Name: DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제를 스크리닝하기 위한 연속 형광 기반 엔도뉴클레아제 결합 DNA 메틸화 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: 학습하세요 연속 형광 기반 엔도뉴클레아제 결합 DNA 메틸화 분석을 통해 DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제를 스크리닝하는 방법을 배우세요. 실시간 형광 모니터링으로 암 치료제 후보 물질을 효율적으로 선별할 수 있습니다.

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저자는이 연구를 지원 한 Bucknell University와 화학과에 감사드립니다.

1. 스크린용 분석 용액 준비
참고: 이 분석에 사용된 기질의 농도는 조정할 수 있습니다. RFTS가 결여된 DNMT1의 경우, 헤어핀 DNA 기질 및 SAM에 대해 실험적으로 결정된Km 값은 각각 1-2nM 및 2μM,26,40이다.
<ol><li>얼음 위의 미세 원심분리 튜브에서 테스트 중인 각 분석 조건 600μL를 준비합니다. 참고: 필요한 분석 용액의 총 부피는 수행되는 반복의 수에 따라 다릅니다. 각각의 분석 조건은 이 프로토콜에 대해 삼중으로 실행되었다.<ol><li>ddH2O및 5x 메틸화 완충액(250mM 트리스 pH 7.5, 5mMMgCl2, 500mM 칼륨 글루타메이트, 5mM 디티오트레이톨(DTT), 25% 글리세롤)을 각 튜브에 첨가하여 1x 완충액의 최종 농도를 달성합니다. 20 μM 화합물을 함유하는 분석의 경우, 472 μL의 ddH2O 및120μL 5x 완충액을 첨가한다. 50 μM 화합물을 함유하는 분석의 경우, 470 μL의 ddH2O 및120μL의 5x 완충액을 첨가한다.</li>
		<li>각 샘플에 20mg/mL 소 혈청 알부민(BSA) 3.15μL를 추가합니다.</li>
		<li>2μL의 3.15μM 헤어핀 DNA 기질과 1.33μL의 4.75mM SAM을 각 샘플에 추가합니다. 참고: 분석 용액 혼합물의 기질 농도는 원하는 최종 농도의 1.05배입니다.</li>
		<li>적절한 샘플에 21 μM (10 mM의 1.26 μL) 또는 52.5 μM (10 mM의 3.15 μL)의 최종 농도로 억제제를 첨가하십시오. 동등한 양의 디메틸설폭사이드(DMSO)를 대조군 샘플에 추가합니다. 알림: 화면에 사용되는 억제제의 농도는 다를 수 있습니다. 최대 최종 DMSO 농도는 ≤5%(v/v)여야 합니다. 최대 5%(v/v)의 DMSO 농도는 분석26에서 관찰된 활성에 영향을 미치지 않습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>3 초 동안 볼텍싱 (3,000 rpm)하여 용액을 혼합하십시오. 탁상용 미니 원심분리기(1,200× g)에서 샘플을 몇 초 동안 회전시켜 용액이 튜브 바닥에 수집되도록 합니다.</li>
	<li>각 분석 용액 95μL를 검은색 반쪽 영역 96웰 플레이트의 6개의 연속 웰에 분취합니다(그림 2). 참고: 이러한 스크리닝 분석은 두 배치로 수행되었습니다. 먼저, 20 μM 억제제 샘플 (총 4 개 조건)을 조사한 다음, 50 μM 억제제 샘플 (총 4 개 조건)을 조사했다.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62949/62949fig02.jpg"> 그림 2: 분석 플레이트 설정. 각 분석 용액은 검은색 96웰 플레이트의 6개 웰(DMSO 대조군(파란색), 화합물 1(녹색), 화합물 2(빨간색) 및 화합물 3(노란색)으로 분취됩니다. RFTS가 부족한 DNMT1과 Gla I은 모두 3 개의 웰에 추가 될 것입니다. 대조군으로 Gla I 단독으로 다른 세 개의 우물에 추가됩니다. 약어: RFTS = 복제 초점 표적화 서열; DNMT1 = DNA 메틸 트랜스퍼 라제 1; DMSO = 디메틸 술폭 시드. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62949/62949fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
2. 스크린을 위한 효소 해결책 준비
참고: RFTS가 결여된 DNMT1은 대장균에서 발현되고 균 질성으로 정제될 수 있습니다. RFTS-결여된 DNMT1에 대한 발현 및 정제 절차는 이전에 설명되었다41. 필요한 효소의 양은 수행되는 분석의 수에 따라 다릅니다. 여기에서 각 세트에서 4 가지 다른 분석이 수행됩니다. 각 분석은 3 배로 완료됩니다.
