Name: 덕트: 3D 간 분석을 위한 마이크로 컴퓨팅 단층 촬영 다음에 이중 수지 주조 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 39 s
Description: 배우세요 DUCT 기법을 활용한 간 혈관 및 담도계의 3D 시각화와 정량 분석 방법입니다. 이 기술은 항체나 형광 이미징 없이 간 질환과 재생의 공간적 측면을 이해하는 데 도움을 줍니다.

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우리는 카리 하퍼트와 스테이시 하퍼트의 전문 지식과 담관 수분 및 실험실 환대에 관한 도움을 주셔서 감사합니다. 우리는 또한 일반적인 담관 통 수분에 대한 그들의 도움에 대한 나드자 슐츠와 샬럿 L. 맷슨에게 감사드립니다.
우리는 그들의 지원에 대한 다음과 같은 부여 기관에 감사드립니다 :
ERA 연구소에서 일하기: 카롤린스카 연구소 (2-560/2015-280), 스톡홀름 란스 랜스팅 (CIMED (2-538/2014-29)), 라그나르 쇠데르 베르그스 스티펠스 (스웨덴 재단의 시작 교부금), 간 연구를위한 유럽 협회 (다니엘 알라길상), 스웨덴 심장 폐 재단 (20170723), 베텐스코프로데트 (2019-01350).
JK 랩의 작업: 우리는 MEYS CR (LM2018110)에 의해 지원 되는 체코 나노 랩 연구 인프라를 인정합니다. J.K. 보조금 FSI-S-20-6353의 지원 덕분에.

<ol><li>Narat, J. K., Loef, J. A., Narat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+preparation+of+multicolored+corrosion+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">On the preparation of multicolored corrosion specimens.</a> The Anatomical Record. 64, 155-160 (1936).</li>
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<li>Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-Dimensional+resin+casting+and+imaging+of+mouse+portal+vein+or+intrahepatic+bile+duct+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">3-Dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e4272(2012).</li>
<li>Hankeova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DUCT+reveals+architectural+mechanisms+contributing+to+bile+duct+recovery+in+a+mouse+model+for+Alagille+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">DUCT reveals architectural mechanisms contributing to bile duct recovery in a mouse model for Alagille syndrome.</a> Elife. 1, 1-29 (2021).</li>
<li>Andersson, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+Alagille+syndrome+and+mechanisms+of+Jagged1+missense+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Mouse model of Alagille syndrome and mechanisms of Jagged1 missense mutations.</a> Gastroenterology. 154, 1080-1095 (2018).</li>
<li>Tanimizu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrahepatic+bile+ducts+are+developed+through+formation+of+homogeneous+continuous+luminal+network+and+its+dynamic+rearrangement+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Intrahepatic bile ducts are developed through formation of homogeneous continuous luminal network and its dynamic rearrangement in mice.</a> Hepatology. 64, 175-188 (2016).</li>
<li>Ober, E. A., Lemaigre, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+liver%3A+Insights+into+organ+and+tissue+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Development of the liver: Insights into organ and tissue morphogenesis.</a> Journal of Hepatology. 68, 1049-1062 (2018).</li>
</ol>

ERA 연구소의 별도 프로젝트는 ModeRNA에 의해 지원됩니다. ModeRNA는 여기에 설명된 프로젝트/프로토콜에 아무런 역할이 없었습니다.

