Name: 짧고 긴 읽기 시퀀싱 기술을 사용하여 요로나박테리아의 완전한 게놈 생성을 위한 하이브리드 드 노보 게놈 조립 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: 배우세요 요로나박테리아의 하이브리드 드 노보 게놈 조립 방법을 Unicycler를 사용하여 완전한 원형 게놈을 생성하는 기술입니다. 이 프로토콜은 항생제 내성 및 집락화 유전자 연구에 필수적인 유전체 데이터를 제공합니다.

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우리는 이 프로토콜에 기여한 무두세 주바이다 이슬람 박사와 루크 조이스 박사에게 감사드립니다. 우리는 또한 그들의 의견과 지원을 위해 달라스 게놈 센터에 있는 텍사스 대학을 인식하고 싶습니다. 이 작품은 웰치 재단에 의해 지원되었다, 수상 번호 AT-2030-20200401 N.J.D.에, 건강의 국립 연구소에 의해, K.P.에 수여 번호 R01AI116610, 그리고 펠레시아와 존 케인 의자에 의해, P.E.Z.에 의해 개최.

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

여기에서 기술된 포괄적인 하이브리드 게놈 조립 프로토콜은 다양한 오줌 microbiota 및 비뇨기요법의 성공적인 배양및 그들의 게놈의 완전한 조립을 위한 능률적인 접근을 제공합니다. 세균성 게놈의 성공적인 WGS는 그들의 게놈 DNA를 추출하기 위하여 다양하고 때때로 까다로운 세균의 격리로 시작합니다. 현재까지, 기존의 소변 배양 프로토콜은 많은 오줌 종을 검출하는 데 필요한 감도가 부족하거나 연장 된 시간과 자원을 필요로하는 길고 광범위한 접근 방식을 포함(11). 설명된 수정된 향상된 소변 문화 접근은 잠재적으로 병원성 또는 유익한 성공종을 포함하여 17개의 일반적인 오줌 제네라에 속하는 박테리아의 성공적인 격리를 위한 단순화되면서도 포괄적인 프로토콜을 제안하며, 촉진및 의무유산소 또는 혐기성 박테리아. 이것은 차례차례로 세균게놈의 정확한 순서 및 조립및 오줌 건강과 질병의 이해에 기여하는 중요한 현상제 실험을 위한 필요한 시작 물질을 제공합니다. 더욱이, 이 수정된 배양 접근법은 소변 견본에서 찾아낸 실행 가능한 미생물의 보다 정의된 임상 진단을 제공하고 미래 게놈 연구를 위한 그들의 biobanking를 허용합니다. 그러나 이 프로토콜은 제한 없이 는 아닙니다. 그것은 유기체에 따라서 긴 잠복기뿐만 아니라 쉽게 사용할 수 없을 수 있습니다 저산소실 또는 제어 인큐베이터와 같은 자원의 사용을 필요로 할 수있다. 혐기성 GasPaks의 사용은 대체 솔루션을 제공하지만 비용이 많이 들고 항상 지속적이고 통제 된 환경을 생성하지는 않습니다. 마지막으로, 배양 편향뿐만 아니라 샘플 다양성은 특정 유기체와 비뇨기과균이 까다로운 박테리아를 능가하는 것을 허용할 수 있습니다. 이러한 제한에도 불구 하 고, 다양 한 오줌 박테리아의 문화는이 접근에 의해 가능.
유전체 시퀀싱은 차세대 시퀀싱 기술의 발전으로 인기를 얻고 있으며, 이는 시퀀싱 데이터14,15의수율과 정확도를 크게 증가시켰습니다. 데이터 처리 및 드 노보 어셈블리를 위한 알고리즘의 개발과 함께 완전한 게놈 서열은 초보자와 전문 과학자 모두15,45의손끝에 있습니다. 완전한 게놈에 의해 제공된 전반적인 게놈 조직의 지식은 유전자 중복, 유전자 손실 및 수평 유전자 전송14를포함하여 중요한 진화적이고 생물학 통찰력을 제공합니다. 추가적으로, 항균 저항 및 독성에 중요한 유전자는 수시로 초안 게놈 어셈블리에서 전형적으로 해결되지 않는 모바일 요소에 국한됩니다15,16.
본 명세서에서 프로토콜은 완전한 게놈 어셈블리를 생성하기 위해 짧은 읽기 및 긴 읽기 플랫폼에서 데이터를 시퀀싱하는 조합을 위한 하이브리드 접근 방식을 따릅니다. 오줌 세균게놈에 집중하는 동안, 이 절차는 각종 격리 근원에서 다양한 박테리아에 적응될 수 있습니다. 이 접근법의 중요한 단계는 적당한 살균 기술을 따르고 순수한 오줌 박테리아의 격리를 위한 적당한 매체 및 문화 조건을 이용하는 것을 포함합니다. 또한, 고수율 gDNA의 추출은 조립 성공을 저해할 수 있는 오염 판독이 없는 시퀀싱 데이터를 생성하는 데 필수적입니다. 후속 라이브러리 준비 프로토콜은 충분한 길이와 깊이의 품질 읽기 생성에 매우 중요합니다. 따라서, 이 기술의 가장 큰 장점은 이론적 상반수 제한없이 긴 읽기의 생성이기 때문에, 특히 긴 읽기 시퀀싱에 대한 라이브러리 준비 중에 주의gDNA를 처리하는 것이 매우 중요합니다. 또한 시끄러운 데이터를 제거하고 어셈블리 결과를 향상시키는 시퀀싱 읽기의 적절한 품질 관리(QC)에 대한 섹션도 설명되어 있습니다.
성공적인 DNA 격리, 라이브러리 준비 및 시퀀싱에도 불구하고, 일부 종의 게놈 아키텍처의 특성은 여전히 폐쇄 게놈 어셈블리45,46의생성에 대한 장애물을 제공 할 수 있습니다. 반복적인 시퀀스는 종종 어셈블리 계산을 복잡하게 하며 긴 읽기 데이터에도 불구하고 이러한 영역은 낮은 신뢰도로 해결되거나 전혀 해결되지 않을 수 있습니다. 따라서 긴 읽기는 게놈 또는 커버리지에서 가장 큰 반복 영역보다 평균적으로 더 길어야 한다 (>100x)19. 일부 게놈은 불완전한 상태로 남아 있으며 완료를 위해 수동 접근이 필요할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 하이브리드 조립 불완전한 게놈은 일반적으로 짧은 읽기 초안 게놈 보다는 더 적은 연속으로 이루어지고 있습니다. 어셈블리 알고리즘의 기본 매개 변수를 조정하거나 읽기 QC에 대한 보다 엄격한 차단을 따르는 것이 도움이 될 수 있습니다. 또는 가장 가능성이 높은 어셈블리 경로에 대한 증거를 찾기 위해 불완전한 영역에 긴 판독을 매핑한 다음 증폭 된 영역의 PCR 및 Sanger 시퀀싱을 사용하여 경로를 확인하는 것이 좋습니다. Minimap2를 사용하여 읽기 매핑이 제안되고 붕대는 연속연결(47)에대한 증거를 제공하는 조립된 연속화를 따라 매핑된 읽기의 시각화를 위한 유용한 도구를 제공합니다.
완전한 게놈을 생성하는 추가적인 과제는 명령줄 도구를 사용하여 친숙함과 편안함에 있습니다. 많은 생물 정보 도구는 모든 사용자에게 계산 기회를 제공하기 위해 개발되었습니다. 그러나, 그들의 활용은 UNIX 및 프로그래밍의 기초와 이해에 의존. 이 프로토콜은 사전 명령줄 경험이 없는 개인이 폐쇄된 게놈 어셈블리를 생성하고 이에 대해 알수 할 수 있도록 충분히 상세한 지침을 제공하는 것을 목표로 합니다.

