Name: 마우스 섬유아세포를 멜라노세포로 직접 재프로그래밍 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: 배우세요 마우스 섬유아세포를 Mitf, Sox10, PAX3 전사인자를 사용하여 멜라노세포로 직접 재프로그래밍하는 최적화된 방법을. 이 기술은 재프로그래밍 효율성과 안정성을 높여 백반증과 같은 탈색 질환 치료에 활용됩니다.

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이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (82070638 및 81770621)과 장쑤성 자연 과학 재단 (BK20180281)의 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다.

이 작업은 강소 대학 (UJS-IACUC-AP--20190305010)의 실험실 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 실험은 실험실 동물 관리 국제 평가 및 인증 협회 (AAALAC International)에 의해 설립 된 표준을 엄격히 준수하여 수행되었습니다. 인간과 관련된 실험은 없었기 때문에이 작업은 인간 연구 윤리위원회의 승인이 필요하지 않았습니다. 시약에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
1. 전사인자를 위한 농축된 렌티바이러스 패키징 시스템 구축
<ol><li>농축된 바이러스의 생산(도 1A, B)<ol>
<li>플레이트 1.5 × 106 HEK-293T 세포를 60 mm 디쉬에 넣고 이들 세포를 5%CO2가 있는 가습 배양기에서 37°C에서 정상 배지(표 1 참조)로 배양하였다. 참고: 바이러스를 일괄적으로 포장해야 하는 경우 100mm 세포 배양 접시를 사용할 수 있습니다(자세한 내용은 표 2 참조).</li>
		<li>24시간 후, HEK-293T 세포가 형질도입 당일에 80-90% 합류에 도달했는지 확인하고, 배지를 3.5 mL의 DMEM (1cm2 당 150 μL의 DMEM)으로 교체하였다. 세포를 37°C에서 2시간 동안 5%CO2 가 있는 가습된 인큐베이터에 방치한다. 참고: 대체 배지는 혈청이 없어야 더 나은 플라스미드 형질감염을 위해 세포가 "굶주리는" 상태가 될 수 있습니다.</li>
		<li>Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9, 또는 Snai2의 표적 플라스미드 3 μg을 함유하는 플라스미드 (믹스 A)의 혼합물을 제조하고; 1 μg의 패키징 플라스미드 PMD2. G, 및 2 μg의 패키징 플라스미드 PSPAX2. 혼합물 A의 부피를 무혈청 DMEM으로 150 μL로 구성한다. 트랜스펙션 시약 12 μL(부피는 모든 플라스미드의 총 질량의 두 배임)를 첨가하여 트랜스펙션 시약(믹스 B)의 믹스를 준비하고, 무혈청 DMEM으로 믹스 B의 부피를 150 μL로 구성한다. 참고 : 믹스를 준비 할 때 기포를 피하기 위해 천천히 액체를 첨가하는 것이 중요합니다.</li>
		<li>믹스 A와 믹스 B를 섞어서 실온에서 5 분 동안 방치하십시오. 혼합물을 실온에서 20-30분 동안 인큐베이션하여 형질감염 복합체를 형성하였다.</li>
		<li>HEK-293T 세포를 인큐베이터에서 꺼내어 배지를 DMEM + 2% FBS로 교체하고 1.1.4 단계의 혼합물을 적가하고 부드럽게 혼합한다.</li>
		<li>8시간 후, 배지를 3.5 mL의 정상 배지로 변경한다. 배지를 변경한 후, 24 h 및 48 h마다 바이러스 상청액을 수집한다.</li>
		<li>두 개의 서로 다른 시점에서 수집된 바이러스 상청액을 혼합한다. 200 × g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리한다. 상청액을 0.45 μm 필터를 통과시키고 50 mL 멸균 원뿔형 튜브에 수집한다. 참고: 24 h에서 수집 된 바이러스는 4 °C에서 저장하고 48 h에서 수집 된 바이러스와 혼합 할 수 있습니다.</li>
		<li>바이러스 상청액을 4°C에서 6000 × g 에서 하룻밤(∼16 h)으로 원심분리하여 농축하였다. 원심분리 후 원뿔형 튜브 바닥에 바이러스 펠렛이 보이는지 확인하십시오.</li>
		<li>상층액을 천천히 붓는다. 바이러스 펠렛을 바이러스 상청액의 부피의 1/100번째 인 정상 배지의 부피에 용해시킨다. P1000 마이크로피펫을 사용하여, 균질한 혼합물이 얻어질 때까지 부드럽게 위아래로 피펫을 한다. 농축 된 바이러스를 필요에 따라 마이크로 원심분리 튜브로 나눕니다. -80 °C에서 보관하십시오. 참고 : 바이러스는이 방법으로 100x로 집중됩니다. 농축된 바이러스(100x)는 -80°C에서 >1년 동안 저장될 수 있다. 바이러스의 반복적 인 동결 및 해동을 피하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>농축된 바이러스 역가의 검출 (도 1C)<ol>
