Name: 질 세척을 활용한 설치류 에스트로우스 사이클 모니터링 : 정상주기와 같은 것은 없습니다. (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: 학습하세요 암컷 설치류의 질 세척 기법을 통해 에스트로우스 주기를 모니터링하는 방법을. 세포 특성 분석과 현미경 관찰을 통해 생식 생물학을 평가하고 심장학 및 약리학 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 연구는 캘리포니아 대학 로스 앤젤레스 뇌 손상 연구 센터 (BIRC) 간의 NIH 자금 협력을 통해 수행되었습니다.

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

주요 단계 및 중요한 고려 사항 제공된 프로토콜의 특정 중요한 단계는 특히 질 세포 수집 내에서 강조가 필요합니다. 질액 추출 중에 주사기 삽입의 적절한 각도와 깊이를 보장하는 것이 만족스러운 결과를 산출하고 궁극적으로 동물에 대한 자극, 부상 또는 자궁 경부 자극을 예방하는 열쇠입니다. 자궁 경부의 자극은 백혈구 전용 질 도말 (11)의 12-14 일로 표시된 의사 임신 유도의 한 원인이 될 수있습니다. 현미경 평가 단계에서 수집 된 질 세포를 표시하는 시각적 평면에 초점을 맞추는 것이 중요합니다. 이것은 하나 또는 두 개의 셀을 식별하고 초점이 달성 될 때까지 시각화를 조정하여 완료됩니다.
그 후, 스테이징을 위한 질 세포의 대표적인 이미지를 캡처하는 것은 현미경 슬라이드의 전체를 스캔함으로써 발생한다. 이렇게하면 캡처 된 이미지가 동물의 질 운하에서 수집되고 존재하는 것을 정확하게 묘사 할 수 있...