요로 미생물군유전체는 요로가 건강한 개인에게 멸균된다는 수십 년 의 긴 오해를 산산조각 난 연구의 신흥 영역입니다. 요로 미생물의 구성원은 요로 환경의 균형을 맞추고 요로 감염 (UTI)1,2를예방하는 역할을 할 수 있습니다. 비뇨기증 균은 요로를 침범하고 상주 미생물을 대체하고, 비뇨기과를 식민지화하고, 면역 반응을 회피하고, 환경 압력에 중화하기 위해 다양한 독성 메커니즘을사용한다 3,4. 소변은 높은 진동, 제한된 질소 및 탄수화물 가용성, 낮은 산소, 낮은 pH5,6,7을특징으로 상대적으로 영양 제한 매체이다. 소변은 또한 항균제로 간주되며, 인체 카플리시딘 LL-378과같은 억제 우레아 및 항균 펩티드의 고농도로 구성된다. 요로를 식민지화하기 위해 상주 박테리아와 비뇨기과 물질 모두에 의해 채택된 기계장치를 조사하는 것은 요로 건강을 더 이해하고 UTI 처리를 위한 새로운 전략을 개발하는 것이 중요합니다. 더욱이, 일선 항균요법의 실패가 보편화됨에 따라, 오줌박테리아의 집단 내에서 항균저항 결정제를 운반하는 이동식 유전적 원소의 보급을 감시하는 것이 점점 더 중요해지고 있다9,10.
요로 박테리아의 유전자형 과 표현형을 조사하기 위해 성공적인 배양과 후속 전체 게놈 시퀀싱 (WGS)이 필수적입니다. 배양의존적 방법은 소변샘플(11)에서가능한 미생물을 검출하고 식별하는 데 필요하다. 표준 임상 소변 배양은 소변을 5% 양 혈액 한천(BAP)과 맥콩키 한천에 도금하고 24h12에대해 35°C에서 항공적으로 배양하는 것을 포함한다. 그러나, ≥105 CFU/mL13의검출 임계값을 가진, 오줌 microbiota의 많은 구성원은 이 방법에 의해 보고되지 않습니다. 향상된 정량소변 배양(EQUC)(11)와 같은 향상된 배양 기술은 표준 소변 문화에 의해 일반적으로 놓친 미생물을 확인하기 위하여 다른 소변 볼륨, 잠복기, 배양 매체 및 대기 조건의 각종 조합을 채택합니다. 본 프로토콜에 기재된 EQUC의 수정된 버전은, 여기에 변형된 향상된 소변 배양 프로토콜이라고 불리는, 선택적 배지와 최적의 대기 조건을 사용하여 다양한 오줌 박테리아와 비뇨기병균을 배양할 수 있지만 본질적으로 정량적이지는 않습니다. 오줌 박테리아의 성공적인 격리는 하류 WGS 및 게놈 조립을 위한 게놈 DNA (gDNA)의 추출을 가능하게 합니다.
게놈 어셈블리, 특히 완전한 어셈블리는, 상주 미생물과 비뇨기과 박테리아 둘 다 중 식민지화, 틈새 유지 보수 및 독성에 기여할 수 있는 유전 적 요인의 발견을 가능하게 합니다. 초안 게놈 어셈블리에는 시퀀싱 오류및 방향 정보가 부족할 수 있는 다양한 수의 연속 서열(연속)이 포함되어 있습니다. 완전한 게놈 어셈블리에서 모든 베이스 쌍의 방향과 정확도가모두 14로확인되었습니다. 더욱이, 완전한 게놈 서열을 얻는 것은 게놈 구조, 유전적 다양성 및 이동성 유전원15에대한 통찰력을 제공한다. 짧은 읽기만으로는 중요한 유전자의 존재 또는 부재를 식별할 수 있지만 그들의 게놈컨텍스트(16)를정확히 찾아낼 수는 없다. 옥스포드 나노포어 및 PacBio와 같은 장시간 읽은 시퀀싱 기술을 가능하게 함으로써, 세균 게놈의 폐쇄 드 노보 어셈블리를 생성하면 더 이상 멀티플렉스 PCR17,18에의한 드 노보 어셈블리의 수동 폐쇄와 같은 격렬한 방법이 필요하지 않다. 차세대 단기 판독 시퀀싱 과 나노포어 장기 읽기 시퀀싱 기술의 조합은 상대적으로 저렴한비용으로정확하고 완전하며 폐쇄된 세균 게놈 어셈블리의 촉진 생성을 허용한다. 짧은 읽기 시퀀싱은 일반적으로 평균 40-100 개의 연속으로 구성된 정확하면서도 단편화된 게놈 어셈블리를 생성하며, Nanopore 시퀀싱은 정확도가 낮지만 연통에 가입하고 유전체 시니를 해결하는 스캐폴드로 작용할 수 있는 길이약 5-100 kb의 긴 판독을 생성합니다. 짧은 읽기 및 긴 읽기 기술을 모두 활용하는 하이브리드 접근 방식은 정확하고 완전한 세균 게놈19를생성할 수 있습니다.
여기에 설명된 것은 하이브리드 어셈블리 접근법을 이용한 인간 소변, 게놈 추출, 시퀀싱 및 완전한 게놈 조립으로부터 박테리아의 격리 및 식별을 위한 포괄적인 프로토콜이다. 이 프로토콜은 플라스미드와 같은 폐쇄된 세균 염색체 및 초염색체 원소의 정확한 조립을 위해 짧은 읽기 및 긴 읽기 시퀀싱으로 생성된 읽기를 올바르게 수정하는 데 필요한 단계에 중점을 둡니다.

