Name: 형광-활성화된 세포 분류-방사성 신호의 세포 기원을 결정하기 위한 방사성리간드 처리조직(FACS-RTT) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: 배우세요 FACS-RTT 기술을 사용하여 알츠하이머병에서 세포 수준 단백질 발현을 분석하는 방법을 TgF344-AD 쥐 모델을 통해 익히세요. 이 기법은 신경퇴행성 질환 연구에 높은 감도와 세포 해상도를 제공합니다.

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이 연구는 스위스 국립 과학 재단 (보조금 번호 320030-184713)의 지원을 받았다. 저자 BBT와 KC는 Velux Foundation (프로젝트 n. 1123)의 지원을 받습니다. 저자 ST는 스위스 국립 과학 재단 (Early Post-Doc Mobility Scholarship, no. P2GEP3_191446), Max Cloetta Foundation (Clinical Medicine Plus 장학금) 교수, Jean and Madeleine Vachoux Foundation.

모든 실험 절차는 제네바 광저우의 인간 및 동물 실험 윤리위원회, 연구 윤리를위한 광저우위원회 (CCER) 및 제네바 광저우 건강 (스위스)의 일반 방향과 각각 합의하여 수행되었습니다. 데이터는 동물 연구: 생체 내 실험(ARRIVE) 지침 보고에 따라 보고됩니다.
1. SPECT 카메라 준비 및 보정
<ol><li>카메라를 켜고 운영 소프트웨어를 로드 합니다(자료 표 참조). 홈 XYZ 스테이지 버튼을 클릭하여 호밍을 수행합니다.</li>
	<li>하나의 10분 스캔 획득으로 구성된 실험을 설정합니다. 스 텝 모드를 Fine 으로 설정하고 획득 모드를 Listmode 로 설정합니다(전체 방출 스펙트럼을 기록하기 위해).</li>
	<li>침대를 설치하고 온난화 시스템, 호흡 센서 및 마취가 기능적이고 안전한지 확인하십시오 (그림 1A-D). 이어서, 동물의 머리가 위치될 팬텀(즉, 2 mL 마이크로퍼지 튜브에 알려진 농도의 125I의 2 mL)을 배치한다(영역 중심, 도 1E).</li>
	<li>화면 하단에 있는 세 개의 이미지를 사용하여 세 차원의 커서를 밀어 스캔 영역을 설정합니다. 팬텀과 동물의 스캔 볼륨이 동일한지 확인하십시오.</li>
	<li>1.2-1.4단계에서 설정된 파라미터로 후속 교정을 위해 팬텀 스캔을 시작합니다.</li>
</ol>2. SPECT 이미징을 위한 작업 공간 설정
<ol><li>소독제 virucide로 작업 공간을 청소하고 모든 표면에 부드러운 종이를 놓습니다.</li>
	<li>각각의 탱크에 이소플루란과 산소가 충분한지 확인하십시오.</li>
	<li>나비 카테터의 지느러미를 잘라 쥐 꼬리 정맥을보다 명확하게 볼 수 있도록 24G 카테터를 준비하십시오.</li>
	<li>바늘을 제거한 후 헤파린 용액 (25000 U / mL)으로 카테터를 완전히 채워서 카테터를 코팅하십시오. 그런 다음 카테터 삽입 후 혈전 형성을 피하기 위해 바늘을 다시 넣으십시오.</li>
</ol>3. [125I]CLINDE 방사성 추적기 합성
주의: 방사능은 살아있는 세포의 원자에 영향을 미치고 유전 물질 (DNA)을 손상시키기에 충분한 이온화 에너지를 가질 수 있습니다.
<ol><li>방사능과 관련된 실험을 위해 승인 된 적절한 환경에서 작업하십시오. 참고: 손가락과 신체 선량계를 포함한 방사능 처리를 위해 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용하십시오. 방사능의 모든 소스에서 안전한 거리에 머물러보십시오.</li>
	<li>100 μL의 트리부틸린 전구체 100 μg을 요오드화나트륨(Na125I)( 물질표 참조) 및 5 μL의 37% 과아세트산과 함께 70°C에서 20분 동안 글로브 박스에 위치된 열순환기에서 인큐베이션한다.</li>
	<li>500 μL의 부피에 도달하기 위해 물에 50% 아세토니트릴(ACN)을 사용하여 반응을 희석한다. 희석된 반응물 500 μL를 역상 컬럼 상에 주입 한다(표 참조).</li>
	<li>10분 동안 7 mMH3PO4중의 5%-95% ACN으로부터 실행되는 선형 구배 HPLC로 [125I]CLINDE를 단리한다. 단리물을H2O로 희석하여 최종 부피 10 mL를 달성한 다음, 희석된 반응을 농축 컬럼 상에 주입한다(표 참조).</li>
	<li>컬럼으로부터 [125I]CLINDE를 300 μL의 무수 에탄올로 에루팅하고, 이어서 이를 RT에서 진공 원심분리기에서 40분 동안 인큐베이션함으로써 에탄올을 증발시켰다.</li>
	<li>[125I]CLINDE를 함유하는 잔류물을 300 μL의 멸균 염수에 희석하여 원액을 생성한다.</li>
	<li>방사능을 측정한 후, 원액을 멸균 식염수에 희석하여 500 μL의 0.037 MBq의 용액을 얻었다.</li>
	<li>트레이서를 HPLC (고성능 액체 크로마토그래피)로 정제하십시오. 450 nm에서의 표준 교정을 사용하여 용출 시간을 결정하고, 단일 방사성 피크를 분리한다. 냉(비방사성) CLINDE(50% ACN의 용액 중 400 μL에서 0.1 μg, 0.5 μg, 0.75 μg, 1 μg, 1.5 μg, 2 μg, 및 5 μg)의 7가지 표준 농도를 사용하여 표준 검량선을 수행한다. 무선 TLC(박층 크로마토그래피)에서 단일 피크를 측정하여 방사화학적 순도를 확립한다. 방사성 화학 물질의 순도가 60 % 이상인지 확인하십시오.</li>
