Name: 애기장염 씨앗의 표면 살균을 위한 높은 처리량, 견고하고 매우 시간 유연한 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-04T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: 배우세요 Arabidopsis thaliana 씨앗 표면 살균을 위한 고처리량 방법을. 진공 펌프와 흡입 장치를 활용하여 하루에 수백 개 샘플을 처리할 수 있어 기능적 게놈학 연구 효율성을 높입니다.

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이 연구는 폰다지오네 E. 마하의 에코게노믹스 그룹의 핵심 자금을 통해 트렌토 자치구에 의해 지원되었다.

1. 시약 및 미디어 준비
<ol><li>70% 에탄올 용액 준비: 737mL95% 기술 용탄올을 증류수 263mL에 추가합니다. 완전히 섞으세요. 참고: 멸균이 아닌 작업 벤치에 70% 에탄올 용액을 준비합니다. 주의: 에탄올은 인화성이 매우 높으며 눈에 심각한 자극을 일으킬 수 있습니다. 화염과 열원을 멀리하십시오. 눈과 접촉하는 경우 풍부한 물로 헹구는 다.</li>
	<li>5% 표백제 용액 준비: 가정용 표백제 5mL(비염염소산나트륨 3.5%, NaClO 포함)을 멸균 증류수 95mL에 추가합니다. 이온 세제(예: 트웬 20)를 몇 방울 떨어뜨리고 완전히 섞습니다. 참고: 라미나르 후드 내부에 표백제 용액을 5% 준비합니다. 주의: 표백제의 활성 성분인 염산화나트륨은 매우 자극적입니다. 그것은 매우 부식성이 며 위 장관에 심각한 손상을 일으킬 수 있습니다. 접촉의 경우, 풍부한 물로 즉시 헹구는 다. 섭취의 경우, 치료 조언을 위해 독극물 관리 센터 또는 의료 의사에게 전화하십시오.</li>
	<li>반강도 무라시게와 스쿠그(1/2 MS) 중간26을준비한다.<ol>
<li>MS 중간 분말 2.2 g(비타민 포함)과 800mL의 증류수에 자당 10g을 넣습니다. 1M KOH를 사용하여 용액의 pH를 조정하고 증류수를 사용하여 최대 1L의 부피를 가져옵니다. Aliquot 500 mL은 1 L 병에 넣고 4g의 천지를 추가하여 단단한 매체를 준비합니다. 솔루션을 자동 복제합니다.</li>
		<li>오토클레이브 후, 수조에서 중간 값을 50-53°C로 식히고 라미나르 플로우 후드 아래에 페트리 접시에 붓습니다. 선택적 매체를 제조하려면 50 mg /mL 카나마이신 재고 용액의 1000 μL /L을 추가하십시오 (10 mL의 가나마이신 황산 단수제 500 mg을 증류수 10mL에 혼합하고 필터 살균 및 저장 -20 °C)를 매체 (50-53 °C)에 넣습니다. 소용돌이에 잘 섞어서 페트리 요리에 부어 넣으세요.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 아스피레이터 설정
참고: 계측기 설정은 그림 1로요약되어 있습니다.
<ol><li>진공 펌프 입구를 적절한 크기의 폴리에틸렌(PE) 튜브의 한쪽 끝에 연결합니다. 튜브의 다른 쪽 끝을 디펜션 병의 양방향 뚜껑의 콘센트에 연결합니다. 튜브의 접합을 밀봉필름(재료 표)으로단단히 감싸서 밀폐 연결을 보장합니다.</li>
	<li>침엽수 병의 나사캡의 입구(병 안쪽으로 돌출된 구멍)에 두 번째 PE 튜브를 연결합니다. 튜브의 다른 면을 수족관 밸브의 콘센트에 맞춥니까. 필요한 경우 접합을 따라 밀봉 필름으로 포장하여 공기 누출을 제거하십시오.</li>
	<li>사용하기 직전에 멸균 200 μL 파이펫 팁을 라미나르 플로우 후드 아래 의 수족관 필터 입구에 맞춥시게 합니다.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62893/62893fig01.jpg"> 그림 1: 멸균 액체의 높은 처리량 제거를 위한 흡입 장치의 회로도. 명확성을 위해 단일 부품의 배율조정이 그려지지 않습니다. 편지(A)는진공 펌프,(B)액체(에탄올, 표백제 또는 멸균수)를 수집하는 저수지 병을 나타내며,(C)액체의 역류를 피하기 위한 밸브,(D)멸균 200 μL 파이펫 팁,(E)종자 및 멸균 액을 함유한 1.5mL 마이크로센트리슈지 튜브를 나타낸다. 화살표는 기류의 방향을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62893/62893fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
3. 씨앗의 높은 처리량 액체 표면 살균
참고: 96개의 독립적인 샘플을 가진 아라비도시스 탈리아나(L.) Heynh 야생형(Col-0) (아라비도시스) 종자의 표면 살균에 필요한 전체적인 절차 및 최소한의 시간은 도 2로요약된다.
