Name: 낭포성 섬유증 기도 미생물군유전체에 대한 보충 산소의 효과를 연구하는 모델의 설계 및 개발 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: 배우세요 인공객담배지를 이용한 낭포성 섬유증 기도 미생물군유전체의 고산소 환경 영향 연구 모델. 이 방법은 폐 미생물 상호작용 이해와 만성 폐질환 치료 전략 수립에 기여합니다.

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이 작업의 일부는 해양 생물 연구소, DOE (DE-SC0016127), NSF (MCB1822263), HHMI (보조금 번호 5600373), 사이먼스 재단의 선물의 지원을 받아 해양 생물 연구소에서 수행되었습니다.

이 연구는 파트너 기관 검토 위원회 (프로토콜 # 2018P002934)의 승인을 받았습니다. 포함 기준은 낭포성 섬유증을 가진 성인 환자를 포함한 연구 결과에 대한 서면 통보 된 동의를 제공. 배제 기준은 없었다. 프로토콜 지침에 따르면, 모든 가래 샘플은 임상 공급자와 예정된 외래 환자 방문 중에 낭포성 섬유증 환자로부터 수집되었습니다.
1. 인공 가래 중간 준비
참고: 여기에 나열된 수량은 최종 인공 가래 매체 의 1 L의 생산을 위한 것이며 재료 표에나열된 특정 시약을 가정합니다. 동일한 최종 제품을 보장하기 위해 다른 볼륨또는 다른 시약을 사용하기 위해 숫자를 조정해야 합니다. 대상 농도의 표 1을 참조하십시오.
<ol><li>인공 가래 화학 혼합 (ASCM) 참고: ASCM은 최종 중간 량의 25%를 차지합니다. 선반안정이며 대량 또는 사전에 준비할 수 있습니다. 나중에 사용할 준비가되면 화학 혼합물을 오토클레이브하고 실온에서 안전하게 보관하십시오.<ol>
<li>성분 화학 주식 솔루션을 혼합합니다.<ol>
<li>M NaCl 스톡 1개 준비: 멸균수 리터당 58.44g의 NaCl을 추가합니다.</li>
			<li>1 M KCl 스톡 준비: 멸균 수의 리터 당 KCl 74.55 g를 추가합니다.</li>
			<li>준비 1 M MgSO4 재고: MgSO4·7H2O 의 MgSO 4,47 g, 또는 멸균 수의 리터 당 120.37 g를 추가 하십시오.</li>
			<li>1M 포도당 육수를 준비: 멸균 수의 리터 당 포도당 180.16 g를 추가하십시오.</li>
		</ol>
</li>
		<li>오토클레이브는 화학 적 재고 솔루션뿐만 아니라 빈 250 mL 병을 살균합니다. 30분 동안 121°C 및 15 PSI의 적어도 표준 값으로 자동 절제 단계를 수행합니다.</li>
		<li>빈 250mL 병에 멸균 수의 80.59 mL을 추가합니다.</li>
		<li>믹스에 1 M NaCl 스톡의 152.30 mL을 추가합니다.</li>
		<li>믹스에 1 M KCl 스톡의 15.8 mL을 추가합니다.</li>
		<li>믹스에 1 M MgSO4 스톡의 610 μL을 추가합니다.</li>
		<li>믹스에 1 M 포도당 스톡의 700 μL을 추가합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>인공 가래 뮤신 믹스 (ASMM) 참고: ASMM은 최종 중간 볼륨의 50%를 차지합니다. 최종 중간 배치와 같은 날에 준비되었는지 확인합니다.<ol>
<li>빈 1 L 병에 멸균 물 450mL를 추가합니다.</li>
		<li>병에 10x 인산염 완충식식염(PBS)의 50mL를 추가합니다.</li>
		<li>병에 일회용 마그네틱 교반 바를 추가합니다.</li>
		<li>PBS와 교반 바가 들어 있는 병을 자동 복제합니다.</li>
		<li>뮤신 파우더 10g을 측정하고 PBS에 추가합니다.</li>
		<li>예비 믹싱을 위해 병을 힘차게 흔들어 주세요.</li>
		<li>마그네틱 교반기로 병을 핫 플레이트에 놓습니다. 50°C를 대상으로 중간 고체로 열을 설정하고 1100 rpm으로 교반 속도를 설정합니다. 바가 자석에서 날지 않도록 속도를 서서히 증가시킵니다.<ol>
<li>가열하고 15 분 동안 저어.</li>
			<li>내열 장갑으로 병을 집어 들십시오. 뮤신 파우더가 용액에서 정착하는지 확인하십시오.</li>
			<li>뮤신 파우더가 완전히 용해되지 않으면 병을 완전히 용해 될 때까지 5 분 간격으로 가열 / 교반기로 돌려줍니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>뮤신 믹스를 실온으로 식힙니다.</li>
	</ol></li>
	<li>인공 가래 생물학적 혼합 (ASBM) 참고: ASBM은 최종 중간 량의 25%입니다. 최종 중간 배치와 같은 날에 준비하고 다른 믹스와 달리 구성 요소를 열에 노출시키지 마십시오.<ol>
<li>4°C 냉장고 또는 얼음에 100x 비타민 육수를 해동하십시오. 참고: 비타민 육수를 10mL 알리쿼트에 미리 분배하여 동결/해동 주기 수를 최소화합니다.</li>
		<li>빈 오토클레이브 250mL 병에 멸균 수의 124.24 mL을 추가합니다.</li>
		<li>믹스에 50x 필수 아미노산 스톡의 25.76 mL을 추가합니다.</li>
