Name: mRNA로 로드된 폴리(베타 아미노에스) 나노입자의 합성 및 특성화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: 배우세요 poly(beta aminoester) 중합체를 사용하여 mRNA를 캡슐화하는 간단한 나노입자 제조 방법을. 이 다용도 기술은 다양한 핵산 및 세포 유형에 적용 가능하며, 동결건조를 통해 안정성을 확보할 수 있습니다.

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<li>Dosta, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+anti-microRNA-712+to+inflamed+endothelial+cells+using+poly%28%CE%B2-amino+ester%29+nanoparticles+conjugated+with+VCAM-1+targeting+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Delivery of anti-microRNA-712 to inflamed endothelial cells using poly(β-amino ester) nanoparticles conjugated with VCAM-1 targeting peptide.</a> Advanced Healthcare Materials. , 1-11 (2021).</li>
<li>Segovia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+doped+with+nanoparticles+for+local+sustained+release+of+siRNA+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Hydrogel doped with nanoparticles for local sustained release of siRNA in breast cancer.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (2), 271-280 (2015).</li>
</ol>

저자는 공개할 것이 없고 이해 상충도 없습니다.

작년에 Covid-19 전염병이 발병한 후, 전염병 통제 측면에서 백신의 중요성은 중요한 구성 요소8로나타났다. 전 세계 과학자들의 노력으로 많은 백신 시장이 출시되었습니다. 역사상 처음으로 mRNA 백신은 몇달내에 새로운 항원5,6,21에적응할 수 있는 능력 때문에 빠른 설계 덕분에 이전에 가설적인 성공을 입증했습니다. mRNA, 또는 메신저 리보핵산은 DNA내인코딩된 정보로부터 단백질 합성을 유도하는 핵산을 지칭한다. 여기서, 예방 접종을 목적으로, mRNA는 전염성 미생물(또는 치료 종양 백신 접종의 경우 종양 항원에 속하는 항원단백질)에 속하는 항원단백질을 명문화한다8,22. 이러한 맥락에서, 과학 계는 mRN...