<li>플레이트 1 × 105개의 HEK-293T 세포를 6-웰 플레이트의 하나의 웰로 만들었다. 부정적인 컨트롤로 하나를 추가하는 것을 잊지 마십시오. 이들 세포를 5%CO2가 있는 가습된 인큐베이터에서 37°C에서 정상 배지로 배양한다.</li>
		<li>24시간 후에 0.1μL 또는 0.2μL의 형광 농축 바이러스(100x)를 각 웰에 첨가하고, 양이온성 고분자 형질감염 시약 4ng/μL를 각 웰에 첨가한다. 감염 후 약 8-12 시간 후에 배지를 정상 배지로 교체하십시오. 참고: 형광 검출의 정확성과 효율성을 보장하려면 감염률이 10-30%여야 합니다. 형광 농축된 바이러스의 0.1 μL 또는 0.2 μL를 첨가하면 이 범위 내에서 감염 효율을 유지할 수 있다. 농축된 바이러스 역가는 적어도 1 × 10,8 형질도입 단위 (TU)/mL에 도달할 수 있다.</li>
		<li>감염 후 대략 48시간 후, 1 mL의 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)로 접시를 세척하여 죽은 세포를 제거하였다.</li>
		<li>이들 세포를 실온에서 1분 동안 6-웰 플레이트에서 웰 당 0.05% 트립신-EDTA의 250 μL를 사용하여 트립신화한다. 200 × g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리한 다음, 상층액을 제거하였다.</li>
		<li>세포 펠릿을 PBS 1 mL에 재현탁시키고, 현탁액을 5 mL 폴리스티렌 둥근바닥 튜브에 첨가하고, 유세포 분석기를 사용하여 바이러스 형광 (녹색 형광 단백질, GFP+)의 감염 효율을 검출한다.</li>
		<li>다음 공식을 사용하여 농축된 바이러스 역가를 계산하십시오: 105 (세포 부피) × 감염률 (GFP+%)/첨가된 바이러스 부피 (0.1 μL 또는 0.2 μL).</li>
	</ol></li>
</ol>2. 섬유아세포를 멜라노사이트로의 직접 재프로그래밍(도 2A)
<ol><li>6-웰 세포 배양 플레이트의 한 웰을 0.1% 젤라틴 용액 1 mL와 실온에서 15-30분 동안 코팅한다. 우물이 0.1 % 젤라틴 용액으로 완전히 덮여 있는지 확인하십시오. 코팅 후 0.1% 젤라틴 용액을 흡인한다. 참고: 0.1% 젤라틴 용액(100 mL)을 다음과 같이 준비하십시오: 0.1 g의 젤라틴 분말을 오토클레이브 유리병에 초순수 100 mL에 녹인 다음 4°C에서 2개월 이상 보관하지 마십시오.</li>
	<li>플레이트 5 × 104 MEFs를 0.1% 젤라틴으로 코팅된 6-웰 플레이트의 한 웰에 넣고 (단계 2.1에서와 같이), 이들 세포를 5%CO2 가 있는 가습 인큐베이터에서 37°C에서 정상 배지로 밤새 배양하였다.</li>
	<li>24시간 후, MEF가 40-50% 합류율에 도달했는지 확인합니다. 매체를 일반 매체로 교체합니다.</li>
	<li>0 일째에 농축 된 바이러스를 냉동실에서 꺼내 얼음 위에서 바이러스를 녹입니다. eq. (1)을 사용하여 첨가될 바이러스의 부피를 계산한다. 계산된 부피에 따라 여섯 개의 전사 인자인 Mitf, Pax3, Sox10, Sox9, Sox2 및 Snai2( 물질 표 참조)에 대해 농축된 바이러스를 각 웰에 첨가한 다음, 양이온성 고분자 형질감염제 4 μg/mL를 첨가한다. 세포 번호 (5 × 104) × 30 (감염 다중, MOI) / 바이러스 역가 (1)</li>
	<li>감염 후 1 일째, 8-12 시간 후, 바이러스가 포함 된 배지를 제거하고 신선한 정상 배지로 교체하면서 0.5 μg / mL 퓨로 마이신을 첨가하여 안정적인 감염된 세포주를 선별하십시오.</li>
	<li>감염 후 48시간 후인 2일째에, 상청액 배지를 점차적으로 리프로그래밍 배지로 교체한다. 먼저, 총 배지 부피의 1/4번째 를 변경하고, 3 μM CHIR99021을 첨가한다.</li>
	<li>제3일째부터 제7일까지, 세포의 상태에 따라, 더 높은 비율의 리프로그래밍 배지로 대체하여 배지를 변경하고( 표 1 참조), 5일 이내에 완전한 리프로그래밍 배지로 전환한다. 참고 :이 기간 동안 퓨로 마이신과 CHIR99021을 매일 사용해야합니다. 많은 죽은 세포가 재 프로그래밍 배지를 변경하는 첫 번째 및 두 번째 날에 나타납니다. 이것은 세포가 점차적으로 형질전환에 적응함에 따라 정상입니다. 따라서, 세포의 건강한 증식을 보장하기 위해 배지를 점진적으로 변화시킬 필요가 있다.</li>
	<li>세포를 통과시키기 위해, 500 μL의 0.05% 트립신-EDTA를 첨가하여 실온에서 3분 동안 세포를 소화시킨다. 세포의 ~ 60 %가 떠 올랐을 때, 소화 효소의 부피의 2 배에 달하는 정상 배지를 첨가하여 소화를 중단하십시오. 세포 현탁액을 15 mL 멸균 원뿔형 튜브에 수집하고, 4°C에서 5분 동안 200 × g 에서 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 세포 펠릿을 리프로그래밍 배지로 재현탁하고, 세포를 3 내지 104/cm2의 밀도로 60 mm 멸균 접시에 ×판화한다. 이들 세포를 가습된 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 배양한다. 참고: 8일째부터 21일째까지, 이들 세포는 3-5일마다 계대배양되고 팽창하기 위해 60mm 멸균 접시에서 배양된다. 그들은 적어도 계대 5에 도달하도록 배양될 수 있다.</li>