새로운 기여 설치류 발정주기는 건강의 필수 지표로 확인되었습니다. 그러나 조사관의 무의식적 인 편견과 여성의 신체에 관한 부정확 한 해석은 과학계를 방해합니다. "estrous"라는 단어의 어원은 열등감과 부정감을 의미합니다. Euripides는이 용어를 사용하여 "광란"또는 광기를 묘사하고, 호머는 공황을 묘사하고, 플라톤은 비합리적인 드라이브를 묘사했습니다. 이 연구는 이러한 원시적 관점이 현재 과학계에 어떻게 영향을 미치는지 강조하고 이전에 연구 된 방법의 업데이트 된 조합 인 새로운 모자이크 패러다임을 통해보다 포괄적 인 접근 방식을 위해 범위를 확대 한 새로운 모자이크 패러다임을 통해 이러한 우려를 해결합니다.
표준화되고 포괄적 인 모니터링 기술이 없기 때문에이 기술의 연구와 사용이 필요하며 데이터 해석 관행이 불분명 할 수 있습니다. 둘째, 에스트로우스 사이클 특성은 연구되는 개별 쥐에 의존하지만, 종종 보편화됩니다. 셋째, 호르몬 순환은 일상적이고 유익한 과정이지만 '인간으로의 번역'섹션에서 탐구 된 위험한 낙인으로 둘러싸여 있습니다. 이 연구는 (A) 심층적 인 에스트로 사이클 모니터링 기술을 설명하고 결과를 해석 할 수있는 방법을 명확히하고, (B) 각 사이클의 무결성과 개성을 유지하는 방법을 요약하고, (C) 입증되지 않은 관행을 영속시키는 오해에주의를 환기시킴으로써 세 가지 방법으로이 세 가지 문제를 해결하는 것을 목표로합니다.
이 연구는 또한 청소년기 쥐에 초점을 맞추는 데있어 독특합니다.이 기간은 성인기의 다양한 행동, 해부학 적 및 생리적 징후를 밝히는 중요한 발달 변화로 특징 지어집니다1. 공통적 편향을 해체하면서 연구가 부족한 인구의 호르몬 주기를 모니터링하기 위한 표준화된 실험 설계를 구축하면 신뢰할 수 있고 유효한 호르몬 상관관계 2,3,4의 개발과 상태 의존적 주기 중단 5,6,7,8,9,10 의 결정이 가능합니다. . 궁극적으로, 이러한 참신함은 진단 기준, 치료 및 다양한 건강 문제의 개입을 확장하는 역할을합니다.
기본 정의 및 사용 에스트로우스 사이클은 세 가지 진동하는 여성 성 스테로이드 호르몬, 즉 에스트라 디올, 류틴 화 호르몬 (LH) 및 프로게스테론 (그림 1A, B)에 반응하여 발생하는 역동적 인 생리 학적 과정의 모음입니다. 내분비와 중추 신경계 사이의 상호 작용은 사이클을 조절하며, 이는 대부분 4-5 일 동안 지속되며 성적 성숙의 시작부터 생식 노화 및 / 또는 중단까지 재발합니다. 그것은 호르몬 수준에 따라 별도의 범주로 나뉩니다 - 가장 일반적으로 원형 방식으로 진행되는 디스트러스 (DIE), 돌출부 (PRO), 발정기 (EST) 및 metestrus (MET)의 4 단계로 나뉩니다. 분할의수는 연구 13의 성격에 따라 3 단계11에서 13 단계 12까지 다양 할 수 있습니다. 부서 수가 적을수록 MET는 종종 스테이지로 제외되고 단기간의 과도기 기간으로 분류됩니다. 더 높은 숫자는 전형적으로 종양 발달 또는 자발적 위임신과 같은 현상의 면밀한 검사를 허용하는 하위섹션, 배아 이식 없이 임신의 생리학적 상태(12,14,15)를 포함한다.
이 연구에서, 단계는 질 운하의 구성 요소를 통해 확인되었으며, 3 가지 분류 결정 인자 - 세포 유형 (들) 존재, 세포 배열 및 세포 양 (그림 2A-D)으로 명명되었습니다. 이 연구에서 질액의 상태는 모니터링되지 않았지만 네 번째 분류 구성 요소로 포함하는 것이 좋습니다. 질 유체를 검사하는 것에 대한 추가 정보는 참조 리스트(16)에서 찾을 수 있다. 분류 구성 요소는 질 세척을 통해 세포를 추출하여 검사 할 수 있습니다.이 기술은 현대 발정주기 모니터링에서 권장되는 기본 기술입니다. 각 단계 내의 심층적 인 생리 학적 과정이이 연구의 범위를 벗어나는 반면, 더 많은 정보는 문헌17에서 찾을 수 있습니다.
이 에스트로우스 사이클 모니터링 기술의 사용 및 지속적인 개발은 성 스테로이드 호르몬과 심혈관 시스템(18), 내분비계(8) 및 중 추신경계(19,20,21)와 같은신체 시스템의 기능 사이의 연결에 뿌리를 두고 있다. 동시에, 여성 설치류가22,23,24,25와 관련되어있을 때 발정주기 모니터링이 항상 필요한 것은 아닙니다. 오히려, 성별 차이가 연구의 특정 영역에서보고되었는지 여부를 고려하는 것이 중요하며, 이는 출판 된 리뷰22,23에서 더 탐구 될 수 있습니다. 에스트로우스 사이클 모니터링은 광범위한 연구 조사에서 필수적이지만, 실험에 여성 설치류를 포함시키는 데 장애물로 간주되어서는 안됩니다. 이 기술은 복잡하고 시간이 많이 걸리는 것처럼 보일 수 있지만 조사자에 따라 절차 자체를 완료하는 데 15 분 미만이 걸릴 수 있으며 비용 효율적입니다. 전반적으로, 과학 연구에 여성 설치류를 포함시키는 것은 신체 시스템, 다양한 조건 및 병리학 및 일반적인 건강에 대한 이해에 유리하며, 이러한 개발은 주로 남성 신체 템플릿에 기반을두고 있기 때문입니다.
