황 색포도상구균 내산화 및 항균 화합물의 세포 내성 효능을 연구하는 향상된 효소 보호 분석
2021년 9월 8일
이 프로토콜은 황색포도상구 균 의 내재화의 범위와 인간 숙주 세포 내부에서 살아남을 수있는 능력뿐만 아니라 항균 화합물의 세포 내 효능을 연구하는 방법을 설명하는 것을 목표로합니다.
효소 보호 분석은 포도상 구레나귀 내재화의 정도와 부착 세포 내부에서 살아남을 수있는 능력뿐만 아니라 항균 화합물의 효능을 연구 할 수 있게합니다. 개선된 효소 보호 분석은 기술적 취급을 크게 단순화하고, 현탁액에 있는 약하게 부착된 세포 및 세포에서 내재된 박테리아를 복구할 수 있게 합니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 Josselin Rigaill, 의사 및 박사 과정 학생이 될 것입니다.
감염 분석 이틀 전, 종자 A549 상피 세포는 24웰 플레이트당 밀리리터 당 5세포당 2.0배 10배, 세포를 5%의 이산화탄소로 섭씨 36도에서 48시간 동안 배양하여 100%의 인플루언서에 도달할 때까지 세포를 배양한다. 분석 당일, A549 세포를 계수하기 위한 3개의 우물에서 소비된 배양 배지를 제거하고 폐기하고, Hoechst 33342의 밀리리터 당 5 마이크로그램을 포함하는 완전한 감염 배지의 1밀리리터와 프로피듐 요오드의 밀리리터당 1마이크로그램을 첨가한다. 세포를 30분 동안 배양한 다음, 광야 형광 현미경을 사용하여 세포 수를 계산하고 세포 생존가능성을 계산합니다.
세균 현탁액을 준비하려면 튜브에 완전한 감염 배지25 밀리리터를 분배하고 섭씨 36도에서 예동하십시오. 다음으로, 세포 밀도 계를 이용하여 완전한 감염 배지에서 0.5의 OD로 황색포도상구균 현탁액을 조정한 다음, 완전한 감염 배지에서 배양을 희석시켜 세포 접종을 위한 세균현탁액의 20밀리리터를 준비하여 양산한 세포의 수에 따라 하나의 MOI를 달성한다. 다음으로, 자동 나선형 플래터를 사용하여, 세포 접종 단계에 사용되는 희석된 세균 현탁액의 황색포도상구균 하중을 결정하고, 36°C에서 18~24시간 동안 천고판을 배양한다.
다음 날, 콜로니 카운터가 있는 콜로니 수를 계산하여 테스트된 각 변형에 대한 정확한 MOI를 계산합니다. 세포 접종 전에, 낮은 배율 현미경 검사법에 의해 24웰 플레이트의 모든 우물을 관찰하여 세포가 건강하고 예상대로 자라도록 한 다음, 24웰 플레이트에서 소비된 세포 배양 배지를 제거하고 폐기하고 100% 컨캔트 세포를 함유하는 각 웰에 세균현탁액의 500마이크로리터를 첨가한다. 5%의 이산화탄소에서 섭씨 36도에서 2시간 동안 세포를 배양합니다.
향상된 효소 보호 분석으로 세포내 세균을 정량화하려면 텍스트 원고에 언급된 대로 작업 용액에서 4배 용해 완충제, 2%트리톤 X-100, 트립신-EDTA 및 리조스타핀 스톡을 준비한다. 다음으로, 리소스타핀 작업 용액의 250 마이크로리터에 완전한 감염 배지의 6밀리리터를 추가하여 리소스타핀으로 보충된 완전한 감염 배지의 6.25 밀리리터를 준비한다. 그런 다음 리조스타핀으로 보충된 전체 감염 배지의 250마이크로리터를 각 우물에 넣고 손으로 접시를 휘저어 부드럽게 접시를 교반합니다.
리소스타핀이 세포외 박테리아를 죽일 수 있도록 하려면, 세포가 이산화탄소 5%에서 섭씨 36도에서 1시간 동안 배양한 다음, 밀리리터당 20 마이크로그램에 단백질라제 K 10마이크로리터를 추가하고 실온에서 2분 동안 세포를 배양하여 리조스타핀을 비활성화합니다. 다음으로, 4x 리시스 버퍼250마이크로리터를 추가하여 삼투성 쇼크에 의해 세포를 용해시키고, 섭씨 36도에서 10분 동안 세포를 배양한다. 인큐베이션 후, 파이펫 세포는 세포가 완전히 lysed 및 균질화되도록 여러 번 lysate, 다음 각 우물의 황색 포도상 구균 하중을 결정하고 36 섭씨에서 18 ~ 24 시간 동안 천어 플레이트를 배양하기 위해 자동 나선형 플래터를 사용합니다.