</ol>3. 직접 재 프로그래밍 및 식별을위한 최적화
<ol><li>최적화된 전사인자에 대한 스크리닝<ol>
<li>2.1-2.7 단계를 반복하여 매번 여섯 가지 전사 인자 중 하나를 줄입니다. MEF를 다섯 가지 전사 인자의 조합으로 바이러스로 감염시킵니다.</li>
		<li>감염 7일 후, 이들 세포의 RNA를 추출하고(16), 역전사 PCR(RT-PCR)17 을 이용하여 이들의 멜라노시스 유전자의 발현 수준을 분석하여 이를 하나씩 제거함으로써 멜라닌 세포로의 전환에 가장 큰 영향을 미치는 전사 인자를 선별한다(도 3A).</li>
		<li>MEF를 감염시키기 위해 멜라노사이트로의 전환에 영향을 미치는 상위 세 가지 전사 인자를 사용하십시오. 2.1-2.7단계를 반복합니다. 참고: 감염 후 칠일 후, 멜라노시스 유전자는 이러한 형질전환된 세포에서 검출될 수 있어야 한다(그림 3B). iMels 특성화를 위한 프라이머 정보가 표 3에 포함되어 있다.</li>
	</ol></li>
	<li>유도된 멜라닌 세포 (iMels)의 확인<ol>
<li>면역형광 염색18 을 사용하여 iMels가 TYRP-1 및 DCT를 포함하는 멜라닌성 단백질을 발현하는지 확인하였다(도 4A).</li>
		<li>멜라닌 특이적 3,4-디하이드록시페닐알라닌(DOPA) 염색(도 4B)<ol>
<li>다음과 같이 4% 파라포름알데히드(10 mL)를 준비한다: 파라포름알데히드 분말 0.4 g을 PBS 10 mL에 용해시킨다. 용해를 촉진하기 위해 용액을 2시간 동안 56°C의 오븐에 놓는다. 참고 : 용액은 한 달 이상 4 ° C에서 보관할 수 있습니다.</li>
			<li>iMels를 30mm 접시에 배양하고 미리 데운 PBS로 접시를 두 번 씻으십시오. 세포를 고정시키기 위해 4% 파라포름알데히드 1 mL를 20분 동안 첨가하고, 접시를 PBS로 3회 세척하였다.</li>
			<li>0.01 g의 L-DOPA 분말을 PBS 10 mL에 용해시켜 사용 직전에 0.1% DOPA 염색 용액(10 mL)을 준비한다. 용액을 30분 동안 37°C의 수조에 놓고; 용해를 촉진하기 위해 여러 번 흔들어주십시오.</li>
			<li>갓 준비한 0.1% DOPA 염색 용액 1 mL를 첨가한다. 37°C의 오븐에서 2-5시간 동안 인큐베이션한다. 갈색-흑색 입자가 없는 경우, 37°C에서 2시간 동안 계속 인큐베이션하되 >5시간 동안은 인큐베이션하지 않는다. 30 분마다 샘플을 확인하십시오.</li>
			<li>매번 1분 동안 PBS로 접시를 3회 세척한다. 2분 동안 헤마톡실린 염색 용액 1 mL로 핵을 착색시킨다.</li>
			<li>장기간 보관을 위해 95% 에탄올을 사용하여 샘플을 3분 동안 탈수시킨 다음 5분 동안 100% 에탄올을 사용하여 탈수시킵니다. 자일렌과 중성 발삼으로 접시를 밀봉하십시오.</li>
		</ol>
</li>
		<li>멜라닌 특이적 마손-폰타나 염색(도 4B)<ol>
<li>iMels를 30 mm 접시에 플레이트하고 세포를 20분 동안 4% 파라포름알데히드로 고정시키고; PBS로 접시를 3 번 씻으십시오.</li>
			<li>Masson-Fontana 염색 키트(자료표 참조)에서 용액 A(암모니아 실버 용액) 1 mL를 첨가하고, 접시를 어두운 상자에 넣고, 어두운 상자를 56°C 의 오븐에서 15-40분 동안 놓는다. 참고: 오븐에서 15분 후에 갈색-검은색 입자가 보이지 않으면 샘플을 56°C 오븐으로 돌려 보내 배양을 계속하되 >40분 동안은 배양하지 마십시오. 일부 물은 건조를 방지하기 위해 어두운 상자에 추가 할 수 있습니다.</li>
			<li>흡인물 용액 A는 증류수로 5-6회, 매번 1-2분 동안 접시를 세척한다.</li>
			<li>Masson-Fontana 염색 키트에서 1 mL 용액 B (하이포 용액)를 첨가하고, 접시를 실온에서 3-5 분 동안 두십시오.</li>
			<li>흡인물 용액 B는 수돗물로 접시를 3 번, 매번 1 분 동안 씻는다.</li>
			<li>Masson-Fontana 염색 키트에서 용액 C (중성 적색 염료) 1 mL를 첨가하고 접시를 실온에서 3-5 분 동안 두십시오.</li>
			<li>흡인물 용액 C는 증류수로 3회, 매번 1분간 접시를 세척한다.</li>
			<li>신속한 탈수를 위해 100% 에탄올 1 mL를 첨가하고, 3분 후에 에탄올을 흡인한다. 참고 : 염색 된 샘플은 자일렌 및 중성 발삼으로 밀봉 한 후 오랜 시간 동안 보관할 수 있습니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

