>
	<li>정확성을 확인하려면 잉크 또는 염료를 주사액으로 사용하고 마우스를 안락사시키고 무력화하십시오.<ol>
<li>두개골 뚜껑을 제거하여 경막 내의 염료를 시각화합니다(그림 1C). 참고 : 염료는 두개골의 뇌 또는 외부에서 관찰되어서는 안됩니다. 마찬가지로, 모든 실험에서 마우스는 주사의 정확성을 검증하고 경막의 무결성이 손상되지 않았 음을 보장하기 위해 사후 검사를 받아야합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>주사 후 마우스를 마취에서 제거하고 의식을 회복 할 때까지 기다린 다음 케이지로 돌아가거나 원하는 분석을 시작하기 위해 테스트 챔버에 놓습니다. 참고 : 행동 실험을하기 전에 마우스가 최소 30 분 동안 마취에서 회복 할 수 있도록하십시오.</li>
</ol>3. 주변 궤도 폰 프레이
<ol><li>약 16-20 마리의 마우스 코호트로 연구를 시작하십시오.</li>
	<li>습관화 전날 한 번, 각 마우스를 적어도 5 분 동안 다루십시오.</li>
	<li>약 24시간 처리 후, 마우스를 시험실 조건 및 폰 프레이 시험 장치에 습관화시킨다(도 2A). 참고: 아크릴 테스트 장치는 뚜껑이 있는 개별 구획으로 구성되어 있으며 약 3 in x 3.5 in x 5 in (W x H x D)이며 0.25 in 19 G 정사각형 아연 도금 강철 메쉬 와이어를 통해 연결된 알루미늄 스탠드로 지지됩니다.<ol>
<li>마우스를 무취이며 폴리텐 또는 파라핀 왁스가 들어 있지 않은 수평으로 놓인 4-oz 흰색 종이 컵 안에 넣으십시오. 참고: 이러한 유형의 컵은 섭취할 경우 마우스의 위장 장애를 감소시키기 때문에 선호됩니다(그림 2B).</li>
	</ol></li>
	<li>동물들이 각각의 방에있는 동안, 동물을 진정시키고 동물에 대한 불필요한 스트레스를 피하기 위해 각 마우스의 개별 챔버에 정상적인 차우 식단의 펠릿을 놓습니다. von Frey 행동 테스트 전에 3 일 동안이 작업을 수행하십시오.<ol>
<li>생쥐가 챔버에있을 때마다 음식에 접근 할 수 있는지 확인하십시오.</li>
		<li>번호를 매기고 각 동물을 테스트 랙의 동일한 공간에 할당합니다. 각 동물이 시험 환경에 적응할 수 있도록 시험 기간 중 매일 같은 컵에 마우스를 넣으십시오. 참고 : 마우스는 컵을 g아 먹고 컵을 파괴합니다. 이런 일이 발생하면 컵을 교체하고 해당 마우스 번호로 레이블을 붙입니다.</li>
	</ol></li>
	<li>습관화의 초기 3 일 후, 마우스를 개별 챔버에 두십시오.<ol>
<li>동물이 폰 프레이 (von Frey) 테스트 전에 적어도 1 시간 동안 시험실과 챔버에 적응하여 마우스가 진정되고 나중에 테스트하기가 더 쉬워집니다.</li>
	</ol></li>
	<li>시험 당일에 방에 순응 한 후, 컵에있는 동안 하나의 마우스를 각각의 챔버에서 제거하십시오.<ol>
<li>컵을 수평 위치에 유지하여 마우스가 앞발과 뒷발에 모두 닿도록 하여 체중이 고르게 분배되도록 합니다. 참고 : 불평등 한 체중 분포는 동물의 반응을 변화시키고 심지어 동물이 반응하지 못하게 할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>마우스가 들어있는 컵을 흡수 패드의 테스트 랙 아래 테이블 위에 놓습니다.</li>
	<li>주변 궤도 폰 프레이 테스트의 경우, 0.07 g 폰 프레이 필라멘트를 얼굴 중앙과 눈 사이에 직접 놓습니다.</li>
	<li>필라멘트에 충분한 압력을 가하여 폰 프레이 (von Frey) 머리카락이 "C"자형 형태로 구부러지도록하십시오.<ol>
