Name: 유전자 인코딩 된 Ca2 + 지표 (GECIs)를 사용하여 성상 세포와 뉴런에서 이미징 미토콘드리아 Ca2 + 섭취 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: 학습하세요 성상세포와 뉴런의 미토콘드리아 칼슘 이미징 방법을 GCaMP5G 및 GCaMP6s 지표를 활용하여. 이 프로토콜은 세포 유형별 실시간 칼슘 역학 분석을 가능하게 합니다.

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이 작품은 국립 국립 신경 장애 및 뇌졸중 연구소 (NINDS)가 R01NS069726 및 R01NS094539를 SD에 보조금으로 지원했습니다. 우리는 오디오 녹음에 대한 에리카 DeMers 감사합니다.

동물과 관련된 절차는 미주리 컬럼비아 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
1. DNA 플라스미드 건설
참고: 시험관 내 및 생체 내 이미징의 경우, 성상세포 및 뉴런 특이적 프로모터 및 미토콘드리아 표적 시퀀스를 사용하여 GCaMP5G/6s를 인코딩하는 DNA 플라스미드가 생성됩니다.
<ol><li>미토콘드리아 매트릭스(MM)-표적화 서열(mito-) ATGT CCGTCCTGAC GCCGCTGCTG CTGCGGCT TGACAGGCTC GGCCCGGCGGGCGGGGGGGGGGGGGCGGCGGCGGGGGGGGGGGCGGGGGGGGGCGGCCCGGCGGCCGGGCGGGGGGGCGGCCGGCCCCGTGCGCCGCGCCAA 가트CCATTCG TTG17 복제 부위에코리 및 밤HI는 아데노 관련 바이러스(AAV) 플라스미드 pZac2.1의 중추에서 성상체 gfaABC1D 프로모터 또는 뉴런 CaMKII 프로모터18,19,20을함유한 플라스미드를 획득한다.</li>
	<li>서브클론 GCaMP5G/6s 는 복제 부위에 BamH I 및 Not 1을 위의 플라스미드에서 획득하여 새로운 플라스미드 pZac-gfaABC1D-Mito-GCaMP5G/6s 및 pZac-CaMKII-Mito-GCaMP5G/6s를 획득하여 미토콘디아시리아에서유전자 발현을 표적으로 하는20개 뉴런(20).</li>
	<li>시험관 내 연구를 위한 트랜스퍼바이스용 pZac-gfaABC1D-Mito-GCaMP5G 및 pZac-CaMKII-Mito-GCaMP6s DNA 플라스미드를 준비한다(섹션 2). 생체 내 연구를 위한 뉴런용 성상세포 및 혈청형 9용 세로형 5형(3절)을 가진 AAV 벡터를 생성한다( 섹션 3).</li>
</ol>2. 성상세포및 뉴런에서 체외 미토콘드리아 Ca2+ 이미징
<ol><li>E1 신생아 마우스의 피질과 E15-16 배아18,22,23,24의피질로부터 1차 성상세포를 준비하고 12mm 직경유리 커버립에 배양합니다. 덜벡코의 변형독수리 매체(DMEM)를 사용하는 24웰 플레이트는 10% 태아소 혈청(FBS)을 함유하고 있으며, 2% B27을 함유한 뉴런 기저배지(NBM), 각각.</li>
	<li>트랜스펙트 성숙한 성상세포및 뉴런pZac-gfaABC1D-GCaMP6s 및 pZac-CaMKII-GCaMP5G 플라스미드를 사용하여 지질 계 형 트랜스페이언시약을 사용하여 성상 세포와 GCaMP5G의 미토콘드리아에서 GCaMP6s를 발현하기 위해 뉴런18,201. DNA의 0.5 μg를 가진 각 우물의 트랜스펙트 세포는 6 시간 후에 배지를 변경합니다. 참고: 성상 세포와 뉴런은 형질 전환 후 1-2 일 동안 이미징할 준비가 되어 있습니다.</li>
	<li>체외 미토콘드리아 Ca2+ 화상 진찰 1-2 일 후에 수행합니다.<ol>
<li>상화세포 또는 뉴런으로 배양된 유리 커버립을 EPIfluorescence 또는 2개의 광자 현미경하에서 PH-1 관류 챔버로 옮는다.</li>
		<li>ACSF에서 100 μM ATP로 성상체 미토콘드리아 Ca2+ 섭취를 자극하거나, 100 μM 글루타메이트/10 μM 글리신20,25(도 2 및도 3)로뉴런 미토콘드리아를 자극한다. 참고: ACSF에서 ATP로의 솔루션 변경 및 글루타민/글리신 함유 ACSF는 ALA-VM8 관류시스템(21)에의해 제어된다. 밸브를 조정하여 솔루션 교체 속도를 1-2mL/min으로 제어합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 생체 내 미토콘드리아 Ca2+ 성상세포 및 뉴런에서 이미징
<ol><li>AAV 준비.<ol>
<li>rAAV2/5-gfaABC1D-미토-GCaMP5G 및 rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s 벡터에서 제조된 DNA 플라스미드를 사용하여 다음과 같은 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) 벡터를 준비한다. 참고: 본 실험에서, 혈청형 5의 rAAV 벡터는 혈청형 9의 성상세포 및 rAAV 벡터에서 미토콘드리아에서 GCaMP5G를 발현할 준비가 되어 뉴런에서 미토콘드리아에서 GCaMP6s를 발현할 수 있었다.</li>
	</ol></li>
	<li>스테레오 탁스 AAV 주입.<ol>
<li>마우스를 3% 이소플루란으로 마취합니다. 참고: 수술 중 나중에 이소플루란 수치가 2%로 감소합니다.</li>
		<li>마우스가 마취의 수술 수준에 도달 한 후, 꼬리와 발가락 핀치에 의해 결정, 수술 부위, 모터 또는 somatosensory 피질, 머리 트리머와 함께 머리를 면도.</li>
		<li>마우스 스테레오탁스 장치에 마우스를 배치하고 이어 바으로 머리를 고정합니다. 수술 중 안과 연고를 눈에 적용하여 보호하십시오. 가열 패드를 사용하여 수술 내내 마우스의 체온을 37 °C에서 유지하십시오. 참고: 무균 절차를 사용하여 수술을 수행합니다. 모든 수술 도구는 오토클레이브 또는 뜨거운 비드 멸균기로 멸균되어야 합니다.</li>