몇 가지 중요한 단계는 샘플 준비에서 CT 장치의 매개 변수에 이르기까지 덕트의 성공을 결정합니다. 최상의 결과를 얻으려면 잘 대조되고 잘 주입되고 거품이 없는 수지로 자동화된 임계값을 사용하여 3D 데이터, 이미지 및 영화를 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜을 교육하고 따라 사용하면 주사의 90 %가 성공하여 재현 가능한 데이터를 초래합니다. 신선한 노란색 수지를 사용하여 두 주입 된 시스템 사이의 최상의 대비를 달성하는 것이 중요합니다. 노란색 수지는 매우 강한 방사선을 가지고 있으며, 파란색 수지는 탐지 할 수없는 방사선을 가지고 있습니다. 최고 결과는 새로운 노란색 수지 병을 연 후 처음 3 개월 이내에 달성된다. 시간이 지남에 따라 수지 침전및 더 이상 저장(>6개월) 후에는 CT 스캔에서 노란색 및 녹색 수지를 더 이상 구별할 수 없습니다. 콘트라스트가 좋지 않은 이미지는 두 시스템의 광범위하고 시간이 많이 소요되는 수동 추적 및 세분화가 필요합니다. 다음으로, 잘 뻗어 있는 튜브는 성인용 마우스의 일반적인 담관과 태아후 마우스의 일반적인 담관 및 포털 정맥에 맞추기 위하여 필수적입니다. 주입의 진입점은 주의하여 만들어야 합니다. 일반적인 담관이 반경으로 열리면 주변 조직에서 분리되어 튜브의 성공적인 진입을 방지할 수 있습니다. 이 단계는 일반적인 담관이 후퇴하고 관도의 삽입을 매우 어렵게 만드는 경우 "곱슬"산후 마우스에 특히 섬세하다. 일반적인 담관 항목 및 주입 몇 가지 연습을 필요로 할 수 있습니다. 수지와 주입 내내 튜브를 준비하는 동안 거품이 CT 이미지에 부정적인 공간을 만들고 시간이 많이 걸리는 수동 보정이 필요하므로 거품 형성을 피하십시오. 주사 시술 도중과 후에 젖은 면봉으로 표면을 부드럽게 통해 간을 마사지하는 것이 중요합니다. 튜브의 주입 및 제거가 완료 된 후 실크 봉합사 매듭을 신속하고 신중하게 조여야하므로 수지가 완전히 중합되기 전에 간에서 흘러 나오지 않습니다. 성공적인 microCT 이미징의 경우 샘플은 아가로즈를 사용하여 적절하게 고정되고 CT 데이터의 이동 아티팩트를 제거하기 위해 열적으로 조정되어야 합니다. 획득 설정도 중요한 중요성을 지니고 있으며, 미세 한 구조를 해결하기 위해 적절한 공간 해상도에 도달하기 위해 최적화되어야 합니다.
주입 절차에 대한 기술적 수정은 젊은 마우스에서 주사를 달성하기 위해 이루어질 수 있습니다. 현재, 젊은 마우스 간수 주조는 충분히 얇은 튜브의 가용성에 의해 제한, PE10은 가장 작은 상업적으로 사용할 수있는 튜브인. 타니미즈 외는 유리 모세혈관11을 사용하여 배아일 17일(E17) 일반적인 담관에 탄소 잉크를 성공적으로 주입하였다. 따라서 유리 모세관을 통해 수지를 전달할 수 있는지 여부에 대한 향후 테스트가 흥미로할 것입니다. 덕트는 폐의 기도 및 폐 동맥 혈관과 같은 다른 관 형 시스템을 주입하기 위해 더 적응되었다9. 이중 수지 주사는 또한 다른 상업적으로 이용 가능한 수지와 함께 사용하도록 수정될 수 있었습니다, 또는 이 프로토콜은 탄소 잉크를 가진 주사에 사용될 수 있었습니다.
덕트 파이프라인의 주요 제한 요인 중 하나는 수지 점도입니다. 덕트는 직경 5 μm 이상의 관 구조의 수지 주조에만 사용할 수 있습니다. 이 데이터 세트에서 수지는 5 μm9의 가장 작은 직경으로 튜브를 관통할 수 있습니다. 이 크기 제한은 미세 한 덕트와 작은 모세 혈관의 분석을 배제합니다. 덕트 파이프라인을 더 작은 구경 선박으로 발전시키기 위해 상업적으로 이용 가능한 다른 수지 또는 새로운 저점도 방사성파크 제제의 개발이 루멘 침투를 향상시킬 수 있습니다.
Hankeova et al.9에서, 덕트는 두 개의 다른 일반적으로 사용되는 기술, 이중 탄소 잉크 주사조직 청산 및 표준 사진, 그리고 iDISCO+와 알파-부드러운 근육 세포 액틴 및 사이토케라틴7담관7을 가진 혈관의 염색으로, 3D imaging9에 그 뒤를 이었다. 덕트는 이중 분석(높은 간 자동 불발성으로 인해 iDISCO+에 도전적이었던), 3D 이미징 및 정량화(탄소 잉크 주입이 불가능함) 및 루멘화(덕트)의 측면에서 다른 두 가지 방법을 능가했습니다( 덕트는 내부 루멘 아키텍처 및 시스템 관류에 대한 데이터를 제공합니다). 위에서 언급했듯이, 덕트의 주요 한계는 탄소 잉크 주입과 iDISCO+가 모두 더 잘 수행되는 파라미터인 주입 및 분석(5 μm 제한)의 최소 루멘 크기입니다. 덕트(DUCT)는 단일 시스템 수지 주조3,5,6에 우수하여 각 주입 된 시스템의 분석을 별도로 허용하고 이중 3D 조사를 용이하게하여 두 시스템 간의 건축 관계를 연구합니다.
덕트(DUCT)는 2개의 튜브 네트워크를 3D로 스터디하기 위해 적용할 수 있습니다. 원리의 증거로, 덕트는 간 담즙 및 포털 정맥 시스템과 폐9의 폐 동맥 혈관 및 기도를 시각화하는 데 사용되었다. 심폐소회관은 포탈 정맥에 인접해 있으며, 포탈 정맥은 담즙 나무의 성장과 분화를 조절하는 구조적 템플릿 및 신호 센터를 제공한다12. Hankeova 외.9에서, 덕트는 인간 소아성병 알라길 증후군을 위한 마우스 모형에 있는 담즙 재생을 탐구했습니다. 덕트(DUCT)는 이전에보고되지 않은 건축 메커니즘을 공개하여 담즙 시스템이 야생 형과 같은 볼륨9을 달성하는 데 사용되었습니다. 알라길 증후군 마우스는 두 가지 다른 전략을 활용: (1) 간의 hilar 및 중앙 지역에서, 담즙 시스템은 그것의 분기를 증가, 그리고 (2) 간 주변에서, 드 노보 생성 담관은 매우 고문했다. 이 두 가지 요인은 비정상적인 아키텍처에도 불구하고 거의 정상담체 시스템 볼륨을 산출하기 위해 결합되었습니다. 또한, 덕트에서는 두 포털 정맥 9 사이의 연결 교량을 형성하는 포털 정맥 분기 및 담관과 무관하게 발생한 비정상적인 담관 분기를 검출했습니다. 이러한 표현형은 단일 수지 주조에서 검출하는 것은 불가능할 것이며 담관 증식으로 2D 조직학적 섹션에서 잘못 해석될 수 있습니다. 따라서 덕트(DUCT)는 전체 기관 또는 로브 수준에서 두 개의 관 형 네트워크의 3D 아키텍처를 설명하는 데이터를 제공하여 질적이고 심층적인 정량적 분석의 가능성을 제공합니다. 덕트는 다른 동물 모형에 있는 산후 간 발달 및 간 재생 분석을 위한 새로운 표준일 수 있었습니다.

