Name: 완전히 정제된 구성 요소로 Msp1 추출 활동의 재구성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: 배우세요 AAA-ATPase Msp1의 재구성 방법을 정제된 구성 요소와 프로테오리포솜을 사용하여 단순화된 시스템에서 단백질 추출 메커니즘을 연구하는 기법입니다.

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MLW는 시카고 대학의 로버트 키넌 박사와 함께 박사 후 연구 를 하는 동안이 프로토콜의 일부를 개발했습니다.
이 작업은 MLW에 NIH 보조금 1R35GM137904-01에 의해 투자된다.

적절한 미토콘드리아 기능은 강력한 단백질 품질 관리 시스템에 따라 달라집니다. TA 단백질 표적화 경로의 충실도에 내재된 한계로 인해 잘못 지역화된 TA 단백질은 미토콘드리아에 대한 지속적인 스트레스 원천입니다. 미토콘드리아 프로테오스테아증 네트워크의 핵심 성분은 OMM에서 잘못 국산화된 TA 단백질을 제거하는 멤브레인 고정 AAA+ ATPase인 Msp1입니다. 여기에서, 우리는 proteoliposomes를 준비하는 방법을 설명했습니다, 공동 재구성 Msp1 및 모형 TA 단백질, 추출 분석기를 능력을 발휘합니다. 우리는 이전에 Msp1이 잘못 된 TA 단백질을 직접 인식하고 어떤 액세서리 단백질이나 공동 요인없이 지질 이중 층에서 이러한 단백질을 추출 할 수 있음을 증명하기 위해이 분석기를 사용했다57.
분석의 단점은 재구성 과정에서 약간의 가변성이 있다는 것입니다. 준비-준비 가변성을 제어하기 위해, 우리는 항상 우리의 분석이 의...

적절한 세포 기능은 프로테오스타시스라는 공정에 따라 달라지며, 이는 기능성 단백질이 올바른 농도 및 세포 위치1에있는지 확인합니다. 프로테오스타증의 실패는 손상된 세포간 기능으로 이어지며 많은 신경 퇴행성질환2,3,4와연관된다. 멤브레인 단백질은 소수성 막 도메인(TMDs)5로부터응집되는 것을 피하면서 올바른 멤브레인을 대상으로 해야 하기 때문에 프로테오스타증 네트워크에 고유한 과제를 제시한다. 따라서, 특수기계는 사이토솔으로부터 소수성 TMD를 보호하고 적절한 세포막6,7,8,9,10,11,12,13,14,15에대한 표적화 및 삽입을 용이하게 하기 위해 진화하였다.
미토콘드리아는 세포의 대사 허브이며 산화 인산화, 철황 클러스터 생성 및 세포세포조절(16,17)과같은 수많은 필수 세포 과정에 관여한다. 이러한 내시비골 세포기관은 내부 미토콘드리아 막(IMM) 및 외부 미토콘드리아 막(OMM)이라고 하는 두 개의 멤브레인을 함유하고 있다. 1,500개의 인간 미토콘드리아 단백질의 99% 이상이 핵 게놈에 인코딩되며 하나 또는 두 개의 다른 멤브레인18,19를통해 전이되어야 합니다. 따라서 적절한 미토콘드리아 기능은 단백질 표적화 또는 전좌의 오류를 교정하기 위해 강력한 프로테오스타증 네트워크에 의존합니다.
우리 실험실은 매우 C-terminus20,21,22,23,24에서단일 막 도메인을 갖는 꼬리 고정 (TA) 단백질이라고 불리는 미토콘드리아 막 단백질의 하위 집합에 초점을 맞추고 있습니다. TA 단백질은 아포토시스, 소포 수송 및 단백질전좌(25)와같은 여러 필수 공정에 관여한다. TA 단백질의 독특한 토폴로지는20,26,27,28에의해 꼬리 고정(GET) 또는 내피성 망상 막 단백질 복합체(EMC) 경로 또는 OMM로 의 유도 진입에 의해 내피성 망상(ER)에서 발생하는 번역 후삽입이필요합니다. TMD의 생물학적 특성은 TA 단백질을 올바른멤브레인(29)으로유도하기에 충분하고 충분하다. 정의된 서열 모티브가 아닌 생물물리학적 특성의 인식은 표적 통로5의충실도를 제한한다. 따라서, TA 단백질의 오현지화는 프로테오스타증 네트워크에 대한 일반적인 스트레스이다. GET 통로의 억제와 같은 세포 스트레스는 이러한 단백질이 즉시제거되지않는 한 OMM 및 미토콘드리아 기능 장애에 대한 단백질 오현지화의 증가를 일으킨다30,31.
막 프로테오스타증의 일반적인 주제는 AAA+(세포 Activities로 분리된 TPase A)단백질을 사용하여 지질 이중층1, 32,33,34,35,36,37,38에서 오래된, 손상또는 잘못 지역화된 단백질을 제거하는것입니다. . AAA+ 단백질은 hexameric 링을 형성하고 ATP 의존적인 움직임을 거쳐 기판을 리모델링하는 분자 모터이며, 종종 좁은 축 모공을 통해 전좌로39,40을한다. AAA+ ATPases에 의해 막 단백질의 추출을 연구하는 데 큰 노력이 전념되었지만, 재구성은 복잡하거나 지질 양성자로부터 기판 추출 메커니즘을 검사하는 실험력을 제한하는 지질 및 세제41,42의혼합물을 포함합니다.
Msp1은 OMM 및 peroxisomes에 고정된 매우 보존된 AAA+ ATPase로, 잘못 지역화된 TA 단백질43,44,45,46,47을제거하여 막 프로테오스타시스에서 중요한 역할을 한다. Msp1은 또한 최근에 OMM48을가로질러 전가되는 막 단백질을 제거하여 미토콘드리아 단백질 수입 스트레스를 완화하는 것으로 나타났다. Msp1 또는 인간 호모로그 ATAD1의 손실은 미토콘드리아 단편화, 산화 인산화, 발작, 뇌졸중 후 부상 증가, 조기 사망31,49,50,51,52,53,54,55, 56을초래한다.
우리는 Msp1과 TA 단백질을 공동 재구성하고 지질이중층(57)으로부터추출을 검출할 수 있음을 보여주었다. 이러한 단순화된 시스템은 OMM(도1)58,59를모방한 정의된 리포솜으로 재구성된 완전 정제 된단백질을사용합니다. 실험 적인 대조의이 수준은 다른 AAA+ 단백질을 관련시키는 더 복잡한 재구성으로 실험적으로 난치성 기판 추출의 상세한 기계론적 질문을 해결할 수 있습니다. 여기서, 우리는 리포솜 제제, 막 단백질 재구성 및 추출 분석법을 위한 우리의 방법을 상세히 설명하는 실험 프로토콜을 제공합니다. 이러한 실험적 세부 사항이 멤브레인 프로테오스타증의 필수적이지만 제대로 이해되지 않은 과정에 대한 추가 연구를 용이하게 할 수 있기를 바랍니다.