설치류의 보편적 인 매개 변수와 자연 다양성 "전형적인"것으로 보이는 측면에 대한 범위를 설정하는 것은 표준 사이클 패턴을 정의하고, 비교 및 분석 목적을 위해 매개 변수를 설정하고, 이상 및 이상값을 감지하는 데 필요합니다. 동시에 각 쥐의주기가 독특하며 동물의 변형, 생리 학적 과정 및 환경 조건에 따른 편차가 예상된다는 것을 인식하는 것도 중요합니다. 사실, 에스트로우스 사이클의 가장 "정상적인"측면 중 하나는 변동성입니다. 이것은 3-38 일26,27의 범위와 함께 총 사이클 길이에서 볼 수 있습니다. 32-34 일에서 여러 주에 이르기까지 다양 할 수있는 성적 성숙의 나이28,29,30; 비주기적 11로 간주되는 것, 및 분류된 결정자 패턴(11,13)이 있다. 전반적으로, 에스트로우스 사이클에 대한 보편적 인 템플릿은 없으며, 과학계와 일반 대중 모두에게 그것을 번역하는 것은 실험 과정의 중요한 부분입니다.
실험 시점과 발달 연령 이러한 변동성 원칙을 인식하면 신뢰할 수 있고 유효한 실험 설계를 구축하는 데 도움이됩니다. 예를 들어, 에스트로우스 사이클링 모니터링의 시작은 쥐의 해부학 적 및 생리적 발달에 의존하며, 이는 환경 및 생리 학적 요인에 따라 다릅니다. 모니터링은 질 운하의 내부 부분으로 이어지는 외음부로 둘러싸인 외부 질 오리피스 인 질 개구부 (VO)가 발달 할 때까지 시작할 수 없습니다 (그림 3A-D). VO는 종종 32 일에서 34 일 사이에 완전히 발달하지만, 각 과목마다 개별화 된 채로 남아 있으며 그 과정에 대한 많은 부분은 알려지지 않았습니다. 이 개구부는 에스트라디올 31의 증가, 시상 하부 - 뇌하수체 - 난소 축 (32)의 성숙 및 쥐 17,33,34,35의 첫 번째 배란과 관련된 성적 성숙의 시작을 확인하는 데 사용되었습니다. 그러나, 최근의 간행물들은 그것이 불리한 환경(31)에서 호르몬 및 발달 발생으로부터 결합되지 않을 수 있고, 성적 성숙(33)보다는 에스트라디올 수준의 변화를 나타낼 수 있기 때문에, 생식 발달의 간접적인 마커일 뿐이라는 것을발견하였다. 따라서, 발달 연령을 결정하기 위해 VO에만 의존하지 않고, 발정기 모니터링(36)을 위한 한정자로서, 또한 성적 성숙의 개시를 표시하기 위해 상피 세포(30)의 첫 번째 EST 단계의 출현 및 각질화를 활용하는 것이 바람직하다.
체중은 설치류30,37의 청소년 기간 동안 발달 연령과 특히 관련이 있으므로이 기간의 발달 연령을 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 현상과 관련된 제안 된 메커니즘은 성장 호르몬과 같은 생식 발달에 필요한 호르몬의 자극, 및 식욕 조절제, 렙틴30에 의한 시상 하부 - 뇌하수체 부신 (HPA) 축의 억제를 포함한다. 그러나, 종에 걸친 쥐와 공급 업체 제공자(38) 사이에서 볼 수있는 큰 차이로 인해이 측정을 발달 연령의 유일한 지표로 활용하는 것은 권장되지 않습니다. VO 및 체중의 발달에서 볼 수있는 변동성은 전체 실험 과정에서 개념의 중요성을 예증합니다.
인간에 대한 번역 : 문화적, 과학적 맥락 동물과 인간의 생식 연구의 번역 관계는 양방향입니다. 동물 기반 연구의 결과는 인간 과정이 어떻게 평가되고, 접근하고, 분석되는지에 영향을 미친다39. 인간의 생식 시스템과 관련 과정에 대한 인식은 동물을 연구하는 방법에 영향을 미칩니다. 사실,이 분야의 추가 연구에 대한 가장 큰 징후 중 하나는 과학적 과정에 영향을 미치는 호르몬주기와 관련된 편향된 사회 문화적 신념에서 비롯됩니다. 이러한 관습의 대부분은 월경을 논의하는 일반적인 문화적 혐오감에서 파생되었으며, 이는 잘 입증 된 지식40,41의 데이터 격차를 초래했습니다. 이것은 선반 높이와 스마트 폰 크기에서부터 경찰 갑옷 피팅 및 놓친 암 진단42에 이르기까지 사소한 것부터 치명적인 것까지 다양한 결과를 초래합니다.
월경을 비위생적이고 파괴적이며 독성이 강한 것으로 묘사하는 것은 존경받는 텍스트, 미디어, 사전 및 의학적 가르침에서 볼 수 있습니다 - 과학 출판물에 의해 보존됩니다. 이것은 호르몬 순환에 대한 부정확하고 편향된 설명, 생식 기관이 신경 내분비 대응 물 및 환경 영향으로부터 분리되는 것, 그리고 '임신 실패'로서의 순환의 완성에 대한 환원 주의적 관점을 통해 발생합니다.43,44. 이것은 호르몬 순환에 영향을 미치는 외부 변수의 생략, 해부학 적 발달만을 기반으로 시작과 종점을 결정하고, 순환 방식이 아닌 선형으로주기 진행을 측정하는 것과 같은 건전하지 않은 실험 관행의 창출로 이어집니다. 사회 문화적 요인과 생물학적 결과 사이의 직접적인 상관 관계에도 불구하고 과학 문헌에서는 종종 고려되지 않습니다. 보다 전체적인 출판물 43,44,45의 검사를 통해 연구자들은 이러한 오명을 해체하고보다 신뢰할 수 있고 유효한 실험 설계를 만들 수 있습니다.