	<li>450 nm에서 자외선 흡광도를 측정하는 방사성 리간드의 특정 활성과 콜드 참조 화합물로 확립 된 보정 곡선을 확인하십시오. 특정 활동이 1000GBq/μmol보다 큰지 확인하십시오.</li>
</ol>4. [125I]R91150 방사성 추적기 합성
참고: CLINDE 합성 섹션에서 언급한 것과 동일한 보안 규칙을 따라야 합니다.
<ol><li>3 μL의 무수 에탄올, 3 μL의 빙초산, 15 μL의 담체가 없는 Na125I(물질 표 참조)(10 mCi)의 용액에 300 μg의 R91150전구체를 0.05 M NaOH 및 3 μL의 30%H2O2의 용액에 혼합한다. 글러브 박스에서 30 분 동안 배양하십시오.</li>
	<li>전체 반응을 역상 컬럼에 주입 하십시오 (재료 표 참조).</li>
	<li>3 mL/min의 유속으로 등용매 HPLC 실행 (ACN/물 50/50, 10 mM 아세트산 완충액)에 의해 [125I]R91150을 분리한다.</li>
	<li>10 mL의 최종 부피에대해 H2O에 [125I]R91150을 희석한다.</li>
	<li>희석된 반응물 10 mL를 농축 컬럼에 주입 한다(표 참조).</li>
	<li>컬럼으로부터 [125I]R91150을 300 μL의 무수 에탄올로 분리한다.</li>
	<li>에탄올을 증발시켜 이를 40분 동안 RT에서 진공 원심분리기에서 인큐베이션한다.</li>
	<li>[125I]R91150을함유하는 잔류물을 300 μL의 식염수에 희석한다.</li>
	<li>HPLC로 추적기를 정화하십시오. 450nm에서 표준 교정을 사용하여 용출 시간을 결정하고 단일 방사성 피크를 분리하십시오. 무선 TLC에서 단일 피크를 측정하여 방사화학적 순도를 확립한다. 방사성 화학 물질의 순도가 98 % 이상인지 확인하십시오.</li>
</ol>5. 동물 준비
<ol><li>TgF344-AD 래트(남성 또는 암컷, 2-24개월령부터)를 3% 이소플루란이 있는 유도 챔버에서 계량하고 마취시킨다. 일단 깊이 마취되면, 이소플루란 유동을 챔버 내에서 2%(0.4 L/min, 100% O2)로 낮춘다.</li>
	<li>마취 노즈콘이 장착 된 미리 따뜻해진 침대에 동물을 놓습니다. 이소플루란을 2%(0.4L/min, 100%O2)로 유지하십시오.</li>
	<li>동물의 눈에 아이 젤 윤활제를 바르고 호흡 모니터링을 통해 마취의 깊이를 확인하십시오. 필요한 경우 마취를 조정하십시오.</li>
	<li>꼬리 정맥에 24G 카테터 삽입을 수행하십시오.</li>
</ol>6. 스펙트 획득
<ol><li>동물을 38°C로 설정된 온도 조절 가열 패드가 장착된 카메라 침대로 옮깁니다(그림 1E).</li>
	<li>동물의 머리를 물린 막대에 고정시키고 머리 지지대를 고정하십시오.</li>
	<li>1분의 60프레임을 구성하는 60분 스캔에서 실험을 설정합니다. 1단계에서 설정한 다른 모든 매개 변수를 다시 사용합니다. 이미지 업데이트 버튼을 클릭하여 동물 위치를 업데이트 하십시오.</li>
	<li>세 가지 차원에 대한 화면 하단 부분에 있는 세 개의 이미지의 도움으로 커서를 밀어 스캔 영역을 설정합니다.</li>
	<li>500 μL의 방사성 방사성 추적기 ([125 I]CLINDE 또는 [125I]R91150)를 주입한 다음, 300 μL의 멸균 0.9% NaCl로 튜브를 플러시한다. 동시에 획득 시작을 클릭하여 스캔을 시작하십시오.</li>
	<li>스캔 시간 동안 호흡률 모니터링을 통해 동물을 일정한 마취하에 유지하십시오. 필요한 경우 이소플루란의 흐름을 조정하십시오.</li>
	<li>스캔이 끝나면 마취 된 동물을 목이 잘려 신속하게 안락사시킵니다.</li>
</ol>7. 스캔 재구성
<ol><li>스캔 재구성 소프트웨어( 재료 표 참조)를 연 다음 데이터 세트를 열고 스캔 폴더에 생성된 [filename].parameters 파일을 찾습니다.</li>
	<li>관심 있는 동위원소를 선택합니다. Listmode 매개 변수는 이 단계에서 여러 동위원소 선택을 허용합니다.</li>
	<li>0.4mm Voxel 크기, 4개(POS-EM) 서브세트, 6회 반복(24ME-EM 환산), 사후 필터 없음 및 해당 붕괴 보정에 해당하는 동위원소 매개변수를 선택합니다. NIfTI에 대한 출력 형식을 선택한 다음 SPECT 재구성 시작 을 선택합니다.</li>
</ol>8. 쥐 뇌 추출
<ol><li>주사 절차와 동일한 마취 사건에서 호흡 속도를 모니터링하여 동물의 깊은 마취 상태를 확인한 후 단두대에 의한 감금으로 진행하고 머리를 해부 벤치로 신속하게 옮깁니다.</li>
	<li>가위로 머리 꼭대기의 피부를 뒤쪽에서 앞쪽으로 조심스럽게 자르고 눈 가운데까지 자릅니다.</li>
	<li>두개골 기저부와 자궁 경부 척추 주위의 과도한 근육을 차단하십시오.</li>
	<li>다음으로, 두개골 뒤쪽의 구멍에 가위의 칼날 하나, foramen magnum을 조심스럽게 놓고 수술 펜치로 두개골의 뒷부분을 제거하십시오.</li>
	<li>그런 다음 외과 용 펜치로 두개골의 윗부분을 조심스럽게 제거하십시오. 오래된 수컷 쥐의 두개골은 두껍고 뇌 손상을 피하기 위해 작은 조각으로 제거 할 수 있습니다.</li>