전염병은 전 세계 수백만 명의 인간에게 심각한 위협을 나타내고 있으며 여전히 일부 개발 도상국에서 주요 사망 원인 중 하나입니다. 예방 접종은 전염병을 예방하고 통제하기 위해 현대 사회의 가장 효과적인 개입 중 하나였습니다1,2. 20세기관련성에 있는 과학의 이 중요한 이정표는 SARS-CoV-2 바이러스3에기인한 최근 세계적인 Covid-19 전염병에 의해 언급되었습니다. 질병의 보급을 줄이기 위해 효율적인 백신을 갖는 것의 중요성을 인식, 모든 생물 의학 지역 사회에서 협력 노력은 성공적으로 1 년 이내에 시장에서 많은 예방 백신을 초래했다4.
전통적으로, 백신은 감쇠 (살아있는, 감소된 독성) 또는 불활성화 (죽음 입자) 바이러스로 구성되었다. 그러나, 안전 오류에 대한 여백이없는 일부 질병의 경우, 바이러스 성 입자는 불가능하고, 단백질 하위 단위는 대신 사용된다. 그럼에도 불구하고, 서브유닛은 일반적으로 하나 이상의 에피토프/항원의 조합을 활성화하지 않으며, 유족은 백신 접종 효능5,6을향상시켜야 한다. 따라서 새로운 백신 유형에 대한 필요성은 분명합니다.
현재 전염병 동안 입증된 바와 같이, 핵산을 기반으로 한 새로운 백신 후보는 긴 발달 과정을 피하고 동시에 중요한 환자 예방 접종을 생산하는 동안 높은 다기능성을 제공하는 측면에서 유리할 수 있다. 이것은 처음에 실험적인 암 백신으로 디자인된 mRNA 백신의 케이스입니다. 항원 특이적 T세포 반응3,5,6,7을생성하는 자연적인 능력 덕분. mRNA는 항원 단백질을 인코딩하는 분자로서, 단지 동일하게 변화하는, 백신은 동일한 미생물, 다른 균주, 다른 전염성 미생물의 다른 변이체를 예방 접종하기 위해 신속하게 조정될 수 있거나, 심지어 암 면역 치료 치료법이 될 수 있다. 또한 대규모 생산 비용 면에서 유리합니다. 그러나, mRNA는 그들의 벌거 벗은 행정을 방해하는 중요한 장애물이 있습니다: 그것의 안정성 및 무결성은 생리적인 매체에서 손상됩니다, 핵의 가득 차있는. 이러한 이유로, 이를 보호하고 mRNA를 항원 제시 세포로 벡터화하는 나노메트릭 담체의 사용은2,8이필요하다.
이러한 맥락에서, 폴리(베타 아미노에스)(pBAE)는 생체적합성 및 생분해성 폴리머의 일종으로, 양이온화9,10,11덕분에나노메트릭 입자에서 mRNA를 복합화하는 놀라운 능력을 입증하였다. 이 중합체는 생리적인 조건에서 에스테라아에 의해 그들의 분해를 쉽게 만드는 에스테르 결합으로 이루어집니다. pBAE 라이브러리 후보 중, 종말 양이온 올리고펩타이드로 기능화된 사람들은 내분비증을 통해 세포를 효율적으로 침투시키고 캡슐화된 유전자 물질을 이식하기 위해 작은 나노입자를 형성하는 더 높은 용량을 보였다. 또한, 버퍼링 용량 덕분에 내성 구획의 산성화는 내도 탈출12,13을허용한다. 즉, pBAE의 특정 종류, 그들의 백본에 소수성 모니티를 포함 (소위 C6 pBAE) 그들의 안정성을 향상 시키고 말 올리고펩티드 조합 (3-lysine로 변형 된 폴리머의 60%와 삼부스티딘을 가진 폴리머의 40%)는 비경구 투여 후 항원 제시 세포를 선택적으로 트랜스펙트 및 mRNA 코드 내포 항원 발표1 . 또한, 이러한 제형은 나노의학 제제의 주요 병목 현상 단계 중 하나를 우회할 수 있다는 것을 입증하였다: 그들의 기능을 잃지 않고 동결 건조할 수 있는 가능성, 이는 연약한 건조한 환경에서 장기적인 안정성을 가능하게한다(15).
이러한 맥락에서, 현재 프로토콜의 목적은 프로토콜의 중요한 단계에 대한 설명을 제공하고 전염병 예방 및 종양 치료 응용을 위한 효율적인 백신의 생산을 가능하게 함으로써 과학 계에 사용할 수 있는 mRNA 나노입자의 형성을 위한 절차를 만드는 것이다.
다음 프로토콜은 올리고펩티드 최종 변형 폴리(베타 아미노에스)를 합성하기 위한 완전한 운동을 설명합니다- 나노입자 합성에 더 사용될 OM-pBAE 폴리머. 프로토콜에서, 나노입자 제형도 포함되어 있다. 또한, 절차 및 대표 결과의 성공을 위한 중요한 단계는 또한 결과 제형이 양수 또는 음수 결과를 정의하는 데 필요한 품질 관리 특성화 기능을 달성할 수 있도록 제공된다. 이 프로토콜은 그림 1로요약되어 있습니다.

<table><tbody><tr><td>1,4-부탄디올 디아크릴레이트</td><td>, 시그마 알드리치</td><td>123048</td><td></td></tr><tr><td>1-헥실아민</td>, <td>시그마 알드리치</td><td>219703</td><td></td></tr><tr><td>5-아미노-1-펜탄올</td><td>, 시그마 알드리치</td><td>411744</td><td></td></tr><tr><td>아세톤</td><td>판리크</td><td>141007</td><td></td></tr><tr><td>CD11b 항체</td><td>BD</td><td>550993</td><td></td></tr><tr><td>CD86 항체</td><td>Bioligend</td><td>105007</td><td></td></tr><tr><td>클로르 하이드록시드</td><td>Panreac</td><td>181023</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform-d</td><td>Sigma Aldrich</td><td>151823</td><td></td></tr><tr><td>Cys-His-His-His 펩타이드</td><td>Ontores</td><td>Custom</td><td></td></tr><tr><td>Cys-Lys-Lys-Lys 펩타이</td>드 <td>Ontores</td><td>Custom</td><td></td></tr><tr><td>D2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>Rnase free water 용 DEPC 시약</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5758</td><td>이 시약은 MilliQ 물을 처리하여 완충액</td></tr><tr><td>Diethyl eter</td><td>Panreac</td><td>212770</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드</td><td>, 시그마 알드리치</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마 알드리치</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>mRNA EGFP</td><td>TriLink Technologies</td><td>L-7601</td><td></td></tr><tr><td>mRNA OVA</td><td>TriLink의 RNase를 제거하는 데 중요합니다. 기술</td><td>L-7610</td><td></td></tr><tr><td>RiboGreen 키트</td><td>ThermoFisher</td><td>R11490</td><td></td></tr><tr><td>아세트산 나트륨</td><td>시그마 Aldrich</td><td>71196</td><td></td></tr><tr><td>자당</td><td>시그마 Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>트리 플루오로 아세트산</td><td>시그마 Aldrich</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>11570626 &alpha</td><td></td></tr><tr><td>; 마우스 AlexaFluor488 항체</td><td>Abcam</td><td>Ab450105</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanoparticle Tracking Analyzer</td><td>Malvern Panalytical</td><td>NanoSight NS300</td><td></td></tr><tr><td>핵 자기 공명 분광계</td><td>Varian</td><td>400 MHz</td><td></td></tr><tr><td>ZetaSizer</td><td>Malvern Panalytical</td><td>Nano ZS</td><td>제타 전위 및 유체역학적 크기 결정</td></tr><tr><td>소프트웨어</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoSight NTA 소프트웨어</td><td>Malvern Panalytical</td><td>MAN0515-02-EN-00</td><td></td></tr><tr><td>NovoExpress 소프트웨어</td><td>Agilent</td><td>지정되지</td><td></td>않음</tr><tr><td>ZetaSizer 소프트웨어</td><td>Malvern Panalytical</td><td>DTS 응용 프로그램</td><td>표면 전하 및 유체역학적 크기를 분석합니다.</td></tr></tbody></table>