바이러스의 품질은이 프로토콜에서 멜라닌 세포에 대한 직접 재 프로그래밍의 성공에 중요합니다. 이 프로토콜에서 바이러스를 포장하고 농축하는 방법은 간단하고 반복하기 쉬우며 다른 보조 농축 시약에 의존하지 않습니다. 이 프로토콜은 대부분의 실험실에서 성공적으로 수행 할 수 있습니다. 농축 된 바이러스의 품질을 보장하기 위해 다음 사항은 특별한주의가 필요합니다. 하나는 HEK-293T의 세포 상태입니다. HEK-293T 세포는 불멸화 된 세포이지만, 농축 된 바이러스를 만드는 데 사용되는 세포는 10 계대 이내에 건강한 세포이어야합니다 (역가는 더 높은 계대에 따라 감소합니다).
또 다른 중요한 점은 사용 된 형질 감염 시약 (이 경우 리포펙타민)의 비율입니다. 형질감염 시약을 첨가한 후 세포가 손상되기 때문에, 세포의 최적 상태와 바이러스의 품질을 보장하기 위해 플라스미드에 대한 시약의 비율을 반복적으로 점검해야 한다. 플라스미드에 대한 트랜스펙션 시약의 2:1 비율은 이 시스템에서...

Vitiligo는 영향을받는 개인의 신체적, 정신적 건강에 심각한 영향을 미치는 피부 질환입니다. 대사 이상, 산화 스트레스, 염증 매개체의 생성, 세포 분리 및자가 면역 반응을 포함한 다양한 이유로 기능적 멜라닌 세포가 손실되고 멜라닌 분비가 중단되어 vitiligo 1,2의 발달로 이어집니다. 이 상태는 널리 발생하며 특히 얼굴에 문제가됩니다. 주요 치료는 코르티코 스테로이드 및 면역 조절제의 전신 사용입니다. 광선 요법은 전신 또는 국소 질환에 사용될 수 있으며, 천공 된 피부 이식 및 자가 멜라닌 세포 이식 3,4,5와 같은 외과 적 치료가 있습니다. 그러나 약물 요법과 광선 요법을 사용하는 환자는 재발하기 쉽고 이러한 치료법은 장기적인 치료 효과가 떨어집니다. 외과 적 치료는 외상성이며 적당히 효과적입니다 2,6. 따라서 vitiligo를 위해서는 새롭고 효과적인 치료 전략이 필요합니다.
유도된 만능 줄기 세포 (iPSCs)의 리프로그래밍은 이들 세포를 그들의 말단 상태에서 다능성 상태로 역전시키고, 전사 인자인 Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc7에 의해 매개되는 과정이다. 그러나, 종양원성의 가능성 및 긴 생산 시간으로 인해, 이 기술은 임상 설정(8)에 적용될 때 회의론에 부딪혔다. 직접 리프로그래밍은 한 종류의 단말 셀을 다른 유형의 단말 셀(9)로 변환시키는 기술이다. 이러한 과정은 적합한 전사 인자에 의해 달성된다. 심근세포(10), 뉴런(11) 및 달팽이관 모발 세포(12)를 포함하는 다양한 세포들이 이미 성공적으로 직접 재프로그램되었다. 일부 연구자들은 심지어 상처 복구에 사용할 수있는 현장에서 직접 피부 조직을 재 프로그래밍했습니다13. 직접 재 프로그래밍의 장점은 대기 시간과 비용 감소, 암 위험 감소, 윤리적 문제 감소, 세포 운명 결정의 기초가되는 메커니즘에 대한 더 나은 이해를 포함합니다9.
직접적인 리프로그래밍 방법이 널리 사용되고 있지만, 현재 피부 세포를 멜라닌 세포로 직접 재프로그래밍하기 위한 확실한 방법은 없으며, 특히14,15개의 전사 인자가 고려되어야 하기 때문이다. 전사 인자인 Mitf, Sox10 및 Pax3는 피부 세포를 멜라노사이트(14)로 직접 재프로그래밍하는데 사용되어 왔다. 대조적으로, MITF, PAX3, SOX2 및 SOX9의 조합은 또한 다른 연구15에서 인간 멜라닌 세포로의 피부 세포의 직접 재 프로그래밍에 사용되었다. 이 프로토콜에서, 상이한 스크리닝 방법의 사용에도 불구하고, 앞서 기술된 바와 같이 멜라닌 세포로의 피부 세포의 직접적인 재프로그래밍을 위한 Mitf, Sox10 및 Pax3의 조합으로 동일한 결과가 얻어졌다. 다른 피부 세포로부터 멜라닌 세포를 생성하는 시스템을 개발하는 것은 vitiligo 환자의 다른 피부 세포를 멜라닌 세포로 변형시키는 계획을 제공 할 수 있습니다. 따라서 멜라닌 세포를 성공적으로 생성하기 위해이 직접 재 프로그래밍을위한 간단하고 효율적인 방법을 구성하는 것이 중요합니다.

