Name: 장내 미생물군유전체 박테리아를 위해 농축하는 야생 케노르하비티스 선충제의 선택적 세척 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: 배우세요 야생 Caenorhabditis 선충의 장내 미생물군유전체 박테리아 농축 방법을. 도우저 단계의 저항성을 활용하여 배양 불가능한 미생물을 연구하고 숙주-미생물 상호작용을 탐구합니다.

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크리스티안 브라렌들 박사와 센터 내셔널 드 라 레체쉬 시엔티피크(CNRS) 누라게 스 필드 스테이션에 감사드립니다.

1. NGM 플레이트에 야생 선충을 위한 다우어 형성 유도
<ol><li>OP50-1 대장균을 식품 원으로 표준 NGM 플레이트에 야생 Caenorhabditis 균주를 성장시키는 것은 관심있는 미생물로 벌레를 얻은 후. 선충을 20°C에서 배양한다. 참고: Caenorhabditis 선충을 성장시키는 표준 온도는 15-25°C 사이이지만 관심 있는 미생물의 손실을 방지하기 위해 경험적으로 결정되어야 합니다.</li>
	<li>모든 OP50-1이 소비되고 대다수가 dauer 단계에 도달할 때까지 4-5 일 동안 동물의 접시를 4-5 일 동안 굶어. 참고: Dauers는 영양의 부재로 인해 발전하고 보호 큐티클이 있는 장수 유충입니다.</li>
</ol>2. 선충 세척
<ol><li>M9 최소 염5m(42m Na2HPO4, 22m KH2PO4, 8.6mM NaCl, 19m NH4Cl)을 6cm 의 노간 웜 플레이트에 추가합니다.</li>
	<li>멸균 유리 파이펫과 전구를 사용하여 플레이트에서 M9과 웜을 피펫으로 올려 멸균 15mL 원심분리기 튜브로 이송합니다.</li>
	<li>임상 원심분리기를 사용하여 실내 온도에서 30 초 동안 1000 x g 의 튜브내 웜을 회전시하십시오.</li>
	<li>멸균 15mL 파이펫을 사용하여 웜 펠릿 위의 M9 상체를 제거하고 폐기하십시오. 벌레 위에 M9의 약 50 μL을 남겨 튜브 의 바닥에 있는 살아있는 벌레를 방해하지 마십시오.</li>
	<li>동일한 원심분리기 튜브에 Triton X-100의 M9 + 0.05%의 M9 + 0.05%를 추가하고 튜브의 캡을 적절히 조입니다.</li>
	<li>외부 미생물을 제거하기 위해 실온에서 20 분 동안 영양사에 튜브를 배양하십시오. 영양사에서 튜브를 제거하고 30 s에 대한 1000 x g 에서 벌레를 회전.</li>
	<li>멸균 파이펫을 사용하여 벌레의 펠릿 위의 M9 상체를 제거하고 폐기하십시오. 벌레 위에 M9의 약 50 μL을 남겨 튜브 의 바닥에 있는 살아있는 벌레를 방해하지 마십시오.</li>
	<li>2.5-2.8 단계를 3번 더 수행합니다.</li>
</ol>3. 선충소 소독
<ol><li>0.25% SDS(10% SDS의 250 μL), 카베니실린 50 μg/mL을 추가하여 M9 완충제 10mL로 항생제 및 SDS 용액을 준비하고, 카나마이신 25μg/mL, 테트라사이클린 12.5 μg/mL, 젠타마이신 100μg/mL, 연쇄상 구균 50μg/mL, 클로람페니콜 37.5 μg/mL, 실포메메의 200μg/mL( 실체).</li>
	<li>항생제및 SDS 용액에 선충을 함유한 튜브를 밤새 실온에서 누에이터에 배양한다. 참고 : 모든 비 dauer 벌레와 배아는 죽을 것이다, 하지만 dauer 벌레의 대부분은이 청소 과정에서 살아남을 것이다.</li>
</ol>4. 항생제 및 SDS 용액 제거
<ol><li>실온에서 1 분 동안 1000 x g 로 튜브의 벌레를 회전시십시오. 멸균 파이펫을 사용하여 튜브 바닥의 웜을 방해하지 않고 원심분리기 튜브에서 상퍼를 제거합니다.</li>
	<li>M9 + 0.05% 트리톤 X-100의 10mL를 추가하고 튜브의 캡을 적절히 조입니다. 실온에서 20 분 동안 영양사에 튜브를 배양하십시오.</li>
	<li>누에이터에서 튜브를 제거하고 1 분 동안 1000 x g 에서 벌레를 회전시십시오. 4.2-4.3 단계를 세 번 수행합니다.</li>
	<li>마지막 세척 후, 웜 펠릿을 용액의 100 μL의 바닥에 방해받지 않고 두고 나머지는 폐기하십시오.</li>
</ol>5. 깨끗한 선충 균주를 전파