<ol><li>프로그레시브 번호가 있는 48 x 1.5 mL 마이크로센심분리기 튜브의 영구 마커 2회 배치가 있는 라벨.</li>
	<li>96개의 멸균 1.5mL 마이크로센심분리기 튜브(튜브의 원추형 끝의 바닥 위 약 1-2mm)에 100-200개의 아라비도시스 씨앗을 추가합니다.</li>
	<li>알리코트 약 1000 μL의 70% 에탄올은 라미나르 플로우 후드(시드 배치 1, 48튜브) 내부의 10mL 멸균 서학적 파이펫을 사용하여 각 튜브에 넣고 뚜껑을 조심스럽게 닫습니다. 참고: 분배된 부피가 씨앗의 부피보다 몇 배 더 높은 한 솔루션을 분배하는 것이 매우 정확할 필요는 없습니다. 또는 라미나르 후드(비멸 상태)의 외부로 이 단계를 수행합니다.</li>
	<li>셰이커에서 적어도 3 분 동안 8.0 Hz의 진동 주파수에서 튜브를 흔들어주세요.</li>
	<li>셰이커에서 어댑터를 제거하고 벤치탑 마이크로센심분리기 의 바구니에 옮기습니다.</li>
	<li>펄스 기능(대부분의 벤치탑 원심분리기에 있음)을 사용하여 씨앗을 빠르게 회전하여 1880 x g(~15s)에 도달합니다. 참고: 더 긴 시간 또는 더 높은 원심 분리 력은 종자 발아에 부정적인 영향을 미칩니다.</li>
	<li>어댑터에서 하나의 랙으로 48 개의 튜브를 옮기고 라미나르 흐름 후드 아래에있는 모든 튜브를 엽니 다. 튜브에 끼어드는 뚜껑의 일부를 만지지 않음으로써 오염을 피하십시오. 뚜껑이 서로 너무 가까우면 튜브를 두 개의 랙으로 나누어 쉽게 처리하십시오.</li>
	<li>멸균 200 μL 노란색 팁을 라미나르 플로우 후드 아래에 수제 흡인기의 수족관 밸브 입구에 넣고 펌프를 켭춥시다.</li>
	<li>액체를 빨아 먹을 때 씨앗을 만지지 않도록 씨앗의 수준 바로 위에 노란색 팁을 삽입합니다. 또는, 신속하게 튜브의 바닥에 팁을 배치; 씨앗이 액체의 흡입을 차단하는 경우 노란색 팁을 제거하고 새 팁을 삽입합니다.</li>
	<li>각 튜브에 알리쿼트는 라미나르 플로우 후드 내부의 10mL 멸균 세로지컬 파이펫을 사용하여 표백제 의 약 1000 μL에 넣습니다.</li>
	<li>모든 뚜껑을 단단히 닫고 모든 튜브를 셰이커 어댑터에 다시 넣습니다. 셰이커에서 적어도 3 분 동안 8.0 Hz의 진동 주파수에서 튜브를 흔들어주세요.</li>
	<li>1880 x g(~15s)에 도달하는 데 필요한 시간 동안 벤치탑 원심분리기의 펄스 기능을 사용하여 씨앗을 빠르게 회전시합니다.</li>
	<li>새로운 멸균 200 μL 노란색 팁은 라미나르 유동 후드 아래의 진공 펌프에 연결된 수족관 밸브에 넣고 펌프를 켭춥시다.</li>
	<li>표백제 용액을 빨아 먹을 때 씨앗을 만지지 않도록 씨앗 의 수준 위에 노란색 팁을 삽입합니다.</li>
	<li>각 튜브에 알리쿼트가 10mL 멸균 혈청 을 사용하여 멸균 된 H2O의 약 1000 μL에 알리코트. 참고: 두 배치의 시드 를 결합하여 작동 시간을 최소화합니다.</li>