오르간 수지 주조는 17 세기 로 거슬러 올라가는 기술입니다1. 현대 수지 주조의 첫 번째 예 중 하나는 부검에서 인간의 간에서 수행되었다. 간 내 담관은 젤라틴과 혼합 된 조영제로 채워졌으며 X 선 CT 스캔2로 이미징했습니다. 덕트 기술의 목적은 3D로 두 개의 관 수지 캐스트 네트워크를 시각화, 디지털화 및 분석하는 것입니다.
덕트(DUCT)는 단일 시스템 간 수지 주조3,4,5,6,7,8에 대한 광범위한 기존 지식을 기반으로 하며, 두 시스템의 동시 3D 시각화 및 분석으로 확장된다9. 덕트 고급 단일 수지 주조는 서로 다른 콘트라스트의 두 개의 radiopaque 수지와 이러한 수지, 특히 일반적인 담관 및 포털 정맥에 주입하여 이중 수지 주조에 캐스팅. 덕트는 출생 후 15일(P15)부터 재현 가능한 결과를 가진 젊은 산후 마우스에 적용될 수 있다. 현미경 기지를 둔 화상 진찰 기술에 비해, 주요 이점은 덕트가 더 빠르고, 항체가 없고, 간 조직 자동형광이 화상 진찰을 방해하지 않는다는 것입니다. 또한 덕트에서는 루멘화 상태, 내부 직경, 네트워크 연결 및 관류를 설명하는 정량적 데이터를 제공합니다. Lumen 형성 세포의 존재와 사실상 의 형태 발생을 튜브로 분화하는 것은 덕성 세포가 존재하지만 Alagille 증후군10의 경우와 같이 튜브를 형성하지 않는 장기를 분석하는 데 필수적입니다. 덕트의 주요 단점은 점성이 있고 작은 구경 (<5 μm)으로 튜브에 들어가지 않는 수지의 제한된 침투입니다. 덕트는 동맥 및 정맥 순환 시스템, 기도, 외형 담관 또는 림프관과 같은 주입 진입점을 결정한 후 임의의 관 구조를 적용할 수 있다. 그것은 이렇게 폐와 췌장과 같은 그밖 조직의 전체 기관 건축 분석을 촉진할 수 있었습니다.
MicroCT 분할 이미지는 ImageJ와 같은 상업적으로 이용 가능한 이미징 소프트웨어 또는 사용자 지정 작성된 파이프라인(예: MATLAB)을 사용하여 처리할 수 있습니다. 수지 주입 간은 네트워크 확장 및 연결또는 단일 시스템의 부피, 길이, 분기, 고문및 두 시스템 간의 거리 또는 지점 의존성(시스템 2 분기에 근접하여 시스템 1 분기)과 같은 두 시스템 간의 상호 작용을 위해 질적으로 분석될 수 있다. 수지 주입, microCT 스캐닝 및 CT 데이터 세분화를 포함하는 덕트 파이프라인은 두 관 시스템의 건축 메커니즘에 대한 상세한 정량적 분석과 결합되어 동물 모델의 전체 간 분석에 대한 표준을 제공할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>1.5mL SafeSeal 마이크로 튜브</td><td>Sarstedt</td><td>72.706</td><td></td></tr><tr><td>23G 버터플라이 바늘(튜빙 포함</td>) <td>BD bioscience</td><td>367283</td><td></td></tr><tr><td>23G 바늘</td><td>BD bioscience</td><td>305892</td><td></td></tr><tr><td>30G 바늘</td><td>BD bioscience</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Top-Bio</td><td>P045</td><td></td></tr><tr><td>벤질 알코올</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td>108006</tr><tr><td>벤질 벤조에이</td>트 <td>Sigma Aldrich</td><td>B6630</td><td></td></tr><tr><td>Corning 50 mL 튜브</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS430829-500EA</td><td>폴리프로필렌</td></tr><tr><td>면봉</td><td>Medicarier</td><td>60406</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Leica Camera AG</td><td></td><td>Leica M60</td></tr><tr><td>Dulbecco의 인산염 완충 식염수</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td>14190144</tr><tr><td>에탄올 70%</td><td>VWR</td><td>83801.41</td><td></td></tr><tr><td>팔콘 튜브 15mL</td><td>Verkon</td><td>331.850.084.006</td><td></td></tr><tr><td>집게 곡선</td><td>Fine Science Tools</td><td>11051-10</td><td>Fine Graefe 10cm 곡선</td></tr><tr><td>집게 직선</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10</td><td>Fine Graefe 10cm 직선</td></tr><tr><td>포름알데히드 용액</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>GE Phoenix v|tome|x L 240</td><td>Waygate Technologoies</td><td></td><td>마이크로 컴퓨터 단층 촬영 스캐너</td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Leo Pharma</td><td>B01AB01</td><td>5000 IE/mL</td></tr><tr><td>Isolfurane</td><td>Baxter</td><td>FDG9623</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11413413</td><td></td></tr><tr><td>MICROFIL</td><td>Flowtech</td><td>MV-122</td><td>합성수지 옐로우</td></tr><tr><td>MICROFIL</td><td>Flowtech</td><td>MV-120</td><td>합성수지 블루</td></tr><tr><td>MICROFIL</td><td>Flowtech</td><td>MV-희석제</td><td>투명 수지 희석제</td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫</td><td>Verkon</td><td>130.690.424.503</td><td></td></tr><tr><td>연동 펌프</td><td>AgnThos</td><td>010.6131.M20</td><td></td></tr><tr><td>피닉스 datos|x 2.0 software</td><td>Baker Hughes</td><td></td><td>CT 데이터 재구성 소프트웨어</td></tr><tr><td>Rocker</td><td>VWR</td><td>444-0142</td><td></td></tr><tr><td>실크 봉합</td>사 <td>AgnThos</td><td>14757</td><td>Black silk, 4-0, sterile, 100 m</td></tr><tr><td>Skin scissor</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-09</td><td>Iris straight tip 9 cm</td></tr><tr><td>Spring scissor</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-03</td><td>Vannas micro, straight tip 2 mm</td></tr><tr><td>주사기 1 mL Luer</td><td>BD bioscience</td><td>303172</td><td></td></tr><tr><td>Tubing PE10</td><td>BD bioscience</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>Tubing PE50</td><td>BD bioscience</td><td>427411</td><td></td></tr><tr><td>VG Studio MAX 3.3 소프트웨어</td><td>Volume Graphics GmbH</td><td></td><td>CT 데이터 처리 및 분석 소프트웨어</td></tr></tbody></table>