		<li>혼합에 100x 비 필수 아미노산 스톡의 80.14 mL을 추가합니다.</li>
		<li>믹스에 10 mL (해동) 100 x 비타민 육수를 추가합니다.</li>
		<li>믹스에 1000x 미량 금속 스톡 1mL를 추가합니다.</li>
		<li>혼합에 30 % 달걀 노른자 에멀젼의 8.33 mL을 추가합니다.</li>
		<li>믹스에 10 g / L 페리틴 재고의 400 μL을 추가합니다.</li>
		<li>수동 흔들림을 통해 솔루션을 잘 섞습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>인공 가래 매체 (ASM)<ol>
<li>ASMM이 포함된 1L 병에 ASCM 250mL를 추가합니다.</li>
		<li>중간 병에 ASBM 250mL를 추가합니다.</li>
		<li>기본 MOPS 버퍼(1M)로 배지를 적시하여 좁은 범위 pH 용지에서 6.3의 pH에 도달합니다. 적정 전에, 중간 혼합은 너무 산성 될 것입니다.</li>
		<li>여과준비가 될 때까지 결과 인공 가래 매체를 4°C에서 냉장 보관합니다.</li>
		<li>여과 공정을 시작하려면 필터링되지 않은 인공 가래 배지 200mL을 0.22 μm 모공 크기 필터가 있는 진공 여과 시스템으로 이송합니다.</li>
		<li>여과 시스템을 진공 펌프에 연결하고 진공 펌프를 켜고 70mbar로 설정한 다음 4 °C의 차가운 방에서 90 rpm에서 흔들리는 궤도 셰이커에 챔버를 놓습니다.<ol>
<li>상당한 양이 필터링됨에 따라 배지의 추가 150mL로 위로 를 드시면 됩니다. 1L의 중간을 완전히 걸게 하는 데 1-2일이 걸립니다.</li>
			<li>모든 용지가 필터링될 때까지 추가 챔버로 반복합니다. 참고: mucin이 시간이 지남에 따라 필터를 연결하기 때문에 동일한 0.22 μm 필터를 통해 매체의 350mL 이상을 필터링하지 않도록 하십시오.</li>
		</ol>
</li>
		<li>여과된 인공 가래 매체를 4°C에서 냉장 보관하여 사용할 준비가 될 때까지 냉장 보관합니다. 최상의 결과를 위해 준비 한 달 이내에 ASM을 사용합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 산소 스파깅
<ol><li>스파깅 스테이션 설정 참고: 이 프로토콜은 한 번만 완료해야 하며, 그 후에필요한 간단한 유지 관리를 통해 설정을 유지할 수 있습니다. 산소 스파기 시스템의 시각적 회로도는 그림 1을 참조하십시오.<ol>
<li>압축 공기 및 산소 탱크를 확보하고 적절하게 고정하십시오. 주의: 고압으로 인해 탱크를 잘못 다룰 때 매우 위험합니다. 탱크가 완전히 밀봉되고 고정되어 있는지, 탱크가 닫히면 누출이 없으며 모든 취급 인력이 완전히 사용하도록 하십시오.</li>
		<li>렌치가 있는 압축 공기 탱크에 공기 레귤레이터를 부착합니다. 레귤레이터에서 최적의 흐름 판독을 위해 레귤레이터를 가능한 한 똑바로 세워 두는 위치에 부착하십시오.</li>
		<li>압축 된 산소 탱크에 산소 레귤레이터를 부착하여 가능한 한 똑바로 세워 놓습니다. 산소 탱크에 따라 조여기 방향으로 반전해야 할 수도 있습니다.</li>
		<li>레귤레이터의 튜브를 Y 커넥터에 연결하여 두 탱크의 가스 흐름을 결합합니다.</li>
		<li>Y 커넥터의 출력을 중앙 T-접합 밸브에 연결합니다.</li>
		<li>중앙 T-접합 밸브의 한쪽을 가스 압력 게이지에 연결합니다.</li>
		<li>가스 압력 게이지의 다른 쪽을 0.22 μm 모공 크기의 25mm 직경멸균 주사기 필터에 연결합니다.</li>
		<li>두 번째 25mm 직경 주사기 필터를 감미 전 시 가스 방출로 사용할 플런저 없이 주사기에 부착합니다.</li>
		<li>중앙 T-접합 밸브의 마지막 면을 산소 모니터의 두 번째 T 접합 밸브에 연결합니다.</li>
		<li>25mm 직경 주사기 필터를 이 두 번째 T-접합 밸브의 한쪽에 연결하고 튜브와 함께 18G 바늘을 부착합니다.</li>
		<li>제2 T-접합 밸브의 마지막 면을 산소 모니터링 장치에 연결합니다.</li>
		<li>모니터링 하는 동안 가스 방출로 사용할 산소 모니터링 장치의 반대편에 컷오프 튜브를 연결합니다. 주의: 산소 스파기 시스템을 테스트/사용할 때T-접합의 위치를 주의 깊게 살펴보고 시스템을 통과하는 의도된 경로와 일치하는지 확인합니다. 이렇게 하지 않으면 시스템 내부의 압력 축적이 발생하고 구성 요소가 실패하고 분해됩니다.</li>
		<li>시스템의 유지 보수와 최적의 성능으로 작동하도록 하려면 다음 관행이 유용합니다.<ol>
<li>분리된 양의 Teflon 테이프와의 연결을 강화하여 씰을 크게 개선하고 내부 압력에서 분리되는 구성 요소의 가능성을 줄입니다.</li>
			<li>최대 압력을 완화하고 오류를 방지하기 위해 결합 된 유량은 10 L / min 미만을 유지합니다.</li>
			<li>누출이 의심되는 경우, 가스 누출 보다 거품이 발생하므로 시판되는 액체 누출 감지기와 같은 세제 용액을 사용하여 해당 위치를 쉽게 식별할 수 있습니다. 폴리테트라플루오로틸렌 테이프(예: 테플론)를 사용하여 누수 패치.</li>