		<li>마우스가 스테레오탁스 장치에 장착된 후, 요오드 기반 스크럽과 70% 에탄올을 3번 번 으로 두피를 살균합니다. 주사 부위를 노출하기 위해 두피의 중간선에 절개를 합니다.</li>
		<li>브레그마-라다 축에서 피부를 열고 모터 또는 소마토 감각 피질의 의도된 주입 위치에서 고속 드릴로 ~1mm 직경의 버 구멍을 만듭니다.</li>
		<li>아데노 관련 바이러스(rAAV2/5-gfaABC1D-Mito-GCaMP5G 벡터[1 x 1011 GC] 또는 rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s 벡터[1 x 1011 GC]를 함유한 33G 해밀턴 주사기를 사용하여 1μ바이러스 의 1μ까지 주입한다. 참고: 예를 들어, 피질 바이러스 전달의 경우 바이러스 솔루션을 여러 단계로 두 깊이에서 주입합니다. 먼저 바늘을 두라에서 1mm 깊이로 삽입하고 뇌가 회복할 수 있도록 5분이 허용합니다. 이어서, 바늘을 ~700 μm 깊이까지 이동하고 마이크로주링펌프 컨트롤러에 의해 제어되는 해밀턴 주사기를 사용하여 10nL/s의 사출 속도로 500nL의 바이러스 용액을 주입한다. 주사가 완료 된 후, 바이러스가 뇌로 확산 될 수 있도록 5 분 기다립니다. 그런 다음 바늘을 300 μm 깊이에서 두 번째 주입 위치로 이동합니다. 여기서, 바이러스 용액의 추가 500 nL을 주입한다. 바이러스가 뇌로 확산 될 수 있도록 10 분 기다립니다.</li>
		<li>조직 접착제를 사용하여 두피와 피부를 닫습니다. 쥐가 가열 패드에서 회복하도록하십시오. 복구 후 동물 시설로 마우스를 다시 보내십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>두개골 창 실및 생체 내 2-광자 (2-P) 미토콘드리아 Ca2+ 신호의 이미징. 참고: 두개골 창 이식은 3주 후 AAV 주입 후 모터 또는 소마토 감각피질(26,27,28,29)을통해 수행됩니다. Carprofen (10 mg/kg) 수술 전에 잠재적인 통증에서 구호를 제공 하기 위해 피하 주입. 두개골 창 외과 적 절차는 AAV 주사 수술 절차와 동일하며 무균 조건에서 수행됩니다.<ol>
<li>마우스를 3% 이소플루란으로 마취합니다. 참고: 이것은 초기 복용량 및 감소 2% 나중에 수술에 대 한. 이미징 하는 동안, 내 peritoneal (IP) 주입 130 mg 케타민/10 mg 자일라진/kg 체중 ACSF에 용해 된 마취에 사용 됩니다.</li>
		<li>마우스 스테레오탁스 장치에 마우스를 배치하고 이어 바으로 머리를 고정합니다. 안과 연고를 눈에 바치게 합니다. 가열 패드를 사용하여 수술 내내 마우스의 체온을 37 °C에서 유지하십시오. 참고: 모든 수술 도구를 소독해야 합니다.</li>
		<li>두피 의 중간선에 5-8mm 길이의 절개를하고 가위 쌍을 사용하여 피부플랩을 제거합니다.</li>
		<li>두개골이 노출된 후, 바이러스 주입 영역(즉, 모터 피질 또는 소마토 감각 피질, 도 1B)을통해 고속 드릴을 사용하여 2.0-3.0mm 직경의 두개골 절제술을 수행합니다. 먼저 네 개의 작은 구멍을 만들어 구멍을 연결하는 원을 따라 드릴합니다. 그런 다음 날카로운 가위로 뼈를 들어 올리고 제거합니다. 노출된 듀라 메이트는 두개골 창의 방해를 위해 제거하거나 그대로 보관할 수 있습니다.</li>
		<li>직경 3-5mm의 유리 커버슬립을 두개부 절제술 위에 투명 실리콘을 장착합니다. 이쑤시개를 사용하여 두개골 창을 뇌 표면으로 부드럽게 밀어 넣습니다. 그런 다음 소량의 실리콘 접착제로 가장자리를 밀봉하십시오. 참고 : 또는 실리콘 디스크 대신 1.2 % 낮은 융점 아가로즈 젤은 커버 유리와 뇌 조직 사이에 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>마지막으로, 치과 시멘트로 커버 슬립의 가장자리를 밀봉합니다. 강한 결합을 위해 두개골 창의 가장자리에 시멘트를 약간 적용하십시오. 치과 시멘트와 두개골에 사용자 정의 만든 금속 헤드 플레이트를 부착합니다. 참고: 금속판은 이미징세션(도 1C)에서마우스의 머리를 2-P 현미경의 단계로 고정하는 데 사용됩니다.</li>
		<li>이미징 중에 물에 잠기위해 두개골 창의 커버슬립 위에 ACSF 용액 0.5mL를 추가합니다.</li>
		<li>두개골 창을 통해 910 nm 파장을 가진 뉴런에서 성상 세포 및 미토-GCaMP6s에서 미토-GCaMP5G의 생체 2-P 이미징에서 시간경과를수행(도 1C)18,20,27. 참고 : 이미징 하는 동안, 마우스생리성 온도를 유지 하기 위해 가열 패드에. 마우스는 이미징 세션이 완료된 직후에 희생됩니다.</li>
		<li>상시화를 결정할 필요가 있는 경우 설포호다민 101(SR101)을 사용하여 생체내성상세포에 라벨을 부착한다.<ol>
<li>3.3.4 단계의 끝에서, 1-5 분 동안 피질 표면에 ACSF에 100 μM SR101의 100 μL을 적용합니다.</li>
			<li>ACSF로 표면을 헹니 언바운드 SR101을 씻어내도록 합니다. 2-P 이미징을 사용하여, 성상세포에서 미토-GCaMP5G 및 SR101의 공동 라벨링은 45-60분 후에 관찰될 수있다(그림 4A).</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Diaz-Garcia, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distinct+roles+of+calcium+in+rapid+control+of+neuronal+glycolysis+and+the+tricarboxylic+acid+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">The distinct roles of calcium in rapid control of neuronal glycolysis and the tricarboxylic acid cycle.</a> eLife. 10, 64821(2021).</li>
</ol>