덕트: 3d 간 분석을 위한 마이크로 컴퓨팅 단층 촬영 다음에 이중 수지 주조

DUCT: Double Resin Casting followed by Micro-Computed Tomography for 3D Liver Analysis

간은 인간과 마우스에 있는 가장 큰 내부 기관이고, 높은 자동 형광은 통 수준에서 기관의 3차원 (3D) 건축을 평가하기위한 중요한 도전을 제시합니다. 간 건축은 혈관과 담즙 나무를 포함하여 수지로 채워질 수 있는 여러 가지 루멘화 된 구조를 특징으로하며, 그렇지 않으면 간세포가 풍부한 파렌치마에서 매우 고정 관념적 패턴을 확립합니다. 이 프로토콜은 마이크로 컴퓨팅 단층 촬영 또는 "덕트"를 캐스팅하는 이중 수지 주조를 수행하기 위한 파이프라인을 설명합니다. 덕트에는 두 개의 다른 방사성 합성 수지와 함께 포털 정맥과 일반적인 담관을 주입하고 조직 고정을 수반합니다. 광학 클리어링 에이전트로 한 엽 또는 간 전체를 제거하여 품질 관리를 통해 적절하게 주입된 시료를 사전 선별할 수 있습니다. 덕트 파이프라인의 두 번째 부분에서, 로브 또는 전체 간은 마이크로 컴퓨팅 단층 촬영(microCT) 스캐닝,(semi-) 자동화된 세분화 및 포털 정맥 및 담즙 네트워크의 3D 렌더링에 사용될 수 있다. MicroCT는 두 수지의 3D 좌표 데이터를 생성하여 두 시스템과 공간 관계의 정량적 분석뿐만 아니라 정성적이었습니다. 덕트산후 및 성인 마우스 간을 적용할 수 있으며 폐내 혈관 네트워크 및 기도와 같은 다른 관형 네트워크로 더 확장될 수 있습니다.