	<li>조심스럽게 가위로 수막을 자르십시오. 수막은 추출 과정에서 뇌를 손상시킬 수 있습니다. 예방 조치로 제거하십시오.</li>
	<li>두개골의 윗부분을 제거한 후 동물의 머리를 돌리고 작은 평평한 주걱으로 시신경과 삼차 신경을 절단하여 조심스럽게 뇌를 당겨 내십시오.</li>
	<li>얼음 위에서 해부를 위해 뇌를 평평하고 깨끗한 유리 표면에 조심스럽게 옮기십시오.</li>
	<li>평평한 금속 주걱과 면도날을 사용하여 뇌의 관심 영역을 해부하십시오. 조직을 2 mL 원심분리 튜브에 넣고 얻은 조직을 칭량한다. 세포 분리를 위해 뇌 섹션을 직접 사용하거나 나중에 사용할 수 있도록 액체 질소에서 신속하게 동결하십시오.</li>
</ol>9. 세포 분리
<ol><li>깨끗하고 멸균 된 환경에서 작업하십시오. 클래스 II 생물 안전 캐비닛 (BSC)에서 일하는 것이 좋습니다. 장갑과 BSC에 도입된 모든 장비가 멸균되어 있는지 확인하십시오.</li>
	<li>세포 분류를 위해 세포를 준비하려면 Jaclyn M. Schwarz14의 프로토콜을 따르십시오. 참고: 이 실험에서는 시판되는 신경 해리 키트( 표 참조)를 세포 준비에 사용했습니다.<ol>
<li>샘플을 1 mL의 HBSS (Ca- 및 Mg-free)가 있는 2 mL 원심분리 튜브에 넣고, 원심분리 (300 x g, 2 분, 실온 = RT)하고, 펠렛을 방해하지 않고 상층액을 제거하였다.</li>
		<li>1900 μL의 효소 믹스-1을 첨가하고, 이를 37°C에서 15분 동안 인큐베이션하면서 매 5분마다 역전시킴으로써 튜브를 교반시킨다.</li>
		<li>30 μL의 효소 믹스-2를 첨가하고, 피펫 1( 물자의 표 참조)로 30회 앞뒤로 부드럽게 교반한다. 이어서, 37°C에서 15분 동안 인큐베이션하면서 매 5분마다 역전시켜 튜브를 교반시킨다.</li>
		<li>피펫 2와 앞뒤로 부드럽게 혼합한 다음, 피펫 3을 37°C에서 10분 동안 인큐베이션하기 전에 조직을 해리시킨다.</li>
		<li>세포를 80 μm 세포 스트레이너로 여과하고, 10 mL의 HBSS (Ca- 및 Mg-free)를 첨가한다. 원심분리 (300 x g, 10 분, RT) 펠렛을 방해하지 않고 상층액을 제거하였다.</li>
		<li>미엘린 고갈을 위해, 펠렛을 400 μL의 미엘린 제거 완충액 (물질 표 참조)으로 재현탁시킨 다음, 100 μL의 미엘린 제거 비드 (물질 표 참조)를 첨가한 다음, 4°C에서 15분 동안 인큐베이션한다.</li>
		<li>미엘린 제거 완충액 5 mL를 원심분리기(300 x g, 10분, RT)에 첨가하고, 펠렛을 방해하지 않고 상층액을 제거하였다.</li>
		<li>500 μL의 미엘린 제거 버퍼를 추가하고 튜브를 자기장 컬럼에 넣으십시오. 컬럼을 미엘린 제거 완충액 1 mL로 네 번 세척한다.</li>
		<li>원심분리 (300 x g, 2 분, RT) 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 제거하였다. 세포를 해리시키기 위해 잠깐 (2 초) 소용돌이 치고, 5 μL의 Fc 블록 CD32를 첨가한다. 다시 소용돌이 4°C에서 5분 동안 인큐베이션한다.</li>
		<li>관심있는 일차 항체의 혼합물 중 100 μL를 첨가하는 단계; 4°C에서 20분 동안 인큐베이션한다.</li>
		<li>원심분리기(350 x g, 5분, 4°C)를 통해 펠렛을 방해하지 않고 상층액을 제거하였다. 튜브를 부드러운 종이에 거꾸로 닦으십시오.</li>
		<li>짧은 와류 (2 s) 후에, 100 μL의 2차 항체 믹스를 첨가하고, 4°C에서 15분 동안 인큐베이션한다.</li>
		<li>미엘린 제거 완충액 2 mL를 원심분리기(350 x g, 5분, 4°C)에 첨가하고, 펠렛을 방해하지 않고 상층액을 제거하였다. 튜브를 부드러운 종이에 거꾸로 닦으십시오. 세포를 250 μL의 멸균 PBS에 재현탁시키고 세포 분류를 직접 진행한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>10. 셀 정렬
<ol><li>분류된 세포를 수집하기 위한 500 μL의 멸균 PBS로 마이크로퍼지 튜브를 준비한다.</li>
	<li>세포 용액 1000 μL 당 10 μL의 Hoechst를 첨가하여 살아있는 세포의 핵을 색칠하고 죽은 세포와 구별하십시오.</li>
	<li>가능한 한 빨리 세포를 4°C의 세포 선별기로 옮긴다.</li>
	<li>먼저 세포를 전방 및 측면 산란으로 정렬 한 다음 Hoechst 양성 세포를 정렬합니다. 다음으로, 관심있는 항체에 기초하여 세포를 정렬한다. 양성으로 염색된 세포를 별도로 수집한다. 양성 세포와 자기 형광 세포를 구별하십시오.</li>
	<li>각 관심 풀에 대해 정렬된 셀 수를 계산합니다.</li>
</ol>11. 감마 카운팅
<ol><li>γ 계수 시스템을 SPECT 교정에 사용된 것과 동일한 팬텀 용액 10μL로 교정하되 1mL의 물에 희석합니다. 참고: 팬텀 용액은 γ 계수 시스템의 정밀도가 향상되었기 때문에 희석됩니다.</li>
	<li>정렬 된 세포의 튜브를 γ 계산 시스템에 놓고 제조업체의 프로토콜에 따라 γ 계산을 진행하십시오.</li>
</ol>