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이 문서에서는 성상 세포와 뉴런에서 미토콘드리아 Ca2+ 신호를 이미징하는 방법과 프로토콜을 제공합니다. 우리는 GECI GCaMP5G/6s를 표현하기 위하여 미토콘드리아 표적화 및 세포 모형 특정 전략을 구현했습니다. 미토콘드리아에서 GCaMP5G/6s를 대상으로 하기 위해 플라스미드에 미토콘드리아 표적 시퀀스를 포함시켰습니다. 생체 내 성상 세포및 뉴런에서GCaMP5G/6s를 표현하기 위해, 우리는 성상세포 특이적 프로모터 gfaABC1D 및 뉴런 특이적 프로모터 CaMKII를 플라스미드에 삽입했습니다. 성상세포 및 뉴런에서 GCaMP5G/6s의 세포 형 특이적 발현은 SR101이 성상세포에 라벨링하고 NeuN을 가진 뉴런의 면역스테인팅에 의해 확인될 수 있다. 우리의 데이터에서, 이 전략은 생체내성상 세포 및 뉴런에 있는 미토콘드리아 Ca2+ 화상 진찰을 위한 믿을 수 있는 세포 모형 특정 접근을 제공합니다.
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미토콘드리아는 동적 세포 세포 세포 기관이며 에너지 생산을위한 세포 강국으로 간주됩니다. 한편, 미토콘드리아는 국소 또는 세포색 Ca2+ 상승에 대응하여 매트릭스에 Ca2+를 차지할 수 있다. 미토콘드리아 Ca2+ 섭취량은 삼환산(TCA) 주기 및 산화 인산화의 반응과 같은 대사 과정을 포함한 미토콘드리아 기능에 영향을 미치며, 생리조건 하에서 Ca2+민감한 단백질을 조절한다1,2,3,4. 미토콘드리아 Ca2+ 과부하는 또한 다양한 뇌질환5,6,7에서괴사 및 세포멸을 포함하는 세포 사멸을 위한 결정요인이다. 그것은 미토콘드리아 투과성 전이 모공 (mPTPs)의 개방과 세포 사멸 세포 죽음을 시작하는 caspase 공동 인자의 방출을 일으킵니다. 따라서, 세포 생리학 및 병리학을 더 잘 이해하기 위하여 살아있는 세포에 있는 미토콘드리아 Ca2+ 역학 및 취급을 공부하는 것이 중요합니다.
미토콘드리아는 Ca2+ 섭취량과 효능 사이의 균형을 통해 매트릭스 Ca2+ 항상성을 유지합니다. 미토콘드리아 Ca2+ 섭취량은 주로 미토콘드리아 Ca2+ 유니포터(MCUs)에 의해 매개되며, 미토콘드리아 Ca2+ efflux는 Na+-Ca2+-Li+ 교환기(NCLXs) 및 H+/Ca2+ 교환기(mHCX)8에의해 중재된다. 균형은 G 단백질 결합 수용체 (GPCRs)9의자극을 통해 교란 될 수있다. 미토콘드리아 Ca2+ 항상성 또한 용해성 xCa2+-xPO4x-xOH 복합체8의형성에 의해 미토콘드리아 버퍼링에 의해 영향을 받습니다.
Ca2+ 농도([Ca2+])의세포내 및 미토콘드리아 변화는 형광 또는 발광 Ca2+ 지표에 의해 평가될 수 있다. 지표에 결합Ca2+ 라이브 셀에서 실시간으로 무료 셀룰러 [Ca2+]를기록 할 수 있도록 스펙트럼 수정을 야기한다. 두 가지 유형의 프로브는 현재 세포의 Ca2+ 변화를 모니터링할 수 있습니다: 유기 화학 지표 및 유전자 인코딩된 Ca2+ 지표(GECIs). 일반적으로, 다른 Ca2+ 친화성(Kd 기준), 스펙트럼 특성(흥분 및 방출 파장), 동적 범위 및 민감성을 가진 다른 변이체는 조사 중인 생물학적 질문에 사용할 수 있습니다. 많은 합성 유기 Ca2+ 지표는 세포성 Ca2+ 이미징에 사용되었지만, 미토콘드리아 Ca2+ 이미징을 위한 미토콘드리아 매트릭스에 선택적으로 적재될 수 있으며, 로드-2가 가장 널리 사용되고 있습니다(리뷰는10,11참조). 그러나, Rhod-2는 긴 시간 과정 실험 도중 누설의 중요한 단점이 있습니다; 또한 미토콘드리아, 다른 소기관 및 사이토솔 사이에 분할되어 다른 서브컴터에서 절대 측정이 어려워집니다. 대조적으로, 세포형 특이적 프로모터 및 세포전 구획 표적화 서열을 이용하여, GECI는 체외 또는 생체 내에서 세포 및 구획 별 Ca2+ 이미징을 위한 상이한 세포 유형 및 세포전 구획으로 발현될 수 있다. 단일 파장 형광 강도 계 GCaMP Ca2+ 지표는 최근 주요 GECIs12,13,14,15,16으로부상했다. 이 문서에서는, 우리는 성상세포 및 뉴런에서 GCaMP5G 및 GCaMP6s (GCaMP5G/6s)의 미토콘드리아 표적화 및 세포 형 특이적 발현을 위한 프로토콜을 제공하고, 이러한 세포 모형에 있는 미토콘드리아 Ca2+ 섭취를 화상 진찰합니다. 이 프로토콜을 이용하여, 개별 미토콘드리아에서 GCaMP6G/6s의 발현이 드러나고, 단일 미토콘드리아 분해능에서 Ca2+ 섭취는 시험관내 및 생체내성상세포에서 달성될 수 있다.