	<li>새로운 멸균 200 μL 노란색 팁을 라미나르 유동 후드 아래의 진공 펌프에 연결된 수족관 밸브에 넣고 펌프를 켭춥시다.</li>
	<li>H2O를 빨아 먹을 때 씨앗을 만지지 않도록 씨앗 의 수준 바로 위에 노란색 팁을 삽입합니다.</li>
	<li>10mL 멸균 세로지컬 파이펫을 사용하여 멸균 된 H2O의 약 500 μL 각 튜브에 알리쿼트가 라미나르 플로우 후드의 모든 뚜껑을 닫습니다. 씨앗은 파종 될 준비가되어 있습니다. 필요한 경우 튜브를 최대 몇 시간 동안 또는 하룻밤 동안 4 °C로 유지하십시오.</li>
	<li>액체를 적당량의 물로 채우고 자동 복제하는 데 사용되는 저수지 병을 채웁니다. 그 후 액체를 일반 싱크대에 버리십시오. 참고 : 저장소 내부의 모든 씨앗을 죽일 액체를 자동 클애브.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62893/62893fig02.jpg"> 그림 2: 96 개의 독립적 인 샘플로 아라비도시스 씨앗의 표면 살균에 필요한 절차 및 최소 시간의 개요. 제시된 실험에서 96개의 독립적인 샘플은 두 개의 동일한 크기의 배치로 처리됩니다. 전체 프로시저는 두 일괄 처리모두에 대해 동일하며 병렬로 처리되지만 배치 2는 일괄 처리에 비해 한 단계 지연으로 처리됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62893/62893fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
4. 1/2 MS 플레이트에 아라비도시스의 도금 및 점수
<ol><li>1000 μL 파이펫으로 부드러운 파이펫을 하여 멸균 H2O의 씨앗과 300-400 μL을 페트리 접시에 옮기습니다.</li>
	<li>10개의 튜브를 옮김한 후, 항생제 없이 녹은 1/2 MS 배지의 약 1.5-2.0mL 각 접시에 붓습니다. 참고: 사전에 녹인 다음 1/2 MS용 융매체를 50-53°C로 설정된 온도성 욕조에 보관하여 응고를 피하십시오. 씨앗의 발아성을 감소시키지 않도록 온도가 58 °C를 초과하지 않도록하십시오.</li>
	<li>접시를 빠르게 소용돌이에 넣고 씨앗을 안쪽으로 분배합니다. 플레이트를 반대편에 테이프로 고정합니다.</li>
	<li>접시를 플라스틱 또는 알루미늄 호일에 싸서 냉장고(4°C)에 넣고 어둠 속에서 3일 동안 넣어 균일한 발아를 얻습니다.</li>
	<li>100-120 μmol·m-2·s-1 및 60% 상대 습도의 가벼운 강도로 장일 조건(16h light/8h dark)에서 23°C로 설정된 성장 챔버로 플레이트를 옮깁니다.</li>
	<li>이틀 후, 복사의 존재에 의해 식물점수를 매는다. 씨앗 발아를 평가하기 위해 방사형 출현과 녹색 코틸레돈 형성 (두 코틸레돈의 전체 개방)을 감지합니다.</li>
</ol>5. 통계 분석
참고: 여기에서 Tukey의 쌍방향 테스트는 통계 분석에 사용되었습니다.