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<li>Tournier, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+TSPO+upregulation+appears+before+microglial+TSPO+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%3A+JAD%22%5BJournal%5D)">Astrocytic TSPO upregulation appears before microglial TSPO in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 77 (3), 1043-1056 (2020).</li>
</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

우리의 지식에 따르면,이 기술은 세포 수준에서 방사성 추적기의 생체 내 결합 변경에 대한 더 나은 이해를 가능하게하는 접근법을 설명하는 최초의 기술이었습니다. 이 프로토콜은 예로서 [125 I]CLINDE (TSPO) 또는 [125I]R91150 (5HT2AR)을 사용하여 세포 수준에서 방사성 추적자 결합을 정량화하는 다중스케일 방법을 기술한다.
이 기술은 LPS에 의해 유도되는 강렬한 염증 반응에서부터 AD의 래트 모델에서 관찰된 보다 미묘한 신경교세포 변화에 이르기까지 광범위한 신경교세포 변화의 세포 기원을 정밀하게 검출할 수 있을 정도로 견고하고 민감하며, SPECT로 얻은 신호의 미세아교세포 기원으로서 생체내 핵 신경영상에 중요한 상보적 정보를 가져온다. 이 연구는 FACS-RTT가5HT2AR의 예와 함께 세포 규모에서 신경 수용체 밀도 변화를 식별 할 수 있음을...

알츠하이머 병 (AD)과 같은 신경 퇴행성 질환은 증상 증가와 관련된 신경 세포 손실을 특징으로합니다. 치매의 가장 흔한 원인 인 AD는 사례의 60 % -70 %를 차지하며 전 세계 약 5 천만 명의 사람들에게 영향을 미칩니다1. 신경 병리학 적 수준에서 AD의 두 가지 주요 특징은 세포 외 아밀로이드 β (Aβ) 플라크와 세포 내 타우 신경 세동 엉킴의 축적입니다. 신경교 세포 변화는 또한 AD2 및 여러 신경 전달 물질 시스템 3,4의 가능한 파괴와 관련이 있습니다.
TgF344-AD 래트 라인은 인간 APP 및 PS1ΔE9 전이유전자를 발현함으로써 AD를 모델로 변형시켜 가용성 및 불용성 Aβ-40 및 Aβ-42 발현 및 아밀로이드 플라크 형성5를 유도하였다. 또한 타우병증으로 이어지는 타우 단백질의 과인산화 형태의 축적을 제시한다. 9-24 개월의 나이부터, 쥐는 점차적으로 AD의 병리학 적 특징과인지 장애 5,6,7,8,9를 개발합니다.
양전자 방출 단층 촬영 (PET), 단일 광자 방출 컴퓨터 단층 촬영 (SPECT) 및 자기 방사선 촬영은 γ선의 방출 및 정량화에 기반한 기술입니다. 방사성 추적기는 생체 내 (PET 및 SPECT) 또는 생체 외 / 시험관 내 (자기 방사선 촬영)에서 정량화됩니다. 이러한 민감한 기술은 AD와 같은 여러 뇌 질환의 메커니즘에 대한 이해에 기여했습니다. 실제로, 신경 염증의 관점에서, [11 C]-(R)-PK11195 또는 [11C]PBR28과 같은 방사성 표지 추적기를 갖는 생체내 신경염증 마커인 18 kDa 트랜스로케이터 단백질 (TSPO)을 평가하는 많은 연구가 있다 (검토를 위해10 참조). 또한, 신경 전달 물질 시스템의 변화는 방사성 추적기11,12,13을 사용하여 연구되었습니다.
그러나, 이러한 기술들은 방사성 신호의 세포 기원을 결정하지 않는다. 이것은 PET/SPECT에서 방사성 리간드의 결합의 변경에 대한 생물학적 토대에 대한 해석을 방해할 수 있다. 예를 들어, 신경 염증에 대한 TSPO 연구의 경우, TSPO의 증가 또는 감소가 성상세포 또는 미세 아교 변화로 인한 것인지 여부를 이해하는 것이 가장 중요합니다. 방사성리간드 처리된 조직으로의 형광-활성화 세포 분류(FACS-RTT) 기술은 이러한 문제를 해결하기 위해 개발되었으며, 이를 통해 모든 세포 유형에서 방사성리간드 결합을 개별적으로 평가하고 세포당 표적 단백질 밀도를 정량화할 수 있습니다. 이 혁신적인 기술은 결과적으로 보완적이며 PET 및 SPECT 이미징과 매우 호환됩니다.
여기에서이 기술은 TSPO 특이적 방사성 리간드를 사용한 신경 염증 연구와 세로토닌성 시스템을 평가하는 두 축을 따라 적용되었습니다. 첫 번째 축에서, 목표는 급성 염증 반응에 반응하여 TSPO 신호의 세포 기원을 이해하는 것이 었습니다. 따라서, FACS-RTT는 리포폴리사카라이드(LPS) 주사를 통해 신경염증을 유도한 후 생체내 [125I]CLINDE SPECT 이미징 연구를 통해 래트의 뇌 조직에 사용되었다. 또한, 동일한 이미징 및 FACS-RTT 프로토콜이 12개월 및 24개월령의 TgF344-AD 래트 및 매칭된 야생형(WT) 래트에 적용되었다. 두 번째 축은 세포 유형별 생체외 5-HT2A R 밀도 평가를 통해 이러한 래트 모델에서 세로토닌성 시스템 변경의기원을 결정하는 것을 목표로 하였다.

