Name: 반응성 산소 종 에 민감한 불소 성 프로브를 사용하여 뮤린 장 오르가노이드의 산화 스트레스 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-17T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: 배우세요 뮤린 장 오르가노이드에서 반응성 산소 종을 불소 성 프로브로 정성적 현미경 관찰 및 정량적 유세포 분석하는 방법을. 산화 스트레스 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 작품은 프랑스 국립 연구 기관 (ANR) 보조금 17-CE14-0022 (i-스트레스)에 의해 지원되었다.

모든 동물 실험은 2016-0022년 프랑스 농무부의 승인 후 수행되었다. 모든 단계는 조직 배양 후드 내부에서 수행됩니다.
1. 장 내장을 배양하기 위한 시약 및 재료 준비
<ol><li>성장 배양 배지를 준비하려면 1x 글루타민, 1배 페니실린/스트렙토마이신(P/S) 용액, HEPES 10mMM, 뮤린 EGF 50ng/mL, 뮤린 노긴 500 ng/mL(R-Spond)의 20 μg/mL(R-Spond1)를 혼합하여 R-Spond 1의 암조를 준비 한다. 지하실을 추출하는 동안 심열(RT)을 실온(RT)에 둡니다. 참고: -20°C에서 알리쿼트에서 사용하지 않은 배지를 동결합니다. 동결 및 해동을 피하십시오.</li>
	<li>고급 DMEM/F-12의 40mL로 50mL 튜브를 채우고 얼음 위에 보관하십시오. 참고: 사용하지 않은 배지를 4°C로 유지합니다. 그것은 유기 체 패시징에 사용 됩니다.</li>
	<li>37°C에서 인큐베이터에서 세포 배양 플레이트(μ-슬라이드 8 웰 챔버 및/또는 96웰 원형 바닥)를 미리 데워십시오.</li>
	<li>해동 지하 멤브레인 매트릭스 (BMM) ( 재료의 표 참조) 얼음에 알리쿼트 (프로토콜을 시작하기 전에 또는 적어도 1 h 도금 토굴 전에 h). 참고: BMM은 차갑게 유지되지 않으면 빠르게 굳어집니다.</li>
	<li>DPBS(DPBS-P/S)에 1% 페니실린-연쇄절제술 용액을 추가하는 세척/플러싱 솔루션을 준비합니다.</li>
	<li>100mm 페트리 접시에 10mL의 차가운 DPBS-P/S. 10mL의 DPBS로 6개의 15mL 튜브를 채우고 F1에서 F6로 라벨을 붙입니다.</li>
	<li>DPBS에서 0.5M EDTA에서 희석하여 10mM EDTA 용액 30mL를 준비합니다. 10mM EDTA의 10mL로 15mL 튜브 2개를 채우고 E1 및 E2로 레이블을 지정합니다.</li>
	<li>모든 솔루션을 4°C에서 미리 냉각하고 시술 중에 얼음 위에 보관하십시오.</li>
</ol>2. 장 내장 배양
<ol><li>국가 규칙 및 규정에 따라 8-10 주 된 Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) 마우스를 희생하십시오.</li>
	<li>십이지장(위장에서 5cm)과 일레움(10cm)을 아우르는 제주5-8cm를 모아 차가운 DPBS-P/S를 얼음 위에 보관한다.</li>
	<li>차가운 DPBS-P/S의 5-10 mL로 플러시하여 장 함량을 청소하십시오. 참고: 200 μL 팁을 10mL 주사기 노즐에 연결하여 집에서 만든 플러싱 주사기를 얻을 수 있습니다.</li>
	<li>공 팁 가위를 사용하여 세로로 장들을 엽니다( 재료표 참조) (조직을 손상시키지 않도록).</li>
	<li>집게를 사용하여, 실온에서 차가운 DPBS-P/S를 포함하는 페트리 접시에 조직을 옮기고 헹구기 위하여 흔들어.</li>
	<li>플라스틱 파스퇴르 파이펫으로, 포부로 내장을 잡고 10mL 콜드 10mMM EDTA가 들어있는 15mL 튜브 로 전송합니다.</li>
	<li>튜브를 3번 반전시키고 얼음에 10분 동안 배양합니다.</li>
	<li>플라스틱 파스퇴르 파이펫을 사용하여 10mL DPBS를 함유한 튜브 F1 에서 조직을 이송합니다. 2 분 동안 소용돌이 (정상적인 소용돌이에서 튜브를 손으로 잡고 창자가 잘 소용돌이지 확인).</li>
	<li>페트리 접시에 분획의 10 μL을 넣고 현미경으로 분수의 품질을 평가합니다. 참고: 모든 소용돌이 단계는 최대 속도로 수행되며, 각 분획의 품질은 현미경(그림 1)에서 평가되어야 합니다.</li>
	<li>플라스틱 파스퇴르 파이펫으로, 포부로 내장을 잡고 2 분 동안 10 mL DPBS와 소용돌이가 들어있는 튜브 F2 로 전송하십시오.</li>
	<li>반복 단계 2.10, 튜브 F3 에서 조직을 전송하여 10mL DPBS 및 소용돌이를 2 분 동안 함유한다.</li>
	<li>10mM EDTA를 포함하는 튜브 E2 에서 조직을 이송하는 단계 2.6에서와 같이 EDTA 인큐베이션을 반복한다.</li>
	<li>튜브를 3번 반전시키고 얼음에 5분 동안 배양합니다.</li>
	<li>반복 단계 2.10, 튜브 F4 에서 조직을 전송하여 10mL DPBS 및 소용돌이를 3 분 동안 함유한다.</li>
	<li>반복 단계 2.14, 튜브 F5 에서 조직을 전송하여 10mL DPBS 및 소용돌이를 3 분 동안 함유한다.</li>
	<li>반복 단계 2.15, 튜브 F6 에서 조직을 전송하여 10mL DPBS 및 소용돌이를 3 분 동안 함유한다.</li>
	<li>70 μm 셀 스트레이너를 통해 중력에 의해 필터링되는 최고의 분수를 50mL 튜브(얼음 위)에 결합하여 사악하고 중요한 이물질을 제거합니다. 참고 : 일반적으로 F5와 F6는 수많은 토굴과 적은 파편을 포함하는 분수입니다.</li>
	<li>4°C에서 150xg 에서 3분 동안 토굴을 회전시합니다.</li>
	<li>튜브를 비우고 펠릿을 기계적으로 방해하고 차가운 DMEM /F12 5 mL을 추가하십시오.</li>
	<li>페트리 접시에 서스펜션의 10 μL을 넣고 현미경으로 수동으로 알리쿼트에 존재하는 토굴의 수를 계산합니다. 참고: 단일 셀이나 작은 파편을 계산하지 마십시오.</li>
	<li>300개의 토굴이 우물당 도금되고, W는 우물의 수이고, N은 서스펜션의 10μL 중계산된 토굴의 수입니다. 새로운 15mL 튜브로 토굴을 전송합니다. 참고: V = 300 x W x 10/N. 계획된 실험에서 소량의 부피를 사용하는 경우 1.5mL 원심분리기 튜브를 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>4°C에서 200 x g 에서 3분 동안 토굴을 회전시합니다.</li>
	<li>파이펫을 사용하여 상체를 조심스럽게 제거합니다.</li>
	<li>기계적으로 펠릿을 방해하고 부드럽게 90 지하실 / μL의 농도를 얻기 위해 성장 배양 매체를 추가합니다.</li>
	<li>2부량의 희석되지 않은 BMM을 추가하여 30개의 지하실/μL의 최종 농도를 갖습니다. 참고: BMM 응고를 피하기 위해 항상 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.</li>
	<li>소굴의 10 μL/BMM 믹스를 각 우물에 넣습니다. 유동 세포 측정 해석의 경우 라운드 하단 96웰 플레이트를 사용합니다. 각각의 중앙에 10 μL과 돔을 분배합니다. 이미징의 경우 μ 슬라이드 8을 잘 사용하고( 재료 표 참조)를 사용하여 10 μL을 얇은 층으로 증착합니다. 참고: 내장 분석의 얇은 층으로 오르가노이드를 플레이트하여 심층 이미징을 가능하게 합니다.</li>
	<li>BMM이 고화될 수 있도록 RT에 5분 동안 플레이트를 둡니다. 플레이트를 인큐베이터에 37°C, CO25 %에 15분 동안 놓습니다.</li>
	<li>BMM을 분리하지 않도록 주의하여 각 우물에 250 μL의 성장 매체를 추가합니다.</li>
	<li>인큐베이터에 플레이트를 37°C 및 5% CO2로 놓습니다.</li>
	<li>문화의 4일과 6일 사이에 ROS 분석을 수행합니다. 그렇지 않으면, 배지를 변경하고 여러 긴 신진 구조의 출현 후 및 죽은 세포가 오르가노이드 루멘에 축적 될 때 오르가노이드를 분할.</li>
</ol>3. 오르가노이드 패시징
<ol><li>중요한 신진 구조가 형성되고 오르가노이드 루멘이 어두워진 문화 6일째 부터 소장 오르가노이드를 전달하기 시작합니다. 참고: 유기체의 루멘은 죽은 세포, 파편 및 점액의 축적으로 인해 어두워집니다. 분할하기 전에 오르가노이드가 과도하게 자라지 않도록 하십시오. 분할 비율은 오르가노이드의 성장에 따라 달라집니다. 10일째에 1:2, 1:3의 비율로 오르가노이드를 전달하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>차가운 고급 DMEM / F-12의 4 mL로 15 mL 튜브를 채우고 얼음에 보관하십시오. 참고 : 여기에 96 웰 문화 판에 대한 볼륨이 제공됩니다. 다른 형식을 사용하는 경우 볼륨을 적절하게 조정합니다.</li>
	<li>BMM 돔을 건드리지 않고 우물에서 파이펫이나 진공 펌프로 매체를 조심스럽게 흡인하고 폐기하십시오.</li>
	<li>100 μL의 콜드 어드밴스드 DMEM/F-12를 잘 넣습니다. 파이펫은 BMM을 분해하고 우물의 함량을 15mL 튜브로 전송합니다.</li>
	<li>200 μL 콜드 어드밴스드 DMEM/F-12로 우물을 씻고 동일한 튜브로 수집합니다. 참고: 동일한 실험 조건에서 여러 우물을 전달하는 경우, 우물의 내용물도 동일한 15mL 수집 튜브로 풀릴 수 있습니다.</li>