<ol><li>0.01 미만의 P 값을 통계적으로 유의한 것으로 간주합니다. 적어도 5개의 생물학적 복제로 모든 실험을 수행하십시오.</li>
</ol>

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<li>Singh, N., Gaddam, S. R., Singh, D., Trivedi, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+arsenic+stress+response+by+ethylene+biosynthesis+and+signaling+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+and+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Regulation of arsenic stress response by ethylene biosynthesis and signaling in Arabidopsis thaliana.</a> Environmental and Experimental Botany. 185, 104408(2021).</li>
<li>Lindsey, B. E., Rivero, L., Calhoun, C. S., Grotewold, E., Brkljacic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+method+for+high-throughput+sterilization+of+Arabidopsis+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JOVE%22%5BJournal%5D)">Standardized method for high-throughput sterilization of Arabidopsis seeds.</a> Journal of Visualized Experiments: JOVE. (128), e56587(2017).</li>
<li>Acemi, A., Özen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+in+vitro+asymbiotic+seed+germination+protocol+for+Serapias+vomeracea%5BTitle%5D)+AND+%22The+EuroBiotech+Journal%22%5BJournal%5D)">Optimization of in vitro asymbiotic seed germination protocol for Serapias vomeracea.</a> The EuroBiotech Journal. 3 (3), 143-151 (2019).</li>
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모든 저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

씨앗의 살균은 애기독증의 기능 적 연구를위한 기본 단계입니다. 그것은 자주 많은 다른 목적을 위해 수행 되지만, 애비도시스에서 높은 처리량 종자 표면 살균에 제한 된 연구를 사용할 수 있습니다.
지금까지, 가장 높은 처리량을 가진 방법 중 하나는 농축 된 HCl과 표백제혼합에 의해 생성 된 염소 가스를 사용하는 것입니다. 이 방법은 제한된 실습 시간을 필요로하지만, 그것은 인간에 매우 독성 가스를 사용(27). 또한 표면 멸균될 종자 수와 표면 종자 살균 지속 시간을 주의 깊게 제어해야 합니다. 씨앗이 너무 많은 경우, 염소 가스의 복용량완전히 종자 배치의 광범위한 오염의 결과로, 종자 코트에 존재하는 미생물을 죽일 충분하지 않을 것이다. 반면에 표면 살균 기간이 너무 길면 씨앗이 죽게 됩니다. 따라서, 몇 가지 장점에도 불구하고, 훈증은 애기독증에서 종자 표면 살균을위한 좋아하는 방법이 아니다.
<p class="jove_con...

아라비도시스는 브라시카세아 족에 속하는 디플로이드 식물 종입니다. 상대적으로 짧은 수명 주기(장시간 성장 조건 하에서 세대당 2개월), 작은 식물 크기, 식물당 수백 종의 종생산과 함께 자체 수분은 최초의 기초 식물 모델 종1,2를만들었습니다. 또한, 그 게놈은완전히 서열3, 광범위한 역유전학 도구(포화 T-DNA, 트랜스포손 및 화학적으로 돌연변이된 인구)를 사용할 수 있는4,5,6,효과적인 아그로박테리움-매개변환은 추가 하류 작업을 위한 충분한 형질전환선을 확보하기 에 잘 확립되어있다7 . 따라서, 지난 2년 동안, 자연, 유전적 및 현상변이를 포함한 분자 수준에서 식물 생물학의 다양한 측면을 해부하는 모델 종으로 애기독증을 사용하여 큰 발전을 이루었다8,9.
애기장염에 대한 관심 있는 유전자를 기능적으로 특성화하기 위해, 곰팡이 및 세균 오염 물질을 제거하기 위한 종자 표면 살균은 축균 배양을 요구하는 많은 다운스트림 프로토콜을 위한 전제 조건 단계이다. 과발현(RNA-I11)또는 녹아웃(12,13)유전자 기능, 세포외 국소화14,프로모터활동(15,16,단백질-단백질17 및 단백질-DNA 상호작용18)에대한 유전적 변형은 종자 표면 멸균 단계를 모두 필요로 한다. 따라서, 상대적 단순함에도 불구하고, 종자 표면 살균은 많은 기능 적 분석에서 근본적인 역할을한다.