<table><tbody><tr><td>아세트산</td><td>시그마 Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>아세토니트릴</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioVet</td><td>바이탈 체크를 위한</td><td>BioVet</td><td></td> 소프트웨어</tr><tr><td>Bondclone C18 역상 칼럼</td><td>Phenomenex, Schlieren, 스위스</td><td></td><td></td></tr><tr>제<td>네바</td><td></td><td>데스-쉬르</td> 대학 병원 <td>Virucide</td></tr><tr><td>Fc 블록/안티-CD32</td><td>BD Biosciences</td><td>BDB550270</td><td>쥐에 대한 반응</td></tr>성 <tr><td>FITC-conjugated anti-rat CD90</td><td>Biolegend</td><td>202504</td><td>쥐에 대한 반응</td></tr>성 <tr><td>Heparin</td><td>B. Braun</td><td>B01AB01</td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Knauer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insyte-W 24 GA 0.75 IN 0.7 x 19 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>321312</td><td>24 G 카테터</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>ZDG9623</td><td></td></tr><tr><td>Lacryvisc</td><td>Alcon</td><td>2160699</td><td></td></tr><tr><td>LS Columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Micropore soft tape</td><td>3M</td><td>F51DA01</td><td></td></tr><tr><td>MILabs-Uspect II</td><td>MILabs</td><td></td><td>Software for SPECT Camera</td></tr><tr><td>MoFlo Astrios</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Cell sorter</td></tr><tr><td>Myelin Removal Beads II</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-733</td><td>비즈와 미엘린 제거 완충액이 함유되어 있습니다.</td></tr><tr><td>NaCl 0.9% 멸균 용액</td><td>B. Braun</td><td>395202</td><td></td></tr><tr><td>신경 해리 키트 (P)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-628</td><td>효소 혼합물, 피펫 1, 2 및 3을 포함합니다.</td></tr><tr><td>나일론 메쉬 시트</td><td>Amazon</td><td>CMN-0074-10YD</td><td>40인치 너비, 80미크론 크기 메쉬</td></tr><tr><td>과아세트산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACS 분리기</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>R91150 pr&eacute; cursor</td><td>CERMN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak C18 컬럼</td><td>Waters</td><td></td><td>Concentration column</td></tr><tr><td>Sodium iodide Na125</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>트리부틸린 전구체</td><td>CERMN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>U-SPECT Rec2.38c</td><td>MILabs</td><td>버전 Rec2.38c</td><td>SPECT 이미지 재구성용 소프트웨어</td></tr><tr><td>USPECT II</td><td>MILabs</td><td></td><td>Spect Camera</td></tr><tr><td>Wizard 3"</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>감마 카운터</td></tr></tbody></table>

형광-활성화된 세포 분류-방사성 신호의 세포 기원을 결정하기 위한 방사성리간드 처리조직(facs-rtt)

Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal

신경교세포는 아마도 알츠하이머병(AD)과 같은 신경퇴행성 장애의 병태생리학에 상당한 영향을 미칠 것이다. 그들의 변화는 아마도 전염증성 상태와 관련이 있습니다. TgF344-AD 래트 균주는 아밀로이드 단백질 Aβ-40 및 Aβ-42를 코딩하는 인간 APP와 인간 PS1ΔE9 유전자를 발현하도록 설계되었으며 노화와 함께 아밀로이드 병리학 및 인지 결핍을 나타낸다. TgF344-AD 래트 모델은 AD에서 교란될 가능성이 있는 18 kDa 트랜스로케이터 단백질 (TSPO, 신경교세포 활성화의 마커) 결합 및 5HT 2A 수용체 (5HT2AR) 세로토닌 수용체 수준의 세포 기원을 평가하기 위해 본 연구에 사용된다. 여기에 제시된 기술은 방사성 리간드 처리 조직에 대한 형광 활성화 세포 분류 (FACS-RTT), 생체 내 PET 또는 SPECT 또는 생체 외 / 시험관 내 자가방사선 촬영 기술과 보완적인 정량적 세포 유형 특이적 기술입니다. 그것은 세포 측정 세포 분류 후 γ 카운터를 사용하여 이미징에 이전에 사용 된 것과 동일한 방사성 표지 추적기를 정량화합니다. 이것은 높은 세포 특이성 및 민감도를 갖는 방사성 표지된 단백질의 세포 기원을 결정할 수 있게 한다. 예를 들어, FACS-RTT를 사용한 연구는 (i) TSPO 결합의 증가가 리포폴리사카라이드(LPS)-유도된 신경염증의 래트 모델에서 미세아교세포와 연관되었고, (ii) 12개월 및 18개월에서의 TSPO 결합의 증가는 성상세포와 먼저 연관되었고, 이어서 야생형(WT) 래트와 비교하여 TgF344-AD 래트에서의 미세아교세포, 및 (iii)5HT2A의 삼중항 밀도와 관련이 있다는 것을 보여주었다. R은 동일한 래트 AD 모델에서 18개월에 성상세포에서 감소한다. 흥미롭게도,이 기술은 거의 모든 방사선 추적기로 확장 될 수 있습니다.