			<li>산소 스파기 시스템에서 25mm 직경 주사기 필터를 격주마다 교체하지만 사용 빈도에 따라 다릅니다. 시간이 지남에 따라 필터에 걸린 입자는 가스 유량을 줄이고 압력 축적을 유발합니다.</li>
			<li>측정을 수행하기 전에 산소 모니터를 산소 압축 공기를 21%로 보정합니다.</li>
			<li>시스템 사용이 완료되면 탱크를 끄고 흐름이 완전히 멈출 때까지 레귤레이터에서 과도한 가스를 출혈합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>세럼 병 문화 스파깅<ol>
<li>샘플 식별자, 접종 날짜/시간 및 표적 산소 백분율로 500mL 자동 혈청 병을 라벨로 지정합니다.</li>
		<li>생물학적 후드에 인공 가래 배지의 24mL을 설정 중인 각 혈청 병에 추가합니다.</li>
		<li>각 혈청 병에 18G 바늘로 균질화 된 환자 가래 1 mL (각 배양 조건에 대한 충분한 양의 샘플을 얻기 위해 필요한 경우 멸균 식염수로 희석)를 추가하십시오.</li>
		<li>멸균 핀셋을 사용하여 오토클레이브 고무 스토퍼를 각 세럼 병 의 상단에 놓습니다.</li>
		<li>고무 스토퍼를 누르고 스토퍼의 밑면을 손으로 만지지 않도록주의하십시오.</li>
		<li>후드에서 병을 제거하고 알루미늄 씰을 바르고 압착합니다. 씰에서 중앙 조각을 제거합니다.</li>
		<li>술 닦아병 의 상단을 닦아 분젠 버너 불꽃을 통해 전달합니다.</li>
		<li>멸균 18-G 바늘을 플런저리스 주사기에 필터를 부착합니다. 이 가스 방출을 병에 먼저 삽입합니다.</li>
		<li>멸균 18-G 바늘을 시스템에서 가스 출력에 부착하고 가스 출력 바늘을 병에 삽입합니다.</li>
		<li>탱크에서 산소 모니터를 통해 T-접합을 라우팅합니다. 대상 산소 농도가 시스템을 통해 흐르는지 확인합니다. 약 5 L/분의 가스 흐름을 목표로 합니다.</li>
		<li>탱크에서 가스 출력으로 T-접합을 다시 라우팅합니다. 가스가 혈청 병을 통해 흐르기 시작합니다. 주의: 산소 스파징 중 압력 게이지에 주의를 기울이세요. 압력이 예기치 않게 증가하면 즉시 시스템을 종료하십시오.</li>
		<li>혈청 병을 통해 산소 스파지를 1 분 동안 실행합니다. 5 L/min에서 10개의 항공 교환을 허용하고 내부 대기가 원하는 부분 압력에 도달할 수 있습니다.</li>
		<li>가스 방출 18-G 바늘을 제거합니다.</li>
		<li>혈청 병의 압력이 +1 대기 (해수면의 대기 2)로 구축 한 다음 즉시 가스 출력 바늘을 제거합니다. 참고: 압력을 유지하여 시간이 지남에 따라 hyperoxic 조건을 유지합니다.</li>
		<li>혈청 병을 37°C 인큐베이터 셰이커에 150 RPM에 넣습니다. 3개의 24-h 간격에 대한 샘플을 배양합니다. 각 24-h 간격에서, 다운스트림 분석을 위해 알리쿼트를 취하고, 샘플을 다시 분리하고, 72h의 총 배양 시간 동안 인큐베이션으로 돌려보세요.</li>
	</ol></li>
	<li>유출 산소 측정<ol>
<li>산소 계수를 압축 공기를 21%로 보정한 다음 탱크를 끕니다.</li>
		<li>혈청 병 섭취를 산소 모니터를 통해 라우팅하고 멸균 바늘을 끝까지 부착합니다.</li>
		<li>고무 스토퍼를 통해 바늘을 혈청 병에 삽입합니다.</li>
		<li>유출 판독이 안정화될 때까지 기다립니다. 혈청 병에서 낮은 유량은 최대 2 분이 걸릴 수 있음을 의미합니다. 객실 공기와 가장 큰 차이를 보고합니다(21%에서 가장 먼 숫자).</li>
		<li>여러 판독값을 수행하는 경우 판독값 사이에 압축 공기로 시스템을 플러시합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Matthews, L. W., Spector, S., Lemm, J., Potter, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+pulmonary+secretions.+I.+The+over-all+chemical+composition+of+pulmonary+secretions+from+patients+with+cystic+fibrosis%2C+bronchiectasis%2C+and+laryngectomy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Review+of+Respiratory+Disease%22%5BJournal%5D)">Studies on pulmonary secretions. I. The over-all chemical composition of pulmonary secretions from patients with cystic fibrosis, bronchiectasis, and laryngectomy.</a> American Review of Respiratory Disease. 88, 199-204 (1963).</li>
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</ol>