<table><tbody><tr><td>Biobeads</td><td>Bio-Rad</td><td>1523920</td><td></td></tr><tr><td>소 간 포스파티딜 이노시톨</td><td>Avanti</td><td>840042C</td><td>PI</td></tr><tr><td>닭 달걀 포스파티딜 콜린</td><td>Avanti</td><td>840051C</td><td></td></tr><tr><td>PC 닭 달걀 포스파티딜 에탄올아민</td><td>Avanti</td><td>840021C</td><td>PE</td></tr><tr><td>ECL SELECT WESTERN BLOTTING DETECTION 시약</td><td>GE</td><td>RPN2235</td><td></td></tr><tr><td>필터 지원</td><td>Avanti</td><td>610014</td><td></td></tr><tr><td>유리 바이알</td><td>VWR</td><td>60910L-1</td><td></td></tr><tr><td>글루타티온 스핀 컬럼</td><td>Thermo Fisher</td><td>PI16103</td><td></td></tr><tr><td>염소 방지</td><td>Thermo Fisher</td><td>NC1050917</td><td></td></tr><tr><td>미니 압출기</td><td>Avanti</td><td>610020</td><td></td></tr><tr><td>폴리카보네이트 멤브레인</td><td>Avanti</td><td>610006</td><td>200 nM</td></tr><tr><td>PVDF 멤브레인</td><td>Thermo Fisher</td><td>88518</td><td>45 &micro; M</td></tr><tr><td>Rabbit anti-FLAG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7245</td><td></td></tr><tr><td>합성 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine</td><td>Avanti</td><td>840035C</td><td>DOPS</td></tr><tr><td>합성 1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol</td><td>Avanti</td><td>710335C</td><td>TOCL</td></tr><tr><td>주사기, 1mL</td><td>Norm-Ject</td><td>53548-001</td><td></td></tr><tr><td>주사기, 1mL, 기밀</td><td>아반티</td><td>610017</td><td></td></tr></tbody></table>

완전히 정제된 구성 요소로 msp1 추출 활동의 재구성

Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components

산화 인산화 및 세포제 조절의 중심지인 미토콘드리아는 인간의 건강에 중요한 역할을 합니다. 적절한 미토콘드리아 기능은 단백질 항상성(proteostasis)을 유지하기 위한 견고한 품질 관리 시스템에 달려 있습니다. 미토콘드리아 프로테오스타증의 감소는 암, 노화, 신경 변성 및 기타 많은 질병과 관련이 있습니다. Msp1은 잘못 지역화된 꼬리 고정 단백질을 제거하여 프로테오스타시스를 유지하는 외부 미토콘드리아 막에 고정된 AAA+ ATPase입니다. 프로테오올리푸좀으로 재구성된 정제 성분을 사용하여, 우리는 Msp1이 지질 이중층에서 모형 꼬리 고정 단백질을 추출하는 데 필요하고 충분하다는 것을 보여주었습니다. 우리의 단순화 된 재구성 시스템은 막 단백질 추출의 상세한 연구를 방해 한 기술적 장벽의 몇 가지 극복. 여기서, 우리는 리포솜, 막 단백질 재구성 및 Msp1 추출 분석의 생성을 위한 상세한 방법을 제공합니다.