<table><tbody><tr><td>Equipment: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer 2100</td><td>Agilent</td><td>G29398A</td><td>선택적이지만 권장되는</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>--</td><td>원추형 및 마이크로 원심분리기 튜브를 회전시키기 위한 모든 원심분리기(예: 모델 5810R/5424R)</td></tr><tr><td>전기영동</td><td>BioRad Laboratories</td><td>1645070</td><td></td></tr><tr><td>Gel 이미징 시스템</td><td>BioRad Laboratories</td><td></td><td>ChemiDoc 모델</td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>--</td><td>Any CO2 인큐베이터(예: Thermo Forma 모델 3110)</td></tr><tr><td>마그네틱 랙</td><td>New England BioLabs</td><td>S15095</td><td>12-튜브 랙</td></tr><tr><td>MinION</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>--</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>다음Seq 500</td><td>Illumina</td><td>SY-415-1002</td><td>다른 Illumina 모델 허용</td></tr><tr><td>플레이트 리더</td><td>BioTek</td><td>--</td><td>Synergy H1</td></tr><tr><td>Qubit 형광측정기</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33238</td><td></td></tr><tr><td>회전자</td><td>벤치마크 Scientific</td><td>H2024</td><td></td></tr><tr><td>열순환기</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>--</td><td>PCR용 모든 열순환기 반응 (예 : ProFlex PCR 시스템)</td></tr> <tr><td>< 강> 재료 : < / 강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X 인산 완충 식염수 (PBS)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>BP3991</td><td></td></tr><tr><td>10X TBE 완충액</td> <td>-</td><td>-</td><td>-1M Tris, 1M 붕산, 0.2M EDTA (pH 8.0)</td></tr> <tr><td>1429R 프라이머</td><td>Sigma Aldrich (맞춤형 올리고)</td> <td>-</td> <td>GGTTACCTTGTTACGACTT</td></tr><tr><td>1kb Ladder</td><td>VWR</td><td>101228-494</td><td></td></tr><tr><td>1M Tris-Cl (pH 7.5)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15567027</td><td></td></tr><tr><td>6x 로딩 염료</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0783588</td><td></td></tr><tr><td>8F 프라이머</td><td>시그마 Aldrich (맞춤형 올리고)</td><td>--</td><td>AGAGTTTGATCCTGGCTCAG</td></tr><tr><td>한</td><td>천 Fisher Scientific</td><td>BP1423-2</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>BioRad Laboratories</td><td>63001</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP 비즈</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>혐기성 파우치 시스템 - GasPak EZ</td><td>BD 진단 시스템</td><td>B260683</td><td></td></tr><tr><td>붕산</td><td>Fisher Scientific</td><td>A73-500</td><td></td></tr><tr><td>뇌 심장 주입 국물</td><td>BD 진단 시스템</td><td>212304</td><td></td></tr><tr><td>CDC 혐기성 5% 양 혈액 한천</td><td>BD 진단 시스템</td><td>L007357</td><td></td></tr><tr><td>CHROMagar 오리엔테이션</td><td>BD 진단 시스템</td><td>PA-257481.04</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy 혈액 및 조직</td><td>QIAGEN</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq 마스터 믹스</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>건조 혐기성 지시자 스트립</td><td>BD 진단 시스템</td><td>271051</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-500</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 200 프루프</td><td>시그마 Aldrich</td><td>E7023</td><td>분자 생물학</td></tr><tr><td>에티듐 브로마이드</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP130210</td><td></td></tr><tr><td>플로우 셀 프라이밍 키트</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>EXP-FLP002</td><td></td></tr><tr><td>플로우 셀 워시 키트</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>EXP-WSH003</td><td></td></tr><tr><td>겔 추출 Miniprep Kit</td><td>BioBasic</td><td>BS654</td><td></td></tr><tr><td>결찰 염기서열분석 키트</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>SQK-LSK109</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Research Products International Corp</td><td>L381005.05</td><td></td></tr><tr><td>Mutanolysin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9901-5KU</td><td></td></tr><tr><td>네이티브 바코드 확장 1-12</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>EXP-NBD104</td><td></td></tr><tr><td>NEB 블런트/TA 리가제 마스터 믹스</td><td>New England BioLabs</td><td>M0367L</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext FFPE DNA Repair Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>M6630L</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext 퀵 ligation 버퍼</td><td>New England BioLabs</td><td>B6058S</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II 엔드 수리 / dA-테일링 모듈</td><td>New England BioLabs</td><td>E7546L</td><td></td></tr><tr><td>Nextera DNA CD 인덱스</td><td>Illumina</td><td>20018708</td><td></td></tr><tr><td>Nextera DNA Flex Library Prep - (M) Tagmentation</td><td>Illumina</td><td>20018705</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>큐비트 1X dsDNA HS 어세이 키트</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33230</td><td></td></tr><tr><td>큐비트 어세이 튜브</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>퀵 T4 DNA 리가제</td><td>New England BioLabs</td><td>E6056L</td><td></td></tr><tr><td>R9 플로우 셀</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>FLO-MIN106D</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr> TE 완충액<tr><td>DS13250</td><td></td> <td>Sheep Blood</td><td>Hemostat Laboratories</td></tr>-<tr><td></td><td>-</td><td>-10mM Tris, 1mM EDTA (pH 8.0)</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tryptic Soy Broth</td><td>BD 진단 시스템</td><td>211825</td><td></td></tr><tr><td>Software & 생물정보학 도구: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bandage</td><td>-</td><td>--</td><td>https://rrwick.github.io/Bandage/</td></tr> <tr><td>Center for Genomic Epidemiology</td><td>---</td><td></td><td>-http://www.genomicepidemiology.org/</td></tr> <tr><td>CLC Genomics Workbench 12</td><td>QIAGEN</td><td>--</td><td></td></tr><tr><td>CRISPRcasFinder</td><td>--</td><td>-</td><td>https://crisprcas.i2bc.paris-saclay.fr/</td></tr><tr><td>FastQC</td><td>--</td><td></td><td>-https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</td></tr> <tr><td>Geneious Prime</td><td>Geneious</td><td>--</td><td></td></tr><tr><td>gVolante (BUSCO)</td><td>-</td><td>-</td><td>-https://gvolante.riken.jp/</td></tr> <tr><td>Kbase Prokka 래퍼</td><td>--</td><td></td><td>--https://kbase.us/applist/apps/ProkkaAnnotation/annotate_contigs/release</td></tr><tr><td>Minimap2</td><td>--</td><td>-- </td><td>https://github.com/lh3/minimap2</td></tr><tr><td>MinKNOW</td><td>옥스포드 나노포어 기술</td><td>--NanoFilt</td><td></td></tr><tr><td></td><td>--</td><td>-</td><td>https://github.com/wdecoster/nanofilt</td></tr><tr><td>NanoStat</td><td>--</td><td></td><td>--https://github.com/wdecoster/nanostat</td></tr><tr><td>PHASTER-</td><td>-</td><td>-</td><td>-https://phaster.ca/</td></tr> <tr><td>Prokka</td><td>--</td><td>--</td><td>https://github.com/tseemann/prokka</td></tr><tr><td>QUAST</td><td>--</td><td>-</td><td>-http://quast.sourceforge.net/quast</td></tr><tr><td>트림 풍부</td><td>--</td><td>-</td><td>https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/</td></tr> <tr><td>Trimmomatic</td><td>--</td><td></td><td>--http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic</td></tr><tr><td>외발자전거-</td><td>-</td><td>--</td><td>https://github.com/rrwick/Unicycler#necessary-read-length</td></tr></tbody></table>