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

이 연구에서는, 체외 모형은 폐 미생물 지역 사회에 hyperoxia의 효력을 연구하기 위하여 개발되었습니다. 이 모델은 인공 가래 매체와 혈청 병의 일일 스파깅을 기반으로 산소 농도가 상승하여 pwCF에서 가래로 확인된 미생물의 성장을 지원합니다.
이 방법의 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫 번째는 인공 가래 매체의 열 살균보다는 필터 살균을 사용하는 선택입니다. 필터 멸균은 뮤신 및 기타 열에 민감한 성분의 절전을 방지하고 미생물 성장의 광학 측정에 사용할 수 있는 명확한 매체를 생성합니다. 다른프로토콜(10)에서필터 멸균이 제안되었지만, 준비된 매체의 최소량이 여과되었을 때 그렇지 않으면 발생하는 필터의 막힘을 방지하기 위해 여과 과정에서 궤도 흔들림을 첨가하는 것이 필수적이라는 것을 발견했습니다. 여과된 인공 가래 배지는 필터내의 머신 내막 작용으로 인해 의도된 최종 뮤신 농도보다 낮을 수 있지만, pwCF의 ...

낭포성 섬유증 (CF)은 폐에서 두꺼운 점액을 지우지 못하는 것을 특징으로하는 유전 질환으로, 반복되는 감염과 종종 폐 이식 또는 사망의 필요성을 초래하는 진보적 인 폐 기능 감소로 이어진다. 낭포성 섬유증(pwCF)을 가진 사람들의 기도 미생물군유전체는 질병 활동1을추적하는 것으로 나타났으며, 불리한 장기 결과2,3과관련된 미생물 다양성의 감소와 함께. pwCF의 임상 연구에서, 보충 산소 요법은 보다 진보된 질병4,5와연관되어 있다, 그러나 전통적으로, 산소 치료의 사용은 단순히 질병 심각도6에대한 마커로 간주되었습니다. 호흡기 부전 환자의 임상 시험에서 최근 연구는 높은 환자 산소 수준이 역설적으로 심각한 세균 감염의 증가와 관련된 것으로 나타났습니다7,보충 산소가 질병 병인에 기여할 수 있음을 시사. 낭포성 섬유증 폐 미생물군유전체에 대한 보충 산소의 효과와 관련 폐 및 기도 미생물 공동체는 잘 연구되지 않았습니다.
기계학 연구는 종종 물류 어려움과 알 수없는 의료 혜택 이나 해의 개입과 관련된 잠재적 인 윤리적 문제로 인해 인간의 주제에 직접 수행 할 수 없습니다. 인간 바이오시편을 모델 시스템에 통합하는 번역 적 접근 법은 이러한 경우에 중요한 생물학적 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 산소를 사용하거나 용인하는 능력은 전통적으로 미생물 분류의 중요한 구성 요소였지만, 환경에 보충 산소의 치료 도입이 어떻게 기도 미생물 공동체를 방해할 수 있는지에 대해서는 거의 알려져 하지 않습니다. pwCF의 기도 미생물군유전체에 보충 산소의 알 수없는 효과에 빛을 비추기 위해, 우리는 두 가지 주요 과제를 해결해야했습니다. 첫째, CF 가래의 조성을 생리적으로 근사화하는 배양 배지의 생성; 둘째, 장기간 배양시 높은 산소 농도의 유지를 허용하는 모델 시스템의 생성.
인공 가래 매체(ASM)는 폐 가래 를모방하는 데 널리사용되며,9,10,특정 레시피에 대한 명확한 합의는 없다. 이 프로토콜은 pwCF에서 생리학적으로 대략적인 가래를 위해 신중하게 설계된 인공 가래 매체 레시피 및 준비 전략을 설명합니다. 표 1은 게시된 문헌을 기반으로 선택한 레시피 값을 간략하게 설명합니다. 기본 화학 성분 및 pH는 인간 CF 가래11,12,13의연구에 의해 확인된값과일치시켰다. 저농도 생리영양분은최종부10의0.25%로 포함된 달걀 노른자를 사용하였으며, 비타민및미량금속믹스(14,15)를첨가하였다. 가래16의핵심 성분인 Mucin은 1%w/v14로포함되었다. 더 많은 노동 집약적이지만, 필터 살균은 필수 미디어 성분의 열 유도 데마튜레이션으로부터 잠재적인 문제를 줄이기 위해 열 살균의 전통적인 관행을 통해선택되었다(10). 필터 살균의 또 다른 이점은 투명한 매체를 생성한다는 것입니다 (열 살균은 소금과 단백질의 강수량 및 응고로 인해 탁구 미디어를 만들 수 있습니다), 이 인공 가래 매체는 탁도의 증가에 따라 미생물 성장을 따르는 데 사용할 수 있도록.
과옥배양을 위한 이 모델 시스템은 산소가 제거되지 않고 첨가되는 혐기성 배양 기술을 기반으로 pwCF에 대한 산소 보충 사용의 효과를 위한 모델을 생성한다. 도 1 및 관련 산소 스파깅 프로토콜은 일반 실험실 및 병원 공급 업체로부터 저렴한 비용으로 얻을 수있는 산소 스파징 시스템의 구성 요소를 간략하게 설명합니다. 이 시스템은 압축 산소와 공기를 21%-100% 산소에 이르는 고정 농도로 혼합할 수 있게 합니다. 산소 센서의 통합을 통해 출력 가스 혼합물의 농도를 검증할 수 있을 뿐만 아니라 이전에 분리된 혈청 병의 유출 가스 조성을 확인하여 산소 조건이 원하는 범위 내에서 유지되었는지 확인할 수 있습니다.
이 프로토콜은 인공 가래 매체를 만드는 절차를 간략하게 설명하고, 산소 스파깅 시스템의 구성 및 사용, 및 차동 산소 조건하에서 배양 CF 가래에 둘 다의 적용을 한다.