<ol><li>얼음 위의 미세 원심분리 튜브에 각 효소 용액 75μL를 준비합니다. 참고: 두 가지 효소 용액이 필요합니다. 하나의 솔루션에는 DNMT1 및 Gla I이 포함됩니다. 다른 하나는 Gla I 만 포함합니다.<ol><li>ddH2O및 5x 메틸화 완충액(250mM 트리스 pH 7.5, 5mMMgCl2, 500mM 글루타민산 칼륨, 5mM DTT, 25% 글리세롤)을 각 튜브에 첨가하여 1x 완충액의 최종 농도를 달성합니다. Gla I 효소 용액의 경우 15μL의 5x 완충액과 58.8μL ddH2O를 추가합니다. DNMT1+Gla I 효소 용액의 경우 15μL의 5x 버퍼와 58.2μLddH2O를 추가합니다.</li>
		<li>0.16 U/μL의 최종 농도에 대해 각 용액에 10 μL의 10 U/μL Gla I를 추가합니다.</li>
		<li>최종 농도 40nM에 대해 5μM RFTS 결여 DNMT1 0.6μL를 DNMT1+Gla I 용액에 추가합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>부드럽게 두드려 용액을 혼합합니다. 탁상용 미니 원심분리기(1,200× g)에서 샘플을 몇 초 동안 회전시켜 용액이 튜브 바닥에 수집되도록 합니다.</li>
	<li>각 효소 용액 12μL를 원뿔형 바닥의 96웰 플레이트에 6개의 웰에 분취합니다(그림 3).</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62949/62949fig03.jpg"> 그림 3: 효소판 설정. Gla I (회색) 및 DNMT1 + Gla I (파란색) 용액은 각각 96 웰 플레이트의 6 개 웰로 분취됩니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 효소를 일련의 분석 용액에 동시에 추가할 수 있습니다. 각 분석 조건 (6 웰)에 대해 3 개의 웰은 DNMT1 + Gla I을 수신하고 3 개의 웰은 Gla I 단독을받습니다. 약어 : DNMT1 = DNA 메틸 트랜스퍼 라제 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62949/62949fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
3. 분석을 실행하고 데이터를 분석합니다.
<ol><li>플레이트 리더를 37°C로 예열합니다. 분석 용액이 들어 있는 검은색 플레이트를 삽입합니다. 플레이트를 흔들고(425cpm에서 5초 동안 이중 궤도) 여기 파장 485nm, 방출 파장 528nm의 형광을 읽습니다. 플레이트를 37°C에서 5분 동안 인큐베이션합니다. 알림: 또는 적절한 파장 차단이 있는 필터를 형광 판독값에 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>분석 플레이트를 제거합니다. 각 웰에 5μL의 효소 용액을 넣고 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다. 참고: 샘플 행을 동시에 시작할 수 있도록 다중 채널 피펫을 사용합니다.</li>
	<li>플레이트를 플레이트 리더에 삽입합니다. 30분 동안 53초마다 형광을 기록합니다. 각 판독 전에 플레이트(425cpm에서 4초 동안 이중 궤도)를 흔듭니다.</li>
	<li>각 조건에 대한 평균 삼중 Gla I 제어 분석. RFTS가 결여된 DNMT1의 존재 하에 수득된 삼중 트레이스로부터 평균 Gla I-함유 대조군 반응 트레이스를 뺀다. 수정된 반복실험에 대한 평균의 평균 및 표준 오차를 확인합니다.</li>
	<li>보정된 평균 반응 트레이스를 플로팅하고 초기 선형 부분을 선에 피팅하여 초기 속도를 결정합니다.</li>
