형광-활성화된 세포 분류-방사성 신호의 세포 기원을 결정하기 위한 방사성리간드 처리조직(FACS-RTT)

이 프로토콜은 생체내 영상화에 상보적이다. 그것은 방사성 추적기의 세포 유형 및 세포 수준 정량화를 허용하며, 이는 생체내에서 얻은 것과 다른 척도입니다. 이 기술의 주요 장점은 방사성 리간드 및 세포 분류의 사용에 의해 주어진 감도 및 세포 분해능이다.

카메라를 켜고 운영 소프트웨어를로드하십시오. 홈 XYZ 스테이지 버튼을 클릭하여 호밍을 수행합니다. 하나의 10분 스캔 획득으로 구성된 실험을 설정합니다.

스텝 모드를 fine으로 설정하고 획득 모드를 Listmode로 설정하여 전체 방출 스펙트럼을 기록합니다. 침대를 설치하고 온난화 시스템, 호흡 센서 및 마취가 기능적이고 안전한지 확인하십시오. 그런 다음 동물의 머리가 배치 될 팬텀을 놓습니다.

화면 하단에 있는 세 개의 이미지를 사용하여 세 차원의 커서를 밀어 스캔 영역을 설정합니다. 팬텀과 동물의 스캔 볼륨이 동일한지 확인하십시오. 이전에 설정된 매개변수로 후속 보정을 위해 팬텀 스캔을 시작합니다.

방사능과 관련된 실험을 위해 승인 된 적절한 환경에서 작업하십시오. 100 마이크로리터의 트리부틸린 전구체를 요오드화 나트륨과 37% 파라세틱 산 5마이크로리터와 함께 100 마이크로리터의 트리부틸린 전구체를 섭씨 70도에서 글로브 박스에 위치한 열순환기에서 20분 동안 배양한다. 물에 50% 아세토니트릴을 사용하여 반응을 희석하여 500 마이크로리터의 부피에 도달한다.

희석된 반응물 500 마이크로리터를 역상 컬럼에 주입한다. CLINDE를 7밀리몰 인산에서 5 내지 95%ACN으로 10분 동안 선형구배 HPLC로 분리한다. 분리 된 물을 물에 희석하여 10 밀리리터의 최종 부피를 얻은 다음 희석 된 반응을 농축 컬럼에 주입하십시오.

컬럼으로부터 CLINDE를 300 마이크로리터의 무수 에탄올로 에루트한 다음, 이를 실온에서 40분 동안 진공 원심분리기에서 인큐베이션하여 에탄올을 증발시킨다. CLINDE를 함유하는 잔류물을 300 마이크로리터의 식염수에 희석하여 원액을 생성한다. 방사능을 측정 한 후 원액을 식염수로 희석하여 500 마이크로 리터의 0.037 메가 베크렐 용액을 얻습니다.

콜드 참조 화합물로 보정 곡선을 설정하고 선형 회귀 방정식인 Y를 AX + B와 동일하게 해결하여 A 및 B 계수를 구합니다. X는 차가운 화합물의 질량을 나타내고, Y는 곡선 아래의 면적을 나타낸다. 방사성 리간드의 곡선 아래의 면적을 확인하고, 보정 곡선을 기준으로 450 나노미터에서 자외선 흡광도를 측정하고, 방사성 리간드의 곡선 아래의 면적을 확인한다.

질량을 추정하고 방사성 리간드의 활성을 측정한다. 특정 활성이 마이크로 몰 당 1, 000 기가베크렐보다 큰지 확인하십시오. 이미지 업데이트 버튼을 클릭하여 동물 위치를 업데이트하십시오.

세 가지 차원에 대한 화면 하단 부분에 있는 세 개의 이미지의 도움으로 커서를 밀어 스캔 영역을 설정합니다. 일분의 60 프레임을 구성하는 60 분 스캔에 실험을 설정하십시오. 처음에 설정된 다른 모든 매개 변수를 다시 사용하십시오.

500 마이크로 리터의 방사성 방사성 추적기를 주입 한 다음 300 마이크로 리터의 멸균 된 0.9 % 염화나트륨으로 튜브를 플러시하십시오. 동시에 획득 시작을 클릭하여 스캔을 시작하십시오. 스캔 재구성 소프트웨어를 연 다음 데이터 세트를 열고 스캔 폴더에 생성 된 파일 이름 매개 변수 파일을 찾습니다.

관심 있는 동위원소를 선택합니다. 목록 모드 매개변수는 이 단계에서 다중 동위원소 선택을 허용합니다. 원고에 설명된 대로 복셀 크기, 하위 집합 수 및 반복과 같은 다양한 재구성 매개 변수를 설정합니다.

출력 형식을 NIFTI로 선택한 다음 SPECT 재구성 시작을 선택합니다. 평평한 금속 주걱과 면도날을 사용하여 뇌의 관심 영역을 해부하십시오. 조직을 두 밀리리터 원심분리 튜브에 넣고 얻은 조직을 칭량합니다.