<ol><li>멸균 유리 파이펫을 사용하여, OP50-1로 시드된 10cm NGM 플레이트의 중앙으로 상체및 펠릿의 100 μL을 전송한다. 중앙의 액체를 방해하지 않고 접시가 건조되도록 하십시오.</li>
	<li>다우어가 중앙에서 5-10분 동안 OP50-1 잔디를 기어 나갈 수 있도록 합니다.</li>
	<li>조심스럽게 하나의 단일 dauer를 선택하고 6cm NGM 시드 플레이트에 접시. 총 10개의 다이어를 선택하고 OP50-1(총 10플레이트)로 시드된 개별 6cm NGM 플레이트로 플레이트를 플레이트합니다.</li>
	<li>20°C에서 4-5일 동안 플레이트를 배양하여 다이어가 성장하고 다음 세대(F1)가 성인 단계에 도달할 때까지 배양한다. 비 OP50-1 미생물 성장으로 간주되는 모든 플레이트의 오염을 시각적으로 확인합니다.</li>
	<li>각 클린 플레이트에 대해, 관심표현형에 따라 노마르스키 또는 형광 현미경검사법을 통한 관심있는 미생물의 전파를 확인한다(FISH)12)</li>
</ol>6. 미생물 종의 장 해부 및 PCR 식별
<ol><li>3-4일 동안 20°C에서 동물을 재배하여 굶어 굶어 내고 OP50-1 박테리아의 양을 줄입니다. 굶주리고 있는 벌레 접시에 M9 용지 5mL를 추가합니다.</li>
	<li>멸균 유리 파이펫과 전구를 사용하여 플레이트에서 M9 + 웜을 파이펫으로 올려 멸균 15mL 원심분리기 튜브로 이송합니다.</li>
	<li>임상 원심분리기를 사용하여 실내 온도에서 30 초 동안 1000 x g 의 튜브내 웜을 회전시하십시오.</li>
	<li>멸균 15mL 파이펫을 사용하여, 튜브 의 바닥에 살아있는 벌레를 방해하지 않고 원심 분리기 튜브에서 상체를 제거합니다.</li>
	<li>M9 + 0.05% 트리톤 X-100의 10mL를 추가하고 외부 미생물을 제거하기 위해 20 분 동안 nutator에 튜브를 배양합니다. 벌레를 씻기 위해 네 번 반복하십시오.</li>
	<li>마지막 세척 후, 멸균 파이펫 팁을 사용하여, 용액의 100 μL에서 하단의 펠릿을 방해하지 않고 상체를 제거합니다.</li>
	<li>멸균 파이펫 팁을 사용하여 M9과 웜을 시드없는 NGM 플레이트로 옮기고 벌레가 20분 동안 기어 다니는 동안 플레이트가 건조하게 하여 큐티클과 내장에서 OP50-1을 제거합니다.</li>
	<li>말린 플레이트에 250 μL의 M9을 추가하고 유리 파이펫을 사용하여 M9 + 웜을 새로운 시드되지 않은 NGM 플레이트로 옮킵니다. 다시 말하지만, 그 접시를 건조하게하고 벌레가 20 분 동안 기어 다니도록하십시오.</li>
	<li>플레이트에 M9 250 μL을 추가하고 M9 + 웜의 100 μL을 깨끗한 시계 유리로 옮기습니다.</li>
	<li>멸균 26 G 주사기 바늘 2개를 사용하여 웜을 한 바늘로 잡고 다른 바늘을 사용하여 벌레를 잘라 내어 선충을 참수합니다. 참수 후, 내장 (세분화) 및 몸에서 gonad (투명) 자연스럽 게 몸에서 나올 것 이다.</li>
	<li>하나의 바늘로 내장을 잡고 다른 바늘로 절단하여 노출 된 장의 조각을 잘라. 참고: 가능하면, 관심있는 미생물이 여전히 Normarski 현미경 검사법, FISH, 또는 면역 조직 화학23을 사용하여 에버틴 장에 존재하는지 확인하십시오.</li>
	<li>10 μL의 멸균 수를 포함하는 0.5 mL PCR 튜브로 해부된 단일 내장을 전송합니다. 다른 동물에서 내장을 포함하는 적어도 5 PCR 튜브의 총 반복.</li>
	<li>최소 5분 동안 -80°C에서 PCR 튜브를 동결합니다. 냉동고에서 PCR 튜브를 제거하고 샘플을 해동합니다.</li>
	<li>액체를 위아래로 몇 번 피펫하여 박테리아를 장으로부터 분리합니다.</li>
	<li>세균의 작은 리보소말 서브유닛의 DNA 서열에 대하여 보편적 인 입문서 쌍을 사용하여 PCR을 실시, 효모, 또는 현미경 포리디아, 미생물의 의심 유형에 따라. 참고: 예를 들어 범용 세균 16S 프라이머를 사용하는 샘플 프로토콜이 표 1에 제시됩니다.</li>
	<li>필터 기반 DNA 세척 및 농도 키트( 재료 표 참조)를 사용하여 앰플리코온을 정화하고 Sanger 시퀀싱을 수행합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