<li>적어도 3 초이지만 5 초 이내의 영역과의 접촉을 유지하거나 마우스가 머리를 철회하고 발로 필라멘트를 스 와이프 할 때까지 유지하십시오. 참고 : 필라멘트가 미끄러 지거나 필라멘트의 끝이 테스트 중에 동물에게 닿으면 어떤 반응도 계산해서는 안됩니다. 이러한 반응은 상이한 메카노수용체에 의해 활성화되는 브러시에 대한 반응일 수 있으며, 따라서 정확한 결과를 반영하지 않을 수 있다.</li>
		<li>폰 프레이 필라멘트를 딕슨 "업다운" 방법22,23에 따라 적용한다.<ol>
<li>처음에는 0.07g의 무게를 가진 폰 프레이 필라멘트를 적용하십시오. 이 연구에서 가능한 가장 낮은 필라멘트와 가장 높은 테스트 된 필라멘트는 각각 0.008g 및 0.6g의 중량을 가진 필라멘트입니다.</li>
			<li>이 검정을 수행하기 위해 중량 0.008 g, 0.02 g, 0.04 g, 0.07 g, 0.16 g, 0.4 g 및 0.6 g의 필라멘트를 사용한다.</li>
			<li>이 방법에서 동물이 필라멘트에 대한 반응을 나타내지 않으면 다음으로 높은 그램 무게의 필라멘트를 적용하십시오.</li>
			<li>마우스가 필라멘트에 반응하는 경우, 마우스가 그 필라멘트에 반응한다고 생각하십시오. 이 경우 다음 낮은 그램 무게의 필라멘트를 적용하십시오.</li>
			<li>동물이 초기 반응 후 4 번 테스트되거나 동물이 분석에서 테스트 된 필라멘트에 반응하지 않는 것으로 판단 될 때까지이 패턴을 반복하십시오. 참고: 팔이나 손목에서 발생하는 추가 압력을 가하지 마십시오. 스케일은 필라멘트의 적용을 연습하는 데 사용될 수 있습니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>4. 기준 인출 임계값 테스트
<ol><li>실험에 포함시키기 전에, 마우스가 0.5-0.6 g 사이의 기준선 금단 역치에 도달하는지 확인하십시오.<ol>
<li>마우스는 3.9.2.2단계에서 언급된 시리즈에서 테스트된 필라멘트에 반응하지 않을 경우 기준선에 도달합니다(0.07g, 0.16g, 0.4g 및 0.6g).</li>
	</ol>
</li>
	<li>기준선 금단 역치를 설정할 때 매일 마우스를 테스트하십시오.<ol>
<li>테스트를 통해 동물들은 폰 프레이 필라멘트의 테스트 조건과 압력에 적응할 수 있습니다.</li>
		<li>실험 셋째 날 후에도 마우스가 여전히 과민 반응을 보이면 다시 테스트하기 전에 1 ~ 2 일 정도 기다리십시오. 참고: 실험 일 사이에 너무 많은 시간이 걸리면 동물이 주변 궤도 영역에서 필라멘트의 무게에 적응하지 못하여 목표 금단 임계 값에 도달하지 못할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>어떤 동물이 실험에 대한 포함 기준을 충족시키지 못하는지 결정하기 전에 대략 7일 동안 마우스를 시험한다. 참고: 마우스의 약 70%가 목표 기준선 수준에 도달합니다.<ol>
<li>경막 자극 전에, 기준선 데이터를 분석하여 0.5-0.6 그램 이상의 기준선 값에 도달하지 않은 마우스를 제외한다.</li>
		<li>제외 후 나머지 각 마우스를 테스트 그룹에 무작위로 할당합니다. 컵에서 그리거나 스프레드 시트에 스크립트를 작성하여 숫자를 그룹으로 무작위화하여이를 달성하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 폰 프레이 결과 분석
<ol><li>일련의 응답이 획득되면, 델타, k 값, 50% 임계값, 및 인출 임계값을 이전에 공개된 방법(24)에 따라 그램으로 결정한다.</li>
	<li>WT = 10(x*F+B) 공식을 사용하여 인출 임계값을 계산합니다. 여기서 WT = 금단 임계값, F = Chaplan 방법을 통해 계산된 발 금단 임계값, B = 로그의 선형 회귀(굽힘력) = x*필라멘트 수 + B.</li>
	<li>데이터를 50% 인출 임계값 또는 평균 인출 임계값(그램)으로 플로팅합니다.</li>
</ol>