<table><tbody><tr><td>인공 눈물 연고</td><td>럭비</td><td>NDC-0536-6550-91</td><td>83 % 백색 바셀린</td></tr><tr><td>시아 노 아크릴 레이트 접착제</td><td>세계 정밀 기기</td><td></td><td>3M Vetbond 접착제</td></tr><tr><td>해부 실체 현미경</td><td>Nikon</td><td>SMZ 2B</td><td>수술</td></tr><tr><td>듀몬트 집게 미세 팁 미세</td><td>과학 도구</td><td>11255-20</td><td>경막</td></tr><tr><td>유리 커버 슬립 제거, 0.13-0.17 mm 두께</td>의 <td>Fisher Scientific</td><td>12-542A</td><td>두개골 창 커버</td></tr><tr><td>고속 마이크로 드릴</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-17</td><td>뼈 연마 드릴 비트</td></tr><tr><td>주입 주사기</td><td>Hamilton</td><td>2.5 ml</td><td>바이러스</td></tr> 주입 <tr><td>케타민</td><td>VEDCO</td><td>NDC-50989-996-06</td><td>체중 100 mg / kg</td></tr><tr><td>낮은 융점 아가로 오스</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9793</td><td>감소 운동 아티팩트</td></tr><tr><td>금속 프레임</td><td>맞춤형</td> 현미경 <td>스테이지에 대한 뇌 부착은</td><td>그림 1 참조</td></tr><tr><td>마이크로 주사기 펌프 컨트롤러</td><td>세계 정밀 기기</td><td>UMP3</td><td>주입 속도 컨트롤러</td></tr><tr><td>마우스 입체 장치</td><td>스톨팅</td><td>51725</td><td>마우스</td></tr><tr><td>관류 챔버</td><td>보유 Warner Instruments</td><td>64-0284</td><td></td></tr><tr><td>침투 시스템</td><td>ALA Scientific Instruments</td><td>ALA-VM8</td><td></td></tr><tr><td>자기 조절 가열 패드</td><td>Fine Science Tools</td><td>21061</td><td>마우스의 저체온증을 예방하기 위해</td></tr><tr><td>Sulforhodamine 101</td><td>Invitrogen</td><td>S-359</td><td>적색 형광 염료 성상 세포를 라벨링하는</td></tr><tr><td>수술 용 가위, 12cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14002-12</td> 해<td>부 용</td></tr><tr><td>재료</td><td>Xylazine</td>VEDCO NDC-50989-234-11 10 mg / kg 체중 제거를위한 Trephine <td>Fine Science Tools</td><td>18004-23</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