다음 날, 각 우물의 세포내 황색포도상구균 부하를 계산하기 위해 식민지 카운터와 식민지의 수를 계산합니다. A549 상피 세포에 의한 황색포도상구균 의 2개의 긴장의 내산화는 여기에서 묘사됩니다. 리소스타핀을 제거하기 위한 세하를 포함하는 효소 보호 분석서를 사용하여, 평균 세포내 하중은 각각 fnbA 및 B 유전자가 결여된 SF8300 야생형 및 동위원소 돌연변이제에 대한 밀리리터당 4.46 및 0.49 로그 차르였다.
리조스타핀을 비활성화하기 위해 단백질효소 K를 사용하는 개선된 효소 보호 분석체를 사용하여, 하중은 밀리리터당 각각 4.53 및 0.56 로그 차푸였다. 효소 보호 분석체를 사용하여 측정된 황색포도상구균에 대한 반코미신, 리팜피신 및 레보플로록사신의 세포내 활성이 여기에 묘사된다. 평균 세포 내 하중은 제어를위한 밀리리터 당 4.57 로그 cfu, 밴코미신4.51, 리팜피신의 경우 3.03, 레보플로록사신의 경우 2.91개였습니다.
효소를 제거하기 위한 집중적인 세차하는 경향이 가장 감염된 세포를 분리하는 경향이 있으며, 이는 부정확한 결과를 제공하고 개선된 프로토콜의 사용을 지원할 수 있다. 개선된 효소 보호 분석으로 포도구균 내산화를 쉽게 연구할 수 있으며, 퍼팅으로 사용되는 고함량 스크리닝 시스템에 쉽게 적응할 수 있습니다.
개요
본 연구는 인간 숙주 세포 내로의 Staphylococcus aureus 내입 과정과 해당 세포 내에서의 생존 기전을 이해하는 데 중점을 둡니다. 또한, 강화된 효소 보호 분석법을 사용하여 이 박테리아에 대한 다양한 항균 화합물의 효능을 평가합니다.
주요 연구 구성 요소
연구 분야
- 미생물 병원성
- 항균 반응
- 세포 내 섭취 역학
배경
- Staphylococcus aureus는 숙주 세포 내에서 생존하는 능력으로 인해 상당한 임상적 난제를 야기합니다.
- 이 박테리아의 세포 내 유입 기전을 이해하는 것은 감염에 대한 치료 전략을 수립하는 데 도움이 될 수 있습니다.
- 기존의 방법들은 박테리아의 세포 내 유입 정도를 정확하게 정량화하는 데 한계가 있을 수 있습니다.
사용된 방법
- 세균 내부화 연구를 위한 개선된 효소 보호 분석법
- 숙주 세포 모델로서의 A549 상피 세포
- 형광 현미경 검사, lysostaphin 처리 및 콜로니 계수법
주요 결과
- 개선된 분석법을 사용하여 Staphylococcus aureus의 평균 세포 내 부하량을 유의미하게 정량화하였습니다.
- 항균 화합물의 효능은 다양하게 나타났으며, vancomycin이 더 높은 세포 내 활성을 보였습니다.
- 수정된 프로토콜을 통해 박테리아의 세포 내 유입을 더 정확하게 측정할 수 있었습니다.
결론
- 본 연구는 호스트 세포 내에서 Staphylococcus aureus의 생존량을 정량화하는 효과적인 방법을 제시합니다.
- 이 연구는 세균성 감염에 대한 치료 전략을 개발하는 데 필수적인 통찰력을 제공합니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
세포 내 세균 부하를 정확하게 정량화하는 것은 전통적인 분석법이 병원체의 지속성을 과소평가할 수 있는 비전문 포식 세포에서 항균 효능을 평가하는 데 매우 중요합니다. 개선된 효소 보호 분석법은 부착력이 약하거나 부유 상태인 세포로부터 내부화된 세균을 회수할 때 발생하는 기술적 한계를 해결하여, 초기 단계의 항균제 스크리닝 신뢰도를 높여줍니다. 이는 세포 내 Staphylococcus aureus에 대한 화합물 활성을 일관되게 측정할 수 있게 함으로써 기전적 리스크 감소(de-risking)를 지원하고, 선도 물질 최적화 결정을 위한 정보를 제공합니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 표적 검증
- 과학적 가치: 내재화 및 세포 내 생존에 대한 병원성 인자의 기여도를 조사할 수 있게 하여, 항감염 전략을 위한 표적 검증을 지원합니다.