이 프로토콜은 일련의 세척 절차를 사용하여 야생 분리 된 Caenorhabditis 선충으로부터 미생물의 격리 및 식별을 설명합니다. 수많은 미생물은 야생 고립 된 선충과 관련이 있으며, 그 중 일부는 숙주 미생물 상호 작용및 타고난 면역에 대한 향후 연구에 사용할 수있는 흥미로운 표현형을 가지고 있습니다. 많은 컬투울림 미생물군유전체와 병원성 박테리아는 체외 세균 성장에 대한 표준 기술을 사용하여 야생 Caenorhabditis 선충으로부터 분리되었습니다25,26. 그러나 모든 미생물이 체외에서 배양 될 수있는 것은 아니며 야생 선충에서 균증해야합니다. 일부 미생물은 현미경포리디아와 같은 내성 포자 단계를 가지고 있으며, SDS의 고농도는 대부분의 박테리아와 곰팡이를 죽이는 데 사용할 수 있으며, 포자의 특정 농축을 허용12. 이 프로토콜은 SDS 및 항생제 치료에 저항하지 않는 막연한 장 세균을 풍부하게 하는 방법을 제시합니다.
여기에 제시된 기술은 큐티클의 강화, 인두 펌핑 억제, 부칼 플러그27로 입을 덮는 등의 생리적 변화로 인해 동물에서 볼 수 있는 환경 저항을 활용합니다. 이 프로토콜의 중요한 단계는 다양한 항생제와 0.25 % SDS를 가진 하룻밤 배양입니다. 이 단계는 내부 미생물을 그대로 유지하면서 모든 외부 미생물을 죽이는 데 사용됩니다. C. elegans dauers는 30 분27에 대한 10 %에서 높은 SDS 농도를 생존하기 위해 입증되었지만,이 프로토콜은 미생물을 죽일뿐만 아니라 항생제에 박테리아를 더 노출하기 위해 중등하지만 장기간 인큐베이션을 사용합니다. 더욱이, SDS의 적당한 농도는 C. tropicalis의 노출이 하룻밤 사이에 1% SDS에 노출되어 모든 dauer 동물의 죽음을 초래했기 때문에 다른 Caenorhabditis 종의 다우어가 살아남을 수 있도록 도울 수 있습니다. 모든 dauers가 죽으면 SDS 및 /또는 SDS에 대한 노출 길이의 농도를 줄여야합니다. 반대로, F1 생성 플레이트가 세척 후에도 여전히 가시적인 오염이 있는 경우 SDS 농도및 인큐베이션 시간이 증가해야 합니다.
또 다른 중요한 단계는 청소 후 단일 dauer 동물의 격리입니다. 이 단계는 모든 동물이 SDS와 항생제 치료 후에 깨끗하지 않기 때문에 중요합니다. 따라서, 동물은 OP50-1이 있는 10cm NGM 플레이트의 중앙에 배치되고 바깥쪽으로 복사하여 기어갈 수 있다. OP50-1을 통해 확장 크롤링이 큐티클에 부착 된 잠재적 생존 미생물을 제거하는 데 도움이 나타납니다으로 종종 더 많은 단면 동물을 선택하는 것이 가장 좋습니다. 그러나, 이것은 고주파에서 인구에 존재하지 않는 경우에 관심있는 미생물을 위해 풍부하게 하는 것이 더 어려울 것이기 때문에, 프로토콜의 한계로 이끌어 냅니다. 여기서, 준수 알파프로테오박테리아는 인구의 90%-95%에서 존재하였다; 따라서 대부분의 깨끗한 플레이트에는 미생물군유전체 박테리아가 있었습니다. 그러나, 관심있는 미생물이 인구에서 훨씬 더 낮은 주파수에 존재하는 경우에, 더 많은 F1 플레이트를 스크린할 필요가 있을 지도 모릅니다.
이 프로토콜은 야생 선충에서 발견되는 관심있는 비 과실 미생물의 수를 격리하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나, 미생물은 dauer 자화에 의해 보호되는 조직에 있어야 하며, 다이어 동물에서 살아남을 수 있고, 숙주에서 관찰 가능한 표현형을 가지고 있어야 한다. 이와 같이, 이 기술은 여기에 기술된 알파프로테오박테리아 종 외에 장 루멘에 있는 다른 미생물군유전체 박테리아를 풍부하게 하는 데 사용될 수 있다, 부착하지 않는 박테리아를 포함. 또한, 프로토콜은 선충 Oscheius tipulae28을 감염시키는 성세포 내 세균, 보르데텔라 아트로피를 위해 풍부하게 하기 위하여 이용되었습니다. 농축 후, B. atropiNGM 플레이트에 식민지를 형성 하는 것으로 나타났습니다., 관심의 미생물 빠른 성장 오염 물질을 제거 되 면 시험관에서 컬터수 발견 될 수 있습니다 보여주는. 이 기술은 가능성이 현미경 및 바이러스에 대 한 작동 할 것 이다, Orsay 바이러스를 포함 하 여, 세포 내 박테리아를 풍부 하 게이 능력을 주어진. 그러나, 이 세균은 dauer의 전환에서 살아남을 수 있어야 합니다.
이 프로토콜은 생물 안전 수준 1 실험실에서 수행 될 수 있지만, 추가 미생물 오염을 방지하기 위해 멸균 기술을 전체적으로 유지해야한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 프로토콜은 항생제의 모형/농도, SDS의 백분율 및/또는 nystatin와 같은 항진균의 추가를 포함하여 연구원의 필요에 따라 변경될 수 있습니다. 종종 야생 으로 격리 된 선충에서 발견되는 미생물을 오염시키는 미생물의 수는 극적으로 다를 수 있습니다. 여기서, NGM 플레이트에 비 OP50-1 대장균 성장의 명백한 손실은 깨끗한 선충 균주에 대한 판독으로 사용되었다. 그러나, 오염 미생물의 비컬링수집단이 존재할 수 있으니, 오염의 정도를 보기 위해서는 16S rRNA 앰플리시온 염기서열분석과 같은 메타게노믹스 방법을 수행하는 것이 필수적이다. 웜 스트레인이 세척되면 향후 연구를 위해 동결 및 저장될 수 있습니다. 전반적으로, 이 프로토콜은 연구원이 야생 선충에 있는 culturable 세균을 풍부하게 하고, 호스트 적정에 대한 효력을 연구하고, 식민지 또는 감염의 표현형을 특성화하고, 유전 공구를 활용하여 호스트 세균 상호 작용의 근본적인 기계장치를 이해하는 것을 허용합니다.