수행할 일 성공적인 이중 수지 주입은 담관 내 담관과 포털 정맥 혈관 이 잘 채워질 때 달성됩니다. 품질 관리 단계로, 하나의 엽(예를 들어, 좌측 엽)을 지우면 성공적인 주사를 검증할 수 있으며, 그 다음에는 관심 있는 로브의 이미징이 뒤따릅니다. 광학적으로 지워진 엽은 microCT를 사용하여 나중에 스캔할 수 있습니다. 따라서 전체 간을 광학적으로 클리어할 수 있습니다. 잘 주입된 마우스 간에서, 포털 정맥 혈관은 간 주변과 수지가 측면 가지(그림 4)에서 보일 때까지 수지로 채워져야 하며, 이 아키텍처는 microCT 스캔 및 세분화된 데이터에서 충실하게 재구성된다. 또한, 잘 주입된 간 담관은 주 포털 정맥 가지가 주변으로 거의 확장되는 옆에 표시되어야 하며, 주요 측면 지점에서 수지가 눈에 띄게 되어야 한다. 제어 로브가 품질 관리 단계를 통과하는 경우, 관심있는 로브 (광학적으로 지워진 것을 포함)는 microCT로 스캔 할 수 있습니다. 잘 주입된 간으로부터의 분할된 데이터의 결과는 P15 마우스(도 4A, B) 및 성인 마우스(도 4C, D)에 대해 도시된다.
하지 말아야 할 일 손상되지 않은 간 조직은 성공적인 주입을위한 전제 조건입니다. 복강과 다이어프램을 절단할 때 는 실수로 간 조직을 닉하지 않도록 주의하십시오. 이 절차 도중 간물리적 손상이 있는 경우에, 수지는 포털 정맥 주입 도중 밖으로 누출하기 위하여 아주 확률이 높습니다 (그림 5A). 간이 물리적으로 손상된 경우 혈관 시스템의 좋은 주입을 달성 할 수 없습니다.
일반적인 실수 중 하나는 시각화 또는 분석에 대 한 도전으로 이어질 수 있는 수 지와 간을 밑주. 시스템 밑약의 원인 중 하나는 주사가 완료되기 전에 바늘이나 튜브의 끝에서 조기에 경화되는 수지입니다 (그림 5B, 파란색 화살촉, 브래킷은 큰 거품을 묘사합니다). 좋은 방법은 동물 당 하나의 주사 세트를 사용하고 경화제가 수지에 추가 된 후 빠르게 작업하는 것입니다. 주사 중에 수지(반충전된 시스템에 의해 관찰될 수 있음) 튜브를 제거하고 튜브 의 끝을 잘라 (항상 대각선으로 굴기울 팁을 만들 수 있음) 플런저를 밀어 넣습니다. 수지가 다시 떨어지기 시작하면 튜브를 조심스럽게 다시 삽입하고 봉합사로 고정하십시오. 수지가 바늘에 경화된 경우 튜브를 완전히 교체하고 수지 (거품 을 피하고)로 채우고 튜브를 조심스럽게 다시 삽입하고 봉합사로 고정하십시오. 조직이 더 연약하기 때문에 특히 젊은 산후 마우스 <p30 class="xfig">그림 5C, 파란색 화살촉은 말단 가지에서 볼 수있는 혈액을 나타냅니다). 이것은 혈관의 끝이 수지 대신 혈액으로 채워질 때 관찰될 수 있습니다. 이를 피하기 위해, 포털 정맥 (간 외부)이 주입 전에 혈액을 포함하지 않는지 확인하십시오. 밑약한 간의 세 번째 원인은 튜브가 간 깊숙이 삽입되어 엽 중 하나를 향해 가지에 들어갈 때입니다. 이를 방지하기 위해 간 입구에서 최소 0.5cm의 튜브를 삽입하십시오.</p30>
반대로, 시스템의 하나 또는 둘 다 수지로 채워집니다(그림 5D). 주사 를 통해 간을 시각적으로 모니터링 할 필요가있다. 수지로 주조하는 담즙 시스템은 수지 채워진 덕트만 간 표면에 희미하게 보이기 때문에 포털 정맥 수지 주조보다 더 어렵고, 시스템이 거의 가득 차고 언제 멈출지 평가하기가 어렵습니다. 작은 노란 수지 점이 간 표면에 나타나면 (그림 2Ci, 파란색 화살표촉), 이것은 담즙 시스템이 완전히 채워지고 수지가 덕트에서 누출되기 시작한다는 신호입니다. microCT 데이터 세분화 중에 사소한 수지 누설을 수동으로 수정할 수 있습니다(그림 5D, 오른쪽 패널).
사출 압력이 너무 높으면 혈관이나 덕트파열(그림 5E), 돌이킬 수 없는 손상 용기 또는 덕트 아키텍처가 발생할 수 있습니다. 간은 microCT 스캐닝 또는 분석에 적합하지 않습니다. 수지 과충전을 방지하려면 각 마우스 모델에서 주입에 사용되는 적절한 볼륨과 압력을 최적화합니다. 담즙 또는 정맥 시스템에 영향을 미치는 독성 식단, 유전자 변형 또는 간 손상으로 어려움을 겪고 있는 마우스와 함께 작업할 때, 주입 압력및 부피는 용적한 양과 압력이 야생형 마우스와 다를 수 있기 때문에 조절될 필요가 있을 수 있다. 이 프로토콜은 두 시스템의 수동 주입을 설명하지만 주사기를 펌프에 연결하여 사출 압력을 표준화할 수 있습니다. 거품은 관 네트워크의 희소한 충전으로 이어지는 또 다른 매우 일반적인 주입 아티팩트입니다 (그림 5F-H, 파란색 화살표). 거품 형성을 피하기 위해 주사기와 튜브에 거품이 포함되어 있지 않고 수지로 완전히 채워지며 수지는 주입 전에 튜브 끝에서 떨어지는지 확인하십시오. microCT 데이터에 부정적인 영역으로 나타나는 작은 거품은 처리 후 단계에서 수동으로 수정할 수 있지만 이는 힘들다.
신선도가 최고입니다 신선한 노란색 수지의 사용이 중요한 요소이며, 두 수지와 microCT 데이터 세분화의 대비에 크게 영향을 미칩니다. 새로 개봉된 수지(도 6A)가 사용되는 경우(그림 6A)는 노란 수지 주입 담관(밝은 흰색)과 녹색 수지 주입 포털 정맥(밝은 회색)의 대비에 뚜렷한 차이가 있다. 신선한 수지주입되는 간은 자동화된 글로벌 임계값을 사용하여 쉽게 처리됩니다. 장시간 보관하면 수지 침전이 되고 대비가 감소합니다. 저장 3개월 후에도, 대조는 여전히 담관(도 6B)과 포털 정맥을 구별하기에 충분할 수 있지만, 침전은 채워진 포털 정맥에서 이질성 불투명도로 보이는 두 수지의 혼합에 영향을 미칩니다(도 6B, 블루 화살촉). 이기종 대비는 자동화된 임계값에 부정적인 영향을 미치고 수동 수정이 필요하므로 처리 시간이 증가합니다. 수지가 6개월 이상 더 오래된 경우, 대조가 대조만을 기준으로 노란색 주입 담관과 녹색 주입 된 포털 정맥을 구별할 수 없는 지점으로 저하되었습니다(그림 6C). 이 경우 담관 및 포털 정맥은 hilar 지역의 지름과 위치에 따라 수동으로 분할되어야 하며 전체 microCT 데이터 전반에 걸쳐 수동으로 따라야 합니다. 이 절차는 매우 시간이 많이 걸리며 피하는 것이 가장 좋습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62941/62941fig01.jpg"> 그림 1: 수지 주조를 위한 주입 세트. (A) 사출 세트 #1은 ~30cm 길이의 30G 바늘과 PE10 튜브를 포함한다. 사출 세트 #2는 23 G 바늘과 PE50 튜브 ~ 30cm 길이로 구성됩니다. (B) 튜브의 끝이 늘어나고 각도로 잘라서 경부된 팁을 만듭니다. A와 B의 눈금자1cm, 중간 5mm, 1mm의 경미한 증분이 있는 센티미터 의 통치자입니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62941/62941fig01large.jpg" target="_blank">.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62941/62941fig02.jpg"> 그림 2: 이중 수지 주조 흐름 차트. (A) 부류 정맥 순환 계통과 강조 된 오른쪽 아트리움을 가진 심장을 보여주는 회로도, 이는 관류 전에 잘라야하며, 바늘을 삽입해야하는 좌심실은 순환 시스템에서 혈액을 씻어 내도록 관류를 위해 삽입해야합니다. 