지금까지, 종자 표면 살균 방법의 두 가지 주요 범주는 가스 또는 액체 상멸균(19)에기초하여 개발되었다. 가스상 종자 표면 살균의 처리량은 중간에서 높지만, 유해 시약 염소 가스를 표면 살균 제로로 사용하여 광범위한 적용을 방해하고 있습니다. 반대로 액체 상 살균을 기반으로 하는 방법은 표면 살균을 위해 에탄올 및 표백제 솔루션과 같은 온화한 화학 물질에 의존하며, 염소 훈증보다 본질적으로 낮은 처리량이 있음에도 불구하고 더 널리 사용됩니다. 일반적으로 액체 시약을 사용하는 두 가지 방법이 일반적으로 사용됩니다. 크게 사용되는 방법은20,21의다른 지속 시간 동안 다른 농도에서 에탄올과 표백제로 세척을 기반으로합니다. 또 다른 방법은 표백제만21,22의적용을기반으로 한다. 두 방법 모두 주로 소규모 종자 표면 살균을 위해 적용됩니다. 그러나, 많은 실험에서, 다른변형(24, 25)으로부터생성된 많은 형질대사를 병렬로 하나의변형(15,23) 또는 스크린에서 파생된 많은 애비독시스 형질대사를 스크리징할 필요가있다. 우리의 지식에, 높은 처리량 종자 표면 살균을 위한 액체 기지를 둔 방법이 간행되지 않았습니다, 이는, 거의 인식하더라도, 기능적인 유전체학 접근을 위한 중요한 병목 현상을 구성합니다. 따라서 종자 표면 살균을 위한 안전하고 견고하며 높은 처리량 방법을 개발하는 것은 한 번에 많은 유전자의 기능적 특성화의 성공을 향한 필요하고 중요한 단계이다.
이를 위해, 현재 연구에서는, 아라비도시스 씨앗의 표면 살균을 위한 향상된 방법이 제시된다. 이 방법은 안전하고 저렴한 비용, 고도로 견고하며 처리량이 높으며, 종자 표면 살균 초기부터 페트리 접시의 종자 파종 끝까지 1시간 이내에 96개의 독립적인 라인을 처리할 수 있습니다. 입증 된 방법은 진공 펌프, 소모품 유리 제품 및 플라스틱 제품과 같은 널리 사용되는 기본 실험실 계측에 의존합니다. 이 개선된 방법은 과학 계에 아라비도시스 및 기타 비모델 식물 종의 현대 기능 적 유전체학 접근법에 적합한 처리량으로 종자 표면 살균을 간소화하는 안전하고 간단하며 저렴한 접근 방식을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>수족관 밸브</td><td>Amazon</td><td>B074CYC5SD</td><td>키트에는 2개의 밸브와 얇은 벽 튜브가 포함되어 있습니다. 판막은 액체가 멸균 팁으로 되돌아가는 것을 방지합니다</td></tr><tr><td>애기장대 Col-0 야생형 종자</td><td>Nottingham Arabidopsis Stock Center</td><td>N1093</td><td>야생형 종자(카나마이신에 민감)</td></tr><tr><td>애기장대 형질전환 계통 AdoIspS-79 종자</td><td>NA</td><td>NA</td> 형<td>질전환 계통 Col-0 배경에서 형질전환된 Arundo donax의 이소프렌 합성효소 유전자를 과발현하고 카나마이신에 내성이 있는 형질전환 계통(Li et al. (2017) Mol. Biol. Evol., 34, 2583&ndash; 2599). 저자의 요청에 따라 사용 가능한</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>EP022628188</td><td>Benchtop microcentrifuge 씨앗을 회전시키는 데 사용되는 마이크로 원심분리기</td></tr><tr><td>Murashige & 비타민을 포함한 Skoog 배지</td><td>Duchefa</td><td>M0222</td><td>식물 멸균 배양</td></tr><tr><td>피펫 컨트롤러</td>용 표준 배지 <td>브랜드</td><td>26300</td><td>혈청학 피펫 작동에 사용</td></tr><tr><td>폴리에틸렌 튜브 1</td><td>Roth</td><td>9591.1</td><td>진공 펌프에서 디캔테이션 병까지 연결용 튜브(내경: 7mm, 외경: 9mm)</td></tr><tr><td>폴리에틸렌 튜브 2</td><td>Roth</td><td>9587.1</td><td>디캔테이션 병에서 수족관 밸브까지 연결하기 위한 튜브&nbsp; (내경: 5mm, 외경: 7mm)</td></tr><tr><td>커넥터가 있는 나사 캡</td>: <td>Roth</td><td>PY86.1</td><td>2-way 디스펜서, 디캔팅 병용 폴리프로필렌 스크류 캡 GL45</td></tr>, <tr><td>혈청학 피펫</td>, <td>브랜드</td><td>27823</td>, <td>눈금이 매겨진 유리(재사용 가능) 혈청학 피펫. 