	<li>15mL 수집 튜브를 100 x g 에서 4°C에서 5분 동안 회전합니다.</li>
	<li>상체를 버리고 1mL의 콜드 어드밴스드 DMEM/F-12를 펠릿에 넣습니다. P1000 팁을 사용하여 P10 팁(필터 제외)과 파이펫을 20회 이상 위아래로 차지합니다.</li>
	<li>튜브에 차가운 고급 DMEM / F-12의 4 mL을 추가합니다. 4°C에서 5분 동안 300 x g 에서 회전합니다.</li>
	<li>펠릿을 방해하지 않고 파이펫이나 진공 펌프로 슈퍼너티드를 흡인합니다. 그런 다음 펠릿을 기계적으로 방해합니다.</li>
	<li>성장 배양 배지에 희석된 BMM을 추가합니다(2:1 비율). 거품을 믹스에 도입하지 않고 조심스럽게 위아래로 피펫.</li>
	<li>소굴의 10 μL/BMM 믹스를 각 우물에 넣습니다.</li>
	<li>BMM이 고화될 수 있도록 RT에서 5분 동안 플레이트를 유지합니다. 플레이트를 인큐베이터에 37°C, CO25 %에 15분 동안 놓습니다.</li>
	<li>각 우물에 250 μL의 성장 매체를 추가합니다. 참고: BMM을 분리하지 않도록 주의하십시오.</li>
	<li>인큐베이터에 플레이트를 37°C 및 5% CO2로 놓습니다.</li>
</ol>4. 장 내장 에서 산화 스트레스를 평가하기 위해 시약 및 재료의 준비
<ol><li>억제제 N-아세틸시스테인(NAC)의 250mM 스톡 용액을 준비하여( 재료표 참조), DPBS 245 μL로 10 mg을 재차판시합니다. 1 mM 최종 농도에서 사용하십시오.</li>
	<li>유도자 테르트 부틸 하이드로퍼산화물(tBHP)의 50mM 스톡 솔루션을 준비하여 물 속 70%를, DPBS의 496.8 μL로 3.22 μL을 희석시다. 200 μM 최종 농도에서 사용하십시오.</li>
	<li>유동 세포측정 연구의 경우, DMSO에서 주식 용액 1/10을 희석하여 불소 물질 프로브의 250 μM 작업 용액( 재료 표 참조)을 준비하십시오. 1 μM 최종 농도에서 사용하십시오. 참고: 제조업체의 지침에 명시된 바와 같이, 불소 성 프로브는 빛과 산소에 민감합니다. 주식과 알리쿼트가 열리고 너무 여러 번 닫아서는 안됩니다.</li>
	<li>이미징 연구를 위해, DMSO에서 스톡 용액 1/2를 희석시킴으로써 불소 성 프로브의 1.25 mM 작업 용액을 준비하십시오. 5 μM 최종 농도에서 사용하십시오.</li>
	<li>DPBS에서 0.1 μg/mL DAPI의 최종 솔루션을 준비하여 유동 세포 분석에서 사세포 차별에 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>희석 Hoechst 33342 받는 방법 1.25 DPBS에서 mg/mL. 5 μg/mL 최종 농도에서 사용하여 이미징 분석에서 핵 염색에 사용하십시오.</li>
	<li>37 °C에서 페놀 레드없이 따뜻한 DMEM. 참고: 이러한 단계는 그림 2A에 표시된 조건을 사용하여 모든 분석서에 포함해야 하는 음수 및 양수 컨트롤을 사용하여 설명합니다. 분석은 항 산화 화합물 또는 프로 산화 화합물을 테스트 하는 데 사용할 수 있습니다. 단계는 동일하며, 유일한 차이점은 불소염염을 사용하기 전에 화합물을 첨가할 때입니다.</li>
</ol>5. 공초점 현미경검사법에 의한 3D 오르가노이드의 산화 스트레스 시각화
<ol><li>μ-슬라이드 8 웰 챔버에서 도금된 오르가노이드를 가져와 해당 우물에 1 μL NAC 스톡 용액을 추가하여 최종 농도를 1mM로 얻습니다.</li>
	<li>37°C에서 1h 및 5% CO2에 대한 배양.</li>
	<li>해당 우물에 1 μL tBHP 스톡 솔루션을 추가하여 200 μM의 최종 농도를 얻습니다.</li>
	<li>37°C에서 30분, CO2 5% 배양합니다.</li>
	<li>불소형 프로브의 1.25 mM 희석의 우물 당 1 μL을 추가하여 5 μM의 최종 농도를 얻습니다.</li>
	<li>Hoescht의 1.25 mg/mL 희석의 우물 당 1 μL을 추가하여 5 μg/mL의 최종 농도를 얻습니다.</li>
	<li>37°C에서 30분, CO2 5% 배양합니다.</li>
	<li>BMM을 방해하지 않고 매체를 제거합니다. 페놀 레드 없이 따뜻한 DMEM 250μL을 부드럽게 넣으세요. 참고: 장기 인수를 계획하는 경우 페놀 레드 없이 DMEM에 성장 인자 화합물을 추가합니다.</li>
	<li>불소 질(ROS)을 검출하는 저혈챔버 및 가스 공급이 장착된 공초점 현미경을 사용하여 유기체를 이미지합니다. 참고: 불소 발생 프로브에 대한 흥분/방출(ex/em)은 644/665, Hoechst(nuclei)에 대한 ex/em은 361/486이며, GFP에 대한 전/em(Lgr5-GFP 마우스의 장 줄기 세포)은 488/510이다. 63배 오일 침수 목표는 줄기 세포의 신호를 감지하는 데 사용됩니다. 샘플 간에 레이저 설정을 변경하지 마십시오. ROS 프로덕션에 대한 개요를 허용하는 데 20배 목표를 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>양수 제어를 사용하여 ROS 신호에 대한 레이저 강도 및 시간 노출을 설정하고 이 신호가 음수 제어에서 더 낮은지 확인합니다.</li>
	<li>안면 화면을 사용하여 슬라이드를 사용하여 레이저 강도를 표현하는 GFP 오르가노이드를 식별하고 조정합니다. 참고: 이 단계는 수동으로 수행됩니다.</li>
	<li>위치를 정의하여 전체 오르가노이드의 스티치 이미지를 얻습니다. 25 μm (단계 크기 5 μm)의 z 스택을 설정하여 세포의 한 층을 보여주는 오르가노이드의 단면을 얻습니다. 참고: 현미경 사용자 설명서를 참조하여 설정을 최적화합니다. 살아있는 세포를 사용하여, 취득은 인큐베이션의 끝 후에 1 시간 안에 행해져야 합니다.</li>
	<li>오픈 소스 이미지 처리 소프트웨어에서 이미지를 엽니 다(재료 표 참조).</li>
	<li>z 스택을 살펴보고 오르가노이드의 중간이 잘 표현되는 섹션을 선택하고 선택한 영역을 사용하여 새 이미지를 만듭니다.</li>
	<li>단계 당 이미지를 정량화 5.15.1 - 5.15.5.<ol>
<li>프리핸드 라인 도구를 선택합니다.</li>
		<li>핵 다음에 선을 그립니다. 참고: 줄기 세포만 분석하는 경우 GFP 양성 세포를 나타내는 영역만 선택합니다.</li>
		<li>선 폭을 늘려 발광 파편을 포함하지 않고 선으로 세포층을 덮습니다.</li>
		<li>ROS 신호에 대한 채널을 선택하고 선택한 영역의 형광 강도를 측정하고 값에 인음을 추가합니다.</li>
		<li>신호가 없는 선을 그리고 최종 강도를 얻기 위해 이전 값으로 빼는 배경의 형광 강도를 측정합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 유동 세포계를 사용하여 해리된 오르가노이드에 산화 스트레스의 정량화
<ol><li>음수 컨트롤을 위해 우물에 1 μL NAC 스톡 솔루션을 추가하여 최종 농도가 1mM입니다. 참고: 96웰의 라운드 하단 플레이트에 도금된 오르가노이드를 사용합니다.</li>
	<li>37°C에서 1h 및 5% CO2에 대한 배양.</li>
	<li>해당 우물에 1 μL tBHP 스톡 솔루션을 추가하여 200 μM의 최종 농도를 얻습니다.</li>
	<li>37°C에서 30분, CO2 5% 배양합니다.</li>
	<li>멀티채널 파이펫을 사용하면 연결된 BMM을 방해하지 않고 매체를 제거하고 다른 96웰 라운드 하단 플레이트로 전송합니다. 이 접시를 따로 두십시오.</li>
	<li>트립신 100 μL을 추가하고 멀티 채널 파이펫으로 피펫을 5회 이상 위아래로 추가하여 BMM을 파괴합니다.</li>
	<li>37°C 및 5% CO2에서 5분 이상 인큐베이션을 합니다.</li>
	<li>멀티채널 파이펫을 사용하면 오가노이드를 해리하기 위해 피펫을 적어도 5배 이상 위아래로 제거합니다.</li>
	<li>RT에서 5 분 동안 300 x g 에서 회전하십시오.</li>
	<li>플레이트를 반전시켜 상체를 폐기합니다. 해당 우물에 6.3 단계에서 수집된 배지를 다시 추가하고 5회 위아래로 피펫팅하여 세포를 다시 중단합니다.</li>
	<li>1 μM의 최종 농도에서 불소 발생 프로브를 추가합니다. 250 μM 희석에서 우물당 1 μL을 추가하고 37°C에서 30분 동안 배양하고 5% CO2로 배양한다. 참고: 악기 설정에 필요한 우물에 형광 프로브를 추가하지 마십시오(그림 2B).</li>
	<li>RT에서 5 분 동안 300 x g 에서 회전하십시오.</li>
	<li>0.1 μg/mL DAPI 용액의 250 μL로 셀을 다시 일시 중지합니다. 적절한 유동 세포측정관에서 샘플을 옮기고, 튜브를 얼음 위에 보관하고, 분석을 진행한다. 참고: 기기 설정에 필요한 웰에 DAPI 대신 PBS를 추가합니다(그림 2B).</li>
	<li>모노 스테인드 샘플을 사용하여 각 불소에 대한 스테인드 컨트롤 및 레이저 전압에서 전방 및 측면 산란 전압 설정을 최적화합니다.</li>
	<li>적절한 게이팅 전략(그림 4A)을 사용하여 최소 20,000개의 이벤트를 수집합니다. 참고: 50,000개의 이벤트가 선호됩니다. 자세한 획득 설정은 사용되는 계측기에 따라 다릅니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