유전자 인코딩 된 ca2 + 지표 (gecis)를 사용하여 성상 세포와 뉴런에서 이미징 미토콘드리아 ca2 + 섭취

Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators (GECIs)

미토콘드리아 Ca2+는 세포경색 Ca2+ 버퍼링, 에너지 대사 및 세포 신호 변환을 제어하는 데 중요한 역할을 합니다. 미토콘드리아 Ca2+의 과부하는 신경 질환의 신경 변성 및 세포 사멸을 포함한 다양한 병리학 적 조건에 기여합니다. 여기서 우리는 시험관 내 및 생체 내 성상세포 및 뉴런에서 미토콘드리아 Ca2+ 이미징을 위한 분자 접근법을 표적으로 하는 세포 형 특이성 및 미토콘드리아를 제시한다. 미토콘드리아 표적을 유전적으로 인코딩한 DNA 플라스미드(GECIs) GCaMP5G 또는 GCaMP6s(GCaMP5G/6s)와 성상세포 및 뉴런 특이적 프로모터 gfaABC1D 및 CaMKII 및 미토콘드리아 표적 시퀀스(미토콘드리아 표적 시퀀스)를 생성했습니다. 시험관 내 미토콘드리아 Ca2+ 이미징의 경우, 플라스미드는 GCaMP5G/6s를 발현하기 위해 배양된 성상세포 및 뉴런에서 전형되었다. 생체 내 미토콘드리아 Ca2+ 이미징의 경우, 아데노 관련 바이러스 벡터(AAV)를 마우스 뇌에 주입하여 성상세포및 뉴런의 미토콘드리아에서 GCaMP5G/6s를 발현하였다. 우리의 접근 은 성상 세포와 뉴런의 미토콘드리아 Ca2+ 역학을 이미지화하여 세포와 미토콘드리아 Ca2 + 신호 사이의 관계뿐만 아니라 성상 세포 뉴런 상호 작용 사이의 관계를 연구하는 유용한 방법을 제공합니다.

이 연구의 목적은 시험관 내 및 생체내 성상세포 및 뉴런에서 GECIs를 사용하여 미토콘드리아 Ca2+ 신호를 이미지하는 방법론을 제공하는 것이었습니다. 시험관 내 및 생체 내 미토콘드리아 Ca2+ 이미징의 결과는 여기에서 제시됩니다.
시험관 내 미토콘드리아 Ca2+ 배양 된 성상 세포및 뉴런에서 신호 성상세포에서 미토콘드리아 Ca2+ 섭취는 ATP 응용 에 의해 유도 될 수 있으며, 뉴런의 미토콘드리아 Ca2+ 섭취는 관혈 시스템을 통해 글루타민트 및 글리신 응용 프로그램에 의해 유도 될 수 있습니다. 도 2 및 <str...

이 프락토콜은 성상세포와 뉴런에서 생체 외 및 생체 내 미토콘드리아 Ca2+ 이미징을 위한 방법을 제공하는 것을 목표로 합니다.

유전자 인코딩 된 Ca2 + 지표 (GECIs)를 사용하여 성상 세포와 뉴런에서 이미징 미토콘드리아 Ca2 + 섭취

Mitochondrial Ca2+ plays a critical role in controlling cytosolic Ca2+ buffering, energy metabolism, and cellular signal transduction. Overloading of ...