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질 세척을 활용한 설치류 에스트로우스 사이클 모니터링 : 정상주기와 같은 것은 없습니다.

Rodent Estrous Cycle Monitoring Utilizing Vaginal Lavage: No Such Thing As a Normal Cycle

현재의 방법론은 여성 Sprague Dawley (SD) 청소년 쥐의 발정주기를 모니터링하기위한 재현 가능하고 표준화되고 비용 효율적인 접근법을 수립합니다. 이 연구는 호르몬주기의 복잡성과 신뢰할 수 있고 유효한 모니터링 기술을 구축하는 데 필요한 광범위한 이해를 보여줍니다. 주요 실험 설계 및 절차 요소에 대한 심층적 인 검토를 통해주기와 기본 원칙에 대한 이러한 설명은 향후 복제에 대한 오해를 더 깊이 이해하고 해체하기위한 틀을 제공합니다.
질 세척을 사용하는 샘플 수집 프로세스의 개요와 함께이 절차는 proestrus, estrus, metestrus 및 diestrus의 네 단계 모델로 데이터 분류 메커니즘을 설명합니다. 이러한 단계는 질액 상태, 존재하는 세포 유형, 세포 배열 및 수집시의 세포량의 4 가지 분류 결정 요인을 활용하는 새로운 제안 된 접근법을 특징으로합니다. 각 단계의 변형, 호의적이고 불리한 샘플, 순환성과 비순환성의 구별, 수집 된 분류 구성 요소의 그래픽 묘사는 데이터의 효과적인 해석 및 조직 관행과 함께 제시됩니다. 전반적으로 이러한 도구를 사용하면 처음으로 정량화 가능한 데이터 범위를 게시할 수 있으므로 복제 시 범주화 요소가 표준화됩니다.

현재의 데이터는 남성 SD 쥐가있는 여성 청소년 SD 국제 유전 표준화 프로그램 (IGS)의 데이터를 반영합니다. 이 동물들은 공동 연구의 일환으로 페퍼딘 대학과 UCLA 실험실에 위치했다. 그림 5는 4 사이클 단계의 여러 변형을 보여줍니다. 도 5A1은 여러 세포 유형이 존재하는 디스트러스 샘플로서 확인되었다. 이 예는 더 많은 수의 상피 세포를 가진 샘플이 LEU의 우세와 같은 다른 분류 성분 자격을 충족할 때 디스트러스로 인정된다는 것을 보여줍니다. 이 샘플은 또한이 단계에서 종종 볼 수있는 LEU로 구성된 점액 가닥 배열을 입증했으며, 이는 PRO 단계에서 볼 수있는 SNE 세포로 구성된 가닥과 유사합니다. DIE 단계의 점액 가닥과 SNE 세포로 구성된 PRO 단계에서 나타나는 가닥을 구별하려면 LEU의 우세를 확인하는 것이 중요합니다. 도 5A...