유전 모형 유기체 C. elegans는 호스트 세균 상호 작용을 공부하기 위하여 생체 내 시스템에서 우수합니다1,2. 그(것)들은 그밖 동물에 비교된 상대적으로 간단한 생리학이 있습니다, 그러나, 그들의 세포 생물학의 대부분은 생물학 연구를 위한 좋은 모형을 만드는 포유류와 근본적으로 유사합니다1,3,4. 또한, 그들은 현미경, 유지 보수 하기 쉬운, 그리고 그들의 짧은 수명 내내 투명 하 게 유지. 이러한 속성호스트-미생물 상호 작용 및 생체 내 감염 및 유전적으로 유연한 호스트의 식민지화를 관장하는 메커니즘으로 의신속한 연구를 가능하게 합니다5,6. 마지막으로, C. elegans는 세균성, 곰팡이 및 바이러스 감염에 빠르게 반응하여 숙주 미생물 상호 작용과 장용 미생물7,8,9을 연구하는 훌륭한 모델입니다.
야생 C. 예인대 및 기타 선충의 샘플링의 증가는 자유 살아있는 선충과 자연적인 유전 변이의 생태학에 대한 연구를 허용했습니다10,11. 동시에, 샘플링은 또한 C. elegans12,13,14,15와 상호 작용하는 자연적으로 발생하는 생물학적 병원균 및 미생물의 발견을 증가시켰으며, 바이러스, 박테리아, 현미경, oomycetes, 또는 곰팡이16,18,19,29,20과의 상호 작용을 연구하는 많은 숙주 미생물 모델 시스템의 설립으로 이어졌습니다. . 일반적으로 야생 C. 예르간은 썩어가는 줄기와 과일에서 종종 더 온화한 기후에서 발견되며 대부분 자체 re프로생산21입니다. 이 견본이 실험실로 가져오면, 야생 선충은 관련미생물의 배열을 운반하는 클로날 인구로 격리됩니다. Caenorhabditis 선충에 관심있는 새로운 미생물을 발견 할 때, 동물은 종종 쉽게 시각화 표현형을 사용하여 현미경 에 의해 감염 또는 식민지화를 위해 직접 검사됩니다. 예를 들어, 바이러스 감염은 장 구조의 붕괴로 시각화될 수 있으며, 현미경 스포리디안 단계는 주전 세포 내부에서 포자 또는 메론츠14,22로 볼 수 있다. 향후 조사를 위해 관심있는 미생물이 발견되면 야생 선충에서 발견되는 다른 오염 미생물과 분리되어 격리되어 연구 할 수 있어야합니다. 많은 경우에, 관심있는 미생물은 시험관 내에서 배양 될 수 없습니다.
예를 들어, 이 프로토콜은 선충의 장 루멘 내에서 식민지화되는 박테리아를 함유하는 C. 열대 성 의 야생 분리를 설명하고, 방향성 방식으로 장 상피 세포를 준수한다. 페노전성, 박테리아는 장 루멘의 내부 측면을 따라 수직으로 성장하여, 동물의 모든 단계에서 표준 Normarski 현미경으로 시각화된 강모와 같은 외관을 제공합니다. 이 야생 C. 열대 균 주가 재배된 선충 성장 배지(NGM) 플레이트에는 다른 미생물과의 가시 오염이 포함되어 있습니다. 이 프로토콜은 이 알려지지 않은 부동 세균을 연구하기 위한 플레이트에 추가오염 미생물 성장을 감소시키기 위하여 개발되었습니다. 선충은 루멘의 박테리아를 보호하기 위해 dauer 단계로 강제로 들어갔고 일련의 세척을 사용하여 청소했습니다. 그 후, 알려지지 않은 세균종은 시퀀싱을 위한 16S 리보소말 DNA의 장 및 PCR 증폭의 해부에 의해 확인되었다.
전반적으로, 이 프로토콜은 잠재적으로 야생 잡은 선충과 관련 되 었던 관심의 어떤 미생물을 풍부하게 할 수 있습니다. 그 후, 연구원은 표적 미생물을 식별하고, 현미경 검사를 통해 생체 내 감염 또는 식민지 화형으로 시각화하고, 호스트 피트니스 또는 숙주 미생물 상호 작용의 다른 측면에 대한 효과를 연구할 것입니다. Caenorhabditis 선충과 상호 작용하는 새로운 미생물 종의 격리 및 조사는 미생물 병인 및 미생물 연구 와 관련된 숙주 미생물 상호 작용의 호스트 면역 및 새로운 패러다임의 유전 메커니즘을 발견 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>아가로스</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP1356</td><td></td></tr><tr><td>10% SDS</td><td>인비트로젠</td><td>AM9822</td><td></td></tr><tr><td>BD 프리시전글라이드 니들 - 26 G</td><td>피셔 사이언티</td>픽 <td>305115</td><td></td></tr><tr><td>카르베니실린</td><td>밀리포어-시그마</td><td>C1389-1G</td><td></td></tr><tr><td>세포탁심</td><td>밀리포어-시그마</td><td>C7039-500mg</td><td></td></tr><tr><td>클로람페니콜</td><td>Millipore-Sigma</td><td>C0378-25G</td><td></td></tr><tr><td>DNA 클린 및 농축기 키트</td><td>Zymo Research</td><td>11-303C</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq 중합효소</td><td>Fisher Scientific</td><td>EP0711</td><td></td></tr><tr><td>겐타마이신</td><td>Millipore-Sigma</td><td>G1264-250mg</td><td></td></tr><tr><td>카나마이신</td><td>Millipore-Sigma</td><td>K1876-1G</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>P-286</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>S-671</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>A-661</td><td></td></tr><tr><td>스트렙토마이신</td><td>밀리포어-시그마</td><td>S6501-50G</td><td></td></tr><tr><td>테트라사이클린</td><td>밀리포어 시그마</td><td>T7660-5G</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP-151</td><td></td></tr><tr><td>시계 안경</td><td>VWR</td><td>470144-850</td><td></td></tr></tbody></table>