결과를 제대로 해석하려면 얼룩이없는 젤과 서부 얼룩을 함께 보아야합니다. 얼룩없는 젤은 모든 샘플에 걸쳐 동일한 로딩을 보장합니다. 얼룩 없는 젤을 볼 때, 샤페론(GST-칼모둘린 및 GST-SGTA)은 입력(I) 및 ELUTE(E) 레인에서 볼 수 있습니다. 이러한 대역의 강도가 모든 입력 샘플에서 균일한지 다시 확인합니다. 마찬가지로 ELUTE 샘플에서 강도가 균일하게 유지되도록 합니다. ELUTE는 입력보다 5배 더 농축되어 있으며 강도의 차이는 젤에서 볼 수 있습니다.
얼룩 없는 젤을 사용하여 적절한 하중을 확인한 후, 서풍 블롯을 검사하여 추출 활성을 결정합니다. 입력(I) 분획에 비해 ELUTE(E) 분획의 기판 양을 비교하여 추출 활동을 측정합니다. 유량 통과(FT)의 신호는 일부 가변성을 나타내지만 일반적으로 입력 분획과 유사합니다. WASH(W) 분획에는 신호가 없어야 합니다. 전형적으로, 음수 제어에 대한 양수 제어 및 1...

여기에서 정의 된 프로테오올리포솜의 완전히 정제 된 구성 요소로 Msp1 추출 활동을 재구성하기위한 자세한 프로토콜을 제시합니다.

완전히 정제된 구성 요소로 Msp1 추출 활동의 재구성

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function ...