일회용 피펫을 대신 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>.</td><td>Qiagen</td><td>85300</td><td>TissueLyser II 비드 밀은 조직 균질화에 일반적으로 사용됩니다. 튜브에 구슬을 추가하지 않고도 셰이커로 작동합니다.</td></tr><tr><td>기술 에탄올</td><td>ITW 시약 (Nova Chimica Srl)</td><td>212800</td><td>에탄올 96% v/v 부분적으로 변성 기술 등급</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Merck Millipore</td><td>655205</td><td>계면활성제 역할을 하는 비이온 세제</td></tr><tr><td>범용 튜빙 커넥터</td><td>Roth</td><td>Y523.1</td><td>튜빙 연결을 개선/단순화하는 데 사용할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>진공 펌프</td><td>Merck Millipore</td><td>WP6222050</td><td>사용됩니다. 흡입 장치 만들기</td></tr></tbody></table>

애기장염 씨앗의 표면 살균을 위한 높은 처리량, 견고하고 매우 시간 유연한 방법

High-throughput, Robust and Highly Time-flexible Method for Surface Sterilization of Arabidopsis Seeds

애기장염은 지금까지 기능 연구에 가장 널리 사용되는 식물 모델 종입니다. 아라비도시스 씨앗의 표면 살균은 이 쪽으로 요구되는 근본적인 단계입니다. 따라서, 고처리량 인 애비도시스 종자 표면 살균 방법을 한 번에 수십~수백 개의 시료(예: 트랜스제닉 라인, 에코타입 또는 돌연변이)를 처리하는 것이 가장 중요하다. 일반적인 진공 펌프로 구성된 수제 흡입 장치로 튜브에서 액체를 효율적으로 제거하는 종자 표면 살균 방법이 이 연구에서 제시된다. 하루에 수백 개의 샘플을 처리하는 이 방법으로 노동 집약적인 실습 시간을 획기적으로 줄임으로써 약간의 노력으로 가능합니다. 시리즈 타임코스 분석은 높은 발아율을 유지함으로써 표면 멸균의 매우 유연한 시간 범위를 더욱 나타내냈습니다. 이 방법은 종자 크기에 따라 흡입 장치의 간단한 사용자 정의와 작은 씨앗의 다른 종류의 표면 살균에 쉽게 적응 할 수있다, 액체를 제거하기 위해 원하는 속도.

전체 종자 살균 절차에 필요한 시간을 평가하기 위해, 현재 프로토콜에서 96개의 시료를 처리하는 액체 처리시 시간 차이를 계산하고 기존의 파이펫팅 방법과 비교하였다. 결과는 현재 프로토콜이 시간을 절약하여 기존의 프로토콜(표 1)을 사용하여 액체 처리 시간을 4분의1로줄임을 나타냅니다. 이 표는 현재 프로토콜의 액체 제거 시간이 기존 방법보다 더 많은 시간을 절약하고 전체 8배 감소로 더 많은 시간을 절약한다는 것을 강조합니다.
종자 살균을 위한 시간 범위 선택 더 긴 살균 단계는 오염 율을 최소화하지만 종자 발아에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 오염 없이 가장 높은 발아율로 종자 살균을 위한 최적 시간 범위를 결정하기 위하여는, 각 살균 단계의 다른 기간이 시험되었습니다, 종자 발아 및 녹색 cotyledon 출현 비율을 둘 다 평가했습니다. 2일부터 4일째까지 수행된 발아 분석은 7일째에 10분에서 40분...