이 작품은 뮤직 제주네아네아의 토굴을 분리하고, 3D 오르간노이드로 배양하고, ROS에 민감한 플루오로겐성 프로브를 전체 오르가노이드의 질적 현미경 영상과 결합하여 오르가노이드 변화 후 단일 세포에 대한 유동 세포측정을 사용하여 분석하는 단계별 프로토콜을 제공한다.
이 방법의 첫 번째 중요한 단계는 암호화 추출 프로시저입니다. 실제로, 토굴 준비의 품질은 성공적인 오르가노이드 형성의 열쇠입니다. 따라서 농축 된 지하실과 셀룰러 파편 이나 죽어가는 세포가 거의없는 분획을 얻는 것이 필수적입니다. 소굴은 마우스의 연령 및 상태와 다를 수 있으므로 프로토콜에 표시된 것과 다른 분획에서 발견될 수 있습니다. EDTA 인큐베이션의 수는 그에 따라 수정될 수 있다. 4분 후 암호가 분리되지 않는 경우 3분 EDTA 배양을 반복해야 합니다. 반대로 첫 번째 EDTA 인큐베이션 이후에 이미 분리된 토굴을 가정합니다. 이 경우 두 번째 EDTA 인큐베이션이 필요하지 않을 수 있으며, DPBS의 ...