열등한 베나 카바는 혈관 압력을 완화하기 위해 신장 아래에서 절단해야합니다. (B) 담관 수지 주입 흐름 차트. (i) IVC를 끊을 위치를 묘사하는 (A)의 확대/축소 이미지입니다. (ii) 간 힐라 부위에서 오디(블랙 화살촉)의 괄약근에 이르기까지 일반적인 담관(노란색 점선)을 묘사한 이미지로, 일반적인 담관 아래에 봉합사 실이 있습니다. (iii) 일반적인 담관 주위에 느슨한 오버 핸드 매듭에 적합한 위치. (iv) 노란색 점선과 검은 색 화살표 머리는 오디의 괄약근을 표시, 절개에 대한 경사 각도와 경사 각도 절개 후 개구부가 어떻게 표시해야하는지 시연. (v) 삽입 시 PE10 튜브 베벨 개구(위쪽)의 방향을 보여주는 회로도. (vi) 노란 수지의 출현이 주입되고; 수지쉽게 느슨하게 묶인 매듭을 통과해야합니다. IVC, 열등한 베나 카바; CBD, 일반적인 담관. (C) 포털 정맥 수지 주입 흐름 차트. (i) 녹색 점선은 히어 리전의 포털 정맥을 표시합니다. 파란색 화살표 헤드는 과충전된 담즙 시스템에 레이블을 지정합니다. (ii) 포털 정맥 주위에 느슨한 오버 핸드 매듭에 적합한 위치. (iii) 삽입 시 베벨 개구부(위쪽)를 보여주는 회로도. (iv) 녹색 수지와 노란 수지의 주입 시 간 모양; 간 주변에 수지로 채워진 혈관에 유의하십시오. PV, 포털 정맥. 그림 2A 는 Biorender.com 함께 만들어졌습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62941/62941fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62941/62941fig03.jpg"> 그림 3: 볼륨 그래픽 소프트웨어의 마이크로 CT 데이터 처리. (A) 표면 결정, (i) 과대 평가 된 등가치 (현재 선택 미리보기는 노란색으로 표시됨), (ii) 과소 평가 된 등가치, (iii) 포털 정맥 및 담관의 적절한 표면 측정을위한 최적의 이소값 선택. (b) 표면 결정에 의해 생성된 관심 영역(ROI)을 분할하고, (i) 하나의 세그먼트(가장 큰)만 남을 정도로 높게 대화창에 값을 설정하고, (ii) 노란색 프레임으로 더 작은(제외) 입자가 도시된다. (C) 데이터의 표면 스무딩, (i) 스무딩 기능은 왼쪽 패널에, (ii) 스무딩 강도를 1(최대 2)로 설정하고 새로운 부드러운 ROI, (iii) 매끄러운 데이터를 생성한다. (D) 개별 관 시스템의 분리, (i) 표면 결정 기능에서 담즙 시스템만 선택에 포함되도록 isovalue를 설정 (선택의 현재 미리보기는 노란색으로 표시됨), (ii) 두 시스템의 ROI에서만 시스템 및 ROI의 ROI를 표시하고 두 시스템의 ROI로부터 의 하부 빌리 시스템 ROI를 표시, (iii) 녹색으로 표시된 담즙 시스템인 회색으로 표시된 포탈 정맥. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62941/62941fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62941/62941fig04.jpg"> 도 4: 잘 주입된 담관(BD) 및 포탈 정맥(PV) 시스템. (A) 산후 15일(P15) 간에서 두 개의 수지로 주입된 오른쪽 내측 엽(RML)을 광학적으로 지웠다. 녹색흰색 및 담즙 시스템의 포털 정맥 혈관을 그린으로 묘사한 (A)에 표시된 P15 RML의 스케일 바 1mm. (B) 3D 렌더링. 스케일 바 1mm. (C) 두 시스템에 두 개의 수지주입 성인 간 RML을 광학적으로 지웠다. 녹색흰색 및 담즙 시스템의 포털 정맥 혈관을 그린(C)에 도시된 성인 RML의 스케일 바 1mm.(D) 3D 렌더링. H = 하이라, P = 주변 장치. 스케일 바 1mm. 패널 A, B, D는 Hankeova 등의 허가하에 적응됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62941/62941fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62941/62941fig05.jpg"> 그림 5: 이중 수지 간 주사의 일반적인 도전. (A) 이미지는 복강의 초기 개구부 도중 우연히 닉된 간을 묘사하고, 수지는 컷(블루 화살촉)을 통해 누출되고 있다. (B) 수지 경화로 인해 포털 정맥 시스템을 제대로 주입하지 않습니다. 파란색 화살표 헤드는 빈 단자 가지에 레이블을 지정하고 빨간색 브래킷은 큰 거품을 레이블. 스케일 바 1mm. (C) 가난한 경정맥 관류로 인해 제대로 주입 된 포털 정맥 시스템. 파란색 화살촉은 말단 가지에서 볼 수 있는 혈액에 라벨을 부착합니다. 스케일 바 1mm. (D) 수지의 고립 된 공에 의해 명시 된 과충전 담즙 시스템. 왼쪽 패널은 광학적으로 지워진 간을 표시하고 오른쪽 패널은 3D microCT 렌더링 된 이미지를 보여줍니다. 파란색 점선은 확대/축소 영역을 묘사합니다. 검은 화살장은 microCT 스캔 후 광학 클리어링 중에 손상된 간 부위에 라벨을 붙입니다. 스케일 바 1mm. (E) 수지 주입 중 고압은 파문 정맥의 파열을 일으킬 수 있습니다 (이 패널의 동물은 Jag1H268Q 돌연변이를 운반), 파란색 화살촉에 의해 표시. 축척 막대 1mm. (F) 포탈 정맥 주입 (블루 애살촉) 및 (G) 담즙 시스템 주입 (블루 애로우 헤드), 스케일 바 1mm . (H) MicroCT 스캔 기포 (블루 화살표 헤드), 불량 터미널 가지 (빨간 브래킷) 및 수지 누설 (노란색 화살표 헤드), 스케일 바 1mm이 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62941/62941fig05large.jpg" target="_blank">더 큰 버전을 보려면 여기에 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62941/62941fig06.jpg"> 도 6: 차동 수지 대비. (A) 새로 개봉된 노란색 수지는 수지 주입 포털 정맥(회색) 및 담관(흰색)을 구별하기에 충분한 대조를 생성한다. (B) 노란 수지의 3개월 보관은 수지의 침전으로 이질성 불투명도(회색-흰색 포털 정맥, 청색 화살촉)의 결과로 이어진다. (C) 노란 수지의 장기간 보관(&gt;6개월)은 포털 정맥(회색)과 담관(회색)의 대비를 감소시다. 배율 막대 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62941/62941fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이중 수지 주조 마이크로 컴퓨팅 단층 촬영 또는 덕트(DUCT)는 두 관 시스템의 시각화, 디지털화 및 세분화를 동시에 통해 장기 아키텍처의 3D 분석을 용이하게 합니다. 덕트(DUCT)는 두 개의 방사성파크 수지의 전 생체 주입 을 결합한 다음, 마이크로 컴퓨팅 단층 촬영 스캐닝 및 지형 데이터의 세분화를 결합합니다.