이 연구는 암컷 쥐와 관련된 실험 설계에서 고려해야 할 중요한 요소를 자세히 설명합니다. 더 큰 의미에서 이러한 데이터는 낙인을 줄이고 더 포괄적 인 진단 및 개입 도구의 개발을 돕는 역할을합니다.

The current methodology establishes a reproducible, standardized, and cost-effective approach to monitoring the estrous cycle of female Sprague Dawley ...

이 프로토콜은 포괄적이고 저렴한 비용 시간 효과적인 기술을 제공한다는 점에서 중요합니다. 번역 연구의 핵심 요소에 답하고 개인 및 그룹 수준에서 구성 요소 데이터를 분류합니다. 이 기술은 동물의 전체 프로파일에 관하여 추출될 수 있는 정보의 총량으로 인해 유리하다.여기에는 분류 구성 요소와 후속 결론이 포함됩니다. 이 기술은 심장학, 신경학 및 약리학을 포함한 광범위한 연구 분야에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 이 기술은 생식 연구에만 적용되는 것은 아닙니다.사춘기 노인 쥐를위한 압축 스타일 홀드와 같은 나이에 적합한 홀드로 쥐를 다루는 것으로 시작하여 코가 땅에 뾰족한 흉부 위쪽 부위에 피사체를 배치하십시오. 주사기를 삽입하기 전에 꼬리를 부드럽게 구부려 피험자의 질 운하를 노출시킵니다. 주사기를 앞 손가락과 가운데 손가락으로 단단히 잡고 주사기의 끝을 평행 한 각도로 질 운하에 삽입하고 엄지 손가락으로 플런저를 안쪽으로 밀어 염화나트륨을 운하로 천천히 배출하십시오.주사기의 플런저를 상피 내벽에서 멀리 당겨 질 운하에서 염화나트륨을 추출하십시오. 각 세포 유형에 대한 기준을 사용하여 샘플에 존재하는 세포를 특성화하고 결과를 기록하십시오. 유핵화된 각질화된 상피 또는 정량화된 상피 세포는 들쭉날쭉하거나 각진 가장자리로 나타날 것이다.핵이 부족함에도 불구하고, 그것은 핵이 한때 유령 핵이라고 불리는 곳을 나타내는 세포 내에서 가벼운 둥근 영역을 나타낼 수 있습니다. 큰 유핵화된 상피, 또는 LNE 세포는 전형적으로 불규칙한 들쭉날쭉한 또는 각진 경계에 의해 둘러싸인 다각형 모양의 세포에 둥글다. 그들의 핵은 손상되거나 악화되는 세포의 핵에서 크로마틴의 돌이킬 수없는 응축과 관련된 온전한 것에서 퇴화 또는 pyknotic까지 다양 할 수 있습니다.핵은 세포 내의 세포질보다 적은 공간을 차지하며, 작은 상피 세포보다 핵 대 세포질 비율이 낮습니다. 백혈구는 콤팩트한 구형 세포입니다. 다른 모든 기술된 세포 유형과 비교했을 때 가장 작다.SNE 세포는 세포 내부의 세포질보다 더 큰 공간을 차지하는 둥근 핵을 가진 비 케라틴화 된 세포로, 큰 상피 세포에 비해 더 높은 핵 대 세포질 비율을 만듭니다. 네 개의 X와 같은 더 낮은 객관화를 사용하여 전체 셀 배열의 대표적인 뷰를 얻는다. 세포가 함께 뭉쳐 있는지, 고르게 분산되었는지, 무작위로 분산되어 있는지 여부를 기록하고 각 세포 유형의 특정 조직을 기록하십시오

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생물학

여기, 우리는 간단한 비 침습적 수집 및 질을 뛰어 넘는 샘플 cytological 평가하여 손쥐 생식 (proestrus, 발정, metestrus, 또는 diestrus)의 단계를 확인하는 방법에 대해 설명합니다. 우리는 더 질 세포학은 손쥐 생식주기를 통해 전환을 하부 호르몬 수준을 순환 반영 방법에 대해 설명합니다.