반응성 산소 종 (ROS) 세포 대사의 자연 부산물. 또한 초산화화물 음이온 및 과산화수소를 생성하는 멤브레인 바인딩 NADPH-Oxidases (NOX) 및 듀얼 옥시다제 (DUOX)와 같은 특수 효소 복합체에 의해 적극적으로 생성 될 수 있습니다. 항산화 효소와 ROS 청소부를 발현함으로써 세포는 레독스 균형을 미세조정하여 조직 항상성을 보호할 수 있습니다2. ROS는 세포에 매우 독성이 있고 DNA, 단백질 및 지질을 손상시킬 수 있지만 중요한 신호 분자2입니다. 장 상피에서, 중간 정도의 ROS 수준은 줄기 및 전구 세포 증식에 필요합니다3; 높은 ROS 수준은 그들의 apoptosis4로 이끌어 내는. 만성 산화 스트레스는 염증성 장 질환이나 암과 같은 많은 위장 질환과 관련이 있습니다. 예를 들어, Wnt 구동 장암의 마우스 모델에서 NADPH-산화제의 활성화를 통한 ROS 생산이 상승하여 암세포 과확산5,6에 요구되는 것으로 나타났다. 장 세포, 특히 줄기 세포가 산화 스트레스를 관리하는 방법과 세포 환경이이 용량에 미치는 영향을 정의하는 것은이 질병의 병인을 더 잘 이해하는 데 필수적입니다7.
조직에서, 다른 세포 모형은 그들의 기능 및 물질 대사 및 산화제 와 항 산화 분자의 다양한 수준의 표현에 따라 다를 수 있는 기저 산화 상태를 제시4,7. 생체 내에서 ROS를 모니터링하는 것은 매우 어렵습니다. 그들의 redox 상태에 따라 형광을 방출하는 세포 투과성 염료는 살아있는 세포 및 동물에 있는 세포 ROS를 구상하고 측정하기 위하여 개발되었습니다. 그러나, 그들의 효능은 살아있는 조직 내부의 확산과 그들의 급속한 판독에 따라 달라 집니다., 동물 모델에서 사용 하기 어려운 만들기8.
과거에는, ROS 생성에 화합물의 효과의 연구는 세포주를 사용하여 수행되었지만, 이것은 생체 내 상황을 반영하지 않을 수 있다. Clevers9의 그룹에 의해 개발된 장 기관지성 모델은 장 1차 세포의 성장을 가능하게 합니다. 행렬에서 장 토굴의 문화, 정의 된 성장 인자의 존재, 3 차원 구조로 이어질, 라는 오가노이드 (미니 창자), 이는 내부 루멘을 안감 다른 상피 혈통에서 세포와, 그리고 소장 줄기 세포는 작은 crypts 같은 돌출에 거주.
여기서, 본 모델을 활용하면, 단세포 배양 배지에 상업적으로 이용 가능한 ROS 에 민감한 염료를 첨가함으로써 단세포 분해능에서 1차 장 세포에서 산화적 스트레스를 연구하는 간단한 방법이 기재된다.
플레이트 판독기는 종종 총 인구에서 ROS 생산을 감지하는 데 사용됩니다. 이 프로토콜은 유동 세포 분석 또는 이미징 분석체를 사용하여 유전자 변형 세포 또는 특정 항체 염색을 가진 특정 세포 유형에서 ROS를 검출합니다. 이 작품은 유동 세포측정에 의한 공초점 화상 진찰 및 정량화에 의한 마우스 장 기관가성 배양 및 ROS 시각화를 포함합니다. Lgr5-GFP 마우스 유래 소장 오르가노이드를 사용하여, 상이한 치료법에 따라 장 줄기 세포에서 산화 스트레스의 수준을 구체적으로 분석할 수 있다. 이러한 프로토콜은 선택된 화합물로 오르가노이드를 자극한 후 ROS 균형에 미생물-유래 무라밀-디펩티드(MDP)10과 같은 외인성 분자의 영향을 테스트하도록 조정할 수 있다.