WT 래트는 일방적 LPS 주사 후 [125I]CLINDE 방사성추적기를 사용한 생체내 SPECT 스캔을 경험하였다(도 2). 이 스캔 (방사선 추적기 주사 후 45-60 분의 이미지로부터의 합산 데이터 사용)은 뇌의 대측성 영역에서보다 LPS 주사 부위 (도 2A)에서 [125I]CLINDE의 더 높은 결합을 보였다 (도 2B). FACS-RTT를 시행한 생체외 샘플은 이러한 결과를 확인하고 미세아교세포에서만 더 많은 수의 [125I]CLINDE 결합 부위의 존재를 밝혀냈으며, 이는 뇌의 동측성 측에서 [125I]CLINDE 신호의 세포 기원이 미세아교세포였음을 보여준다(도 3A)15.<sup class="...

형광-활성화된 세포 분류-방사성리간드 처리된 조직(FACS-RTT)은 알츠하이머병에서 세포 규모로 18kDa 트랜스로케이터 단백질 또는 세로토닌 5HT2A-수용체 발현의 역할을 연구하는 강력한 도구입니다. 이 프로토콜은 TgF344-AD 래트 모델에서 FACS-RTT의 생체외 적용을 기술한다.

형광-활성화된 세포 분류-방사성 신호의 세포 기원을 결정하기 위한 방사성리간드 처리조직(FACS-RTT)

Glial cells probably have a considerable implication in the pathophysiology of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD). Their ...