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경막에서 국소 nociceptive system의 부적응 변화는 조직 손상의 부족에도 불구하고 편두통 발작의 두통 단계에 중요한 기여자로 간주됩니다25,26. 여기서 연구는 경막의 최소 침습적 자극이 안면 촉각 과민증을 유도할 수 있는 방법을 제시한다. 두개골과 조직에 손상을 일으키지 않고 경막 nociceptor 활성화에 관련된 메커니즘과 사건을 밝히는 것은 전임상 모델에서 편두통 메커니즘을 더 정확하게 반영 할 수 있습니다.
두개골 절제술 및 캐뉼라 이식은 편두통 통증11,12에 기여하는 기능과 메커니즘을 평가하기 위해 오랫동안 사용되어 왔습니다. 그러나, 두개골 절제술이 경막 비만 세포의 활성화를 유도하고 설치류27에서 pi...

편두통 통증은 전 세계적으로 주요 공중 보건 문제로 남아 있습니다. 세계 보건기구 (WHO)는 지구상에서 여섯 번째로 널리 퍼진 질병으로 분류하여 지구 인구의 15 % 미만을 괴롭 히고 사회 2,3에 상당한 사회 경제적 부담을 초래합니다. 치료 옵션과 그 효능은 차선책이었으며 증상 완화만을 제공하고 편두통 발생을 저조하게 하는 병리생리학적 사건을 유의하게 변형시키지 않는다4,5. 치료 성공의 부족은 편두통이 병리학이 제대로 이해되지 않는 다인자 장애이기 때문에 제한된 수의 치료 목표로 이어질 가능성이 큽니다. 편두통은 특히 편두통 진단이 오라, 두통, 광공포증 및 동종 요법과 같은 편두통 특징에 대한 경험을 설명하는 환자와의 구두 의사 소통을 기반으로 이루어 진다는 점을 감안할 때 동물 모델에서 완전히 포착하기가 어렵습니다. 그럼에도 불구하고, 편두통 치료의 최근 발전은 현재 전임상 모델에 의해 잘 검증 된 많은 신경 학적 상태에 대한 치료법을 능가하고 있음을 주목하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 칼시토닌 유전자 관련 펩티드 또는 그의 수용체를 표적으로 하는 모노클로날 항체 및 소분자는 편두통 환자의 삶의 질을 개선하는데 매우 성공적이었으며 잠재적으로 편두통의 임상 관리를 변화시킬 수 있다. 이 장애를 이해하는 데 진전이 있었지만, 아직 해명되지 않은 것이 많이 있습니다.
전임상 동물 모델과 인간 연구에 기초하여, 편두통은 삼차 및 상부 자궁 경부 등근 신경절 6,7,8,9,10을 통해 신호하는 수막 내의 nociceptive 섬유의 비정상적인 활성화에 의해 시작된다는 것이 널리 받아 들여지고 있습니다. 이 이론에도 불구하고, 많은 연구는 편두통의 근본적인 기여 메커니즘을 이해하기 위해 약물의 전신 투여를 여전히 사용합니다. 약물의 전신 투여가 우리의 이해를 실질적으로 강화했지만, 이러한 발견은 관심있는 표적 조직 내의 국소 행동이 편두통에 중요한 역할을하는지 여부를 직접 평가하지는 않습니다. 반대로, 몇몇 연구는 듀라를 자극하는 접근법을 취했다; 그러나 이러한 실험은 침습적 두개골 절제술과 연장 된 회복 시간11,12를 통한 캐뉼라 이식이 필요합니다. 이러한 한계 때문에, 우리는 두개골 절제술의 부족이 수술 후 회복을 제거하고 깨어있는 동물12,13,14에서 즉각적인 검사를 가능하게하는 경막을 국부적으로 자극하는 최소 침습적 접근법을 개발했습니다. 이러한 주사는 가벼운 이소플루란 마취 하에서 수행되고 마우스의 시상과 람도이드 봉합사의 접합부에서 투여된다.
설치류15에서 nociceptive 행동 반응을 평가하기 위해 몇 가지 접근법이 개발되었습니다. 피부 이질통은 편두통 환자16,17의 약 80 %에서보고되었으며 설치류에 사용하기위한 잠재적 인 번역 종점을 나타냅니다. 전임상 모델에서, 설치류 발의 발바닥 영역에 폰 프레이 필라멘트를 적용하는 것은 전임상 편두통 모델에서 통증 행동을 평가하는 데 사용되었습니다. 이 접근법의 주요 한계는 두개 부위를 검사하지 않는다는 것입니다. 얼굴 grimace 점수는 통증 자극18,19의 유도 후 얼굴 표정을 분석하여 설치류의 통증 행동을 포착하는 데 사용되었습니다. 그러나 그 한계는 급성 자극에 대한 반응 만 포착하고 만성 구강 안면 통증 상태가 아닌 것을 포함합니다. 안면 손질과 양육 감소는 편두통20,21의 전임상 모델에서 행동 반응의 결과물로 간주됩니다. 전자의 한계에는 통증 반응을 정상적인 일상적인 손질 및 가려움증과 같은 다른 감각과 구별하는 데 어려움이 포함됩니다. 후자의 경우, 사육 행동은 일반적으로 설치류를 새로운 환경에 도입 한 후 빠르게 감소합니다. 이러한 행동 종점 각각은 통증 상태에 기여하는 다양한 메커니즘의 이해에 가치가 있지만, 편두통과 같은 통증 장애의 전임상 모델에 두개 과민 반응을 특이적으로 포착하는 종점을 포함해야합니다. 경막 자극 후 주변 궤도 피부의 촉각 과민증을 평가하는 것은 감각 증상이 본질적으로 주로 두증인 편두통에 기여하는 메커니즘에 대한 더 나은 통찰력을 제공 할 수있는 방법입니다. 여기에서는 편두통의 전임상 모델로서 마우스 경막에 물질을 투여하는 방법을 설명합니다. 듀럴 적용에 따라, 우리는 또한 딕슨 업다운 방법에 적용된 보정된 폰 프레이 필라멘트를 사용하여 주변 궤도 촉각 과민증을 테스트하기 위한 상세한 방법을 제시합니다.