<table><tbody><tr><td>Mice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP)</td><td>The Jackson Laboratory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Growth culture medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM F12 (DMEM/F12)</td><td>ThermoFisher</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>B-27 보충제, 비타민 A 뺀</td><td>ThermoFisher</td><td>12587010</td><td>재고 농도 : 50x</td></tr><tr><td>GlutaMAX (glutamine)</td> <td>ThermoFisher</td><td>35050038</td><td>재고 농도 : 100x</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>ThermoFisher</td><td>15630056</td><td>재고 농도 : 1 M</td></tr><tr><td>쥐 EGF</td><td>R & D</td><td>2028-EG-200</td><td>재고 농도: 500 &마이크로; PBS</td></tr><tr><td>쥐 Noggin</td> R&의 g/mL<td>; D</td><td>1967-NG/CF</td><td>재고 농도: 100 & 마이크로; PBS</td></tr><tr><td>쥐 R-spondin1 R&</td>의 g/mL<td>; D</td><td>3474-RS-050</td><td>재고 농도 : 50 &마이크로; PBS</td></tr><tr><td>N-2 보충제</td><td>ThermoFisher</td><td>17502048</td><td>재고 농도 : 100x</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토 마이신 (P / S)</td> <td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td>재고 농도 : 100x (10,000 단위 / mL의 페니실린 및 10,000 &micro; 스트렙토 마이신의 g / mL)</td></tr> <tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m 세포 여과기</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>96-웰 라운드 바닥</td><td>Corning</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>볼 팁 가위 Fine</td><td>Science Tools GMBH</td><td>14086-09</td><td></td></tr><tr><td>CellROX&reg; 딥 레드 시약</td><td>ThermoFisher</td><td>C10422</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidino-2-ph&eacute; nylindole, dichlorhydrate) (fluorgenic probe)</td><td>ThermoFisher</td><td>D1306</td><td>stock at 10 mg/mL</td></tr><tr><td>DPBS 1x 칼슘 없음 무마그네슘(DPBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red)</td><td>ThermoFisher</td><td>A1896701</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>ThermoFisher</td><td>H3570</td><td>10 mg/mL 재고</td></tr><tr><td>Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix)</td> <td>Corning</td><td>356231</td><td>냉장고에서 한 번 해동하고 얼음에 1 시간 동안 보관하고 500 mL 분취액을 만들고 -20 °C에서 보관하십시오. C</td></tr><tr><td>&micro;-Slide 8 웰 챔버</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>N-아세틸시스테인(NAC)</td><td>시그마</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>tert-부틸 하이드로퍼옥사이드(tBCHP) 용액(70%wt. H2O2)</td><td>Sigma</td><td>458139</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1X), 페놀 레드 없음 (trypsin)</td><td>ThermoFisher</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0</td><td>ThermoFisher</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Sigma</td><td>Y0503</td><td>Rock-inhibitor to used to minimize cell dead on tissue</td></tr> dissociation<tr><td>Programs and Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Attune NxT (유세포 분석기)</td><td>ThermoFischer</td><td></td><td>유세포 분석기</td></tr><tr><td>Fiji/ImageJ</td><td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td><td></td><td>이미지 생성</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td>FACS 분석</td></tr><tr><td>Observer.Z1</td><td>Zeiss</td><td></td><td>confocal system</td></tr><tr><td>Opterra (swept-field confocal)</td><td>Bruker</td><td></td><td>컨포칼 시스템</td></tr><tr><td>고속 EMCCD 카메라 Evolve Delta 512</td><td>광도 컨</td><td></td><td>포칼 시스템</td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad 소프트웨어</td><td></td><td>통계 분석</td></tr></tbody></table>