절차를 시연하는 것은 대학원생 Zhe Zhang, 연구 전문가 난난 장, 교수 일커 오즈덴과 싱화 딩입니다. 이 절차의 전반적인 목표는 유전으로 인코딩된 칼슘 표시기, GCaMP5G 및 6s를 사용하여 생체 내 및 생체 내 미토콘드리아 수에 대한 세포 유형 특정 쌍 성상세포 및 뉴런 및 미토콘드리아 표적 화 방법을 개발하는 것입니다. 시험관 내 또는 생체 내 이미징의 경우, 우리는 성상 세포 또는 뉴런 특정 프로모터 gfaABC1D 또는 CaMKII및 유전자 로코딩 된 칼슘 지표, 미토콘드리아 표적 화 시퀀스를 포함하는 DNA 플라스미드를 생성할 것입니다.체외 미토콘드리아 칼슘 이미징의 경우 Lipofectamine 방법을 사용하여 전술한 DNA 플라스미드를 사용하여 유리 커버 슬립에서 배양된 성상세포 뉴런을 감염시켰습니다. 이미징은 유리 커버 전표를 상피 또는 2광자 현미경하에서 증혈 챔버로 이송하여 트랜스퍼빙 후 1~2일 후에 시작할 수 있다. 다음은 미토콘드리아와 왼쪽에 GCaMP6s를 발현하는 성상세포의 항성세포, 그리고 뉴런의 미토콘드리아의 경우 오른쪽에 GCaMP5G를 발현하는 예입니다.생체 내 이미징의 경우, 우리는 성상세포에서 미토-GCaMP5G의 발현을 위한 혈청형 5 관련 아데노바이러스를 제조하고 혈중 에서 미토-GCaMP6s의 발현을 위한 혈청형 9 관련 아데노바이러스를 제조하였다. 스테레오탁스 바이러스 주입 수술의 경우, 마우스를 3%이소플루란으로 먼저 마취시켰습니다. 수술 후, 이소플루란 수준은 마취의 적절한 수준에 도달 한 후 2 %로 감소, 두피에 머리가 면도하고 마우스는 스테레오 탁스 수술 기구에 배치된다.안과 연고는 수술 중 그들을 보호하기 위해 눈에 적용됩니다. 주사 수술은 멸균 기구 및 무균 기술을 포함하여 무균 절차를 사용하여 수행됩니다. 수술 기구는 오토클레이브 또는 뜨거운 비드 멸균기에 의해 멸균됩니다.마우스를 스테레오탁에 장착한 후, 두피는 베타딘과 70%에탄올로 3번 세척됩니다. 그런 다음 브레그마 람다 축을 따라 피부가 열리고 수직은 대상 위치를 통해 고속 드릴로 만들어집니다. 이 작품에서, 우리는 모터 피질 또는 파라피질을 표적으로 했습니다.연관된 아데노바이러스 벡터를 운반하는 33 게이지 해밀턴 주사기는 뇌내의 구멍을 통해 삽입되고 벡터는 대상 부위에 주입된다. 피질 전달을 위해 여러 단계에서 두 개의 깊이에서 바이러스 솔루션을 주입합니다. 첫째, 우리는 바늘을 피질 깊숙이 1밀리미터 삽입합니다.뇌가 회복할 수 있도록 5분 후, 바늘을 최대 700마이크로미터 깊이로 이동하고 500나노 리터의 바이러스 용액을 주입합니다. 주사가 완료 된 후, 우리는 바이러스가 뇌에서 확산 될 수 있도록 5 분 동안 기다립니다. 그리고 우리는 300 마이크로 미터 깊이에서 두 번째 주입 위치로 바늘을 이동합니다.여기에서, 우리는 바이러스 용액의 또 다른 500 나노 리터를 주입합니다. 주사가 완료 된 후, 우리는 바이러스가 확산 될 수 있도록 10 분 동안 기다린 다음 뇌에서 바늘을 제거하고 뼈 왁스 또는 Kwik-Sil로 버 구멍을 닫습니다. 마지막으로, 피부는 Vetbond로 봉합되고 마우스는 동물 시설로 다시 보내지기 전에 가열 패드에서 회복됩니다.마우스는 GCaMP 발현이 성숙한 기간인 최소 3주 내에 생체 내 이미징에 사용할 준비가 되어 있습니다. 