덕트: 3D 간 분석을 위한 마이크로 컴퓨팅 단층 촬영 다음에 이중 수지 주조

The liver is the biggest internal organ in humans and mice, and high auto-fluorescence presents a significant challenge for assessing the ...

이 방법을 사용하면 간 혈관 및 담즙 시스템 아키텍처를 3D로 분석, 시각화 및 정량화할 수 있습니다. 우리는 지금 간 질병과 재생의 공간 적인 측면을 더 잘 이해할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 항체 또는 형광 화상 진찰의 존재에 의존하지 않는다는 것입니다.또한 네트워크가 제대로 유인되는 네트워크를 직접 시각화할 수도 있습니다. 이 방법은 관 시스템의 분석에 적합하므로 혈관, 담관 및 기도에 대한 연구가 이상적인 영역입니다. 우리는 담즙 재생과 관련된 구조적 변화를 이해하기 위해 덕트를 사용했습니다.마우스의 담즙 시스템에 수지를 주입하기 전에, 일반적인 담관 및 포털 정맥을 노출하기 위해 PBS로 젖은 면봉을 사용하여 마우스의 왼쪽으로 내장과 췌장을 이동하기 시작합니다. 그런 다음 열등한 베나 카바에서 작은 트랜스 버들 절개를 합니다. 간의 복부 면을 심장쪽으로 뒤집어 내장 표면과 히어 부위를 노출시키고 췌장을 가로 질러 히어 지역에서 실행되는 일반적인 담관과 오디의 괄약판의 내장으로 이동합니다.일반 집게를 사용하여 일반적인 담관에서 약 5 밀리미터의 주변 조직 영역을 지웁니다. 그런 다음 일반적인 담관 아래에 실크 봉합사 실을 배치하여 일반적인 담관 주위에 느슨한 오버핸드 매듭을 묶습니다. 일반적인 담관에 대해 스프링 가위를 평평하게 잡고 일반적인 담즙 덕이 오디의 괄약근 옆에 췌장과 내장에 들어가는 지점에서 일반적인 담관에 경사 절개를 합니다.다음으로, 노란색 수지의 밀리리터 1밀리리터를 MV 경화제의 50마이크로리터와 혼합하고 수지 경화제 혼합물로 1밀리리터 루어 주사기를 채웁니다. 채워진 주사기를 튜브 세트 1과 연결하고 플런저를 눌러 튜브 끝에서 수지 경화제 혼합물이 흘러 들어갈 때까지 튜브를 채웁니다. 일반적인 담관 절개 주위 영역을 곧게 하기 위해 집게를 사용합니다.담관의 등쪽을 향해 아래쪽으로 베벨 팁의 가장 긴 가장자리와 공통 담관의 개구부에 튜브를 삽입하기 전에. 그런 다음 실크 실 매듭을 조여 일반적인 담관 내부의 튜브를 고정합니다. 일반적인 담관에 수지 주입 후 담낭과 개별 간 엽을 관찰하십시오.PBS 젖은 면봉으로 간을 마사지하여 수지를 똑같이 퍼뜨리세요. 수지 로 채워진 담관 말단 가지는 간 표면에서 희미하게 볼 수 있습니다. 수지의 점이 간 표면에 나타나거나 저항이 충족될 때 수지 주입을 중단하십시오.그런 다음 일반적인 담관에서 당겨 튜브를 제거하고 수지누출을 방지하기 위해 집게를 사용하여 실크 매듭을 신속하게 조입니다. 실크 봉합사의 느슨한 끝을 잘라, 그래서 그들은 포털 정맥 주입을 방해하지 않습니다. 포털 정맥에 수지 주입하기 전에, 직선 집게를 사용하여, 간입구에서 약 2 센티미터 주변 조직에서 포털 정맥을 취소합니다.그런 다음 실크 봉합사 실을 포털 정맥의 지워진 영역 아래에 놓고 느슨한 오버핸드 매듭을 묶습니다. 간으로 의한 포문 정맥에서 매듭을 묶기 전에 세로 절개를 합니다. 다음으로, 주사기에 녹색 수지 경화제 혼합물을 준비하고 이전에 설명한 바와 같이 혼합물로 튜브를 채웁니다.포셉을 사용하여 주변 조직을 꼬리 쪽으로 당겨서 배의 등쪽쪽으로 가장 긴 모서리로 튜브를 삽입합니다. 실크 실을 조여 포털 정맥의 튜브를 고정합니다. 수지를 포탈 정맥에 주입한 후 수지로 채워진 혈관을 관찰하고 PBS 젖은 면봉으로 간을 마사지하여 수지 확산을 돕습니다.모든 혈관이 채워지면 포털 정맥에서 튜브를 꺼내서 집게를 사용하여 실크 매듭을 빠르게 조이어 수지가 누출되는 것을 방지합니다. 마우스에서 해부된 간의 마이크로 컴퓨팅 단층 촬영 또는 MicroCT 스캔의 경우, 오른쪽 내측 간 엽을 15 밀리리터 원내 튜브에 배치하고 마이크로CT 측정 중에 원치 않는 샘플 모션을 최소화하기 위해 튜브의 총 부피의 약 3분의 2에 1%아가로즈 젤로 튜브를 채웁니다. CT 장치의 회전 단계에 샘플을 가진 15 밀리리터 원추형 튜브를 장착합니다.튜브가 적어도 1시간 동안 측정 챔버에 열적으로 적응하도록 허용합니다. 샘플이 열적으로 조정되면 뷰 필드 또는 FOV 필드에 중심을 두고 소스 샘플 및 샘플 검출기 거리 또는 SSD 및 SDD를 최적화하여 충분한 복셀 해상도에 도달합니다. 매개 변수가 설정되면 CT 측정을 시작합니다.