mrna로 로드된 폴리(베타 아미노에스) 나노입자의 합성 및 특성화

Synthesis and Characterization of mRNA-Loaded Poly(Beta Aminoesters) Nanoparticles for Vaccination Purposes

예방 접종은 현대 사회의 주요 성공 중 하나이며 질병을 통제하고 예방하는 데 필수적입니다. 전통적인 백신은 전염하는 에이전트의 전체 또는 분수로 구성되었다. 그러나 과제는 남아 있으며 새로운 백신 기술은 필수입니다. 이러한 맥락에서, 예방 접종 목적을 위한 mRNA의 사용은 SARS-CoV-2 감염을 방지하는 2개의 mRNA 백신의 신속한 승인에 의해 입증된 바와 같이 향상된 성능을 보여주었습니다. 바이러스 감염 예방에 성공 하는 것 외에도 mRNA 백신 치료 암 응용 프로그램에 사용할 수 있습니다.
그럼에도 불구 하 고, mRNA의 불안정과 핵의 존재로 인해 신체에서 그것의 빠른 간격은 그것의 알몸 배달 불가능. 이러한 맥락에서, 나노 의약품 및 특히 중합체 나노 입자는 중요한 mRNA 전달 시스템입니다. 따라서, 본 문서의 목적은 독점적 중합체 나노입자에 기초하여 mRNA 백신 후보의 제형 및 시험을 위한 프로토콜을 기술하는 것이다. 폴리(베타 아미노에스) 폴리머의 합성 및 화학적 특성화, 나노입자를 형성하기 위한 mRNA와의 복합성, 및 이들의 구종화 방법론이 여기에서 논의될 것이다. 이는 스토리지 및 유통 비용을 줄이는 중요한 단계입니다. 마지막으로, 시험관 내 및 성숙한 모델 수지상 세포에 대한 능력을 입증하는 데 필요한 검사가 표시됩니다. 이 프로토콜은 이러한 백신이 다양한 질병을 예방하거나 치료할 수 있도록 하는 높은 다기능성 때문에 예방 접종에 종사하는 과학 계에 도움이 될 것입니다.

중합체 합성 및 특성화 OM-pBAE 합성 절차는 도 2에서주어진다. 도 2A에서 알 수 있듯이 OM-pBAE를 획득하는 첫 번째 단계는 아민(1-헥실라민 및 5-아미노-1-펜타놀, 비율 1:1)을 디아크릴레이트(1,4부티디올 디아크릴레이트)에 추가하여 C6-pBAE를 합성하는 것이다. 이 반응은 20 시간 동안 90 °C에서 수행되며 일정한 교반으로 수행됩니다. 그 후, 올리고펩타이드의 용액이 이전반응(도 2B)으로부터얻어진 C6 중합체의 용액에 첨가된다. 마지막으로, 합성은 20시간 연속 교반을 이용한 25°C에서 용매로서 DMSO를 이용하여 수행된다. 생성된 폴리머는 1H-NMR을 특징으로 합니다(보충 도S2참조). 특성화에서...