두개골 창 이식 수술은 또한 주사 수술에 대해 설명된 바와 같이 무균 조건을 사용하여 수행됩니다. 두개골 창 외과 적 절차는 두개골 노출 시점까지 주사 수술 절차와 동일합니다.두개골이 노출되면 바이러스 주입 부위에 2-3mm 직경의 두개골 절제술이 조작기에 부착 된 고속 드릴에 의해 만들어진 4 개의 얕은 구멍으로 표시됩니다. 그런 다음 두개골의 단면, 두개골 절제술의 협곡에서 조심스럽게 천천히 이 네 개의 구멍을 연결하여 원주위의 뼈를 드릴링하여 얇게 합니다. 국경의 두개골이 충분히 얇으면 뼈가 날카로운 핀셋으로 들어 올려 제거됩니다.노출된 듀라 마터는 두개골 창의 이식을 위해 제거하거나 그대로 보관할 수 있습니다. 우리의 두개골 창은 직경 3-5 밀리미터의 유리 커버 슬립으로 구성되어 있으며 중앙에 약 300 미크론 두께의 실리콘 디스크를 만듭니다. 두개골 창의 장착은 두개골 절제술 위에 배치하여 수행됩니다.조작기에 부착 된 이쑤시개 조각은 두개골 창을 뇌 표면으로 부드럽게 밀어 붙이는 데 사용됩니다. 그런 다음 두개골 창의 가장자리는 소량의 실리콘 접착형 Kwik-Sil으로 밀봉됩니다. 마지막으로 두개골 창은 두개골 가장자리에 치과 아크릴이 고정되어 있습니다.강한 결합을 위해 두개골 창의 가장자리에 약간 치과 아크릴을 적용하는 데 주의를 기울여야합니다. 과거에 많은 다른 연구 그룹이 구현한 바와 같이, 1.2%의 아가로즈 젤은 실리콘 디스크의 대안으로 커버 글래스와 뇌 간에 사용될 수 있다. 두개골 창을 단단히 설치하면 두개골에 금속 판이 부착됩니다.이 헤드 플레이트는 이미징 세션 동안 2광자 현미경의 단계에서 마우스의 머리를 고정하는 데 사용됩니다. 성상세포에서미토콘드리아 칼슘 섭취는 ATD 적용에 의해 유도될 수 있으며, 뉴런의 미토콘드리아 칼슘 섭취는 관혈 시스템을 통해 중력으로 인공 뇌척수액의 글루타민리 글리신 적용에 의해 유도될 수 있다. 성상 세포와 뉴런의 개별 미토콘드리아에서 칼슘 섭취를 관찰 할 수 있습니다.다음 영화는 왼쪽에 ATP에 의해 유도 된 성상세포에서 미토콘드리아 칼슘 섭취를 보여 주며 오른쪽에 글루타민트와 글리신에 의해 유도 된 뉴런. 이미징은 Coherent에서 백만 티 사파이어 울트라 1 레이저를 장착 프레리 테크놀로지스의 울티마 2 광자 현미경 시스템을 가진 성상세포 및 뉴런에서 미토콘드리아 형광 신호의 생체 내 2 광자 이미지를 수집하여 수행됩니다. 우리는 GCaMP5G 및 6s를 가진 생체 내 화상 진찰에 최적인 880 에서 910 나노미터의 흥분 파장을 이용합니다.미토-GCaMP5G 및 6s의 성상세포 및 뉴런 특이적 발현 및 SR101 또는 뉴런 특이적 마커 NeuN의 성상세포 특이적 라벨링의 공동 국소화에 의해 재확인된다. 생체 내 성상 세포와 뉴런의 자발적인 미토콘드리아 칼슘 섭취는 2광자 현미경 검사를 사용하여 시간 경과 이미징에 의해 관찰될 수 있다. 이미지는 왼쪽에 있는 성상세포에 있는 개별 미토콘드리아에 있는 개별적인 칼슘 증가 및 오른쪽에 있는 신경을 보여줍니다.우리의 접근은 체외 및 생체 내의 세포 모형 특정 미토콘드리아 칼슘 화상 진찰에 유용합니다. 이 비디오를 시청 한 후, 당신은 성상 세포와 뉴런에서 미토콘드리아 칼슘 섭취를 이미지하는 방법에 대한 좋은 이해가 있어야합니다.