<table><tbody><tr><td>4 oz 뜨거운 종이컵</td><td>Choice Paper Company</td><td>5004W</td><td>https://www.webstaurantstore.com/choice-4-oz-white-poly-paper-hot-cup-case/5004W.html</td></tr><tr><td>흡수성 언더패드</td><td>Fisherbrand</td><td>14-206-65</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-absorbent-underpads-8/p-306048</td></tr><tr><td>C313I/SPC 내부 28G 캐뉼라</td><td>P1 기술(이전 Plastics One)</td><td>8IC313ISPCXC</td><td>I.D. 18mm, O.D. 35mm</td></tr><tr><td>기밀 모델 1701 SN 주사기</td><td>Hamilton</td><td>80008</td><td>https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/80008</td></tr><tr><td>Ismatec 펌프 튜브, 0.19mm</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-96460-10</td><td>https://www.coleparmer.com/i/ismatec-pump-tubing-2-stop-tygon-s3-e-lab-0-19-mm-id-12-pk/9646010</td></tr><tr><td>치킨 와이어</td><td>스탠드 사용자 정의</td><td></td><td>아연 도금 강철 치킨 와이어 치수는 0.25인치입니다. x 19게이지</td></tr><tr><td>테스팅 랙(개별&nbsp; Chambers</td><td>Custom</td><td></td><td>각 챔버는 마우스를 담을 수 있도록 각 마우스와 뚜껑 사이에 구분이 있어야 합니다. 챔버는 또한 4온스 종이컵을 담을 수 있을 만큼 충분히 커야 합니다.</td></tr><tr><td>폰 Frey 필라멘트</td><td>터치 테스트 / 스톨팅</td><td>58011</td><td>https://www.stoeltingco.com/touch-test.html</td></tr></tbody></table>

dural stimulation and periorbital von frey testing in mice as a preclinical model of headache

Dural Stimulation and Periorbital von Frey Testing in Mice As a Preclinical Model of Headache