짧고 긴 읽기 시퀀싱 기술을 사용하여 요로나박테리아의 완전한 게놈 생성을 위한 하이브리드 드 노보 게놈 조립

Hybrid De Novo Genome Assembly for the Generation of Complete Genomes of Urinary Bacteria using Short- and Long-read Sequencing Technologies

완전한 게놈 서열은 유전적 다양성과 오줌 미생물의 독특한 식민지 요인에 대한 이해를 위한 귀중한 데이터를 제공합니다. 이러한 데이터는 플라스미드 및 외염색체 파지와 같은 이동식 유전 적 원소를 포함할 수 있으며, 이는 항균 저항의 보급에 기여하고 요로 감염 (UTI)의 치료를 더욱 복잡하게 합니다. 게놈 구조의 미세한 분해능을 제공하는 것 외에도, 완전하고 폐쇄된 게놈은 상세한 비교 유전체학 및 진화 분석을 가능하게 합니다. 완전한 게놈 드 노보의 생성은 사용 가능한 시퀀싱 기술의 한계로 인해 오랫동안 도전적인 작업이었습니다. 페어링 엔드 차세대 염기서열 분석(NGS)은 고품질의 짧은 판독을 생성하여 정확하지만 단편화된 게놈 어셈블리를 생성합니다. 반대로, 나노포어 시퀀싱은 일반적으로 오류가 발생하기 쉬운 완전한 어셈블리로 이어지는 낮은 품질의 긴 판독을 제공합니다. 이러한 오류는 게놈 전체 협회 연구를 방해하거나 오해의 소지가 있는 변형 분석 결과를 제공할 수 있습니다. 따라서 짧고 긴 판독을 모두 결합한 하이브리드 접근법은 매우 정확한 폐쇄세균 게놈을 달성하기 위한 신뢰할 수 있는 방법으로 부상했습니다. 본 명세서에서 보고된 다양한 오줌 박테리아의 배양, 종 식별에 의한 16S rRNA 유전자 시퀀싱, 게놈 DNA(gDNA)의 추출, NGS 및 나노포어 플랫폼에 의한 짧고 긴 판독의 생성이 각각 이다. 또한,이 방법은 추가로, 추가된 완전한 게놈 서열의 생성을 위한 품질 관리, 조립 및 유전자 예측 알고리즘의 생물포계 파이프라인을 기술합니다. 생물 정보 도구의 조합은 하이브리드 게놈 조립 및 다운스트림 분석을위한 고품질 읽기 데이터의 선택을 가능하게합니다. 이 프로토콜에 기재된 하이브리드 드 노보 게놈 어셈블리에 대한 간소화된 접근법은 임의의 컬투성 박테리아에서의 사용을 위해 적응될 수 있다.