<table><tbody><tr><td>BME 비타민(100개) 용액</td><td>MilliporeSigma</td><td>B6891</td><td>비타민 보충 농축 용액.</td></tr><tr><td>크림퍼, 30mm</td><td>DWK Life Sciences</td><td>224307</td><td>크림퍼는 알루미늄 씰을 혈청 병에 부착하기 위한 것입니다.</td></tr><tr><td>D-(+)-포도</td>당 <td>MilliporeSigma</td><td>G7021</td><td>고체 포도당 분말(덱스트로로테이터 이성질체).</td></tr><tr><td>다이어프램 펌프 ME 2 NT</td><td>VACUU 20730003</td><td></td><td>진공 여과용 진공 펌프.</td></tr><tr><td>달걀 노른자 에멀젼</td><td>HiMedia</td><td>FD045</td><td>식염수 30% 달걀 노른자의 멸균 에멀젼.</td></tr><tr><td>페리틴, Horse Spleen</td><td>MilliporeSigma</td><td>F7879</td><td>페리틴(철 저장 단백질) 용액</td>에서 양이온화.</tr><tr><td>FIREBOY 플러스 안전 분젠 버너</td><td>Integra Biosciences</td><td>144000</td><td>분젠 버너는 사용자 인터페이스 및 안전 기능을 갖추고 있습니다.</td></tr><tr><td>하이드리온 pH 종이 (1.0&ndash; 14.0)</td> <td>Micro Essential Laboratory</td><td>94</td><td>pH 테스트 용지 1.0&ndash; 14.0 범위.</td></tr><tr><td>Hydrion pH 종이 (4.0&ndash; 9.0)</td> <td>Micro Essential Laboratory</td><td>55</td><td>pH 테스트 용지 4.0&ndash; 9.0 범위.</td></tr><tr><td>Hydrion pH 종이 (6.0&ndash; 8.0)</td> <td>Micro Essential Laboratory</td><td>345</td><td>pH 테스트 용지 6.0&ndash; 8.0 범위.</td></tr><tr><td>피하 주사 Needle-Pro EDGE 안전 장치, 18G</td><td>Smiths Medical</td><td>401815</td><td>안전 캡이 있는 18G 바늘.</td></tr><tr><td>인라인 압력 게이지</td><td>MilliporeSigma</td><td>20469</td><td>병 압력 모니터링용 가스 압력계.</td></tr><tr><td>Innova 42 Incubated Shaker</td><td>Eppendorf</td><td>2231000756</td><td>인큐베이터/오비탈 Shaker 조합</td></tr>.<tr><td>바늘이 부착된 Luer-Lok 주사기</td><td>Becton Dickinson</td><td>309580</td><td>조합 3mL 주사기 및 18G 바늘.</td></tr><tr><td>Luer 밸브 구색</td><td>World Precision Instruments</td><td>14011</td><td>가스 흐름 튜브용 밸브.</td></tr><tr><td>LSE 오비탈 쉐이커</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>6780-NP</td><td>오비탈 쉐이커는 여과 중 매체를 교반합니다.</td></tr><tr><td>마그네슘 황산염 헵타하이드레이트</td><td>MilliporeSigma</td><td>M2773</td><td>고체 엡솜염(마그네슘 황산염 헵타하이드레이트).</td></tr><tr><td>유량계가 있는 의료용 공기 1단 조절기</td><td>Western Enterprises</td><td>M1-346-15FM</td><td>15L/min 미터의 공기 유량 조절기.</td></tr><tr><td>MEM 아미노산 (50x) 용액</td><td>MilliporeSigma</td><td>M5550</td><td>필수 아미노산 농축 용액.</td></tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산 (100x) 용액</td><td>MilliporeSigma</td><td>M7145</td><td>비필수 아미노산 농축 용액.</td></tr><tr><td>Millex-GP 필터, 0.22 &마이크로; m</td><td>MilliporeSigma</td><td>SLMP25SS</td><td>0.22 &마이크로; M 폴리에테르설폰 멤브레인 멸균 주사기 필터.</td></tr><tr><td>Milli-Q 아카데믹</td><td>MilliporeSigma</td><td>ZMQS60E01</td><td>Milli-Q 멸균 정수 여과 시스템.</td></tr><tr><td>MiniOX 3000 산소 모니터</td><td>MSA</td><td>814365</td><td>가스 유량 산소 퍼센트 모니터.</td></tr><tr><td>MOPS 완충액(1M, pH 9.0)</td>매체 pH 조정을 위한 <td>Boston BioProducts</td><td>BBM-90</td><td>MOPS 완충액.</td></tr><tr><td>돼지 위</td><td>MilliporeSigma</td><td>M2378</td><td>뮤신(글리코실화 겔 형성 단백질) 분말의</td> 뮤신.</tr><tr><td>천연 폴리프로필렌 가시 피팅 키트</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-1413</td><td>가스 흐름 튜브용 커넥터.</td></tr><tr><td>Nextera XT DNA Library Preparation Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1096</td><td>염기서열분석 중 식별을 위한 라이브러리 준비.</td></tr><tr><td>NovaSeq 6000 염기서열분석 시스템</td><td>Illumina</td><td>770-2016-025-N</td><td>시료 판독 생성을 위한 Shotgun 염기서열분석 플랫폼.</td></tr><tr><td>유량계가 있는 산소 단일 단계 조절기</td><td>Western Enterprises</td><td>M1-540-15FM</td><td>15L/min 미터의 산소 유량 조절기.</td></tr><tr><td>2개의 표준 커넥터가 있는 산소 튜빙</td><td>SunMed</td><td>2001-01</td><td>가스 시스템 구성 요소를 연결하기 위한 튜빙.</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수, 10x, pH 7.4</td><td>Molecular Biologicals International</td><td>MRGF-6235</td><td>농축 인산염 완충 식염수.</td></tr><tr><td>PC 420 핫 플레이트/교반기</td><td>Marshall Scientific</td><td>CO-PC420</td><td>조합 핫 플레이트/교반기.</td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>MilliporeSigma</td><td>P9541</td><td>고체 염화칼륨 염.</td></tr><tr><td>PTFE 일회용 교반 막대</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-513-95</td><td>일회용 자기 교반 막대</td></tr>.<tr><td>PTFE 스레드 씰 테프론 테이프</td><td>VWR</td><td>470042-938</td><td>가스 시스템 연결 강화용 테프론 테이프.</td></tr><tr><td>Q-Gard 2 정제 카트리지</td><td>MilliporeSigma</td><td>QGARD00D2</td><td>Milli-Q 시스템용 정제 카트리지.</td></tr><tr><td>재사용 가능한 배지 보관 병</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>06-423A</td><td>배양 배지 혼합 및 보관용 병.</td></tr><tr><td>고무 마개, 30mm, 회색 브로모부틸</td><td>DWK Life Sciences</td><td>224100-331</td><td>세럼 병용 고무 마개.</td></tr><tr><td>성형 눈금이 있는 세럼 병, 밀봉 배양을 위한 500mL</td><td>DWK Life Sciences</td><td>223952</td><td>유리 세럼 병.</td></tr><tr><td>스몰 보어 확장 세트</td><td>Braun Medical</td><td>471960</td><td>루어 잠금 커넥터가 있는 튜빙 확장.</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>MilliporeSigma</td><td>S3014</td><td>고체 염화나트륨 소금.</td></tr><tr><td>스파이크인 제어 I (높은 미생물 부하)</td><td>ZymoBIOMICS</td><td>D6320</td><td>절대 미생물 부하 계산을 위한 스파이크인 미생물(I. halotolerans 및 A. halotolerans)</td></tr><tr><td>Stericup 퀵 릴리스 멸균 진공 여과 시스템</td><td>MilliporeSigma</td><td>S2GPU02RE</td><td>250 mL 0.22 &micro; M 진공 여과 챔버.</td></tr><tr><td>Super Sani-Cloth 살균 일회용 물티슈</td><td>Professional Disposables International</td><td>H04082</td><td>살균용 일회용 살균 물티슈.</td></tr><tr><td>미량 금속 혼합물, 1000x</td><td>ThermoFisher Scientific NC0112668</td><td></td><td>생리학적 미량 금속의 농축 용액.</td></tr><tr><td>안감 없는 알루미늄 씰, 30mm</td><td>DWK Life Sciences</td><td>224187-01</td><td>고무 스토퍼 위에 크림핑 처리된 알루미늄 씰.</td></tr><tr><td>USP 의료용 에어 탱크</td><td>Airgas</td><td>AI USP200</td><td>살포 시스템에 입력하기 위한 압축 공기 탱크.</td></tr><tr><td>USP 의료용 산소 탱크</td><td>에어가스</td><td>OX USP200</td><td>살포 시스템에 입력하기 위한 압축 산소 탱크.</td></tr></tbody></table>