경막 매트, 거미류 및 피아 매트로 구성된 두개골 수막은 주로 신경계의 구조적 기능을 제공하는 것으로 생각됩니다. 예를 들어, 그들은 두개골로부터 뇌를 보호하고 피질의 혈관 및 신경 공급을 앵커 / 조직합니다. 그러나 수막은 편두통과 같은 신경계 장애에도 연루되어 편두통 중에 경험되는 통증은 국소 멸균 염증 및 국소 nociceptive 구심증의 후속 활성화에 기인합니다. 수막의 층 중 경막은 편두통의 병리 생리학에 특히 관심이 있습니다. 그것은 고도로 혈관화되고, 국소 nociceptive 뉴런을 보유하고, 면역 세포와 같은 다양한 상주 세포의 본거지입니다. 국소 수막 미세 환경의 미묘한 변화는 경막 혈관 주위 결절기의 활성화 및 감작으로 이어질 수 있으며, 따라서 편두통 통증을 유발할 수 있습니다. 연구는 경막 구심 부심이 생체 내 전기 생리학, 이미징 기술 또는 행동 모델을 사용하여 활성화 / 감작되는 방법을 다루려고 노력했지만, 이들은 일반적으로 매우 침습적 인 수술을 필요로합니다. 이 프로토콜은 마우스에서 경막에 화합물을 비교적 비침습적으로 적용하는 방법과 경막 자극 후 주변 폰 프레이 테스트를 사용하여 두통과 같은 촉각 감도를 측정하는 적절한 방법을 제시합니다. 이 방법은 경막과 두개골의 무결성을 유지하고 융합되지 않은 시상과 람도이드 봉합사의 교차점에서 0.65mm 변형 된 캐뉼라를 통해 물질을 주입하여 침습적 기술로 인한 혼란스러운 영향을 줄입니다. 이 전임상 모델을 통해 연구자들은 두개골과 수막에 대한 손상없는 상태를 유지하면서 nociceptor 활성화, 면역 세포 활성화, 혈관 변화 및 통증 행동과 같은 편두통의 병리학 적 진행에 대한 광범위한 경막 자극과 그 역할을 조사 할 수 있습니다.

이 주사 방법은 후속 행동 검사가 발생할 수 있도록 마우스의 경막에 자극을 투여하는 데 사용됩니다. 이 모델로 측정 된 가장 일반적인 행동 출력은 von Frey12,13,14를 통해 평가 된 피부 안면 과민증입니다. 여기에서는이 모델을 편두통 병리학에 대한 잠재적 인 성별 별 기여도를 평가하는 데 어떻게 사용할 수 있는지 보여줍니다 (그림 3).
이 절차는 기계적으로 유발된 안면과민증 에 대한 경막 프로락틴(PRL)의 효과를 조사하기 위해 사용되어 왔다(그림 3). 이 연구의 결과는 암컷 ICR 마우스가 5 μg의 경막 프로락틴에 대한 반응으로 안면 금단 역치가 현...

편두통의 가장 주목할만한 증상은 심한 두부 통증이며, 이것이 수막에 신경을 쓰는 감각 뉴런에 의해 매개된다는 가설이 있습니다. 여기에서는 안면 과민증을 출력으로 사용하면서 최소 침습적 방식으로 경막에 물질을 국부적으로 적용하는 방법을 제시합니다.

The cranial meninges, comprised of the dura mater, arachnoid, and pia mater, are thought to primarily serve structural functions for the nervous system.  ...