샘플을 칼슘 및 마그네슘이 없는 HBSS 한 밀리리터가 있는 두 밀리리터 원심분리 튜브에 넣은 다음, 실온에서 두 분 동안 300배 G에서 원심분리하고 펠렛을 방해하지 않고 상층액을 제거하였다. 1, 900 마이크로리터의 효소를 넣고 1개씩 섞어서 섭씨 37도에서 15분간 배양하면서 5분마다 역전시켜 튜브를 교반시킨다. 30 마이크로 리터의 효소 믹스 두 개를 추가하십시오.

1, 000 마이크로리터 피펫으로 30회 앞뒤로 부드럽게 교반하십시오. 이어서, 혼합물을 섭씨 37도에서 15분 동안 인큐베이션하면서 5분마다 역전시켜 튜브를 교반시킨다. 200마이크로리터 피펫으로 앞뒤로 부드럽게 혼합한 다음 10마이크로리터 피펫을 가졌고, 혼합물을 섭씨 37도에서 10분 동안 인큐베이션하기 전에 조직을 해리시킨다.

세포를 70마이크로미터 세포 스트레이너로 여과하고 10밀리리터의 칼슘과 마그네슘이 없는 HBSS를 첨가하십시오. 실온에서 10분 동안 300배 G에서 원심분리하고 펠렛을 방해하지 않고 상층액을 제거하였다. 미엘린 고갈을 위해, 펠렛을 400 마이크로리터의 미엘린 제거 완충액으로 재현탁시킨 다음, 섭씨 4도에서 15분 동안 인큐베이션하기 전에 미엘린 제거 비드 100 마이크로리터를 첨가한다.

미엘린 제거 완충액 다섯 밀리리터를 첨가하고 실온에서 10분 동안 300배 G를 원심분리한다. 500 마이크로 리터의 미엘린 제거 버퍼를 추가하고 부유 한 펠렛을 자기장 컬럼에 넣으십시오. 미엘린 제거 완충액 한 밀리리터로 컬럼을 네 번 세척하십시오.

실온에서 두 분 동안 300배 G에서 원심분리하고 펠렛을 방해하지 않고 상층액을 제거하였다. 소용돌이를 잠깐 소용돌이 치면서 세포를 해리시키고 다섯 마이크로 리터의 Fc 블록 CD32를 첨가한다. 관심있는 일차 항체의 혼합물 100 마이크로리터를 첨가하고, 섭씨 네 도에서 20분 동안 인큐베이션한다.

섭씨 네 도에서 5분 동안 350배 G에서 원심분리하고 펠렛을 방해하지 않고 상층액을 제거하였다. 튜브를 부드러운 종이에 거꾸로 닦으십시오. 튜브를 간략하게 소용돌이 치고, 100 마이크로리터의 이차 항체 믹스를 첨가하고, 섭씨 4도에서 15분 동안 인큐베이션한다.

미엘린 제거 완충액 한 밀리리터를 넣고 원심분리를 반복한다. 상층액을 버리고 튜브를 부드러운 종이에 거꾸로 닦으십시오. 세포를 250 마이크로리터의 멸균 PBS에 재현탁시키고 세포 분류를 직접 진행한다.

야생형 래트의 생체내 SPECT 스캔은 뇌의 대측 영역에서보다 리포폴리사카라이드 주사 부위에서 CLINDE의 더 높은 결합을 나타냈다. 방사성리간드 처리 조직 또는 FACS-RTT를 분류하는 형광 활성화 세포 분류를 시행한 생체외 샘플은 미세아교세포에서만 더 많은 수의 CLINDE 결합 부위의 존재를 밝혀냈으며, 이는 뇌의 동측성 측면에서 CLINDE 신호의 세포 기원이 미세아교세포임을 보여준다. TgF344-AD 래트에서 12개월째에 트랜스로케이터 단백질 또는 TSPO 결합의 증가는 성상세포로 제한되었다.

24개월령의 래트에서, TSPO 결합의 증가는 성상세포 및 미세아교세포 변화 둘 다로 인해 관찰되었다. 더 오래된 TgF344-AD 래트에서, 줄무늬 성상세포는 야생형과 비교했을 때 감소된 5HT2AR 밀도를 나타냈다. TSPO의 피질 과발현은 인간 AD 사후 샘플에서 FACS-RTT를 수행했을 때 연령 일치 대조군과 비교하여 AD 피험자의 성상세포 및 미세아교세포 둘 다에서 관찰되었다.

방사능으로 작업 할 때는 방사선 보호의 지시에 따라 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오. 그런 다음 절차가 끝나면 작업 환경의 오염을 제거하십시오. 단백질 정량 및 유전자 발현 분석은 분리된 세포 집단에서 이 절차 후에 쉽게 수행할 수 있다.