낭포성 섬유증 기도 미생물군유전체에 대한 보충 산소의 효과를 연구하는 모델의 설계 및 개발

Design and Development of a Model to Study the Effect of Supplemental Oxygen on the Cystic Fibrosis Airway Microbiome

기도 미생물 지역 사회는 낭포성 섬유증 (CF) 및 그밖 만성 폐 질병의 진행에 있는 중요한 역할을 하기 위하여 생각됩니다. 미생물은 전통적으로 산소를 사용하거나 용인하는 능력에 따라 분류되었습니다. 보충 산소는 낭포성 섬유증을 가진 사람들에게 투여되는 일반적인 의학 치료입니다 (pwCF); 그러나, 산소와 기도 미생물군유전체에 대한 기존 연구는 아옥시아(high oxygen)가 아닌 저산소증(저산소)이 주로 호기성 및 촉진성 혐기성 폐 미생물 공동체에 어떻게 영향을 미치는지에 초점을 맞추고 있다. 이러한 중요한 지식 격차를 해결하기 위해 이 프로토콜은 pwCF의 가래 구성을 모방한 인공 가래 매체를 사용하여 개발되었습니다. 투명 배지를 산출하는 필터 살균을 사용하면 광학 방법이 서스펜션 배양에서 단세포 미생물의 성장을 따를 수 있습니다. 과산화 조건을 만들기 위해,이 모델 시스템은 hyperoxic 조건을 연구하기 위해 설립 혐기성 배양 기술을 활용; 산소를 제거하는 대신, 산소는 압축 산소와 공기의 혼합물과 혈청 병의 매일 스파깅에 의해 배양에 추가됩니다. 50 pwCF에서 가래는 차동 산소 조건을 유지하기 위해이 모델의 능력을 확인하기 위해 72-h 기간 동안 매일 스파깅을 겪었다. 산탄총 메타게놈 시퀀싱은 11 pwCF로부터 배양 및 비배양식 가래 샘플에서 수행되어 낭포성 섬유증 가래에서 흔히 발견되는 발생성 및 병원성 미생물의 성장을 지원하는 이 매체의 능력을 검증하였다. 성장 곡선은 일반적인 낭포성 섬유증 병원균의 성장을 지원하기 위해 이러한 인공 가래 배지의 능력을 확인하기 위해 pwCF로부터 얻은 112개의 분리물로부터 수득되었다. 우리는 이 모형이 CF 가래에 있는 병원균 및 교근의 다양한 문화가, normoxic 조건하에서 비배양되지 않은 가래와 매우 유사한 지역 사회를 복구하고, 다양한 산소 조건하에서 다른 문화 표현형을 창조할 수 있다는 것을 것을을 발견합니다. 이 새로운 접근은 기도 미생물 지역 사회와 일반적인 호흡 병원체에 pwCF에 있는 산소의 사용에 의해 유도된 예기치 않은 효력의 더 나은 이해로 이끌어 낼 수 있습니다.

이 프로토콜은 매사추세츠 주 보스턴에 있는 매사추세츠 종합 병원에 있는 외래 환자 낭포성 섬유증 진료소에 일상적인 배려를 위해 제출하는 pwCF에서 50의 예상한 가래 견본에 적용되었습니다. 각 환자의 가래는 인공 가래 매체를 사용하여 21%, 50%, 산소 100% 산소 조건 하에서 배양되었으며, 각 배양에서 0.5mL 알리쿼트가 24시간, 48h, 72h의 배양 시간으로 배양하였다. 시각적 변화를 추적하기 위해 추출할 때 문화가 촬영되었습니다. 또한, 각 1차 가래 샘플의 0.5mL 알리쿼트(aliquot)는 배양 전에 채취하였다. 이로 인해 환자당 10개의 개별 샘플과 500개의 샘플의 최종 N이 발생했습니다. 이들 중 11명의 환자(11명의 배양되지 않은 스푸타, 11개의 배양스스퍼타, 11개의 배양된 스푸타에서 48h의 인큐베이션에서 산소)가 핵산 추출17을받았으며, 시퀀싱 라이브러리는 상업용 DNA 라이브러리 준비 키트를 사용하여 생성되었으며, 메타게노믹 시퀀싱 플랫폼은 전체...

이 프로토콜의 목표는 낭포성 섬유증 기도 미생물 지역 사회에 hyperoxia의 효력을 위한 모형 시스템을 개발하는 것입니다. 인공 가래 배지는 가래의 조성을 모방하고, 과옥배양 조건은 폐 미생물 공동체에 대한 보충 산소의 효과를 모델링한다.

Airway microbial communities are thought to play an important role in the progression of cystic fibrosis (CF) and other chronic pulmonary diseases. ...