imaging-mitochondrial-ca2-uptake-astrocytes-neurons-using-genetically

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

기록 칼슘 활동을위한 칼슘 표시기 염료와 subventricular 영역 (SVZ) 세포를로드 할 방법이 설명되어 있습니다. 출생 후의 SVZ는 신경 전구 세포와 neuroblasts 포함 단단히 포장 세포가 포함되어 있습니다. 오히려 목욕로드를 사용하는 것보다 우리가 더 나은 염료 확산을 허용 조직 내부의 압력에 의해 염료를 주입했다.

칼슘 이미징에 대한 급성 Subventricular 지대 슬라이스의 작성

이 프로토콜에서는, 우리는 영상 칼슘의 최근 진행 상황을...

Hypothalamic 마우스 뇌 슬라이스의 GFP 태그 뉴런의 영상 칼슘 응답

이 동영상은 배양된 세포에서 미토콘드리아 칼슘 흡수를 측정하기 위한 컨포칼 현미경 이미징 기반 분석에 대해 설명합니다. 이 분석은 칼슘에 민감한 형광 염료 Rhod-2/AM을 사용하여 투과 배양 세포에서 미토콘드리아 칼슘을 측정합니다.

배양된 세포에서 미토콘드리아 칼슘 흡수를 측정하기 위한 칼슘 유입 분석

여기에서 우리는 성상 교세포 G 단백질 결합 수용체의 가소성 연구를위한 신경 세포의 항상성 가소성을 유도하기 위해 사용되는 프로토콜의 적응을 설명합니다. 최근 성상 세포 그룹 청소년 생쥐 내가 mGluRs의 변화를 검사하는 데 사용되는 방법은 현장에서 생체 성인 마우스의 조직에서, 다양한 성상 세포의 GPCR의 확장을 측정하고, 성상 세포 수용체의 감도의 더 나은 인식을 얻기 위해 적용 할 수있는 신경 활동의 변화에​​.

신경 발사 환율의 조작에 의해 성상 세포 수용체의 가소성을 유도

선조체에서 성상교세포 세포 내 Ca2+ 신호의 특성과 기능은 불완전하게 탐구된 상태로 남아 있습니다. 혈청형 2/5(AAV2/5)의 아데노 관련 바이러스를 사용하여 선조체 성상세포에서 유전적으로 암호화된 칼슘 지표를 발현하는 방법과 선조체 성상세포 내 Ca2+ 신호를 안정적으로 이미지화하는 절차를 설명합니다.

이미징 세포 내 칼슘 2 + 유전자 인코딩 된 칼슘 표시기를 사용하여 성인 마우스의 선조체 성상의 신호

여기, 우리는 고립 된 미토 콘 드리 아 및 경작된 한 세포에 있는 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 유입의 측정에 대 한 두 개의 프로토콜을 제시. 고립 된 미토 콘 드리 아에 대 한 우리는 플레이트 리더 기반 Ca2 + 가져오기 세부 분석 결과 사용 하 여 Ca2 + 민감한 염색 칼슘 그린-5N. 경작된 한 세포에 대 한 우리 confocal 현미경 검사 법 방법 Ca2 + 염료 오전-2/로드를 사용 하 여 설명 합니다.

고립 된 미토 콘 드리 아 및 경작된 한 세포에 있는 미토 콘 드 리아 칼슘 유입의 분석

유전자 인코딩된 Ca2 + 지표 (GECIs) 근본적으로 어떻게 현장에서 캘리포니아2 + 이미징 수행 달라졌다. 이러한 녹음에서 데이터 복구를 최대화 하기 위해 캘리포니아2 + 신호의 적절 한 분석이 필요 합니다. 이 종이에 프로토콜 캘리포니아2 + 신호를 원래의 spatiotemporal 매핑 및 입자 기반 분석을 사용 하 여 기록의 정량화를 촉진 한다.

세포내 캘리포니아2 + 제자리에서 신호 계량 Spatio 시간적 매핑 및 입자 분석 기법에의 응용

이 문서는 공초점 살아있는 현미경 검사를 사용하여 1 차해 및 피질 뉴런에 있는 급성 동요에 기초 redox 상태 및 redox 반응에 있는 다름을 결정하는 프로토콜을 기술합니다. 프로토콜은 최소한의 수정으로 다른 세포 유형 및 현미경에 적용 될 수 있습니다.

비율 표시기를 사용하여 1 차 신경에 있는 미토콘드리아 글루타티온 Redox 상태의 살아있는 화상 진찰

현재 방법은 쉽게 사용할 수 있는 유전적으로 암호화된 칼슘 지표를 사용하여 예쁜꼬마선충에서 생체 내 고해상도 하위 구획 칼슘 이미징을 위한 비비율계량 접근 방식을 설명합니다.

생체 내에서 처리되는 신경 칼슘의 세포 내 이미징

이 프로토콜은 온전한 삼차신경절(TG) 뉴런의 생체 내 GCaMP 칼슘 이미징을 설명합니다. 이 설명에는 TG 노출 수술, TG 뉴런의 생체 내 공초점 현미경 이미징, TG 뉴런 현미경 이미징 중 체세포 자극 적용 및 생체 내 GCaMP 칼슘 이미징 데이터 분석이 포함됩니다.

생체 내 온전한 삼차신경절의 일차 감각 뉴런 네트워크에서 신경 앙상블의 칼슘 이미징

이 프로토콜은 여러 기억 관련 뇌 영역에 걸쳐 뉴런과 성상교세포로부터 칼슘 신호를 동시에 기록하는 방법을 포괄적으로 설명하며, 학습 및 기억 행동 패러다임에서의 적용 방식을 시연합니다.

학습 및 기억 행동 중 여러 뇌 영역에 걸친 성상교세포-뉴런 활동을 기록하는 이중 색상 섬유 광도 측정법

학습하세요 성상세포와 뉴런의 미토콘드리아 칼슘 이미징 방법을 GCaMP5G 및 GCaMP6s 지표를 활용하여. 이 프로토콜은 세포 유형별 실시간 칼슘 역학 분석을 가능하게 합니다.

유전자 인코딩 된 Ca² + 지표 (GECIs)를 사용하여 성상 세포와 뉴런에서 이미징 미토콘드리아 Ca^{2 +} 섭취

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