이 프로토콜은 생체내 영상화에 상보적이다. 그것은 방사성 추적기의 세포 유형 및 세포 수준 정량화를 허용하며, 이는 생체내에서 얻은 것과 다른 척도입니다. 이 기술의 주요 장점은 방사성 리간드 및 세포 분류의 사용에 의해 주어진 감도 및 세포 분해능이다.카메라를 켜고 운영 소프트웨어를로드하십시오. 홈 XYZ 스테이지 버튼을 클릭하여 호밍을 수행합니다. 하나의 10분 스캔 획득으로 구성된 실험을 설정합니다.스텝 모드를 fine으로 설정하고 획득 모드를 Listmode로 설정하여 전체 방출 스펙트럼을 기록합니다. 침대를 설치하고 온난화 시스템, 호흡 센서 및 마취가 기능적이고 안전한지 확인하십시오. 그런 다음 동물의 머리가 배치 될 팬텀을 놓습니다.화면 하단에 있는 세 개의 이미지를 사용하여 세 차원의 커서를 밀어 스캔 영역을 설정합니다. 팬텀과 동물의 스캔 볼륨이 동일한지 확인하십시오. 이전에 설정된 매개변수로 후속 보정을 위해 팬텀 스캔을 시작합니다.방사능과 관련된 실험을 위해 승인 된 적절한 환경에서 작업하십시오. 100 마이크로리터의 트리부틸린 전구체를 요오드화 나트륨과 37% 파라세틱 산 5마이크로리터와 함께 100 마이크로리터의 트리부틸린 전구체를 섭씨 70도에서 글로브 박스에 위치한 열순환기에서 20분 동안 배양한다. 물에 50% 아세토니트릴을 사용하여 반응을 희석하여 500 마이크로리터의 부피에 도달한다.희석된 반응물 500 마이크로리터를 역상 컬럼에 주입한다. CLINDE를 7밀리몰 인산에서 5 내지 95%ACN으로 10분 동안 선형구배 HPLC로 분리한다. 분리 된 물을 물에 희석하여 10 밀리리터의 최종 부피를 얻은 다음 희석 된 반응을 농축 컬럼에 주입하십시오.컬럼으로부터 CLINDE를 300 마이크로리터의 무수 에탄올로 에루트한 다음, 이를 실온에서 40분 동안 진공 원심분리기에서 인큐베이션하여 에탄올을 증발시킨다. CLINDE를 함유하는 잔류물을 300 마이크로리터의 식염수에 희석하여 원액을 생성한다. 방사능을 측정 한 후 원액을 식염수로 희석하여 500 마이크로 리터의 0.037 메가 베크렐 용액을 얻습니다.콜드 참조 화합물로 보정 곡선을 설정하고 선형 회귀 방정식인 Y를 AX + B와 동일하게 해결하여 A 및 B 계수를 구합니다. X는 차가운 화합물의 질량을 나타내고, Y는 곡선 아래의 면적을 나타낸다. 방사성 리간드의 곡선 아래의 면적을 확인하고, 보정 곡선을 기준으로 450 나노미터에서 자외선 흡광도를 측정하고, 방사성 리간드의 곡선 아래의 면적을 확인한다.질량을 추정하고 방사성 리간드의 활성을 측정한다. 특정 활성이 마이크로 몰 당 1, 000 기가베크렐보다 큰지 확인하십시오. 이미지 업데이트 버튼을 클릭하여 동물 위치를 업데이트하십시오.세 가지 차원에 대한 화면 하단 부분에 있는 세 개의 이미지의 도움으로 커서를 밀어 스캔 영역을 설정합니다. 일분의 60 프레임을 구성하는 60 분 스캔에 실험을 설정하십시오. 처음에 설정된 다른 모든 매개 변수를 다시 사용하십시오.500 마이크로 리터의 방사성 방사성 추적기를 주입 한 다음 300 마이크로 리터의 멸균 된 0.9 % 염화나트륨으로 튜브를 플러시하십시오. 동시에 획득 시작을 클릭하여 스캔을 시작하십시오. 스캔 재구성 소프트웨어를 연 다음 데이터 세트를 열고 스캔 폴더에 생성 된 파일 이름 매개 변수 파일을 찾습니다.관심 있는 동위원소를 선택합니다. 목록 모드 매개변수는 이 단계에서 다중 동위원소 선택을 허용합니다. 원고에 설명된 대로 복셀 크기, 하위 집합 수 및 반복과 같은 다양한 재구성 매개 변수를 설정합니다.출력 형식을 NIFTI로 선택한 다음 SPECT 재구성 시작을 선택합니다. 평평한 금속 주걱과 면도날을 사용하여 뇌의 관심 영역을 해부하십시오. 조직을 두 밀리리터 원심분리 튜브에 넣고 얻은 조직을 칭량합니다.샘플을 칼슘 및 마그네슘이 없는 HBSS 한 밀리리터가 있는 두 밀리리터 원심분리 튜브에 넣은 다음, 실온에서 두 분 동안 300배 G에서 원심분리하고 펠렛을 방해하지 않고 상층액을 제거하였다. 1, 900 마이크로리터의 효소를 넣고 1개씩 섞어서 섭씨 37도에서 15분간 배양하면서 5분마다 역전시켜 튜브를 교반시킨다. 30 마이크로 리터의 효소 믹스 두 개를 추가하십시오.1, 000 마이크로리터 피펫으로 30회 앞뒤로 부드럽게 교반하십시오. 이어서, 혼합물을 섭씨 37도에서 15분 동안 인큐베이션하면서 5분마다 역전시켜 튜브를 교반시킨다. 200마이크로리터 피펫으로 앞뒤로 부드럽게 혼합한 다음 10마이크로리터 피펫을 가졌고, 혼합물을 섭씨 37도에서 10분 동안 인큐베이션하기 전에 조직을 해리시킨다.세포를 70마이크로미터 세포 스트레이너로 여과하고 10밀리리터의 칼슘과 마그네슘이 없는 HBSS를 첨가하십시오. 실온에서 10분 동안 300배 G에서 원심분리하고 펠렛을 방해하지 않고 상층액을 제거하였다. 미엘린 고갈을 위해, 펠렛을 400 마이크로리터의 미엘린 제거 완충액으로 재현탁시킨 다음, 섭씨 4도에서 15분 동안 인큐베이션하기 전에 미엘린 제거 비드 100 마이크로리터를 첨가한다.미엘린 제거 완충액 다섯 밀리리터를 첨가하고 실온에서 10분 동안 300배 G를 원심분리한다. 500 마이크로 리터의 미엘린 제거 버퍼를 추가하고 부유 한 펠렛을 자기장 컬럼에 넣으십시오. 미엘린 제거 완충액 한 밀리리터로 컬럼을 네 번 세척하십시오.실온에서 두 분 동안 300배 G에서 원심분리하고 펠렛을 방해하지 않고 상층액을 제거하였다. 소용돌이를 잠깐 소용돌이 치면서 세포를 해리시키고 다섯 마이크로 리터의 Fc 블록 CD32를 첨가한다. 관심있는 일차 항체의 혼합물 100 마이크로리터를 첨가하고, 섭씨 네 도에서 20분 동안 인큐베이션한다.섭씨 네 도에서 5분 동안 350배 G에서 원심분리하고 펠렛을 방해하지 않고 상층액을 제거하였다. 튜브를 부드러운 종이에 거꾸로 닦으십시오. 튜브를 간략하게 소용돌이 치고, 100 마이크로리터의 이차 항체 믹스를 첨가하고, 섭씨 4도에서 15분 동안 인큐베이션한다.미엘린 제거 완충액 한 밀리리터를 넣고 원심분리를 반복한다. 상층액을 버리고 튜브를 부드러운 종이에 거꾸로 닦으십시오. 세포를 250 마이크로리터의 멸균 PBS에 재현탁시키고 세포 분류를 직접 진행한다.야생형 래트의 생체내 SPECT 스캔은 뇌의 대측 영역에서보다 리포폴리사카라이드 주사 부위에서 CLINDE의 더 높은 결합을 나타냈다. 방사성리간드 처리 조직 또는 FACS-RTT를 분류하는 형광 활성화 세포 분류를 시행한 생체외 샘플은 미세아교세포에서만 더 많은 수의 CLINDE 결합 부위의 존재를 밝혀냈으며, 이는 뇌의 동측성 측면에서 CLINDE 신호의 세포 기원이 미세아교세포임을 보여준다. TgF344-AD 래트에서 12개월째에 트랜스로케이터 단백질 또는 TSPO 결합의 증가는 성상세포로 제한되었다.24개월령의 래트에서, TSPO 결합의 증가는 성상세포 및 미세아교세포 변화 둘 다로 인해 관찰되었다. 더 오래된 TgF344-AD 래트에서, 줄무늬 성상세포는 야생형과 비교했을 때 감소된 5HT2AR 밀도를 나타냈다. TSPO의 피질 과발현은 인간 AD 사후 샘플에서 FACS-RTT를 수행했을 때 연령 일치 대조군과 비교하여 AD 피험자의 성상세포 및 미세아교세포 둘 다에서 관찰되었다.방사능으로 작업 할 때는 방사선 보호의 지시에 따라 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오. 그런 다음 절차가 끝나면 작업 환경의 오염을 제거하십시오. 단백질 정량 및 유전자 발현 분석은 분리된 세포 집단에서 이 절차 후에 쉽게 수행할 수 있다.

fluorescence-activated-cell-sorting-radioligand-treated-tissue-facs

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

살아있는 세포의 플라즈마 막의 형광 단백질 지질 뗏목의 파티션을 알아내기 위해 기술이 설명되어 있습니다. 그것은 지질 보트 내부 또는 외부에있는 단백질의 확산시기에 불균형을 이용합니다. 취득이 통제 조건이나 약물 이외 후에 동적으로 수행할 수 있습니다.