여기서, 폴리(베타 아미노에스) 폴리머를 기반으로 mRNA 나노입자를 제조하기 위한 간단한 프로토콜이 제시되고, 캡슐화된 mRNA를 변경하여 맞춤화되기 쉽다. 중합체, 나노입자 및 체외 필수 특성화를 합성하기 위한 워크플로우도 설명되어 있습니다. 예방 접종에 관한 개념 증명도 추가됩니다.

mRNA로 로드된 폴리(베타 아미노에스) 나노입자의 합성 및 특성화

Vaccination has been one of the major successes of modern society and is indispensable in controlling and preventing disease. Traditional vaccines were ...

이 프로토콜은 중합체 나노 입자를 제조하는 방법을 보여주기 때문에 중요하며, 하나의 간단한 단계에서 핵산을 캡슐화합니다. 이 기술의 주요 장점은 다른 핵산 및 세포 유형에 적용 될 수 있기 때문에 다재 다능합니다. 입자 제제를 위한 간단한 절차의 사용, 예를 들어 위아래로 파이펫팅, 그리고 lyophilization에 의한 나노입자 및 드럼 조건의 안정성을 확장할 수 있는 가능성.절차를 시연하는 것은 로라 올모, 산호 가르시아-페르난데스, 마리아 스탬파 로페즈-핀토, 마리아 나발론 로페즈, 우리 연구소의 박사 과정 학생, 마르타 디아즈 카바예로, 우리의 실험실에 대한 포스트 문서입니다. 폴리플렉스 형성을 위해, 이전에 준비된 폴리머, C6 펩티드, 폴리 베타 아미노 에스테르 및 용액을 해동한다. 폴리머 혼합물을 위아래로 배관한 후 아세테이트 나트륨으로 12.5 밀리머 용액을 준비합니다.용액을 소용돌이쳐 10 분 동안 기다립니다. 다음으로, 밀리리터 당 0.5 밀리그램에서 mRNA를 준비하고 파이펫팅에 의해 혼합한다. 폴리머 용액을 다시 소용돌이시키고, 마이크로 원심분리기 튜브에서 일대일 비율로 폴리머 용액의 유전 물질 용액을 혼합하고 Thermoblock에서 30분 동안 25도에서 튜브를 배양한다.배양 후 물을 포함하는 마이크로 원심분리기 튜브에 샘플을 추가하여 1-2 RNase 자유수분으로 혼합물을 침전한 다음, 부형제를 포함시키고, mRNA 및 폴리 베타 아미노 에스테르의 혼합물과 동일한 부피로 20 밀리머 힙과 4% 자당 용액을 첨가하고 파이프를 혼합하여 혼합한다. 1시간 동안 폴리플렉스 용액을 영하 80도에서 동결한 후, 1차 건조를 수행한 다음, 다시 수분을 피하기 위해 즉시 폴리플렉스를 영하 20도에 보관합니다. 폴리플렉스 리서스펜션의 경우, 영하 20도의 냉동고에서 리오필화된 나노 입자를 제거하고 고체를 재분산시키기 위해 상응하는 양의 깊은 수소화수를 빠르게 첨가하여 원하는 농도를 달성하였다.파이펫은 총 재서스펜션이 용해되고 일단 용해될 때까지 부드럽게 피펫을 위아래로 피피하여 거품을 피합니다. 형광 현미경에 의한 질적 평가를 위한 24시간의 전환 후, 전감염된 헬라 세포를 함유한 96개의 웰 플레이트를 현미경에 배치하고 10배 의 목표를 사용하여 시각화를 시작합니다. 먼저 화이트 밸런스를 적용하여 소프트웨어에 대한 배경 참조를 만든 다음 분석 중에 형광 이미지로 오버레이하는 이미지를 얻습니다.현미

synthesis-characterization-mrna-loaded-poly-beta-aminoesters

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이 비디오는 고분자 나노 입자를 사용하여 mRNA 백신 후보를 생성하는 방법을 보여줍니다. 양이온 고분자는 음전하를 띤 mRNA와 상호 작용하여 폴리플렉스를 형성합니다. 폴리플렉스의 형성은 mRNA를 안정화시켜 면역 치료 응용 분야에서 향후 mRNA 백신의 잠재적 후보가 됩니다.