이 프로토콜은 도 1에나열된 제네라에 속하는 요로균의 배양 및 시퀀싱에 최적화되어 있다. 모든 오줌 박테리아는이 방법에 의해 컬터. 문화권 미디어 및 조건은 그림 1의속에 의해 지정됩니다. gDNA 무결성의 예시겔 전기전도 평가는 도 2에서묘사된다. 판독 처리, 게놈 어셈블리 및 별표 시퀀싱을 위한 생물정보학 파이프라인의 개요는 도 3에설명되어 있다. 프로토콜 이해를 단순화하고 성공적인 조직을 위한 프레임워크를 제공하기 위해 그림 4에 계산 디렉터리 구조에 대한 가이드가 제공됩니다. 더욱이, 이 프로토콜에 의해 생성된 2개의 Klebsiella spp., K. pneumoniae 및 K. oxytoca의대표적인 완전 게놈이 포함됩니다. 이러한 어셈블리의 표현은 도 5에 제공되며 또한 추가 불완전한 예 K. 폐렴 게놈을 포함한다. 완전히 인가된 각 전체 게놈에 대한 자세한 개요는 도 6에나와 있다. 마지막으로, 표 1에 시퀀싱 읽기 통계의 요약이 제공되어 고품질 폐쇄 게놈 어셈블리생성에 충분한 원시 및 트리밍 된 데이터에 대한 광범위한 이해를 제공합니다. 또한 두 대표의 주요 매개 변수는 Klebsiella spp를 완료합니다. 게놈이 나열됩니다. 게놈과 원시 데이터는 BioProject PRJNA683049에 따라 Genbank에 입금되었습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62872/62872fig01.jpg"> 그림 1: 다양한 요로 게네라의 소변 배양을 수정했습니다. 다양한 오줌 제네라를 배양하는 데 사용될 수 있는 한천 및 액체 국물에 대한 차트. 모든 배양은 1.1절에 기재된 바와 같이 35°C에서 수행될 것을 제안된다. 원은 특정 속을 배양하는 데 적합한 미디어를 나타내며, 색상은 임의로 선택되어 한 미디어 유형을 다른 미디어 유형과 구별합니다. CDC-AN BAP (빨간색), CDC 혐기성 양 혈액 천; 5% 양-BAP (오렌지), 양 피 한천; BHI (녹색), 뇌 심장 주입; TSB (노란색), 트립틱 콩 국물; 크로마가르 오리엔테이션(파란색). 가드너엘라질은 HBT 바이레이어 G. 질경 선택적 천에서 미세 열과소및 특별한 국물 배양 요건44하에서배양되어야 한다. b유산균 이너는 5% 토끼-BAP 플레이트와 NYCIII 국물에 미세 비행대기에서 배양되어야 합니다. c유산균 스프. 미세 에어로필 조건에서 MRS에 배양 될 수있다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62872/62872fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62872/62872fig02.jpg"> 그림 2: 유전체 DNA 추출 아가로즈 젤 이미지. gDNA 추출 결과를 묘사한 대표적인 젤 이미지. (A)레인 1: 1 kb 사다리, 레인 2: 손상되지 않은 gDNA는 성공적인 추출, 레인 3: 단편화된 gDNA를 나타내는 얼룩을 나타낸다. (B)레인 1: 1 kb 사다리, 차선 2 및 3 : rRNA 오염은 1.5 kb와 3 kb 사이의 두 밴드에 의해 표시된다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62872/62872fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62872/62872fig03.jpg"> 그림 3: 하이브리드 게놈 조립 워크플로우. 읽기 품질 관리 및 사전 처리에서 어셈블리 별표에 이르는 단계의 회로도. 읽기 트리밍은 모호하고 품질이 낮은 읽기를 제거합니다. Q 점수 및 길이 매개 변수가 표시되고 유지되는 읽기를 나타냅니다. 어셈블리는 짧고 긴 읽기를 모두 활용하여 하이브리드 드 노보 게놈 어셈블리를 생성합니다. 조립 품질은 지정된 도구및 매개 변수를 사용하여 완전성과 정확성에 따라 평가됩니다. 최종 게놈 어셈블리는 모든 유전자와 관심의 특정 loci에 대해 추가됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62872/62872fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62872/62872fig4v2.jpg"> 그림 4: 생물 정보학 디렉토리 구조 가이드. 짧고 긴 읽기, 하이브리드 어셈블리 및 게놈 별표 및 QC의 처리를 위한 권장 디렉토리 및 파일 조직의 회로도. 주요 명령줄 데이터 처리 단계는 해당 파일 및 디렉터리 옆에 강조 표시됩니다. 명령 및 플래그(굵게), 입력 파일(파란색), 출력 파일 또는 디렉토리(빨간색), 파일 명명 규칙(마젠타)과 같은 사용자 입력을 유도합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62872/62872fig4v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62872/62872fig05.jpg"> 그림 5: 붕대에 의한 게놈 어셈블리 그래프. 대표적인 완전한 게놈 조립 그래프(A) Klebsiella oxytoca KoPF10 및(B) 클렙시엘라 폐렴 KpPF25 및 불완전한 게놈 조립의(C) Klebsiella pneumoniae KpPF46. KoPF10의 완전한 게놈은 단일 폐쇄 염색체를 보여주고 KpPF25의 완전한 게놈은 닫힌 염색체 및 5개의 닫힌 플라스미드로 이루어져 있습니다. KpPF46의 불완전한 염색체는 두 개의 상호 연결된 연속체로 구성됩니다. 외발 자전거 하이브리드 드 노버 어셈블리는 붕대에 의해 시각화되는 어셈블리 그래프를 생성합니다. 어셈블리 그래프는 단일 연속의 두 끝을 연결하는 링커에 의해 닫힌 염색체 또는 플라스미드를 나타내는 게놈의 단순 한 회로도를 제공합니다. 상호 연결된 연속체가 하나 이상 존재하면 불완전한 어셈블리가 있음을 나타냅니다. 붕대에서도 연속적인 크기와 깊이를 지적할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62872/62872fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62872/62872fig06.jpg"> 그림 6: 추가 된 하이브리드 어셈블리의 완전한 게놈지도. (A) K. 옥시토카 KoPF10 및(B) K. 폐렴 KpPF25의 완전한 게놈에 대한 제네어스 프라임에 의해 생성된 조립 지도는 플라스미드 백본을 따라 유색 화살표로 표시된 불음 유전자를 보여주는 것이다. 염색체는 단순성만을 위한 rRNA 및 tRNA 유전자를 보여줍니다. 게놈 주석은 이 프로토콜의 섹션 10에 표시된 바와 같이 Prokka를 사용하여 수행되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62872/62872fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Table 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62872/62872table1.jpg"> 표 1: 대표 클레브시엘라 spp. K. 옥시토카 균주 KoPF10 및 K. 폐렴 균주 KpPF25. NCBI에 대한 증착된 데이터에 대한 수탁 번호가 제공된다. 트리밍 이전과 트리밍 후 의 읽기 수는 시퀀싱 기술 모두에 대해 지정됩니다. N50은 짧은 읽기가 제어 된 길이이기 때문에 긴 읽기에 대해 제공됩니다. 플라스미드 레플리시온은 플라스미드파인더 v2.1 엔테로박테리아세이 데이터베이스를 사용하여 80%의 정체성과 60%길이로 설정된 파라미터를 사용할 것으로 예측했다. MLST, 멀티로커스 시퀀스 유형. b CDS, 코딩 시퀀스. c 플라스미드 레플리콘은 플라스미드파인더 v2.1 엔테로박테리아세이 데이터베이스를 사용하여 80%의 정체성과 60%길이로 설정된 파라미터를 사용할 것으로 예측하였다. d 옥스포드 나노 포어 기술 (ONT) 읽기 데이터를 입금. e 일루미나예금 읽기 데이터. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62872/Table%201_Sharon_JoVE_Revised.xlsx" target="_blank">이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 프로토콜은 오줌 박테리아의 배양, 시퀀싱 및 드 노보 하이브리드 게놈 조립에 대한 포괄적 인 접근 방식을 자세히 설명합니다. 그것은 오줌 식민지, 병기 발생 및 항균 저항 보급에 기여하는 염색체 및 외염색체 유전 요소 둘 다 공부에 유용한 완전하고 원형 게놈 서열의 생성을 위한 재현 가능한 절차를 제공합니다.