마우스 Estrous 사이클 스테이징 확인을 위해 질 세척, 크리스탈 바이올렛의 착색 및 질 Cytological 평가를 수행

두 운동의 패러다임은 운동 능력과 운동 심장 적응에 폐경의 영향을 조사하기 위해 새로 개발 된 화학적으로 유도 된 폐경의 마우스 모델에서 테스트되었다.

쥐의 운동 능력과 심장 적응에 화학적으로 유도 된 난소 실패의 영향을 연구하는 방법

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당연히 여성 쥐 사이클링에 에어컨 공포의 멸종 유학을위한 프로토콜

이 원고는 여성 쥐 생식 및 부인과 조사에 대 한 실험 모델을 설계 하에 수행 하는 초음파의 유틸리티를 설명 합니다. Ultrasonographic 평가 수행 하는 방법에 대 한 단계별 설명을 표시 됩니다.

초음파에 쥐 실험 생식 조사에

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마우스 생식 기관 자발적 운동성 및 데이터 분석을 위한 MATLAB 기반 자궁 운동 추적 알고리즘을 평가하기 위한 Ex Vivo 방법

이 프로토콜은 저비용 미세 주입 시스템의 건설, 깊은 뇌 구조로의 입체 이식 및 깨어 있고 억제되지 않은 쥐에서 테트로독신의 시간 제한 된 미세 주입 절차를 설명합니다. 목표는 그들의 신경 활동을 억제 하 여 배란의 규칙에 시상 하 체 구조의 참여를 공개 하는 것입니다.

테트로독신 미세 주입에 의해 뒤집을 수 있는 불활성화를 통해 배란의 규칙에 있는 쥐 두뇌의 이산 영역의 역할을 해명

제시된 자궁 경부 조작 방법은 정관 수술을받은 수컷과 암컷을 번식시킬 필요없이 생쥐에서 가임신을 유도 할 수 있습니다. 비수술적 배아 이식과 비수술적 인공수정의 성공을 위해서는 가임신유도가 필요하며, 이 두 가지 모두 제시되어 있다.

비수술적 배아 이식 또는 인공 수정 전에 정관 수술을 받은 수컷 없이 암컷 마우스에서 가임신을 유도하는 행위

다양한 성선외 조직과 장기의 난포 자극 호르몬(FSH)은 여러 질병의 발병과 관련이 있습니다. 난소 절제술 및 난포자극호르몬 처리 마우스 모델(OVF)을 사용하여 난포자극호르몬의 성선외 작용을 탐색할 수 있습니다.

Exploring Independent Effects of Follicle-Stimulating Hormone In Vivo in a Mouse Model (생쥐 모델에서 모낭 자극 호르몬의 생체 내 독립 효과 탐색)

황체 형성 호르몬(LH) 박동은 생식 기능의 특징입니다. 우리는 연속적인 자동 혈액 수집과 관련된 특정 신경 세포 집단의 원격 활성화를 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 기술은 시간 제한 호르몬 조절, 다중화 및 의식이 있고 자유롭게 움직이며 방해받지 않는 동물의 LH 수준에 대한 조작 효과를 최소화할 수 있습니다.

생쥐의 순환 황체 형성 호르몬을 유도하고 측정하기 위한 자동 혈액 샘플링과 결합된 원격 신경 세포 활성화

안달 기반 기자 점점 라이브 세포 키나제와 인산 가수 분해 효소 활동을 모니터링하는 데 사용됩니다. 여기 대상 인산화에서 세포주기 종속 변화를 평가하기 위해 안달 기반의 기자를 사용하는 방법에 대한 방법을 설명합니다.

안달 Ratiometric하여 세포주기를 통해 키나제와 인산 가수 분해 효소 활동을 모니터링

학습하세요 암컷 설치류의 질 세척 기법을 통해 에스트로우스 주기를 모니터링하는 방법을. 세포 특성 분석과 현미경 관찰을 통해 생식 생물학을 평가하고 심장학 및 약리학 연구에 활용할 수 있습니다.

질 세척을 활용한 설치류 에스트로우스 사이클 모니터링 : 정상주기와 같은 것은 없습니다.

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