조직 손상이없는 경우 두통에 기여하는 수막 내에서 어떤 사건이 발생합니까? 래트에서 경막 자극 모델의 이전 사용과는 달리, 그것은 유전자 변형 마우스의 광범위한 카탈로그의 사용을 허용한다. 주요 투쟁은 인젝터로 두개골을 촉지하여 람도이드와 시상 봉합사의 교차점을 찾는 것입니다.시작하려면 시판 된 내부 캐뉼라를 수정하고 조정 가능한 용융 실리카 플라스틱 캡으로 주입기를 만들고 28 게이지 가이드 캐뉼라에 삽입하십시오. 캘리퍼를 사용하여 주입기를 구부리지 않고 주입기의 용융 실리카 플라스틱 캡을 조정하십시오. 주입기를 주입기의 팁에서 실리카 플라스틱 캡의 가장자리까지 측정 된 6 밀리미터의 길이로 조정하십시오.다른 마우스 균주에 대한 파일럿 주사를 수행하고 길이를 조정하여 경막에 정확하게 주입하십시오. 그런 다음 주입기의 긴 끝을 여덟 인치 이상의 플라스틱 튜브에 부착하여 다섯 마이크로 리터 부피를 유지합니다. 튜브를 삽입하면서 금속 부품과 주입기에 위치한 플라스틱 마개 상단을 완전히 덮을 수 있도록 하여 기포가 라인에 축적되는 것을 방지합니다.다음으로, 미세주사기를 채우고 튜브의 다른 쪽 끝을 10 마이크로리터 유리 미세주사기에 부착하여 주사기의 금속 부분 위에 단단히 밀봉하십시오. 이어서, 기포 형성을 방지하기 위해 선택된 PBS 또는 합성 간질액 또는 다른 비히클의 다섯 마이크로리터로 주사기를 백필한다. 필요한 경우 차량으로 라인을 넘치게하여 미리 형성된 거품을 분산시킵니다.대안적으로, 주사기를 미리 채우고, 연결 후, 연결된 라인을 통해 유체를 밀어낸다. 차량으로 채워진 라인이 효율적으로 작동하면 다섯 마이크로 리터의 용액을 해밀턴 주사기에 적재하십시오. 마우스가 완전히 마취되면 멸균 안과 연고를 눈에 바르고 동물의 머리를 면도 한 다음 포비돈 요오드와 에탄올로 피부를 소독하십시오.한 손으로 동물의 머리를 안정시키고 다른 한 손에는 약물이 든 주사기로 주입기를 잡으십시오. 그런 다음 주입기를 사용하여 마우스의 두개골에있는 시상과 람도이드 봉합사의 접합부를 조심스럽게 조사하고 찾아 확인합니다. 봉합사가 위치되고 주입기가 제자리에 놓이면 in 주입기가 피부를 관통하고 플라스틱 마개까지 접합부로 떨어질 때까지 천천히 부드럽게 인퓨저를 앞뒤로 흔들어 전체 6mm 주입기 팁을 접합부에 삽입하십시오.그런 다음 주사기의 플런저를 천천히 밀어 다섯 마이크로 리터의 유체를 경막 매트로 배출합니다. 시험 당일, 방에 순응 한 후, 각 챔버에서 컵과 함께 하나의 마우스를 제거하십시오. 불평등 한 체중 분포가 동물의 반응을 변경하거나 방해 할 수 있으므로 컵을 균등하게 분포 된 체중을 위해 수평 위치에 유지하십시오.마우스와 함께 컵을 테스트 랙 아래의 테이블에 보관된 흡수 패드에 놓습니다. 그런 다음 주변 궤도 폰 프레이 테스트를 위해 07 그램 폰 프레이 필라멘트를 눈 사이의 얼굴 중앙에 놓고 필라멘트에 충분한 압력을 가하여 폰 프레이 모발이 C 자형 형태로 구부러지게합니다. 필라멘트 접촉을 약 삼 ~ 다섯 초 동안 또는 마우스가 머리나 발을 사용하여 필라멘트를 쓸어 넘길 때까지 유지하십시오.Dixon 업다운 방법을 따르려면 마우스가 필라멘트에 반응하는 경우 다음 저중량 필라멘트를 적용하고, 그렇지 않으면 더 높은 중량의 필라멘트를 적용하십시오. 이 절차는 기계적으로 유발 된 안면 과민증에 대한 경막 외 프로락틴의 효과를 조사하는 데 사용되었습니다. 이 연구의 결과는 다섯 마이크로 그램의 듀랄 프로락틴에 대한 반응으로 여성 ICR 마우스에서 안면 금단 역치가 현저하게 감소한 것으로 나타났습니다.5 마이크로 그램의 프로락틴의 열 배 낮은 복용량은 또한 높은 용량의 프로락틴과 비슷한 안면 금단 역치 감소를 보였다. 프롤락틴 주사는 자발적인 통증 관련 행동을 만들어 냈으며, 이는 grimace를 통해 평가되었습니다. 듀랄 5 마이크로 그램의 프로락틴은 암컷 마우스에서 상당한 슬픔을 일으켰고 여성 편두통과 같은 행동에서 경막 프로락틴에 대한 명확한 역할을 입증했습니다 폰 프레이 필라멘트 또는 안면 슬픔을 이용한 행동 테스트는 부상이없는 자극이 두통 반응을 유발하는지 여부를 결정합니다.이 기술은 이제 두개골 및 후속 염증에 의해 유발되는주의 사항에 대한 우려없이 수막의 염증 기반 메커니즘을 조사하는 데 사용될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 연구에서, 저자는 처음으로보고 새로운 3D 몰입 및 생체 내에서 환자의 뇌의 μ-오피오이드 시스템의 자발적인 편두통 공격의 영향을 통해 대화 형 Neuronavigation (3D-IIN).