아라비도프스탈리아나(Arabidopsis) 종자의 표면 살균을 위한 고처리량 프로토콜이 제공되어 진공 펌프로 구성된 간단한 흡입 장치로 액체 처리 단계를 최적화합니다. 수백 개의 종자 시료는 하루에 표면 살균될 수 있습니다.

Arabidopsis is by far the plant model species most widely used for functional studies. The surface sterilization of Arabidopsis seeds is a fundamental ...

이 프로토콜은 종자 표면 살균을 향상, 모델 종 애비도프시탈리아나의 기능 적유학의 기본 단계. 이 기술의 주요 장점은 하루 수백 개의 샘플을 처리 할 수 있도록 쉽고 높은 처리량입니다. 몇 가지 간단한 수정을 통해 이 방법은 다른 많은 모델 및 비모델 식물 종에 적용할 수 있습니다.처음 이용자의 경우, 종자 생존에 모두 중요하기 때문에 매체의 온도와 원심분리 속도에 주의를 기울이십시오. 시작하려면, 증류수에 95%의 기술 에탄올을 추가하고 철저히 혼합하여 70%에탄올을 준비하십시오. 다음으로, 멸균 증류수 95밀리리터에 가정용 표백제 5밀리리터를 추가하여 5% 표백제 용액을 준비합니다.그런 다음, 표백제 용액에 몇 방울의 니오니언 세제를 넣고 철저히 섞습니다. 다음으로, 비타민을 포함한 MS 중간 분말 2.2그램과 증류수 800밀리리터에 자당 10그램을 첨가하여 반강도 무라시게와 스쿠오그 배지를 준비합니다. 수산화 물화 칼륨 1개를 사용하여 매체의 pH를 5.7로 조정한 다음 증류수를 사용하여 최대 1리터까지 부피를 가져옵니다.Aliquot 500 밀리리터 의 배지 를 1 리터 병에 넣고 4 그램의 천을 추가하여 단단한 매체를 준비합니다. 오토클레이브 후, 매체가 수조에서 섭씨 50~53도까지 식힙니다. 그런 다음 라미나르 플로우 후드 아래에 페트리 접시에 붓습니다.선택적 매체를 준비하려면, 카나마이신을 매체에 넣고, 앞에서 설명한 대로 페트리 접시에 붓습니다. 흡혈구를 설정하려면 진공 펌프 입구를 적절한 크기의 폴리에틸렌 튜브의 한쪽 끝에 연결합니다. 그런 다음 튜브의 다른 쪽 끝을 디펜션 병의 양방향 뚜껑의 출구에 연결합니다.튜브의 접합을 밀봉 필름으로 단단히 감싸서 밀폐 된 연결을 보장합니다. 다음으로, 두 번째 폴리에틸렌 튜브를 디펜션 병의 나사 캡 입구에 연결합니다. 그런 다음 튜브의 반대편을 얇은 폴리에틸렌 튜브가 장착된 수족관 밸브의 출구에 연결합니다.필요한 경우 접합을 밀봉 필름과 싸서 공기 누출을 제거합니다. 48 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브의 두 배치를 점진적 인 숫자로 표시 한 후, 튜브의 원추형 끝의 바닥보다 약 1 ~ 2 밀리미터 높은 96 멸균 미세 원심 분리 튜브각각에 100 ~ 200 개의 아라비도시스 씨앗을 추가하십시오. 다음으로, 10 밀리리터 멸균 세알리테스 파이펫을 사용하여 각 튜브에 70%에탄올의 약 1밀리리터를 추가하고 뚜껑을 조심스럽게 닫습니다.쉐이커에서 3분 동안 8헤르츠의 진동 주파수에서 튜브를 흔들어 주세요. 그런 다음 셰이커에서 어댑터를 제거하고 펄스 기능을 사용하여 씨앗을 회전하기 위해 벤치탑 미세 원심 분리기바구니로 옮겨넣습니다. 튜브를 랙으로 옮은 후 라미나르 플로우 후드 아래에 있는 모든 튜브를 엽니다.오염을 피하기 위해 튜브에 장착 된 뚜껑의 부분을 만지지 마십시오. 