지질 이중층에서 단백질을 제거하기 위해 AAA-ATPases를 사용하는 것은 단백질 품질 관리에서 일반적인 주제입니다. 이 필수 프로세스에 대한 기계적 이해는 재구성된 시스템이 필요합니다. AAA-ATPases와의 이전 재구성은 복잡하고 이질적이었습니다.우리의 시스템은 간단하고 완벽하게 정의됩니다. 이를 통해 AAA-ATPase Msp1, 기판 및 지질 환경을 조작할 수 있습니다. 시작하려면 이전에 준비된 재구성 버퍼, 정제된 Msp1 및 TA 단백질 및 리포솜을 PCR 튜브에 추가한 다음 혼합물을 얼음에 10분 동안 배양합니다.인큐베이션 하는 동안, 직경의 인치의 약 1/8에 P200 파이펫 팁의 끝을 잘라. 다음으로, 균일한 혼합물을 얻기 위해 BioBeads를 철저히 함유하는 튜브를 소용돌이시다. 그런 다음 뚜껑을 신속하게 제거하고 절단 된 P200 파이펫 팁을 사용하여 구슬의 적절한 볼륨을 빈 PCR 튜브로 전송합니다.재구성을 위한 10분 인큐베이션이 완료되면, 절단되지 않은 파이펫 팁을 사용하여 BioBeads에서 모든 액체를 제거합니다. 그런 다음, BioBeads와 튜브로 재구성의 100 마이크로 리터를 전송하고 16 시간 동안 바퀴에 회전 할 수 있습니다. 다음 날, 피코푸지에서 튜브를 회전하여 구슬을 펠릿한 다음 재구성된 재료를 깨끗한 PCR 튜브로 옮기고 튜브를 얼음 위에 보관합니다.리포솜으로 재구성하지 못한 단백질을 제거하기 위해 글루타티온 스핀 컬럼을 추출 버퍼로 평형화하며, 이는 일반적으로 400 마이크로리터의 완충제로 3라운드를 세척한 다음 원심분리를 통해 버퍼를 제거합니다. 다음으로, 각 샤페론의 5마이크로몰을 재구성된 물질에 추가하고, 100마이크로리터의 추출 버퍼를 추가하여 최대 200마이크로리터의 부피를 가져온다. 이 혼합물을 평형 글루타티온 스핀 컬럼에 추가한 다음 스핀 컬럼을 연결하고 30분 동안 회전하여 샤페론이 수지에 결합할 수 있도록 합니다.회전 후 열을 짧게 회전합니다. 응집된 단백질의 고갈된 미리 지워진 물질인 흐름을 수집합니다. 얼음 위에 놓고 추출 분석으로 직접 진행합니다.SDS 페이지 분석을 위해 튜브를 준비합니다. 입력 튜브에 이중 증류수 45마이크로리터, 유동 튜브에 40 마이크로리터, 각 튜브에 4X SDS-PAGE 적재 버퍼16.6 마이크로리터를 추가합니다. 추출 분석의 경우 추출 반응을 준비하고 추출 버퍼로 최종 부피를 200 마이크로리터로 끌어올수 있습니다.그런 다음 추출 분석체를 섭씨 30도 의 열 블록에서 2 분 동안 미리 데우십시오. 분석작업을 시작하려면 ATP를 2밀리몰의 최종 농도에 추가합니다. 피코푸지에서 5초 동안 튜브를 회전시키고 30분 동안 섭씨 30도에서 배양합니다.인큐베이션 중에 반응의 5마이크로리터 샘플을 채취하고 입력 튜브에 추가합니다. 또한, 이전에 입증된 바와 같이 추출 분석에서 각 샘플에 대해 하나의 글루타티온 스핀 컬럼을 평형화한다. 30분 분량의 인큐베이션이 완료되면 200마이크로리터의 추출 버퍼를 튜브에 추가하여 총 부피4000마이크로리터를 넣습니다.그런 다음 평형 글루타티온 수지에 이 반응을 추가하고 섭씨 4도에서 30분 동안 회전할 수 있습니다. 회전 후 컬럼을 회전하여 흐름을 수집한 다음 유동 튜브에 대해 10 마이크로리터 샘플을 채취합니다. 추출 버퍼 400 마이크로리터로 수지를 두 번 세척하여 세척 후 흐름을 폐기합니다.세 번째 세척 후, 흐름을 유지하고 세척 튜브에 대한 50 마이크로 리터 샘플을 가져 가라. 다음으로, 추출 버퍼에 5 밀리몰의 최종 농도에 감소 된 글루타티온을 추가하여 용출 버퍼의 5 밀리리터를 준비합니다. 용출 버퍼 200 마이크로리터를 스핀 컬럼에 추가하고 5분 동안 배양합니다.그런 다음 컬럼을 원심분리하고 흐름을 수집합니다. 용출 단계를 다시 한 번 반복합니다. 두 번째 용출 후 용액 샘플에서 50 마이크로 리터 알리코트 (aliquot)를 가져 와서 엘루트 튜브에 추가하십시오.서부 블롯을 실행한 후, 추출 효율은 엘루트 분획내의 기판의 양을 입력 분획과 비교하여 결정될 수 있다. 유동에서의 신호는 일부 가변성을 나타내지만 일반적으로 입력 분획과 유사하며 세척 분획에는 신호가 없습니다. 전형적으로, 음수 제어를 위한 약 10%의 추출 효율과 음수 제어를 위한 1~2%의 추출 효율이 있다.재구성 조건이 최적화되지 않은 경우 추출 수준은 양수 샘플과 음수 샘플 간의 비교됩니다. 이 기술은 우리의 실험실이 Msp1에 의한 인식에 영향을 미치는 기판의 생물학적 특성을 시험할 수 있었습니다.

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연구

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Biochemistry

생화학

여기서 우리는 매우 적극적인 Hsp104, hexameric AAA + 단백질 효모, 단백질 disaggregation에 커플 ATP의 가수 분해로부터의 정화를 위해 프로토콜을 설명합니다. 이 제도는의 친화력 정화를위한 His6 - 태그 구축을...

Hsp104의 정화, 단백질 Disaggregase

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Nanodisc 지질 입자로 ABC의 전송의 Reconstitution을위한 단계별 방법

이 비디오는 리포좀의 지질 이중층에 통합된 잘못 국소화된 TA 단백질의 Msp1 매개 제거를 연구하기 위한 체외 프로토콜을 보여줍니다. Msp1 및 TA 단백질은 리포솜으로 동시 재구성되며, TA 단백질의 ATP 의존적 전좌는 친화성 정제를 통해 확인됩니다.

잘못 국소화된 TA 단백질의 제거를 연구하기 위한 Msp1 추출 분석

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한 단계 연쇄상-Tactin 수지 비스 (술포 숙신 이미 딜)로 가교 수베 (BS3)에 트윈 연쇄상 구균 - 태그 단백질과 그들의 단지의 정화

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사전 형성된 나노디스크에 공동 번역하여 삽입하면 세제와의 접촉 없이 정의된 지질 환경에서 무세포 합성된 막 단백질을 연구할 수 있습니다. 이 프로토콜은 필수 시스템 구성 요소의 준비와 발현 효율성 및 샘플 품질을 개선하기 위한 중요한 파라미터를 설명합니다.

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