반응성 산소 종 에 민감한 불소 성 프로브를 사용하여 뮤린 장 오르가노이드의 산화 스트레스 분석

Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe

반응성 산소 종 (ROS)은 장 집상성에서 필수적인 역할을합니다. ROS는 세포 대사의 천연 부산물입니다. 그들은 항균 반응 및 상처 치유에 관여로 점막 수준에서 감염 또는 부상에 대 한 응답으로 생산 됩니다. 그(것)들은 또한 세포 성장 및 분화를 포함하여 몇몇 통로를 통제하는 중요한 이차 메신저입니다. 다른 한편으로는, 과도한 ROS 수준은 산화 스트레스로 이끌어 내고, 이는 세포에 대한 해로운 일 수 있고 만성 염증 또는 암 같이 장 질병을 선호할 수 있습니다. 이 작품은 상업적으로 이용 가능한 불소 성 프로브를 사용하여 살아있는 화상 진찰 및 유동 세포측정에 의하여 장 내 뮤뇨 오르가노이드에서 ROS를 검출하는 간단한 방법을 제공합니다. 여기서 프로토콜은 장 가구형에서 레독스 균형을 조절하고 특정 장 세포 유형에서 ROS 수준을 검출하는 화합물의 효과를 분석하며, 여기에 GFP로 유전적으로 표지된 장 줄기 세포의 분석에 의해 예시된다. 이 프로토콜은 다른 형광 프로브와 함께 사용될 수 있다.

설명된 프로토콜의 개념 증명으로서, 장줄기 세포가 바커 등에서 확립한 모자이크 GFP 발현을 표시하는 Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2 마우스 라인에서 얻은 토굴은 처음에 장 줄기 세포를 특성화하고 GFP 발현에 기초하여 이러한 세포를 매핑할 수 있도록 사용되었다. 모델은 상이한 처리시 특정 세포 유형 집단에서 ROS 수준을 비교하기 위하여 제공됩니다. ROS 억제제(NAC)가 사용되었고, 유도제(tBHP)가 세포로 작용하여 레벨의 변화를 시각화하는 것으로 알려져 있다.
도 1A 및 1B 는 장 가구 배양에 대한 암호화 추출 절차 중에 얻은 분수 F1 및 F4의 대표적인 이미지를 보여줍니다. 각 분획은 추출 절차 중에 현미경 또는 쌍안경으로 검사해야 만 소굴 분리를 따르고 사악, 단일 세포 또는 파편이 아닌 토굴로 농축된 분수를 정의해야 합니다. ...

본 프로토콜은 질적 이미징 및 정량적 세포 분석 분석법을 사용하여 장 내 뮤뇨 오르노이드에서 반응성 산소 종(ROS)을 검출하는 방법을 설명합니다. 이 작업은 잠재적으로 ROS에 선택된 화합물의 효력을 시험하기 위하여 그밖 형광 탐사선으로 확장될 수 있습니다.

Reactive oxygen species (ROS) play essential roles in intestinal homeostasis. ROS are natural by-products of cell metabolism. They are produced in ...