장내 미생물군유전체 박테리아를 위해 농축하는 야생 케노르하비티스 선충제의 선택적 세척

Selective Cleaning of Wild Caenorhabditis Nematodes to Enrich for Intestinal Microbiome Bacteria

Caenorhabditis elegans (C. elegans)는 호스트 미생물 상호 작용과 미생물군유전체를 연구하기위한 훌륭한 모델로 입증되었으며, 특히 장의 맥락에서. 최근, 야생 Caenorhabditis 선충의 생태 샘플링은 박테리아, 바이러스, 곰팡이 및 현미경을 포함하여 관련 미생물의 다양한 배열을 발견했습니다. 이 세균의 다수는 추가 연구 를 보증 하는 흥미로운 식민지 또는 감염 표현형, 하지만 그들은 종종 culturable. 이 프로토콜은 C. elegans 및 관련 선충에서 원하는 장 내 미생물을 풍부하게 하고 표피를 고수하는 많은 오염 미생물의 존재를 감소시키는 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 동물을 개발 단계로 강제하고 일련의 항생제 및 세제 세차재를 사용하여 외부 오염을 제거하는 것을 포함합니다. dauer 동물은 가혹한 환경 조건에서 선충을 보호하는 생리적 변화가 있기 때문에, 모든 장 내 미생물은 이러한 조건으로부터 보호될 것입니다. 그러나 농축이 작동하려면 동물이 다우어로 발전할 때 관심있는 미생물을 유지해야합니다. 동물들이 다이어 스테이지를 떠날 때, 그들은 노래적으로 개별 라인으로 전파됩니다. F1 인구는 다음 원하는 미생물 또는 감염 표현형을 위해 그리고 가시오염에 대하여 선택됩니다. 이 방법은 연구원이 C. elegans 및 세포내 장 병원체의 자연적인 미생물의 일부를 구성하는 장 루멘에 있는 culturable 세균을 풍부하게 하는 것을 허용할 것입니다. 이 세균은 그 때 식민지 또는 감염 표현형 및 호스트 적정에 그들의 효력을 위해 공부될 수 있습니다.