<table><tbody><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-062</td>는 <td>-20 &deg에 저장했습니다. C</td></tr><tr><td>0.45 & M 필터</td><td>Millipore</td><td>SLHVR33RB</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 폴리스티렌 원형 바닥 튜브</td><td>Falcon</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>95%/100% 에탄올</td><td>LANBAO</td><td>210106</td><td>RT</td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Sigma</td><td>A2786</td>에 보관 <td>재고 농도 40 mg/mL 최종 농도 24 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 염소 안티 마우스 IgG2a</td><td>Invitrogen</td><td>A21137</td> 항생제(Pen/Strep)를 <td>사용하기 위한 1:500 희석</td></tr><tr><td></td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>-20 &deg에 저장; C</td></tr><tr><td>Anti-TRP1/TYRP1 항체</td><td>Millipore</td><td>MABC592</td><td>Host/Isotype: Mouse IgG2a 종 반응성: Mouse/Human </td></tr><tr><td>Anti-TRP2/DCT 항체</td><td>Abcam ab74073</td> Host/Isotype을 사용하기 위한 1:200의 희석 Abcam <td>ab74073</td><td>Host/Isotype: Rabbit IgG Species reactive: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Stemgent</td><td>04-0004</td><td>Stock concentration 10 mM Final 농도 3 &Mu; M</td></tr><tr><td>콜레라 독소</td><td>Sigma</td><td>C8052</td><td>재고 농도 0.3 mg/mL 최종 농도 20 pM</td></tr><tr><td>Cy3 염소 항 토끼 IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>111-165-144</td> DMEM (High glucose)HyClone SH30243.01 4°C를 <td>사용하기 위해 1:500의 희석</td></tr>;<tr><td></td><td></td><td></td><td> C</td></tr><tr><td>DMSO&nbsp;</td><td></td><td>RT</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td>에 저장된 Sigma D2650 <td>-20 &deg; C 사용 전 열 비활성화</td></tr><tr><td>젤라틴</td><td>시그마</td><td>G9391</td><td>RT</td></tr><tr><td>GFP-PURO 플라스미드(Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 및 Snai2)</td>에 보관<td>Hanheng Biological Technology Co., Ltd.</td><td>pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325</td><td>-20°C에 저장됨; C</td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Abcam</td><td>ab220365</td><td>RT</td></tr><tr><td>Human EDN3</td><td>American-Peptide</td><td>88-5-10A</td>에 저장 재고 <td>농도 100 &mu; M 최종 농도 0.1 &mu; M</td></tr><tr><td>하이드로코르티손</td><td>시그마</td><td>H0888</td><td>재고 농도 100 &마이크로; g/mL 최종 농도 0.5 & 마이크로; g/mL</td></tr><tr><td>L-DOPA</td><td>Sigma</td><td>D9628</td><td>RT</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>형질주입 시약, 4°C에 저장; C</td></tr><tr><td>Masson-Fontana 염색 키트</td><td>Solarbio</td><td>G2032</td><td>4°C에 보관; C</td></tr><tr><td>중성 발삼</td><td>Solarbio</td><td>G8590</td><td>4 &deg에 저장; C</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마</td><td>P6148</td><td>RT</td></tr><tr><td>PBS (-)</td><td>Gibco</td><td>C10010500BT</td><td>RT</td></tr><tr><td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA)</td><td>Sigma</td><td>P8139</td>에 보관 재고 <td>농도 1 mM 최종 농도 200 nM</td></tr><tr><td>폴리브레네</td><td>시그마</td><td>H9268</td><td>양이온성 고분자 형질주입 시약; 재고 농도 8 &mu; g/&마이크로; L 최종 농도 4 ng/&micro; L</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Gibco</td><td>A11138-03</td><td>-20 &deg에 저장; C</td></tr><tr><td>재조합 인간 bFGF</td><td>Invitrogen</td><td>13256-029</td><td>재고 농도 4 &mu; g/mL 최종 농도 10 ng/mL</td></tr><tr><td>재조합 인간 인슐린</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>I3536</td><td>재고 농도 10 mg/mL 최종 농도 5 &마이크로; g/mL</td></tr><tr><td>재조합 인간 SCF</td><td>R& D</td><td>255-SC-010</td><td>재고 농도 200 &mu; g/mL 최종 농도 100ng/mL</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td>4°C에 보관; C</td></tr><tr><td>크실렌</td><td>시그마</td><td>1330-20-7</td><td>RT에 저장</td></tr></tbody></table>

마우스 섬유아세포를 멜라노세포로 직접 재프로그래밍

Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts into Melanocytes

멜라닌 세포의 기능 상실은 vitiligo로 이어지며, 이는 영향을받는 개인의 신체적, 정신적 건강에 심각한 영향을 미칩니다. 현재, vitiligo에 대한 효과적인 장기 치료는 없습니다. 따라서 vitiligo에 대한 편리하고 효과적인 치료법을 개발하는 것이 필수적입니다. 피부 세포를 멜라닌 세포로 직접 재 프로그래밍하기위한 재생 의학 기술은 vitiligo의 유망한 새로운 치료법 인 것 같습니다. 이것은 환자의 피부 세포를 기능적 멜라닌 세포로 직접 재 프로그래밍하여 vitiligo 환자의 멜라닌 세포 손실을 개선하는 데 도움을줍니다. 그러나이 방법은 먼저 마우스에서 테스트해야합니다. 직접 재 프로그래밍이 널리 사용되지만, 멜라닌 세포로의 직접 재 프로그래밍을위한 명확한 프로토콜은 없습니다. 더욱이, 이용가능한 전사 인자의 수는 압도적이다. 
여기서, 농축된 렌티바이러스 패키징 시스템 프로토콜은 Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9 및 Snai2를 포함하는 멜라닌 세포에 피부 세포를 재프로그래밍하기 위해 선택된 전사 인자를 생산하기 위해 제시된다. 마우스 배아 섬유아세포(MEFs)를 시험관내에서 유도된 멜라노사이트(iMels)로의 MEFs의 직접적인 리프로그래밍을 위한 이들 모든 전사 인자에 대해 농축된 렌티바이러스로 감염시켰다. 또한, 이들 전사 인자를 스크리닝하고, 시스템은 멜라닌 세포에 대한 직접 재프로그래밍을 위해 최적화되었다. 유전자 또는 단백질 수준에서 iMels에서 멜라닌의 특징적인 마커의 발현이 유의하게 증가하였다. 이러한 결과는 섬유아세포를 멜라노사이트로의 직접 재프로그래밍이 vitiligo에 대한 성공적인 새로운 치료 전략이 될 수 있고 멜라노사이트 발달 메커니즘을 확인할 수 있음을 시사하며, 이는 섬유아세포를 생체내에서 멜라노사이트로의 추가적인 직접적인 재프로그래밍을 위한 기초를 제공할 것이다.