Complete genome sequences provide valuable data for the understanding of genetic diversity and unique colonization factors of urinary microbes. These data ...

이 포괄적인 프로토콜은 다양한 오줌 박테리아의 가까운 게놈을 생성하는 방법을 지시하고 코딩 경험이없는 독자가 말기 기반 게놈 조립 및 분석 파이프 라인을 성공적으로 구현 할 수 있게합니다. 완전한 게놈 어셈블리는 교만및 비뇨기생 박테리아 중 식민지화 및 독성에 기여하는 유전자의 발견을 가능하게 합니다. 가까운 게놈은 게놈 아키텍처및 모바일 유전 요소에 대한 통찰력을 제공합니다.하이브리드 게놈 조립 방법은 다른 해부학 적 사이트 또는 환경 틈새 에서 분리 된 모든 컬처 박테리아에 적용하여 게놈 함량 및 아키텍처에 유사한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 프로토콜 및 제조업체 가이드를 따라 이중 좌초 된 DNA 풀을 준비하고 DNA 풀에 파라자성 구슬의 2.5 배를 추가한 다음 튜브를 부드럽게 가볍게 쓸어 서 내용내용을 혼합하여 정리하십시오. 샘플을 2, 000회 G로 잠시 회전하고 실온에서 5분 동안 회전에 샘플을 배치한 다음 자석에 구슬을 밀어 넣는다.다음으로, 펠릿을 방해하지 않고 뉴클레아제 없는 물에 70%에탄올을 새로 준비한 250마이크로리터로 펠릿을 두 번 씻는다. 세차하는 동안 튜브를 자석에 둡니다. 각 세척 후 에탄올을 흡입한 다음 2, 000회 G에서 샘플을 잠시 회전한 다음 자석으로 되돌림합니다.파이펫은 잔류 에탄올을 벗겨내고 펠릿이 30초 동안 건조할 수 있도록 합니다. 일단 건조되면, 뉴클레아제없는 물의 60 ~ 70 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단하고 2 분 동안 실온에서 샘플을 배양 한 다음 엘루트가 명확해질 때까지 자석에 샘플을 펠릿하십시오. 엘테를 깨끗한 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브로 옮기십시오.플루오로미터를 사용하여 농축 된 이중 좌초 DNA 풀을 정량화한 다음 65 마이크로 리터 최종 부피로 샘플700 나노그램의 알리쿼트를 준비하여 어댑터 결찰 단계로 진행하고 첫 번째 실행이 완료된 후 두 번째 실행을 위해 4도에서 풀의 나머지 부분을 유지합니다. 제조업체 지침에 따라 어댑터 리그레이션을 계속합니다. 시퀀싱을 진행하려면 프라이밍 버퍼를 혼합하고 유동 셀을 누를 수 있습니다.DNA 라이브러리 솔루션을 준비하고 샘플을 로딩 포트에 드롭방향으로 로드합니다. 시퀀싱 실행을 시작합니다. 시퀀싱을 위해 운영 소프트웨어를 열고 시작 버튼을 클릭한 다음 실험이름을 입력합니다.키트 선택을 계속하여 사용 중이던 적절한 라이브러리 준비 키트 및 바코드 확장 팩을 선택한 다음 계속 실행 옵션을 클릭합니다. 두 번째 실행을 위해 충분한 라이브러리를 준비하려는 경우 실행 길이를 기본 값 72시간에서 48시간으로 조정하고 계속 베이스콜을 누릅니다. 빠른 베이스콜을 통합하여 베이스 콜링 옵션을 확인합니다.출력 FASTQ가 바코드 시퀀스에서 트리밍되고 바코드를 기반으로 별도의 디렉터리로 멀티플렉싱을 해제할 수 있도록 바코드를 사용하도록 설정합니다. 출력을 계속 클릭합니다. 다음으로 출력 시퀀싱 데이터를 저장할 위치를 선택합니다.FASTQ 출력을 절약할 경우 FASTQ 출력과 500기가바이트 이상의 데이터만 절약하면 약 30~50기가바이트의 데이터를 기대할 수 있습니다. 시퀀싱 후 수동 필터링을 진행할 계획이라면 필터링 옵션 Qscore 7을 필터링되지 않은 읽기 길이로 선택 해제합니다. 그렇지 않으면 옵션을 선택합니다.설정 탭을 계속 실행하여 모든 설정을 검토합니다. 설정이 올바른 경우 시작 단추를 클릭합니다. 다른, 필요한 조정을 다시 클릭 합니다.긴 읽기 디렉터리에서 실행에 사용되는 각 바코드에 대한 새 디렉터리를 만듭니다. 각 바코드에 해당하는 모든 fastq 파일을 적절한 폴더에 복사합니다. 모든 실행에서 각 바코드에 대한 모든 fastq 파일을 결합합니다.파일이 결합되면 터미널을 열고 CD 명령을 사용하여 긴 읽기 디렉터리 내의 바코드 디렉토리로 이동합니다. 