야생 C. 열대 균주 (JU1848) 프랑스 령 기아나의 누라그 숲에서 썩은 야자수 과일에서 격리 되었다 (그림 1A)24. 이 균주는 방향성 방식으로 장의 루멘을 식민지화하는 얇은 미생물을 갖는 것으로 나타났습니다 (도 1B). 이 미생물은 균주 JU1848과 공동 배양을 통해 C. 엘레간스 스트레인 N2로 쉽게 옮겨졌으며, 이 때 장의 루멘을 유사하게 식민지화하였다.
여러 세대에 걸쳐 대장균 OP50-1로 시드된 표준 NGM 플레이트에서 JU1848의 전파는 지속적으로 가시적인 오염을 초래했으며, OP50-1 잔디 안팎의 다양한 어두운 점막 콜로니로 여겨진다(그림 2A). 야생 JU1848의 접시는 동물을 도어로 강제로 굶주려 설명된 대로 청소했습니다. 청소에서 살아남은 단일 도어 동물은 OP50-1로 시드된 개별 6cm NGM 플레이트에 도금되어 20°C에서 4일 동안 성장할 수 있었습니다. F1 자손의 다중 플레이트는 눈에 보이는 미생물 오염 없이 관찰되었다(도 2B). F1 자손은 여전히 장의 루멘에 부동 박테리아를 포함하는 것으로 확인되었다 (아래 참조).
깨끗한 JU1848 동물은 프로토콜에 설명된 바와 같이 장 조각을 분리하기 위해 세척및 참수되었다(6.1-6.12 단계). 해부된 장의 루멘에 있는 박테리아를 부수는 것은 노마르스키 현미경 검사를 통해 확인되었다(도 3). JU1848의 루멘내의 미생물은 박테리아로 의심되었기 때문에 해부된 장은 범용 세균 16S 프라이머, 27F 및 1492R를 사용하여 PCR용 템플릿으로 사용되었습니다. 총 6개의 개별 해부된 장에서, PCR 제품은 Sanger를 통해 시퀀스되고, 깨끗한 크로마토그래프는 6개의 순서가 모두 동일하다는 것을 보여주었습니다. 이러한 서열에 기초하여, 이 박테리아는 클래스 Alphaproteobacteria에 있는 새로운 종으로 확인되었지만 알려진 순서 또는 속으로 분류될 수 없었습니다 (보충 파일 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62937/62937fig01.jpg"> 그림 1: 야생 C. 열대의 루멘을 식민지화하는 박테리아를 고수하는 박테리아. (A) 썩은 유터페 스프의 필드 샘플 이미지( 가족: Arecaceae) 프랑스 령 기아나의 누라그 숲에서 야자수 과일. (B) 호스트 장의 루멘 (lu)에서 브러시와 같은 모양을 형성하는 길고 얇은 박테리아수천으로 본 변형 JU1848의 Nomarski 이미지 (in). 내장을 코팅하는 세균성(ba) 층은 괄호([)로 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62937/62937fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62937/62937fig02.jpg"> 도 2: 오염 미생물 성장은 선충 세척 후 손실됩니다. (A) 야생 균주 JU1848은 대장균 OP50-1 박테리아로 시드된 표준 6cm NGM 플레이트에 눈에 띄는 미생물 성장을 전파한다. (B) 청소 후, 단일 dauer에서 F1 자손의 플레이트는 20 °C에서 배양 4 일 후 눈에 보이는 미생물 오염을 나타내지 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62937/62937fig02large.jpg" target="_blank">않습니다.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62937/62937fig03.jpg"> 그림 3: 박테리아를 해부한 장의 루멘에서 볼 수 있습니다. 노마스키는 소장이 유출되도록 참수된 깨끗한 JU1848 동물의 이미지입니다. 식민지화 균(ba)은 브래킷([)으로 표시되며 선충체(nb) 외부인 장내 한 조각의 루멘(lu)에서 볼 수 있다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62937/62937fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>시약</td>
			<td>농도</td>
			<td>분량</td>
		</tr>
<tr>
<td>27F 프라이머 (5'-AGAGTGATCMTGGCTCAG-3')</td>
			<td>20mM</td>
			<td>2.5 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1492R 프라이머 (5'GGTTACCTTGTTACGACTT-3')</td>
			<td>20mM</td>
			<td>2.5 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>물에 해부 된 창자</td>
			<td>N/A</td>
			<td>3 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>10x PCR 버퍼</td>
			<td>10x</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>dNTP</td>
			<td>10mM</td>
			<td>1 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>타크 폴리머라제</td>
			<td>5 U/μL</td>
			<td>0.5 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>물</td>
			<td>N/A</td>
			<td>35.5 μL</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 범용 세균 프라이머를 사용하여 시료 PCR 프로토콜과 해부된 장.
보충 파일 1: 6 개의 해부 JU1848 장의 PCR에서 파생 된 세균 성 16S rDNA 서열의 근육 정렬. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62937/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

야생 Caenorhabditis 선충은 많은 미생물과 연관됩니다, 종종 창 자 루멘에서 또는 창 자를 감염. 이 프로토콜은 도어 큐티클의 저항을 활용하여 내장을 식민지화하는 헤아릴 수없는 미생물을 풍부하게하는 방법을 자세히 설명합니다.

Caenorhabditis elegans (C. elegans)&#160;has proven to be an excellent model for studying host-microbe interactions and the microbiome, especially in the ...