이 문서에는 섬유아세포를 멜라노세포로 직접 재프로그래밍하기 위한 전사 인자의 렌티바이러스를 생산하기 위한 농축된 렌티바이러스 패키징 시스템의 프로토콜과 MEF로부터 멜라닌 세포의 전사 인자 스크리닝 및 직접 리프로그래밍을 위한 프로토콜이 포함되어 있다.
농축된 렌티바이러스 생산의 성공은 GFP의 형광 강도를 관찰(도 1A) 또는 HEK-293T 세포를 비농축 렌티바이러스(1x) 및 농축 렌티바이러스(100x)로 48시간 동안 감염시킨 후 유세포 분석기(도 1B)에 의해 평가하였다. 농축된 바이러스의 역가는 10,8 TU/mL 이상이었으며, 이는 비교적 높다(도 1C).
멜라노사이트로의 섬유아세포의 직접 리프로그래밍은 전사 인자 렌...

여기에서는 멜라노사이트를위한 최적화 된 직접 재 프로그래밍 시스템과 원활한 직접 재 프로그래밍을 보장하는 고효율, 집중 바이러스 포장 시스템에 대해 설명합니다.

The loss of function of melanocytes leads to vitiligo, which seriously affects the physical and mental health of the affected individuals. Presently, ...