이 프로토콜은 낭포성 섬유증 환자의 폐 미생물군유전체에 보충 산소 사용의 체외 효과를 모델링하도록 설계되었습니다. 이 미디어 레시피는 낭포성 섬유증을 앓고 있는 사람들을 위한 가래의 생리적 구성을 반영하도록 맞춤화되어 있습니다. 스파깅 과정은 다른 산소 조건하에서 배양 할 수있는 능력을 소개합니다.인공 가래 매체에 변경하면 동시 낭포성 섬유증 및 당뇨병 환자의 다른 포도당 농도와 같은 다른 조건하에서 다른 만성 폐 질환을 모방하고 미생물 커뮤니티를 모델링 할 수 있습니다. 인공 가래 매체 준비를 위한 단계의 개요는 준비된 ASCM, ASMM 및 ASBM의 혼합을 보여줍니다. 걸레 버퍼는 pH를 6.3으로 적발하고 배지의 필터 살균을 궤도 셰이커의 콜드룸에서 수행한다.우선 ASMM이 함유된 1리터 병에 250밀리리터의 ASCM을 추가하여 인공 가래 매체를 준비하십시오. 그런 다음 중간 병에 ASBM250 밀리리터를 추가합니다. pH 용지에 6.3의 pH에 도달하기 위해 기본 하나의 어어걸레 버퍼로 배지를 적시한다.인공 가래 매체를 여과될 때까지 섭씨 4도에 냉장 보관하십시오. 그런 다음 여과 공정을 시작하기 위해 여과되지 않은 인공 가래 매체 200 밀리리터를 0.22 마이크로미터 모공 크기 필터를 갖춘 진공 여과 시스템으로 이송합니다. 여과 시스템을 진공 펌프에 연결한 후 진공 펌프를 켜고 챔버를 궤도 셰이커에 놓고 섭씨 4도의 차가운 방에서 분당 90 회전에서 흔들어 놓습니다.350 밀리리터의 매체가 필터링된 후 필터를 변경하여 막힘 문제를 극복합니다. 상당한 양을 여과한 후 여과를 위한 추가 150 밀리리터 배지에서 필터링됩니다. 모든 용지가 필터링될 때까지 추가 챔버로 여과를 반복합니다.자동 혈청 병에 인공 가래 매체에 환자 가래의 추가를 보여주는 산소 스파징의 개요. 그런 다음 밀봉 된 혈청 병을 가스 혼합물로 분리합니다. 마지막으로, 혈청 병은 후속 메타 유전체학 시퀀싱을 위해 24시간 간격으로 배양 알렉 와츠를 얻기 위해 배양된다.혈청 병 배양 스파깅을 시작하려면 샘플 식별자, 접종 날짜 및 시간 및 대상 산소 백분율로 500 밀리리터 오토클레이브 혈청 병에 라벨을 붙입니다. 생물학적 후드에 인공 가래 배지의 24 밀리리터를 설정 중인 각 혈청 병에 추가합니다. 각 배양 조건에 대한 충분한 샘플 부피를 얻으려면 필요한 경우 멸균 인산염 완충식 식염수로 샘플을 희석한 다음 18 게이지 바늘로 가래를 균질화한 다음 각 혈청 병에 환자 가래의 1 밀리리터를 추가합니다.다음으로, 멸균 핀셋을 사용하여, 각 혈청 병의 상단에 오토클레이브 고무 스토퍼를 놓고 스토퍼의 밑면을 만지지 않고 고무 스토퍼를 누릅니다. 후드에서 병을 제거 한 후 알루미늄 씰을 적용하고 압착하십시오. 물개 의 중심을 제거하고 알코올 닦아 병의 상단을 닦아 분센 버너 불꽃을 통해 병 씰을 전달합니다.이제 멸균, 18 게이지 바늘을 필터로 플런저 리스트 주사기에 고정하고 부착 된 가스 방출 주사기를 병에 먼저 삽입합니다. 이제 멸균, 18 게이지 바늘을 시스템에서 가스 출력에 고정하고 가스 출력 바늘을 병에 삽입합니다. 탱크에서 산소 모니터를 통해 T 접합을 라우팅합니다.시스템을 통해 흐르는 표적 산소 농도를 확인한 후 분당 약 5리터의 가스 흐름을 목표로 합니다. T 접합을 탱크에서 가스 출력으로 다시 라우팅합니다. 가스가 혈청 병을 통해 흐르기 시작하면 압력 게이지에 주의를 기울이고 압력이 예기치 않게 증가하면 즉시 시스템을 종료하십시오.분당 5리터에서 1분 동안 혈청병을 통해 산소를 분리하면 10개의 공기 교환이 허용되고 내부 대기가 100% 산소의 원하는 농도에 도달할 수 있도록 합니다. 가스 방출, 18 게이지 바늘을 제거합니다. 혈청 병의 압력이 하나의 대기로 구축 할 수 있도록 한 후, 즉시 가스 출력 바늘을 제거합니다.37섭씨 37도의 세럼 병을 분당 150회전에서 3시간, 24시간 간격으로 배양합니다. Alec Watts는 다운스트림 분석을 위해 각 24시간 간격으로 채취되고 샘플은 매번 재분리됩니다. 이 예제에서는 배양 전후의 문화가 어떤 모습일지 보여 주습니다.유출 산소 및 pH 수준은 37°C에서 유지된 가래 샘플에 대한 배양 과정의 과정을 통해 측정하였다. 12시간 24시간의 간격을 모두 절약한 결과, 산소 농도는 시간이 지남에 따라 약 유지되었고 산소 농도는 세 가지 조건 모두에 대해 관찰되었다. 측정된 pH 수준은 시간이 지남에 따라 중요한 변화없이 생리 범위 내에 있었습니다.미생물 부하의 비교, 다양성과 문화가 없는 가래 사이 지역 사회 조성은 배양 가래에 있는 미생물 하중에 있는 20 배 증가를 제시했습니다. 다양성 지표는 문화 과정에 의해 도입 된 최소한의 글로벌 차이와 지역 사회 구성의 보존을 나타냈다. 배양 및 비배양식 가래에서 120종의 미생물 종의 비교 분석은 대사 게놈 시퀀싱에 의해 수행되었다.이들 종 중 46종은 배양되지 않은 시료와 배양된 샘플 모두에서 확인되었다. 35는 비배양식 샘플에서 독점적으로 확인되었으며 39는 배양 된 샘플에서 독점적으로 확인되었습니다. 흡수성 기반 성장 곡선은 정상적인 21%의 산소 농도 하에서 분리된 환자 샘플로부터 인공 가래 매체에서 배양된 일반적인 CF 폐 병원균을 위해 생성되었다.ASM에서 600 나노미터의 광학 밀도에서 시간이 지남에 따라 변화가 없으며 부정적인 제어만오염 없는 배양을 나타냈다. 일반적인 성장 곡선 패턴은 ASM 배지가 광학 방법을 사용하여 성장 곡선의 생성에 사용될 수 있음을 나타내는 관찰된다. 메타게놈 시퀀싱은 미생물 공동체 구성을 설명하기 위해 여기에서 사용된다.대사산물 시퀀싱과 같은 다른 기술은 대사산물 생산을 평가하기 위해 유전자 발현 또는 메타볼로믹스를 평가하는 데 사용될 수 있다.