이 방법은 야생 Caenorhabditis 선충에서 발견되는 새로운 미생물의 농축 및 식별을 용이하게하여 숙주 미생물 상호 작용에 대한 추가 조사를 가능하게 했습니다. 이 기술의 주요 장점은 연구자가 야생 선충의 장에서 직접 비 컬터블 병원균 및 미생물군유전체 박테리아를 풍부하게 할 수 있다는 것입니다. 관심의 헤아릴 수 없는 미생물로 선충의 야생 Caenorhabditis 균주를 얻고 식품 원으로 OP51 에슈리치아 대장균을 포함하는 표준 선충 성장 매체 또는 NGM 플레이트에 벌레를 성장시킴으로써 시작합니다.모든 OP51 에슈리치아 대장균이 소비되고 대부분의 벌레가 Dauer 단계에 도달할 때까지 20도에서 4~5일 동안 선충을 배양합니다. Dauer 단계에서 선충을 세척하려면 M9 최소 소금 미디어 5 밀리리터를 굶주린 벌레 6센티미터 플레이트에 추가하고 멸균 유리 파이펫과 전구를 사용하여 플레이트에서 M9 미디어와 웜을 피펫하고 멸균 15 밀리리터 원심분리기로 이송합니다. 실온에서 30초 동안 1, 000회 G에서 벌레를 회전한 다음, 벌레 위에 약 50마이크로리터의 M9를 방치하여 살아있는 벌레를 방해하지 않고 멸균 15 밀리리터 파이펫을 사용하여 벌레펠릿 위에 M9 상체를 제거하고 폐기하십시오.동일한 원심분리기 튜브에 트리톤 X-100의 0.05%를 포함하는 M9 매체의 10밀리리터를 추가하고 튜브의 캡을 적절하게 조여 실내 온도에서 누타에 튜브를 배치하여 외부 미생물을 제거합니다. 누테이터에서 20분 동안 잠복한 후 실온에서 30초 동안 1, 000배 G로 웜을 회전한 다음, 시연된 대로 M9 슈퍼네티티를 제거하고 폐기하고 트리톤 X-100의 0.05%를 함유한 M9 미디어를 통해 세 번 세척 절차를 반복합니다. 다음으로, 새로 준비된 항생제 및 SDS 용액을 추가하여 실온에서 누테이터에서 하룻밤 동안 선충을 함유한 튜브를 배양한다.항생제로 치료 한 후, 실온에서 1 분 동안 1, 000 배 G에서 튜브의 벌레를 회전시십시오. 0.05%트리톤 X-100을 함유한 M9의 10밀리리터를 추가하기 전에 상퍼를 제거하고 캡을 적절하게 조여 실온에서 20분 동안 누테이터에 튜브를 배양합니다. 완료되면 1분 동안 1, 000회 G에서 웜을 회전시키고 이 절차를 세 번 반복합니다.0.05%트리톤 X-100을 함유한 M9로 네 번째 세척 후, 100마이크로리터의 용액에 방해받지 않고 벌레 펠릿을 방치하고 나머지는 폐기한다. OP51 에슈리치아 대장균으로 시드된 10센티미터 NGM 플레이트의 중심으로 상수및 펠릿의 100마이크로리터를 전달한다. 다우어스가 중앙과 OP51 잔디밭을 5-10분 동안 기어나가는 동안 접시가 방해받지 않고 건조하도록 합니다.조심스럽게 하나의 Dauer를 선택하고 OP51시드 6 센티미터 NGM 플레이트에 접시. 같은 방법으로 OP51로 시드된 개별 6센티미터 NGM 플레이트에서 최소 10개의 다이어플레이트가 있습니다. 다이어스가 성장하고 다음 세대 F1이 성인 단계에 도달 할 때까지 섭씨 20도에서 4 ~ 5 일 동안 플레이트를 배양 한 다음 모든 플레이트의 오염을 시각적으로 확인하십시오.각 깨끗한 플레이트에 대해, 관심의 표현형에 따라 노마르스키 또는 형광 현미경 검사를 통해 관심있는 미생물의 전파를 확인합니다. 벌레를 굶주리고 OP51 박테리아의 수를 줄이려면 선충을 섭씨 20도에서 3~4일 동안 배양합니다. M9 매체의 밀리리터 5기를 최근 굶주린 벌레의 접시에 추가한 다음 M9 미디어와 웜을 멸균 15mm 원심분리기 튜브로 옮겨 실온에서 30초 동안 1, 000배 G로 회전합니다.20 분 동안 누에이터에 0.05 %트리톤 X-100을 포함하는 M9의 10 밀리리터로 벌레를 5 번 세척하기 전에 상체를 제거하십시오. 마지막 세척 후, 용액의 100 마이크로 리터에서 펠릿을 방해하지 않고 상체를 제거하고 M9과 웜을 시드되지 않은 6센티미터 NGM 플레이트로 옮겨. 벌레가 20 분 동안 기어 다니는 동안 접시를 건조시켜 큐티클과 장에서 OP51을 제거하십시오.플레이트가 건조하면 M9의 250 마이크로리터를 추가하고 웜을 새로운 시드되지 않은 6센티미터 NGM 플레이트로 이송하여 플레이트가 건조되는 동안 벌레가 기어갈 수 있도록 절차를 반복하십시오. 20분 후, M9의 마이크로리터 250개를 접시에 넣고 벌레와 함께 M9의 100마이크로리터를 깨끗한 시계 유리로 옮은 다음, 26게이지 주사기 바늘을 사용하여 선충을 참수한 다음, 벌레를 26 게이지 주사기 바늘로 내려 놓습니다. 일단 참수되면, 창자, 과립 질량 및 투명한 gonad는 선충 체에서 자연적으로 회피하고, 노출된 장의 조각을 잘라 내고 멸균물 10 마이크로리터를 포함하는 0.5 밀리리터 PCR 튜브로 전송합니다.PCR 튜브에서 적어도 5 개의 다른 동물에서 내장을 수집하는 절차를 반복합니다. PCR 튜브를 섭씨 영하 80도에서 최소 5분간 동결합니다. PCR을 진행하기 전에 장 샘플을 해동하고 식별을 위해 시퀀싱합니다.야생 Caenorhabditis 열대 균주 JU1848 방향 방식으로 장의 lumen을 식민지화 얇은 미생물을 가지고 있는 것으로 나타났습니다. 야생 균주 JU1848은 에체리치아 대장균 OP51 박테리아로 시드된 표준 6센티미터 NGM 플레이트에 눈에 띄는 미생물 성장을 전파했습니다. 청소 후, 단일 Dauer에서 F1 자손의 플레이트는 잠복 4 일 후 눈에 보이는 미생물 오염을 보여주지 않았다.참수 된 JU1848 동물의 노마르스키 이미지에서, 식민지 박테리아는 선충 체 의 외부에 있는 장의 조각의 lumen에서 볼 수 있었다. 일부 Caenorhabditis 종은 Dauer 죽음을 방지하기 위해 낮은 SDS 농도를 요구할 수 있습니다. 깨끗한 선충 균주를 전파하려면 크롤링이 생존 오염 물질을 제거하는 데 도움이되기 때문에 중앙에서 가장 멀리 기어 다니는 Dauers를 선택하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

출처: Taylor, MN, et.al. 단일 웜 데이터를 사용하여 Caenorhabditis elegans-박테리아 상호 작용의 이질성을 정량화합니다. J. Vis. 경험. (2022년)이 비디오는 무균, 연령 일치 Caenorhabditis elegans 벌레가 장 집락화를 위해 박테리아 균주에 노출되는 것을 보여줍니다. 부착되지 않은 외부 박테리아를 선택적으로 제거하여 정량화를 위해 장 상피에 부착된 생존 가능한 박테리아만 남기는 것을 설명합니다.