바코드당 모든 fastq 파일을 단일 패스트크 파일에 연결하려면 명령을 실행하고 각 바코드에 대한 절차를 반복합니다. NanoStat를 사용하여 명령을 실행하여 샘플의 읽기 품질을 평가한 다음 출력을 텍스트 또는 Word 파일로 복사하여 결과를 기록하여 향후 참조를 확인할 수 있습니다.결과가 저장된 후 NanoFilt를 사용하여 MinION 읽기를 필터링하고 명령을 실행하여 7개 미만의 Q와 길이가 200개 미만인 읽기를 폐기합니다. 생성된 트리밍 된 파일에서 명령으로 NanoStat를 실행합니다. 출력을 텍스트 또는 Word 파일로 복사하여 결과를 기록하고 이전 결과와 비교하여 필터링이 성공되었는지 확인합니다.시퀀싱 실행에 사용되는 각 바코드에 대한 단계를 반복합니다. 하이브리드 게놈 어셈블리를 생성하기 위해 짧은 읽기 파일과 긴 읽기 파일을 trimmed_reads라는 단일 디렉토리로 구성합니다. 따라서 디렉토리에는 이전에 생성된 fastq가 포함되어 있습니다.긴 읽기와 두 개의 fastq에 대한 gz 파일. gz 파일R1 및 R2로 트리밍 된 짧은 읽기. 터미널에서 CD 명령을 사용하여 읽기 파일을 저장하는 디렉터리 trimmed_reads 이동합니다.올바른 디렉토리에 들어가면 두 개의 짧은 읽기 파일을 압축하여 fastq에 저장합니다. 명령을 실행하여 gz 형식입니다. R1과 R2 모두에 대한 단계를 반복합니다. 모든 읽기 파일이 패스트크에 있는지 확인합니다.gz 형식및 모든 파일이 동일한 격리와 일치하는지 확인합니다. 명령을 실행하여 유니사이클러를 사용하여 하이브리드 어셈블리를 시작합니다. 실행이 완료되면 외발 자전거를 검토합니다.오류를 보장하기 위해 파일을 로그합니다. 생성된 컨텍스트의 숫자, 크기 및 완전하거나 불완전한 상태를 기록합니다. 유니사이클러 로그에서 불완전한 컨텍스트가 식별되면 명령에 플래그를 추가하여 굵은 모드에서 외발 자전거를 다시 실행합니다.붕대를 열고 파일을 클릭한 다음 로드 그래프를 선택하고 어셈블리를 선택합니다. 이전에 유니사이클러에 의해 생성 된 unicycler_output_directory 저장 된 gfa 파일. 파일이 로드되면 왼쪽 도구 모음의 그리기 그래프 단추를 클릭하고 연속적이 어떻게 연결되고 구성되는지 검사하여 어셈블리가 완료되었는지 평가합니다.단말 내에서 CD 명령을 사용하여 유니사이클러 출력을 저장하는 폴더로 이동합니다. 그런 다음 명령을 실행하여 쿼트 프로토콜을 실행합니다. 출력 디렉터리 quast_output_directory 쿼에서 생성된 보고서를 검토합니다.단말 내에서 CD 명령을 사용하여 유니사이클러 출력을 저장하는 폴더로 이동한 다음 명령을 실행하여 prokka를 실행합니다. tsv 테이블을 열고 시퀀스 분석 소프트웨어에 생성된 gFF 파일을 업로드하여 주석을 검토합니다. 소프트웨어의 주석을 시각화하고 분석합니다.대표적인 젤 이미지에서 게놈 DNA 또는 gDNA 추출 결과가 묘사됩니다. 손상되지 않은 gDNA의 성공적인 추출 및 분리를 관찰할 수 있다. 단편화된 gDNA 및 RNA 오염을 보여주는 실패한 추출도 묘사됩니다.박테리아의 게놈 조립 그래프는 유니사이클러 하이브리드 드 노보 어셈블리에 의해 생성되고 붕대에 의해 시각화되었다. Klebsiella oxytoca KoPF10의 완전한 게놈은 단 하나 폐쇄염색체 및 Klebsiella 폐렴 KpPF25의 완전한 게놈이 닫힌 염색체와 5개의 닫힌 플라스미드로 이루어져 있음을 보여주었습니다. Klebsiella 폐렴 KpPF46의 불완전한 염색체는 두 개의 상호 연결된 연속으로 이루어져 있었습니다.클레브시엘라 옥시토카 KoPF10과 Klebsiella 폐렴 KpPF25의 완전한 게놈에 대한 제너리어스 프라임에 의해 생성 된 조립지도는 플라스미드 백본을 따라 색깔의 화살표에 의해 표시 된 불음 유전자를 보여주는. 흐름 셀 로드가 성공적이도록 권장 설정을 사용하여 긴 읽기를 필터링하고 모든 파일이 fastq에 있는지 확인합니다. gz 형식입니다.동일한 샘플에 속한 파일을 사용하여 올바른 유니사이클러 명령을 실행합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

우리는 화학 돌연변이 및 전체 게놈 시퀀싱에 따라 클라미디아의 유전자 분석을 수행하는 방법을 설명합니다. 또한, 감염된 세포 내에서 DNA 교환을위한 시스템은 유전자 매핑에 사용할 수있는 설명합니다. 이 방법은 변환 시스템 및 분자 유전 학적 도구가 부족한 미생물 시스템에 광범위하게 적용 할 수있다.