전용 토모그래픽 재구성 소프트웨어를 사용하여 CT 데이터를 재구성합니다. CT 데이터를 분석하려면 파일, 가져오기 및 명령을 선택하여 파일을 로드합니다. 상단 패널의 표면 결정 함수를 사용하여 글로벌 임계값을 사용하여 데이터의 수지를 분할합니다.대화 창에서, 수지 채워진 용기만 분할하도록 적색 등가값 선의 위치를 설정하여 히스토그램 평가를 사용하여 임계값값을 결정한다. 왼쪽 패널에서 모듈을 선택하여 부피 또는 CAD 또는 메시에서 ROI를 생성하여 수지 채워진 용기의 관심 영역 또는 ROI영역을 만듭니다. 대화 창에서 옵션을 사용하여 솔리드에서 ROI를 만들어 처리된 볼륨의 이름을 선택하고 확인합니다.이 ROI의 백그라운드 영역에서 노이즈 클러스터의 잘못된 세분화를 제거합니다. 오른쪽 패널에서 ROI를 오른쪽 단추로 클릭하고 모듈 분할 ROI를 선택하여 ROI를 표시합니다. 대화 창에서 최소 볼륨 복셀 매개 변수를 설정하여 모든 노이즈 입자를 제외합니다.매개 변수 값은 실험 및 데이터에 따라 달라지며 분석할 각 샘플에 최적화됩니다. 왼쪽 패널에서는 스무딩 모듈을 사용하여 수지 비용 ROI에 기포 또는 수지 누설과 같은 아티팩트없이 부드럽고 연속적이며 견고한 운하 마스크를 만듭니다. CT 데이터에서 더 높은 강도 값을 가진 일반적인 담관 주입에 사용되는 노란색 수지와 같은 더 많은 흡수 수지로 채워진 시스템에 대해 앞에서 설명한 별도의 ROI를 만듭니다.마크 및 수지는 ROI를 우회한 다음 수지 마스크 ROI에서 새 ROI를 빼기 전에 마우스 오른쪽 단추로 클릭하여 새 ROI를 마스크하여 나머지 관 시스템에 대한 새로운 ROI를 만듭니다. 다른 소프트웨어에서 후속 처리를 위한 연산자 참조를 기반으로 다양한 형식으로 두 관 시스템에 대한 결과 ROI를 내보냅니다. 볼륨 그래픽 소프트웨어에서 결과 ROI를 추가처리하여 최종 시각화를 이미지 또는 비디오 형태로 내보냅니다.이 연구에서는, 성공적인 이중 수지 주입은 잘 채워진 간 담관 및 포털 정맥 혈관으로 달성되었습니다. 대표적인 분석은 P15 마우스에 대해 잘 주입된 간으로부터 분할된 데이터와 측면 가지에서 수지를 볼 수 있는 성인 마우스의 결과를 보여줍니다. 실패한 주입의 전형적인 예에서, 외과 수술 도중 간물리적 손상은 수지 누설 귀착되었습니다.또한 주입 전에 바늘이나 튜브의 끝에 수지의 조기 경화, 그리고 부족한 경화는 시스템 과소 충전을 일으켰다. MicroCT 데이터 세분화 중에 사소한 수지 누설을 수동으로 수정할 수 있습니다. 높은 사출 압력은 혈관이나 덕트를 파열시킬 수 있으며 용기 또는 덕트 아키텍처를 돌이킬 수 없게 손상시킬 수 있습니다.또한, 거품은 관 네트워크의 희소하게 충전을 주도 또 다른 매우 일반적인 주입 아티팩트했다. 갓 개포할 때 수지가 사용되었을 때, 노란 수지 주입 담관과 녹색 수지 주입 포털 정맥 사이의 대비에 명확한 차이가 관찰되었다. 3개월의 저장 후, 콘트라스트는 담관과 포문 정맥을 구별하기에 충분했다.그러나, 강수량은 채워진 포털 정맥에서 이질성 불투명성으로 보였다 두 수지의 혼합에 영향을 미쳤다. 수지가 6개월 이상 되었을 때, 대조는 대조만을 기준으로 노란색 주입담관과 녹색 주입 된 포털 정맥을 구별하는 것이 불가능했던 지점으로 저하되었습니다. 일반적인 담관에 경사 절개를 하는 것이 중요합니다.그렇지 않으면 튜브를 삽입하는 것은 매우 어려울 것입니다. 덕트 기술은 히어 및 말초 엽 영역에서 뚜렷한 특징을 가진 임상적으로 관련된 모델에서 담즙 재생의 새로운 건축 메커니즘을 계몽합니다.

duct-double-resin-casting-followed-micro-computed-tomography-for-3d

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

비 - 파괴적인 볼륨 시각화는 가장 효율이 X - 선 마이크로 컴퓨터 tomography (CT) 어떤의 단층 기술에 의해 형성될 수 있습니다.

고해상도 3D 영상의 전 VIVO</em마이크로 중부 표준시로> 생물 학적 샘플

시각화 및 마우스 간문맥 정맥 또는 intrahepatic의 담즙 덕트의 3 차원 구조를 정량화하는 방법이 설명되어 있습니다. 이 수지 주조 기술은 다른 ductal이나 혈관 시스템에 적용이 가능 할 수...

3 차원 수지 주조 및 마우스 포털 정맥 또는 Intrahepatic의 담즙 덕트 시스템의 이미징

이 비디오는 3D 담도 구조를 이해하기 위한 담도 시스템 수지 주조 절차를 설명합니다. 이 기술은 담도계의 내부 직경과 네트워크 연결성에 대한 통찰력을 제공하며, 이는 간 재생 분석에 사용될 수 있습니다.

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