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Medicine

의학

출처: Vieira, J., et al. 낭포성 섬유증 기도 마이크로바이옴에 대한 보충 산소의 효과를 연구하기 위한 모델의 설계 및 개발.  J. Vis. 경험. (2021).이 비디오는 낭포성 섬유증 폐 가래의 점도, 영양 조성 및 pH를 모방한 인공 가래 배지의 준비를 보여줍니다. 생성된 배지는 생체 외 연구를 위한 생리학적으로 관련된 플랫폼을 제공합니다.

낭포성 섬유증 폐 가래를 생체 외에서 모방하기 위한 인공 가래 배지의 준비

이 프로토콜은 슬라이드 챔버 모델을 사용하여 숙주 인자에 노출된 후 생물막 발달의 시각화를 설명합니다. 이 모델을 사용하면 컴퓨터 소프트웨어 프로그램을 사용하여 생물막 매개변수를 분석할 뿐만 아니라 생물막 개발을 직접 시각화할 수 있습니다.

챔버의 coverglass 모델을 사용하여 바이오 필름 개발에 객담의 효과를 시각화

점액은 낭포 성 섬유증의기도가 (CF) 환자는 미생물 병원균이 번창 할 수있는 이상적인 환경이다 연결. 원고들은 화학 조건의 질병 및 방법 변경의 원인이 모방 미생물 역학을 구동 할 수있는 환경에서 CF 폐 마이크로 바이 옴을 연구하기위한 새로운 방법을 설명합니다.

WinCF 모델 - 폐렴의 미생물학을 연구하기 위해 점액으로 촘촘하게 밀집된 Bronchiole의 저렴하고 견고한 소우주

당사는 CFBE41o-세포, THP-1 대식세포 및 슈도모나스 아에루기노사(공기-액체인터페이스)에 설립된 감염된 기도의 3차원 공동 배양 모델에 대한 프로토콜을 설명합니다.- 이 모델은 항생제 효능, 상피 장벽 기능 및 염증 성 마커를 동시에 테스트하는 새로운 플랫폼을 제공합니다.

P. 아루기노사 감염된 3D 기관상피세포 및 대식세포의 공동 배양

이 워크플로우는 낭포성 섬유증을 가진 개별의 폐에 있는 세균성 생물막의 확립된 ex vivo 모형을 사용하여 항생제 감수성 시험을 능력을 발휘하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 모델의 사용은 MBEC의 임상 타당성을 향상시킬 수 (최소한의 생물 막 박멸 농도) 에세이.

낭포성 섬유증 폐에 있는 슈도모나스 아에루기노사 및 황색포도상구균 생물막의 Ex vivo 모형에 있는 항생제 효능 시험

이 프로토콜은 박테리아 종간 상호 작용의 영향을 탐구하는 데 사용할 수 있는 낭포성 섬유증(CF) 폐 관련 4종 다미생물 생물막 모델을 설명합니다.

커뮤니티 표현형을 조사하기 위한 낭포성 섬유증 관련 다미생물 생물막 성장

이 방법론을 통해 연구 및 임상 실험실에서 항균성 감수성 테스트를 위해 낭포성 섬유증에서 다미생물 생물막 모델을 구축할 수 있습니다. 이 모델은 다양한 출력에 걸쳐 정확하고 신뢰할 수 있는 결과를 제공합니다.

낭포성 섬유증에서 항균제를 테스트하기 위한 다미생물 집락 생물막 모델 개발

이 연구는 낭포성 섬유증 폐 환경을 반영하는 녹농균 유전자 발현을 평가하기 위해 응집체 다미생물 생물막 모델을 개발하고 RNA 추출 프로토콜을 최적화하기 위한 프레임워크를 설명합니다. 응용 분야에는 항균 효과 평가 및 낭포성 섬유증과 관련된 조건에서 항생제 대안 연구가 포함됩니다.

감염 관련 유전자 발현을 연구하기 위한 낭포성 섬유증 응집체 생물막 모델

이 동영상은 쥐에 이식 vasculopathy (TVP)의 개발을 연구하기위한 간단한 모델로 orthotopic 대동맥 이식 모델을 보여줍니다.

Orthotopic 대동맥 이식 : 만성 Vasculopathy의 개발 연구에 생쥐 모델

우리는 PTSD 환자의 특징 neuroendocrine 기능의 영구적 인 변경 및 지연, 장기, 과장된 공포 반응을 보여 후 외상 후 스트레스 장애 (PTSD)의 쥐 모델을 설명합니다. 동물 모델과 여기에 설명 된 방법은 기계론의이지만 주변 흰색 혈액 세포의 생체과 함께, 환자로 측정 할 수없는 뇌 핵에 생체, 수를 상호 연관 유용합니다.

PTSD의, 신경 Hematologic, 그리고 행동 상관 관계를 누설하는 행위에 대해서는 동물 모델에서 생체

배우세요 인공객담배지를 이용한 낭포성 섬유증 기도 미생물군유전체의 고산소 환경 영향 연구 모델. 이 방법은 폐 미생물 상호작용 이해와 만성 폐질환 치료 전략 수립에 기여합니다.

낭포성 섬유증 기도 미생물군유전체에 대한 보충 산소의 효과를 연구하는 모델의 설계 및 개발

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