멜라닌 세포를 생성하기 위한 직접적인 리프로그래밍이 보고되었다. 그러나, 다양한 전사 인자가 상이한 연구에서 사용된다. 이 프로토콜에서 우리는 더 높은 재 프로그래밍 효율성으로 전사 인자 수를 검증하고 줄였습니다.우리는 Mitf, Sox10 및 PAX3의 세 가지 전사 인자 만 사용하여 멜라닌 세포를 생성하기위한 직접 재 프로그래밍 시스템을 수립하고 배양 시스템을보다 안정적이고 견고하게 변형했습니다. 기능적 멜라닌 세포를 재생하는 방법은 vitiligo와 같은 탈색 질환에 대한 치료 한계를 해결하는 데 도움이 될 수있는 중요한 질문입니다. 올바른 재 프로그래밍은 장래성을 제공합니다 우리의 기술은 편리함, 강력한 조작성 및 안정성의 특성을 가지고 있으며, 이는 홍보하고 반복하기가 더 쉽습니다.농축된 렌티바이러스의 생산을 시작하기 위해, 플레이트 1.5 내지 6개의 HEK-293T 세포를 60밀리미터 접시에 1.5회 플레이트하고, 세포를 섭씨 37도에서 정상 배지로 5% 이산화탄소가 있는 가습 배양기에서 배양하였다. 배양 24시간 후, HEK-293T 세포가 80 내지 90%컨플루언시에 도달하면, 배지를 3.5 mL의 DMEM으로 교체한 다음, 세포를 섭씨 37도에서 5%이산화탄소로 2시간 동안 가습 배양기에서 인큐베이션한다. 인큐베이터에서 세포를 제거한 후, 배지를 2%FBS를 함유하는 DMEM으로 교체하고, 새로 제조된 트랜스펙션 복합 혼합물을 적가하는 방식으로 세포에 첨가한다.액체 혼합물을 부드럽게 섞으십시오. 여덟 시간이 끝나면 세포 배지를 3.5 mL의 정상 배지로 바꿉니다. 24 및 48 시간에 바이러스 상청액을 수집하십시오.다음으로, 수집된 바이러스 상청액을 두 개의 상이한 시점에서 혼합하고, 혼합물을 섭씨 네 도에서 다섯 분 동안 200 xg에서 원심분리한다. 그 후 수집된 상청액을 0.45 미크론 필터를 통해 통과시켜 여액을 50-mL 멸균 원뿔형 튜브에 수집하였다. 여과된 바이러스 상청액을 섭씨 4도에서 6, 000 xg에서 하룻밤 사이에 원심분리하여 농축하였다.완료되면 바이러스 펠릿이 원뿔형 튜브의 바닥에 보이는지 확인하십시오. 상층액을 천천히 붓는다. 바이러스 펠릿을 바이러스 상청액의 100 배 * 부피로 정상 배지에 용해시킵니다.P1000 마이크로피펫을 사용하여 균질한 100x 농축된 바이러스 혼합물이 얻어질 때까지 부드럽게 위아래로 피펫을 한다. 농축 된 바이러스를 마이크로 원심분리 튜브로 나누어 섭씨 80도에서 보관하십시오. 플레이트를 1회 10회 내지 5번째 HEK-293T 세포를 여섯 웰 플레이트의 하나의 웰에 넣는다.이 세포를 섭씨 37도의 정상 배지로 5 % 이산화탄소가있는 가습 배양기에서 배양하십시오. 24시간 후, 0.1 내지 0.2 마이크로리터의 100x 형광 농축 바이러스를 각 웰에 첨가한다. 이어서, 양이온성 중합체성 형질감염 시약의 마이크로리터당 네 나노그램을 각 웰에 첨가하였다.바이러스에 감염된 후 약 여덟 시간에서 열두 시간 후, 배지를 정상 배지로 교체하십시오. 감염 후 마흔여덟 시간에, 접시를 멸균 PBS 1 mL로 세척하여 죽은 세포를 제거하였다. 그런 다음 실온에서 여섯 웰 플레이트의 웰 당 0.05%트립신-EDTA 용액 250 마이크로리터를 사용하여 세포를 트립신화한다.플레이트를 섭씨 네 도에서 다섯 분 동안 200 xg에서 원심분리한다. 상청액을 제거한 후, 세포 펠릿을 PBS 한 mL에 재현탁시키고, 세포 현탁액을 다섯 mL 폴리스티렌 둥근바닥 튜브에 첨가한다. 그런 다음 튜브를 유세포 분석기에 넣고 샘플을 분석하십시오.섬유아세포의 직접적인 재프로그래밍을 위해, 여섯 웰 세포 배양 플레이트의 1웰을 실온에서 0.1%젤라틴 용액 1mL로 코팅한다. 15 ~ 30 분 후, 우물이 젤라틴으로 완전히 덮일 때, 흡인물 0.1 % 젤라틴 용액. 다음에, 플레이트 5 내지 4번째 마우스 배아 섬유아세포, 또는 MEFs를, 0.1%젤라틴으로 코팅된 6웰 플레이트의 한 웰에 넣고, 5% 이산화탄소로 가습된 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 정상 배지로 밤새 세포를 배양하였다.24시간 후, MEF가 40 내지 50%컨플루언시에 도달하면, 배지를 정상 배지로 교체한다. 다음으로, 얼음에 얼어 붙은 농축 된 바이러스를 녹입니다. 방정식을 사용하여 첨가되는 바이러스의 부피를 계산한 다음, 계산된 부피에 따라 여섯 개의 전사 인자에 대해 농축된 바이러스를 각 웰에 첨가한다.양이온성 중합체성 형질감염제의 mL당 네 마이크로그램을 웰에 첨가한다. 렌티 바이러스 감염의 하루 제로로 간주하십시오. 첫째 날에, 8 내지 12시간의 감염 후, 바이러스가 포함된 배지를 신선한 정상 배지로 교체하고, 안정한 감염된 세포주를 스크리닝하기 위해 퓨로마이신 mL 당 0.5 마이크로그램을 첨가한다.감염 후 48시간 후인 둘째 날에, 상청액 배지를 점차적으로 재프로그래밍 배지로 교체한다. 세 마이크로몰 CHIR99021을 첨가하기 전에 총 배지 부피의 네 번째를 변경한다. 셋째 날부터 일곱째 날까지, 세포의 상태에 따라, 배지를 점차적으로 더 높은 비율의 리프로그래밍 배지로 대체하여 오일일 이내에 완전한 리프로그래밍 배지로 전환시킨다.다음으로, 세포를 실온에서 3분 동안 0.05%트립신-EDTA 소화 효소 500 마이크로리터로 분리한다. 세포의 약 육십 %가 떠 올랐을 때, 소화 효소의 부피의 두 배인 정상 배지를 추가하여 소화를 중단하십시오. 세포 현탁액을 15-mL 멸균 원뿔형 튜브에 수집하여 섭씨 네 도에서 5분 동안 200 xg에서 원심분리한다.세포 펠릿을 재프로그래밍 배지로 재현탁시키기 전에 상청액을 제거한다. 완료되면, 재현탁된 세포를 60-밀리미터 멸균 접시에 플레이트한다. 세포를 가습된 5% 이산화탄소 배양기에서 섭씨 37도에서 배양한다.HEK-293T 세포에서 렌티바이러스 감염의 마흔여덟 시간 후, 농축된 렌티바이러스 생산의 성공은 GFP의 형광 강도를 관찰하거나 유세포 분석기에 의해 평가하였다. 농축된 바이러스의 역가는 10 내지 8번째 TU/mL에서 높은 것으로 밝혀졌다. 섬유아세포의 직접적인 재프로그래밍 동안, 세포 형태학은 길쭉한 세포 시냅스 및 확대된 세포 핵으로 점차적으로 변화하였다.그러나, 세포는 스무 일 후에 점진적으로 노화되었다. 전사 인자인 Mitf, Pax3 또는 Sox10의 제거는 멜라닌 세포로의 섬유아세포 전환에 가장 큰 영향을 미치는 멜라노시안 유전자인 Tyr, Tyrp1 및 Mlana의 발현의 침묵을 초래하였다. 따라서, 세 개의 전사 인자를 갖는 직접 프로그래밍에 의해 유도된 멜라노시스 유전자의 발현은 여섯 개의 전사 인자와 비교했을 때 더 높았다.MEF 유도된 멜라닌 세포 또는 iMels를 확인하기 위해, 멜라닌 마커, TYRP1 및 DCT의 발현을 면역형광 염색을 사용하여 검출하였다. 더욱이, DOPA 및 Masson-Fontana 염색과 같은 멜라닌 특이적 염색 방법은 긍정적 인 결과를 보였다. 293T 셀은 고르게 분포되어야 합니다.또한, 세포에 형질감염 혼합물을 첨가하는 것은 세포가 부유하는 것을 방지하기 위해 부드럽게 행해져야 한다. 이 프로토콜은 안정적이고 실용적이며 다른 유형의 세포를 재 프로그래밍하는 데 사용할 수 있습니다. 향후 의학에서 멜라노사이트 재생에서 생체내 직접 재프로그래밍을 위한 참조 및 전략을 제공할 것으로 기대한다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 동영상은 inducible의 lentivirus를 사용하여 유도된 pluripotent 줄기 세포를 생성하는 절차를 보여줍니다 표현 Oct4, Sox2, C - Myc와 Klf4.