- 운영적 가치: 동종 균주를 비교할 수 있는 재현 가능한 방법을 제공하여, 병원체 지속성의 유전적 결정 요인을 명확히 합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 과학적 가치: 세포 내로 유입된 Staphylococcus aureus에 대한 화합물의 효능을 평가하기 위해 정량적인 세포 내 CFU 판독값을 생성합니다.
- 운영적 가치: 세포 박리를 유발하는 세척 단계를 제거하여 오가노이드를 포함한 부착 및 부유 모델에서 분석의 견고성을 향상시킵니다.
- 과학적 가치: 용해 및 회수 단계를 단순화하여 고함량 스크리닝 적용을 용이하게 하며, 항균 프로파일링의 처리량을 높입니다.
중개 및 전임상 연구
- 과학적 가치: 부착성 비전문 식세포 및 세포 내 틈새(niche)를 모사한 3D 오가노이드 시스템을 활용하여 질병 관련 모델링을 지원합니다.
- 운영적 가치: 표준화된 세포 내 세균 부하 지표를 제공함으로써 히트 물질 발굴부터 전임상 평가까지의 연속성을 가능하게 합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
본 분석법은 표현형 스크리닝을 통한 표적 검증부터 전임상 효능 평가까지를 연결하며, 세포 내 병원체 부하를 핵심 약력학적 종점으로 정량화함으로써 항균제 발굴 연속 과정에 부합합니다.
- 발견 생물학: 제어된 MOI 및 lysostaphin 보호 단계를 통해 숙주-병원체 상호작용과 병원성 기전에 대한 가설 검증을 지원합니다.
- 스크리닝: 재현 가능하고 정량적인 세포 내 CFU 측정을 제공하여 다양한 조건에서 항균 화합물을 비교할 수 있게 합니다.
- 분석: log CFU/mL 판독값을 생성하여 팀이 화합물의 세포 내 활성 순위를 매기고 시간-사멸(time-kill) 또는 감염 후 치료 효과를 평가할 수 있도록 합니다.
- 중개 연구: 일차 세포 및 오가노이드 모델에 적용 가능한 전이 가능한 세포 내 효능 지표를 제공함으로써 전임상 워크플로와 연결합니다.
- 기업적 재사용: Staphylococcus aureus 외에도 여러 병원체와 세포 유형에 적용 가능한 재사용 가능한 세포 내 감염 플랫폼을 구축합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 세포 외 효과와 세포 내 효과를 구분함으로써 항균 작용의 기전적 모호성을 줄입니다.
- 운영적 가치: 세포 내 박테리아 회수 과정을 표준화하여 처리 중 세포 손실로 인한 변동성을 최소화합니다.
- 전략적 가치: 실제 세포 내 활성을 가진 화합물을 밝혀내어 go/no-go 결정의 정확도를 높이고, 후기 단계의 실패 위험을 줄입니다.
- 포트폴리오 영향: 세포 내 효능 데이터를 기반으로 리드 물질의 위험 조정 우선순위 지정을 가능하게 하여, 항감염제 프로그램의 자본 효율성을 향상시킵니다.
실행 시 고려 사항
- 세포 배양, 감염 다중도(MOI) 계산, 그리고 혐기성 또는 통성 혐기성 병원체 취급에 관한 전문 지식이 필요합니다.
- 정확한 CFU 정량을 위해 lysostaphin, proteinase K, 용해 버퍼 및 spiral plater의 사용 가능 여부에 따라 결과가 달라집니다.
- 실험실 간 MOI, lysostaphin 노출 시간 및 불활성화 프로토콜의 표준화가 필수적입니다.
- 1차 세포 또는 3D 모델에 적용할 경우 lysostaphin의 침투 및 용해 조건에 대한 최적화가 필요할 수 있습니다.
- 실질적 제한 사항: 분석 시간이 24시간을 초과하여 초고속 대량 스크리닝(ultra-high-throughput screening) 캠페인 수행에 제약이 있을 수 있습니다.
바이오제약 FAQ
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:41
Determination of Cell Density and Viability
1:33
Preparation of the Bacterial Suspension
2:32
Cell Inoculation
3:03
Quantification of Intracellular Bacteria with Improved Enzyme Protection Assay (iEPA)
4:44
Results: Intracellular Staphylococcus aureus Load in Epithelial Cells
5:54
Conclusion