이 방법은 형광성 프로브를 사용하여 유기체로 시험관에서 재배된 살아있는 1차 세포에서 세포 ROS 수준을 평가하기 위한 세포 생물학 분야에서 귀중한 도구입니다. 이 기술의 주요 장점은 ROS가 현미경 검사법에 의해 온전한 장 오르가노이드로 질적으로 시각화되고 96웰 플레이트를 사용하여 혈류 세포측정에 의해 해리된 세포에서 정량적으로 분석될 수 있다는 것입니다. 이 방법은 다른 오르가노이드 모델에 적용될 수 있으며 대체 형광 센서를 사용하여 다른 세포 경로를 분석할 수 있습니다.이 프로토콜을 처음으로 적용하기 전에 실험자는 오르가노이드 문화와 패시징에 익숙해져야합니다. 우리의 프로토콜은 선별 접근에 잘 적응되어 있지만 초보자는 몇 가지 샘플로 시작해야합니다. 이 절차를 시연하는 것은 실험실의 엔지니어인 소피 둘라우로이(Sophie Dulauroy)가 될 것입니다.8-10주 된 Lgr5-GFP 마우스를 희생한 후 십이지장과 일루 사이에 있는 제주의 5~8cm를 모아 얼음에 항생제로 보충된 차가운 DPBS에 배치한다. 다음으로, 항생제를 함유한 감기 DPBS의 5~10밀리리터로 세척하여 장 내 함량을 청소한다. 그런 다음 볼 팁 가위를 사용하여 장내를 세로로 열고 집게를 사용하여 항생제로 차가운 DPBS를 함유 한 페트리 접시로 조직을 옮깁니다.접시 안에 있는 조직을 흔들어 헹구세요. 다음으로, 플라스틱 파스퇴르 파이펫을 사용하여 원자를 포부로 잡고 차가운 10 밀리리터EDTA의 10 밀리리터를 포함하는 15 밀리리터 튜브로 옮춥시다. 튜브를 세 번 반전하고 10 분 동안 얼음에 배양하십시오.인큐베이션 후, DPBS와 소용돌이의 10 밀리리터를 포함하는 튜브에서 조직을 2 분 동안 전송합니다. 페트리 접시에 분획 10 마이크로리터를 즉시 추가하고 현미경을 사용하여 분수의 품질을 평가합니다. DPBS에서 각 전송 사이에 2분 동안 소용돌이를 가하는 튜브가 포함된 두 번의 전송 후, 이전에 설명한 대로 5분 동안 EDTA의 내장을 얼음 위에 배양합니다.DPBS를 함유한 튜브에서 3회 연속 이송한 후, 선택한 튜브를 세 번 반전하고 70미크론 세포 여과기를 통해 필터링하여 최적의 분획을 50 밀리리터 튜브에 결합합니다. 그런 다음 지하실을 회전시키고, 상체를 버리고, 차가운 DMEM F12의 5 밀리리터를 추가하기 전에 기계적으로 펠릿을 방해합니다. 현미경의 밑에 수동으로 10 마이크로 리터 알리쿼트에 존재하는 토굴의 수를 계산합니다.계산 후, 다시 토굴을 회전하고 신중하게 상체를 제거합니다. 그런 다음 기계적으로 펠릿을 방해하고 마이크로 리터 당 90 개의 지하실의 농도를 얻기 위해 튜브에 성장 배양 매체를 추가합니다. 다음으로, 희석되지 않은 지하 멤브레인 매트릭스 또는 BMM의 두 볼륨을 추가하여 마이크로리터당 30개의 토굴의 최종 농도를 얻고 거품을 혼합에 도입하지 않고 서스펜션을 위아래로 조심스럽게 피펫합니다.유동 세포측정 분석을 위해, 소굴의 10 마이크로리터 BMM 믹스는 미리 따뜻워진 둥근 바닥 96웰 플레이트의 각 웰의 중심에 돔으로 혼합됩니다. 그리고 이미징을 위해, 미리 따뜻워진 마이크로 슬라이드 8웰 챔버에서 얇은 층으로 믹스의 10 마이크로리터를 증착한다. BMM이 실온에서 5분 동안 고화할 수 있도록 허용한 후, 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 인큐베이터에 놓습니다.15분 후, BMM을 분리하지 않도록 주의하여 각 우물에 250 마이크로리터의 성장 매체를 추가하고 플레이트를 인큐베이터에 넣습니다. 공초점 현미경 검사법에 의해 산화 스트레스를 시각화하려면, 오가노이드로 도금 된 마이크로 슬라이드 8 웰 챔버의 해당 우물에 n-아세틸시스테인 스톡 솔루션의 마이크로 리터 를 추가합니다. 1시간 동안 인큐베이션을 한 후, 해당 우물에 테르트 부틸 하이드로퍼산화물 스톡 솔루션 1마이크로리터를 추가하고 30분 동안 배양합니다.다음으로, 1.25 밀리머 희석제의 마이크로리터를 잘 합산한 다음 밀리리터 Hoechst 용액당 1.25 밀리그램의 마이크로리터를 첨가합니다. 또 다른 30 분 인큐베이션 후, BMM을 방해하지 않고 매체를 제거하고 부드럽게 페놀 레드없이 따뜻한 DMEM의 250 마이크로 리터를 추가합니다. 불소 발생 프로브를 감지하는 저혈 챔버 및 가스 공급이 장착된 공초점 현미경을 사용하여 유기체를 이미지합니다.양수 제어를 사용하여 ROS 신호에 대한 레이저 강도 및 시간 노출을 설정하고 이 신호가 음수 제어에서 더 낮은지 확인합니다. 다음으로, 접제를 사용하여 슬라이드를 스크린하여 GFP를 표현하는 오르가노이드를 식별하고 레이저 강도를 조정합니다. 25 마이크로미터의 z 스택을 설정하고 세포의 한 층을 보여주는 오르가노이드의 단면을 얻기 위해 전체 오르가노이드의 스티치 이미지를 얻기 위해 위치를 정의합니다.오르가노이드를 함유한 96웰 라운드 하단 플레이트의 네거티브 컨트롤 웰에 n-아세틸시스테인 스톡 용액의 마이크로리터 1개를 추가합니다. 1시간 동안 인큐베이션한 후 해당 우물에 마이크로리터 테르트 부틸 하이드로퍼산화물 스톡 솔루션 1개를 추가하고 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 다중 채널 파이펫을 사용하여 연결된 BMM을 방해하지 않고 매체를 제거하고 다른 96웰 원형 하단 플레이트로 전송합니다.이 접시를 따로 두십시오. 다음으로, 트립신의 100 마이크로 리터를 추가하고 멀티 채널 파이펫을 사용하여, 피펫을 위아래로 다섯 번 사용하여 BMM을 파괴합니다. 짧은 5 분 잠복 후, 두 번째 시간 위아래로 파이프팅하여 오르가노이드를 분리합니다.접시를 회전하고 접시를 반전하여 상체를 폐기합니다. 이전에 다른 96웰 플레이트에서 수집한 배지를 해당 우물에 다시 넣고 5번 위아래로 피펫팅하여 세포를 다시 중단합니다. 다음으로, 불소 질 프로브의 마이크로리터 1개를 추가하고 30분 동안 배양합니다.그런 다음 플레이트를 다시 회전시키고 DAPI 용액의 250 마이크로리터로 세포를 다시 분리합니다. 흐름 세포측정관에서 샘플을 옮기고 튜브를 얼음 위에 보관합니다. 단염색한 샘플을 사용하여 각 불소에 대한 스테인드 컨트롤 및 레이저 전압에서 전방 및 측면 분산 전압 설정을 최적화합니다.그런 다음 적절한 게이팅 전략을 사용하여 최소 20, 000 이벤트를 수집합니다. ROS 염색 및 오르가노이드의 대표적인 공초점 이미지는 NAC 억제제의 존재에서, 오르가노이드의 루멘에 포함 된 죽은 세포로부터의 신호만 볼 수 있음을 보여 주었다. 비처리 된 오르가노이드에서, 기저 ROS 수준은 특히 GFP 양성 세포에서 볼 수 있으며, 줄기 세포가 분화 된 세포보다 더 높은 ROS를 생성한다는 것을 증명합니다.GFP 양성 세포는 형광 탐사선이 존재하여 유도체와 함께 보다 중요한 세포질 신호를 제시하며, 치료 후 줄기 세포에서 특히 ROS 수치가 증가한다는 것을 입증한다. 장 기관가노이드에서 ROS 생산의 유동 세포 분석은 저해기로 자극 후 기저 ROS 수치가 감소하고 유도제와 도전 후에 증가한다는 것을 보여줍니다. 억제제로 전처리된 다음 유도제로 자극한 세포는 유도제만으로는 자극받은 세포보다 낮은 수준을 제시합니다.GFP 양성으로 게이트된 줄기 세포에 대한 유사한 분석은 억제제 치료 시 ROS 레벨의 3.5배 감소와 비자극세포에 대한 유도제 치료에 따른 4배 증가를 나타낸다. 이 절차를 시도할 때 사용자는 organoid 조작 및 해리 중에 세포 스트레스를 제한하는 것을 기억해야 합니다. 또한 ROS를 분석할 때 항상 양수 및 음수 컨트롤을 포함해야 합니다.이 절차에 이어, 분석은 ROS 조절에 대한 추가 통찰력을 얻기 위해 고정 된 그대로 유기체, 세포 정렬 및 유전자 발현 분석에 대한 면역 형광 염색에 의해 보완 될 수있다. 이 비디오를 시청한 후에는 뮤린 장 오르가노이드를 재배하고, 그대로 유기체에 대한 실시간 이미징 분석을 수행하고, 유동 세포측정 분석을 위한 장 기관을 처리하는 방법을 알아야 합니다.