백신 접종 목적을 위한 mRNA 로딩 나노입자 제형

nanoparticle 추적 분석 (NTA)와 고분자 유전자 전달 나노 입자를 평가하기 위해 높은 처리량 유동 세포 계측법에 대한 프로토콜이 설명되어 있습니다. NTA는 nanoparticle 입자 크기 분포와 플라스미드 당 입자 분포를 특성화하기 위해 사용됩니다. 높은 처리량 유동 세포 계측법은 유전자 전달 biomaterials의 라이브러리에 대한 양적 transfection 효율 평가를 할 수 있습니다.

고분자 유전자 배달에 대한 평가는 Nanoparticle 추적 분석 및 높은 처리량 유동 세포 계측법에 의해 나노 입자

나노 소재 기초 과학 및 변환 응용 프로그램에 대 한 제어 치료 납품의 다양 한 메커니즘을 제공 하지만 그들의 제조를 종종 가장 생물 의학 연구소에서 제공 하는 전문. 여기, 우리가 현재 확장 가능한 제조 및 플래시 nanoprecipitation를 사용 하 여 다양 한 자기 조립된 nanocarriers의 치료 로드에 대 한 프로토콜.

급속 하 고, 확장 가능한 어셈블리 및 플래시 Nanoprecipitation 통해 다양 한 합성 Nanocarriers에 생리 활성 단백질의 Immunostimulants 로드

여기 우리가 드라이 필름 방식에 기반 하 고 안전에 대 한 사용할 수 있습니다 양이온 nanoliposomes의 생성에 대 한 프로토콜을 설명 하 고 효율적인 전달 체 외에 문자 메신저 RNA.

체 외에서 의 효율적인 배달 양이온 Nanoliposomes의 세대 문자 메신저 RNA

백신 개발에 사용하기 위한 자가 조립 단백질 나노입자(SAPN)의 정제, 재접이식 및 특성화를 설명하는 상세한 방법이 여기에 제공된다.

삼중 에피토프 프리젠 테이션을 필요로하는 백신을위한 대장균- 발현 자가 조립 단백질 나노 입자의 생산

본 프로토콜은 외막 소포의 생명공학을 생산, 정제, 생체접합 및 특성화를 포함하는 "플러그 앤 디스플레이" 백신 플랫폼으로 설명합니다.

SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인을 표시하는 외막 소포를 기반으로 하는 "플러그 앤 디스플레이" 나노입자 백신 플랫폼

자체 조립된 펩타이드-폴록사민 나노입자(PP-sNp)는 미세유체 혼합 장치를 사용하여 개발 되어 시험관 내 전사된 메신저 RNA를 캡슐화하고 전달합니다. 기술된 mRNA/PP-sNip는 배양된 세포를 시험관내에서 효율적으로 형질감염시킬 수 있었다.

펩티드-폴록사민 나노입자를 사용하여 배양된 세포에서 시험관내 트랜스크립션된 mRNA의 효율적인 형질감염

여기에서는 비강 자가 조립 나노에멀젼 종양 백신의 시험 관 내 및 생체 내 비강 내 진단 및 평가를 위한 자세한 방법을 제시 합니다.

비강 자기조립 나노에멀젼 종양백신의 제조, 특성, 독성 및 효능 평가 In Vitro 및 In Vivo

이 방법은 광견병 항원을 미리 결정된 지연 후에 박동성 방출을 가능하게 하는 구조적 및 물질적 특성을 가진 생분해성 고분자 미세입자로 캡슐화하는 것을 설명합니다. 입자 코어에서 회수된 항원의 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 평가는 입자 제조를 통해 손상되지 않은 삼량체 광견병 바이러스 당단백질의 존재를 확인합니다.

광견병 항원을 캡슐화하는 박동성 고분자 미세입자의 제조

본 프로토콜은 새로운 나노에멀젼 보조제 백신의 물리적 특성, 면역 반응 및 생체 내 보호 효과를 준비하고 평가합니다.

메티실린 내성 황색포도상구균 (MRSA) 감염에 대한 나노에멀젼 보조제 백신의 면역 반응 평가

배우세요 poly(beta aminoester) 중합체를 사용하여 mRNA를 캡슐화하는 간단한 나노입자 제조 방법을. 이 다용도 기술은 다양한 핵산 및 세포 유형에 적용 가능하며, 동결건조를 통해 안정성을 확보할 수 있습니다.

mRNA로 로드된 폴리(베타 아미노에스) 나노입자의 합성 및 특성화

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