3D-Neuronavigation<em&gt; 생체</em&gt; 자발적인 편두통 두통 동안 환자의 뇌를 통해

여기에서, 우리는 마우스에 있는 잠/각성 상태의 감시 도중 뉴런의 특정 모형의 광유전학 조작의 방법을 기술합니다, 예를 들면 stria 말단의 침대 핵에 우리의 최근 일을 제시하.

마우스에서 수면/각성 상태를 모니터링하는 동안 신경 회로의 광유전학 적 조작

설치류는 편두통 증상을보고 할 수 없습니다. 여기에서는 편두통 환자에서 가장 흔하고 귀찮은 증상 중 하나 인 가벼운 혐오감을 측정하기위한 관리 가능한 테스트 패러다임 (빛 / 어둠 및 개방 필드 분석)을 설명합니다.

마우스에서 가벼운 혐오감을 이용한 편두통과 같은 행동 조사

본 프로토콜은 생체 외 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드 (CGRP) 방출 모델 및 설치류의 삼차 혈관계에서 방출되는 CGRP의 양에 대한 약리학 적 제제의 효과를 정량화하는 전략을 설명합니다.

생체 외 설치류의 삼차 혈관 시스템에서 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드의 방출

우리는 뇌 전기장 측정 및 관련 바이오마커-대뇌 혈류의 관점에서 두개외 자극에 대한 용량-반응 곡선을 평가하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 뇌에 침습적인 전극 배치를 포함하기 때문에 전신 마취가 필요하며 통제된 호흡보다는 자발적 호흡이 선호됩니다.

두개외 자극 전극의 배치 및 마취된 마우스의 대뇌 혈류 및 두개내 전기장 측정

여기에서는 광동태 반사를 정량화하기 위한 표준 프로토콜을 설명합니다. 가상 드럼 자극과 비디오 안구 촬영을 결합하여 동작의 특징 선택성과 적응 가소성을 정확하게 평가할 수 있습니다.

생쥐에서 광동태 반사의 시각적 특징 선택성 정량화

생쥐에서 원위 안와하부 신경의 만성 수축 손상은 촉각 자극에 대한 반응으로 자발적 행동(얼굴 손질 활동 증가)과 통각 행동(von Frey 모발 자극에 대한 과민성)의 변화를 유발하며, 이는 지속적인 통증 및 이질증의 징후이며 삼차신경병증성 통증의 모델 역할을 합니다.

삼차신경병증성 통증을 연구하기 위한 마우스의 원위 안와하부 신경(DIoN-CCI)의 만성 수축 손상

여기에는 레이저 도플러 프로브를 쥐와 생쥐에게 적합한 안와 주위 위치인 중간 대뇌 동맥(MCA)의 원위 영역 위에 두개골에 배치하여 일시적인 MCA 폐색 중 혈류를 평가하는 것이 포함됩니다.

설치류 모델에서 중뇌동맥 폐색 전 대뇌 혈류 모니터링을 위한 레이저 도플러 프로브의 안와 주변 배치

이 프로토콜은 신경 생리학적 측정에 대한 시간 잠금과 호환되는 방식으로 시간이 지남에 따라 설치류의 자동화된 눈 사시를 추적하는 방법을 제공합니다. 이 프로토콜은 편두통과 같은 통증 장애의 메커니즘을 연구하는 연구자들에게 유용할 것으로 기대됩니다.

마우스 통증 연구에서 시간 동기화 행동 및 뇌 역학을 위한 자동화된 곁눈질 방법

이 문서에서는, 우리는 기본 네트워크에 뇌 자극의 효과를 조사하기 위해 TMS와 fMRI의 조합과 관련된 방법론과 고려 사항을 검토하십시오.

기본 모드 네트워크를 검사하기 위해 Transcranial 자석 자극과 fMRI를 결합

배우세요 쥐의 경막 자극 및 안면 von Frey 검사를 통해 편두통 유사 행동을 유발하는 최소 침습적 방법을. 이 기법은 유전자 변형 쥐를 활용하여 두통 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

Dural Stimulation and Periorbital von Frey Testing in Mice As a Preclinical Model of Headache

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