analyzing-oxidative-stress-murine-intestinal-organoids-using-reactive

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오는 배양된 오가노이드에서 산화 스트레스를 시각화하는 기술에 대해 설명합니다. 이 연구는 서로 다른 ROS 조절제로 처리한 후 오가노이드에 존재하는 다양한 세포 유형에서 ROS 축적으로 인한 산화 스트레스 수준을 이해하는 데 도움이 됩니다.

형광 프로브 이미징 분석: 반응성 산소종 유도 처리로 처리된 배양된 장 오가노이드 세포의 산화 스트레스를 시각화하는 기술

이 동영상은 GFP 발현 형질전환 마우스에서 얻은 3D 장 오가노이드의 ROS 수준을 정량화하기 위한 유세포 분석 분석을 보여줍니다. 이 방법은 ROS 생산에 대한 테스트 화합물의 효능을 조사하기 위한 체외 실험 모델을 제공합니다.

산화 스트레스를 정량화하기 위한 유세포 분석 분석: 형량 탐침을 사용하여 장 오가노이드의 활성 산소 종을 정량화하기 위한 분석

우리는 정량적 연구를위한 각종 아메바 및 포유류의 세포 모델에 적용 할 수있는 활성 산소 종 (ROS)의 측정을위한 일련의 프로토콜을 채택.

검출 시각화 및 아메바 모델 시스템에서 활성 산소 종의 생성을 정량

여기에서 우리는 살아있는 제브라피시 배아의 산화 스트레스를 측정하는 프로토콜을 보고합니다. 이 절차를 통해 전체 배아 조직과 단일 세포 집단 모두에서 활성 산소 종(ROS)을 검출할 수 있습니다. 이 프로토콜은 정성적 분석과 정량적 분석을 모두 수행합니다.

제브라 피쉬 배아에서 산화 스트레스의 분석

이 원고 xenobiotic 유발 산화 스트레스의 시험에 대 한 유전자 인코딩된 fluorogenic 기자 라이브 셀 이미징 응용 프로그램에서 사용을 설명합니다. 이 실험 방법은 많은 독성 산화 스트레스의 검색에 사용 되는 기존 방법의 단점을 피하는 동안 탁월한 spatiotemporal 해상도, 감도 및 특이성을 제공 합니다.

유전자로 인코딩된 Fluorogenic 센서를 사용 하 여 독성 산화 스트레스의 평가에 접근을 이미징

우리는 비-침략 적 vivo에서 이미징 프로토콜을 간소 하 고 비용 효율적인, L-012, chemiluminescent luminol 아날로그, 시각화 하 고 계량 상처 excisional 마우스 모델에서 생성 된 반응성 산소 종 (선생님)을 활용 하 여 설명 합니다.

Vivo에서 영상에는 Murine 반응성 산소 종의 상처 모델

여기에서 우리는 소장 오르가노이드의 장벽 무결성을 정량화하는 기술을 기술합니다. 이 방법이 살아있는 오르가노이드를 기반으로 한다는 사실은 시간 해결 방식으로 상이한 장벽 무결성 변조 물질 또는 이들의 조합에 대한 순차적 조사를 가능하게 한다.

살아있는 오르가노이드의 장 장벽 고장 조사

여기서, 우리는 2',7'-디클로로디하이드로플루오레세인 디아세테이트(DCFH-DA)를 사용하여 총 세포 반응성 산소 종(ROS)을 검출하는 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 형광 현미경으로 부착 된 세포에서 세포 ROS 국소화를 시각화하고 형광 판 판독기와 ROS 강도를 정량화 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 간단하고 효율적이며 비용 효율적입니다.

2',7'-디클로로디하이드로플루오레세신 디아세테이트 염색에 의한 부착세포에서 총 반응성 산소종 검출

이 프로토콜은 셀 내의 세포 전체 구획 별 레독스 상태의 평가를 설명합니다. 레독스에 민감한 형광 프로브는 그대로 있는 세포에서 편리한 비율 측정 분석을 허용합니다.

세포간 구획-특이적 레독스-에민감한 녹색 형광 단백질을 이용한 세포 산화 평가

여기에서는 뮐러 아교 세포 (MGC)에서 2',7'-dichlorofluorescein diacetate probe (DCFH-DA)를 사용하여 세포 반응성 산소 종 (ROS)을 검출하기위한 체계화되고 접근 가능하며 재현 가능한 프로토콜을 제안합니다. 이 방법은 유세포 분석기로 총 세포 ROS 수준을 정량화합니다. 이 프로토콜은 사용하기 매우 쉽고 적합하며 재현 가능합니다.

뮐러 신경교 세포에서 2',7'-디클로로플루오레세인 디아세테이트 프로브 및 유세포 분석기를 사용한 반응성 산소 종의 정량화

배우세요 뮤린 장 오르가노이드에서 반응성 산소 종을 불소 성 프로브로 정성적 현미경 관찰 및 정량적 유세포 분석하는 방법을. 산화 스트레스 연구에 활용할 수 있습니다.

반응성 산소 종 에 민감한 불소 성 프로브를 사용하여 뮤린 장 오르가노이드의 산화 스트레스 분석

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