삭스 - 2의 강제 표현을 통해 MEFS에서 IPS 세포를 생성, 10 - 4, C - Myc, 그리고 Klf4

이 비디오는 출생 후 새끼 쥐의 피부에서 멜라닌 세포와 섬유아세포를 동시에 분리하고 배양하는 빠른 방법을 설명합니다. 이러한 세포는 피부 세포 생물학, 상처 치유 및 흑색종을 연구하기 위해 체외에서 유지 및 조작할 수 있습니다.

1차 쥐 멜라닌 세포 및 섬유아세포의 빠른 배양: 전체 쥐 피부 샘플에서 멜라닌 세포 및 섬유아세포 분리

유도 만능 줄기 세포의 생성은자가 이식의 유도에 대한 매혹적인 전망을 제공합니다. 그러나, 만능 상태와 힘든 다시 차별화를 통해 진행은 여전히​​ 임상 번역을 방해한다. 여기에서 우리는 성인 인간 섬유 아세포의 유도와 유도 된 신경 전구 세포에 자신의 직접 변환과 신경 계통에 후속 차별화를 설명합니다.

성인 인간 섬유 아세포의 유도 및 확장 신경 전구 세포에 자신의 직접 변환

여기에 설명된 프로토콜은 최소 전사 인자 세트의 과발현을 통해 마우스 배아 섬유아세포에서 혈액 프로그램의 유도를 자세히 설명합니다. 이 기술은 조혈, 혈액 질환 및 조혈 줄기 세포 이식에 대한 향후 연구를 위한 플랫폼을 제공하기 위해 인간 시스템으로 변환될 수 있습니다.

전사 인자와 마우스 배아 섬유 아 세포를 재 프로그램하는 것은 Hemogenic 프로그램을 유도하는

여기 선물이 overexpression Mef2c, GATA4, Hand2, Tbx5, 미르-1, 그리고 미르-133 (GHMT2m) TGF-β 신호 전달의 억제와 함께 통해 기능 cardiomyocytes에 기본 미 발달 섬유 아 세포를 재 설 정할 하는 강력한 방법. 우리의 프로토콜 생성 박동 cardiomyocytes 일찍 최대 60 %7 일 후 변환 효율.

프로 거리 신호 억제 유도 Cardiomyocytes에 마우스 미 발달 섬유 아 세포의 프로그래밍 요소 중재 Potentiates

생산 유발에 대 한 우리의 프로토콜 여기 제시 erythroid 창시자 (Iep) 성인 섬유 아 세포 전사 인자 제어를 사용 하 여 마우스에서에서 직접 혈통 프로그래밍 (DLR).

리니지 Reprogramming 성인 마우스 구와 Erythroid 창시자에의 직접

여기 우리 재활 요인 인코딩 수정된 mRNAs를 사용 하 여 유도 만능 줄기 세포로 인간의 기본 섬유 아 세포를 재 설 정할 임상 관련, 높은 효율, 피더 무료 메서드를 설명 하 고 성숙한 예측에 관한-367/302 모방. 또한는 재활 효율성을 평가 하는 방법 클론 iPSC 식민지 확장 및 pluripotency 마커 TRA-1-60의 식을 확인 있습니다.

인간의 기본 섬유 아 세포의 유도 만능 줄기 세포로 재프로그래밍 RNA 기반

이 프로토콜은 0-4일 된 마우스의 피부로부터 멜라닌세포 및 섬유아세포 배양을 동시에 생성하는 신속한 방법을 간략하게 설명한다. 이러한 1차 배양은 피부 세포 생물학, 색소 침착, 상처 치유 및 흑색종을 포함한 다양한 생리학적 관련 과정을 연구하기 위해 시험관 내에서 유지 및 조작될 수 있다.

1 차적인 뮤린 멜라닌세포 및 섬유아세포 배양물의 급속한 생성

이 프로토콜은 조혈 줄기 및 전구 세포를 생성하는 전사 인자 GATA2, GFI1B 및 FOS의 발현을 강제함으로써 인간 진피 섬유아세포에서 혈생 프로그램의 유도를 입증한다.

전사 요인의 강제 표현에 의한 인간 섬유아세포의 혈생 재프로그래밍

세포 재프로그래밍은 다능성 세포 상태를 조절하고 유지하는 주요 유전자의 도입을 요구합니다. 기술된 프로토콜은 바이러스/통합 방법 없이 인간 진피 섬유아세포로부터 유도된 만능 줄기 세포(iPSCs) 콜로니의 형성을 가능하게 하지만, 세포 방어 메커니즘을 감소시키는 면역 회피 인자와 결합된 비변형 RNA(NM-RNAs)를 사용한다.

비통합 방법을 사용하여 복부 피부에서 성인 인간 진피 섬유 아세포의 분리 및 유도 만능 줄기 세포의 생성

이 프로토콜은 근막세포로 피부 섬유아세포의 변환과 근투로의 분화를 설명합니다. 세포주 신경 근육 장애를 가진 환자에서 파생 되 고 병리학 적 메커니즘을 조사 하 고 치료 전략을 테스트 하는 데 사용할 수 있습니다.

신경 근육 장애에 대 한 치료를 조사 하기 위해 Myoblasts에 인간 섬유 아 세포의 직접 재프로그래밍

배우세요 마우스 섬유아세포를 Mitf, Sox10, PAX3 전사인자를 사용하여 멜라노세포로 직접 재프로그래밍하는 최적화된 방법을. 이 기술은 재프로그래밍 효율성과 안정성을 높여 백반증과 같은 탈색 질환 치료에 활용됩니다.

마우스 섬유아세포를 멜라노세포로 직접 재프로그래밍

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