그런 다음 라미나르 플로우 후드 아래에 멸균 200 마이크로리터 옐로우 팁에 수제 흡기의 수족관 밸브 입구에 넣고 펌프를 켭춥시다. 액체를 빨아 먹을 때 씨앗을 만지지 않도록 씨앗의 수준 바로 위에 팁을 삽입합니다.다음으로, 10 밀리리터 멸균 세로지컬 파이펫을 사용하여 각 튜브에 5%의 표백제 용액을 1밀리리터를 알리쿼트합니다. 튜브를 셰이커 어댑터에 다시 넣기 전에 뚜껑을 닫은 다음 이전에 설명한 대로 튜브를 흔들어 줍니다. 벤치탑 원심분리기의 펄스 기능을 사용하여 씨앗을 회전한 후, 새로운 멸균 200 마이크로리터 옐로우 팁에 수족관 밸브에 넣고 펌프를 켭분드합니다.표백제 용액을 빨아 먹을 때 씨앗을 만지지 않도록 씨앗 의 수준 위에 팁을 삽입합니다. 다음으로, 10 밀리리터 멸균 세로지컬 파이펫을 사용하여 각 튜브에 멸균 된 물의 1 밀리리터를 알리쿼트합니다. 새로운 멸균 200 마이크로 리터 노란색 팁을 수족관 밸브에 장착 한 후 펌프를 켭채를 켭타보시면 됩니다.물을 빨아 먹을 때 씨앗을 만지지 않도록 씨앗의 수준 바로 위에 팁을 삽입합니다. 마지막으로, 각 튜브에 멸균 된 물의 500 마이크로 리터를 알리 쿼트하고 라미나르 흐름 후드의 모든 뚜껑을 닫습니다. 씨앗은 이제 파종 될 준비가되어 있습니다.필요한 경우, 튜브를 실온에서 최대 몇 시간 또는 하룻밤 사이에 섭씨 4도까지 유지하십시오. 1밀리리터 파이펫을 사용하여 300~400마이크로리터의 멸균물을 페트리 접시에 옮겨 씨앗을 옮킨다. 10개의 튜브를 옮긴 후, 각 플레이트에 항생제 없이 녹은 반강도 무라시게와 스쿠그 배지의 1.5~2밀리리터를 붓습니다.접시를 빠르게 소용돌이쳐 씨앗을 분배하고, 접시를 반대편에 테이프로 고정시십시오. 접시를 플라스틱 또는 알루미늄 호일에 싸서 3일 동안 냉장고에 넣고 균일한 발아를 얻습니다. 발아 분석은 2일, 3일, 4일, 7일에 수행된 70%에탄올을 사용하여 살균 시간의 10~40분 사이에 큰 차이를 나타내지 않았습니다.그러나 살균 시간이 40분을 초과했을 때 발아율은 감소했습니다. 이에 따라 그린 코틸레던 출현률도 감소했다. 연구에 기초하여, 70%에탄올을 위한 3분 및 5%표백제3분은 씨앗을 살균하는 최소 시간으로 선택되었다.원래 사용된 씨앗이 미생물로 오염되었다는 것을 보여주기 위해 비멸 성 씨앗은 접시에 직접 파종되었습니다. 멸균 씨앗에 비해, 비 멸균 씨앗은 7 일 발아 후 접시 전체에 확산 이틀 후 곰팡이 모양을 보였다. 서로 다른 종자 샘플을 처리하기 위해 단일 멸균 파이펫 팁을 사용하여 수행된 교차 오염 분석은 콜롬비아-0 유전자형 씨앗에서 카나마이신이 있는 판에 파종된 녹색 코틸레톤이 관찰되지 않은 것으로 나타났다.이와 동시에, 컬럼비아-0 씨앗은 카나마이신이 없는 접시에 파종되어 발아 후 모든 코틸레톤이 녹색으로 나타났습니다. 이러한 결과는 단일 파이펫 팁을 사용하여 멸균 용액을 제거했음에도 불구하고 샘플 간의 오염이 이월되지 않는다는 것을 나타냅니다. 이 절차는 유전자 과발현, 게놈 편집, 세포외 국소화, 프로모터 활동 및 단백질 단백질 및 단백질-DNA 상호 작용과 같은 많은 다른 기능성 유전체학 방법의 기초입니다.

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Research

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