지질 뗏목의 결정은 형광 상관 분광학 (FCS)에 의해 살아있는 세포에서 Fluorescently 태그가 추가된 프로브의 파티션

암 관련의 섬유 아세포 (CAFs)는 확산, 혈관 신생 및 염증을 조장하는 신호를 통해 종양 개시, 성장과 진행을 촉진한다. 여기 우리는 표면 마커로 PDGFRα를 사용하여 셀 정렬에 의해 신선한 마우스와 인간의 조직에서 정상 섬유 아세포와 CAFs의 순수한 인구를 분리하는 방법을 설명합니다.

형광 활성 세포 정렬 (FACS)에 의해 신선한 조직으로부터 정상 및 암 관련 섬유 아세포의 분리

출처: Kim, H. 외, 고처리량 유전효소 스크리닝 시스템을 이용한 다효소 스크리닝. J. Vis. 경험 (2016)이 영상은 메타게놈 포스미드 라이브러리와 염색 기질을 이용한 효소 발현을 검출하는 유전적 스크리닝 방법을 시연합니다. 유세포분석은 색소 생성물을 생성하는 단일 세포를 식별하고 분리하여 활성 효소 발현 세포의 고처리량 선택을 가능하게 합니다.

유전자 변형 박테리아 세포에서 표적 효소 발현 검출

이 비디오는 생물학적 샘플에서 분리된 단백질 응집체의 파종 활성을 감지하기 위한 FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer) 유세포 분석 분석을 보여줍니다. 타우 리포터 단백질을 발현하는 포유류 세포는 타우 씨앗을 함유한 리포좀 형질도입 복합체와 함께 배양됩니다. 이 씨앗은 리포터 단백질의 응집을 매개하여 유세포 분석기에서 FRET 양성 신호를 생성합니다.

Tau-Seed 유도 Reporter 단백질 응집을 검출하기 위한 FRET 유세포 분석 기법

이 프로토콜의 목표는 형광 활성화 세포 분류(FACS) 기술을 사용하여 세포 유형별 유전자 발현, 후성유전학적 마커 및/또는 단백질 발현의 후속 분석을 위해 특정 유형의 신경 세포를 분류하는 것입니다.

쥐 뇌 조직 검사 정렬 형광 활성 셀을 사용하여 셀 타입 별 유전자 발현

여기에서 우리는 신선한 냉동 모두 뇌 조직에서 신경 앙상블 별점이 발현 분자 변화를 연구하는 형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS) 프로토콜을 제안한다. 동결 조직의 사용은 유용한 동물 피험자의 사용을 최대화하기 위해 다수의 세션을 통해 많은 뇌 영역의 FACS 분리 할 수​​있다.

형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS)와 신선한 및 냉동 쥐 뇌 조직 FOS를 발현하는 신경 세포의 유전자 발현 분석

우리는 PDC의 기능 연구를위한 루푸스 발생하기 쉬운 마우스의 골수로부터 고순도 형질 수지상 세포 (PDC)를 분리 정렬 형광 활성화 된 세포를 사용하여 프로토콜을보고합니다.

마우스 골수에서 형질 수지상 세포의 정화를위한 형광 활성화 셀 정렬

원고, 우리는 밀매에 관여 하 고 식물 독 소 리 (RTA)의 소 단위는 세포 독성의 프로세스를 죽이고 세포 구성 요소를 식별 하는 효 모 기반 형광 기자 분석 결과 사용 하 여를 설명 합니다.

세포질 구성 요소를 식별 하는 간단한 형광 기반 기자 분석 결과 리 독 소에 필요한 체인 (RTA) 효 모에 인신 매매

우리는 전 임상 생체 내에서 암 전이의 추적에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 그것은 비 침략 적 [18F] tetrafluoroborate-애완 동물, 그리고 유선형 비보 전 확인에 대 한 형광 단백질에 의해 감지 나트륨 요오드 화물 symporter 결합 방사성 핵 종 형광 기자를 기반으로 합니다. 방법은 전 임상 vivo에서 세포 종양 생물학 넘어 추적에 적용 합니다.

방사성 핵 종 형광 취재 원 유전자 설치류 종양 모델에서 종양의 진행을 추적 하기 위해 이미징

우리는 현대 형광 라벨링 기술을 사용하여 살아있는 세포에서 멤브레인 수용체 역학을 연구하기 위해 Förster 공명 에너지 전송 (FRET)과 결합 된 라이브 셀 이중 색 형광 교차 상관 분광법 (FCCS)을 수행하기 위해 실험 프로토콜 및 데이터 분석 워크플로우를 제시합니다.

살아있는 세포에서 단백질 단백질 상호 작용 및 단백질 역학을 연구하기 위한 이중 색 형광 교차 상관 분광법

배우세요 FACS-RTT 기술을 사용하여 알츠하이머병에서 세포 수준 단백질 발현을 분석하는 방법을 TgF344-AD 쥐 모델을 통해 익히세요. 이 기법은 신경퇴행성 질환 연구에 높은 감도와 세포 해상도를 제공합니다.

형광-활성화된 세포 분류-방사성 신호의 세포 기원을 결정하기 위한 방사성리간드 처리조직(FACS-RTT)

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