무균 C . elegans에서 장내 세균 집락화 평가

출처: 모건, E. 외 장내 미생물군 박테리아를 풍부하게 하기 위한 야생 선 충선충의 선택적 세척. J. Vis. Exp. (2021)이 영상은 야생 카에노르합딧 벌레에서 관심 있는 장내 박테리아를 분리하는 프로토콜을 시연합니다. 벌레는 먼저 굶주림을 주고 세척하여 표면과 장 내강에서 잔류 영양 박테리아를 제거하면서 표적 미생물을 보존합니다. 표면 세척과 여러 차례의 기어 다니는 단계를 거친 후, 벌레를 해부하여 관심 박테리아가 포함된 장을 추출한 후 수집하여 냉동하여 보관합니다.

장내 미생물 풍부화를 위한 카에노르합 딧 벌레의 선택적 세척

여기, 선물이 미생물 상호 작용을 공부 하는 다양 한 호스트 모델로 선 충 류 꼬마 선 충 .

선 충 꼬마 선 충-모델을 다양 한 비보에 호스트-미생물 상호작용 연구

이 프로토콜은 필드의 천연 기판에서 살아있는 선충을 효율적으로 추출하는 방법을 간략하게 설명합니다.

베어만 퍼널에 의해 야생 선충의 신속한 격리

이 프로토콜은 자아 Caenorhabditis 선충류의 대규모 생태 조사를 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 자연에서 수집 된 선충류와 관련된 생태 및 분자 데이터의 효율적인 조직 및 분석입니다.

Selfing caenorhabditis 선충류의 생태 조사를 수행하기위한 고도로 확장 가능한 접근법

세포 외 박테리아와 오르세 바이러스 및 미세 포자충 (곰팡이)과 같은 세포 내 병원체를 포함한 장내 미생물은 종종 야생 Caenorhabditis 선충류와 관련이 있습니다. 이 기사에서는 C. elegans 선충류에 서식하는 미생물을 검출 및 정량화하고 실험실에서 통제 된 감염 후 병원체 부하를 측정하기위한 프로토콜을 제시합니다.

RNA 형광 제자리 혼성화(FISH)를 통해 Caenorhabditis elegans 장에서 미생물 집락화 및 감염을 시각화합니다.

이 프로토콜은 외부 박테리아를 제거하기 위해 감기 마비 및 표면 표백에 이어 박테리아 식민지화 된 Caenorhabditis elegans의 96-well 파괴를 설명합니다. 생성 된 현탁액은 한천 플레이트에 도금되어 많은 수의 개별 웜에서 박테리아 부하의 정확하고 중간 처리량 정량화를 허용합니다.

단일 웜 데이터를 사용하여 예쁜꼬마선충-박테리아 상호작용의 이질성 정량화

본 프로토콜은 유전체학, 단백질체학, 마이크로바이옴 또는 기타 분석에 입력하기 위해 손으로 성인 Caenorhabditis elegans 선충으로부터 장을 분리하는 절차를 설명합니다.

Caenorhabditis elegans 내장의 손 해부

Caenorhabditis elegans 는 생물학의 주요 모델 종 중 하나이지만 거의 모든 연구는 자연적으로 관련된 미생물이없는 상태에서 수행됩니다. 여기에 설명 된 방법은 미래의 기능적 C. elegans 연구의 기초로서 관련 미생물의 다양성에 대한 이해를 향상시키는 데 도움이 될 것입니다.

모델 선충 Caenorhabditis elegans의 자연 미생물 총의 분리 및 특성화

퇴비 소우주는 자연에서 발견되는 미생물 다양성을 실험실로 가져와 Caenorhabditis elegans의 미생물 군집 연구를 용이하게합니다. 여기에는 소우주 실험을 설정하기위한 프로토콜이 제공되며, 실험은 환경 미생물 다양성과 벌레 장내 미생물 구성 간의 관계를 탐구하기 위해 환경 미생물 다양성을 조절하는 능력을 보여줍니다.

Caenorhabditis elegans의 마이크로바이옴 연구를 위한 미생물적으로 다양하고 자연과 유사한 환경으로서의 소우주를 퇴비화

예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans) 은 숙주-마이크로바이옴 상호작용을 유도하는 분자 결정 요인을 조사할 수 있는 강력한 모델입니다. 우리는 예쁜꼬마선충(C. elegans ) 생리학의 주요 측면과 함께 장내 마이크로바이옴 집락화의 단일 동물 수준을 프로파일링하는 고처리량 파이프라인을 제시합니다.

예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans) 장내 마이크로바이옴의 정량화 및 분석을 위한 유동 지렁이 측정법의 적용

배우세요 야생 Caenorhabditis 선충의 장내 미생물군유전체 박테리아 농축 방법을. 도우저 단계의 저항성을 활용하여 배양 불가능한 미생물을 연구하고 숙주-미생물 상호작용을 탐구합니다.

장내 미생물군유전체 박테리아를 위해 농축하는 야생 케노르하비티스 선충제의 선택적 세척

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