앞으로 유전 접근<em&gt; 클라미디아의 trachomatis</em

미생물 군집을 특성화하는 것은 환경 미생물학의 오랜 목표였습니다. 차세대 염기서열분석 방법을 통해 이제 최소한의 비용과 노동력으로 전례 없는 깊이로 미생물 군집의 특성을 분석할 수 있습니다. 여기에서는 벤치탑 염기서열분석기를 사용하여 박테리아 16S 리보솜 RNA 유전자를 염기서열분석하는 접근 방식에 대해 자세히 설명합니다.

16S 리보솜 RNA 유전자 증폭 산물의 차세대 시퀀싱

우리는 16S rRNA의 유전자의 증폭 시퀀싱을 사용하여 세균 지역 사회의 특성에 대한 면봉에서 핵산을 추출하기위한 효율적이고 강력하고 비용 효과적인 방법을 설명합니다. 이 방법은 여러 종류의 시료에 대한 일반적인 처리 방법을 허용하고 하류 공정 분석들을 수용한다.

세균 커뮤니티 특성화에 대한 효율적인 핵산 추출 및 16S rRNA의 유전자 시퀀싱

미세한 생물의 게놈 시퀀싱 하는 동안 오염에는 큰 문제가 남아 있다. 여기, 우리가 오염 위험을 최소화 하기 위해 전체 게놈 증폭 없이 genomic DNA의 작은 50 세와 단일 표본에서 tardigrade의 게놈을 시퀀싱 하는 방법을 보여줍니다.

Ultralow 입력된 게놈 시퀀싱 단일 Tardigrade 견본에서 라이브러리 준비

이 프로토콜의 목적은 계산의 조합 및 벤치 연구를 사용 하 여 부분적 으로만 알려져 있을 수 있습니다 공동 정화 시퀀스에서 쉽게 분리 될 수 없는 새로운 시퀀스를 찾을 것입니다.

빼기 게놈에 의해 소설 시퀀스 검색

긴 읽기 시퀀스는 크게 복잡 한 유전자 및 구조 변화의 특성의 어셈블리를 촉진 한다. 연속 nanopore 기반 플랫폼으로 매우 긴 시퀀스를 생성 하는 방법을 설명 합니다. 접근은 최적화 된 DNA 추출이 수정된 라이브러리 준비 인간 세포에서 kilobase 읽기 적당 한 보도 수백을 생성 하 여 다음을 채택 한다.

전체 게놈 DNA 분석을 위한 매우 긴 읽기 시퀀싱

우리는 이전에 나노 기공 시퀀싱 플랫폼에서 앰플리코 기반 전체 게놈 우스투 바이러스 (USUV) 시퀀싱에 대한 프로토콜을 검증했습니다. 여기서, 보다 자세하게 사용되는 방법을 설명하고 나노기공 R10 유량 셀의 오차율을 결정한다.

전체 게놈 나노기공 시퀀싱 검증, 우스투 바이러스를 예로 사용

당사는 그람 음성 박테리아에 있는 포화 트랜스포슨 돌연변이 라이브러리를 생성하고 고처리량 시퀀싱을 위한 DNA 증폭기 라이브러리의 후속 준비를 생성하는 방법을 설명합니다. 예를 들어, 우리는 ESKAPE 병원체, 아신토박터 baumannii에초점을 맞추고 있지만,이 프로토콜은 그람 음성 유기체의 넓은 범위에 순종.

고처리량 시퀀싱을 위한 그람 음성 박테리아에 트랜스포슨 삽입 라이브러리 생성

이 프로토콜은 긴 판독 시퀀싱 플랫폼을 사용하여 결핵균 의 18개 약물 내성 영역에 대한 표적 심층 시퀀싱에 최적화되었으며, 이어서 장기 판독 데이터용으로 설계된 결핵 특이적 생물정보학 파이프라인으로 분석했습니다.

Long-Read Sequencing Technologies를 사용한 Amplicon Sequencing

여기에서는 표적 농축을 사용하여 임상 샘플에서 박테리아 성병 감염의 전체 게놈 시퀀싱을 가능하게 하는 프로토콜을 제시합니다. 이 새로운 증후군 패널 기반 방법은 풍부한 인간 DNA와 낮은 박테리아 부하의 문제를 극복하여 클라미디아 트라코마티스, 임질균, 팔리듐 트레포네마 및 마이코플라스마 제니탈리움에 대한 게놈 감시를 용이하게 합니다.

표적 농축 워크플로우를 사용하여 임상 샘플에서 전체 박테리아 게놈 생성

본 연구는 염색체 서열이 이미 알려져 있거나 관심 없는 플라스미드의 나노포어 시퀀싱 워크플로우를 설명합니다. 초기 플라스미드 DNA 풍부화 단계는 최적의 플라스미드 서열 깊이를 보장하고 플로우 셀당 시퀀싱 가능한 샘플 수를 극대화합니다.

나노포어 시퀀싱 기반 워크플로우를 이용한 롱리드 플라스미드 시퀀싱 및 조립

배우세요 요로나박테리아의 하이브리드 드 노보 게놈 조립 방법을 Unicycler를 사용하여 완전한 원형 게놈을 생성하는 기술입니다. 이 프로토콜은 항생제 내성 및 집락화 유전자 연구에 필수적인 유전체 데이터를 제공합니다.

짧고 긴 읽기 시퀀싱 기술을 사용하여 요로나박테리아의 완전한 게놈 생성을 위한 하이브리드 드 노보 게놈 조립

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