	<li>화합물이 있을 때 관찰된 속도를 DMSO 함유 제어 반응에서 관찰된 속도로 나누고 100을 곱하여 활성 백분율을 결정합니다.</li>
</ol>4. 추가 분석 제어 — 효소의 순차적 첨가
<ol><li>얼음 위의 미세 원심분리 튜브에 550μL의 분석 용액을 준비합니다. 110μL의 5x 메틸화 완충액, 3.88μL의 3.15μM 헤어핀 DNA 기질, 6.43μL의 47.5mM SAM, 3.06μL의 20mg/mL BSA 및 426.6μL의ddH2O를 추가합니다.</li>
	<li>3 초 동안 볼텍싱 (3,000 rpm)하여 용액을 혼합합니다. 탁상용 미니 원심분리기(1,200× g)에서 샘플을 몇 초 동안 회전시켜 용액이 튜브 바닥에 수집되도록 합니다.</li>
	<li>90 μL의 분석 용액을 검정색 반면적 96-웰 플레이트에서 6개의 연속적인 웰로 분취한다.</li>
	<li>얼음 위에 DNMT1 효소 용액을 준비합니다. 4μL의 5x 메틸화 완충액, 0.76μL의 5μM RFTS 결핍 DNMT1 및 15.24μL의ddH2O를 하나의 튜브에 추가합니다. 4 μL의 5x 메틸화 완충액 및 16 μL의 ddH2O를 다른 튜브에 첨가한다.</li>
	<li>부드럽게 두드려 용액을 혼합합니다. 탁상용 미니 원심분리기(1,200× g)에서 샘플을 몇 초 동안 회전시켜 용액이 튜브 바닥에 수집되도록 합니다.</li>
	<li>5μL의 DNMT1 함유 용액을 검은색 반면적 96웰 플레이트의 3웰에 추가합니다. 5μL의 완충액 대조액을 다른 3개의 웰에 추가합니다.</li>
	<li>마이크로타이터 플레이트를 37°C로 예열된 플레이트 리더에 넣습니다. 플레이트를 흔들고(425cpm에서 3초 동안 이중 궤도) 여기 파장 485nm, 방출 파장 528nm의 형광을 읽습니다. 흔들기를 반복하고 60 분 동안 30 초마다 읽습니다.</li>
	<li>분석 플레이트가 플레이트 리더에있는 동안 얼음 위에 Gla I 용액을 준비하십시오. 8μL의 5x 메틸화 완충액, 0.64μL의 10U/μL Gla I 및 31.4μL의ddH2O를 미세 원심분리 튜브에 추가합니다. 부드럽게 두드려 용액을 섞습니다. 탁상용 미니 원심분리기(1,200× g)에서 샘플을 몇 초 동안 회전시켜 용액이 튜브 바닥에 수집되도록 합니다.</li>
	<li>6 μL의 Gla I 용액을 원뿔형 바닥의 96 웰 플레이트에서 6 개의 웰로 분취한다.</li>
	<li>처음 30분 동안 읽은 후 플레이트 리더에서 검은색 플레이트를 제거합니다. 5μL의 Gla I 용액을 6개의 웰 모두에 추가하고 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다. 알림: 모든 웰을 동시에 시작할 수 있도록 다중 채널 피펫을 사용하십시오.</li>
	<li>검은색 플레이트를 플레이트 리더에 다시 놓습니다. 35분 동안 35초마다 형광을 기록합니다. 각 판독 전에 플레이트(425cpm에서 3초 동안 이중 궤도)를 흔듭니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

DNA 메틸 트랜스퍼 라제의 억제제를 확인하고 특성화하려면 효소의 활성을 측정해야합니다. DNA 메틸 트랜스퍼 라제 활성을 검사하기위한 몇 가지 방법이 존재합니다. 활동은 일반적으로 방사능을 사용하여 모니터링됩니다. SAM의 표지된 메틸기의 전사는 29,30,31,32,33,34로 정량화될 수 있다. 메틸-민감성 엔도뉴클레아제를 이용하는 겔-기반 분석이 또한 기술되었다35,36. 이러한 분석은 일반적으로 불연속적이며 활성을 검사하기 위해 여러 단계가 필요합니다. 여기서, 잠재...

DNA 메틸화는 유전자 발현과 염색질 구조를 조절하는 중요한 후성유전학적 표시입니다. 메틸화는 주로 CpG 디 뉴클레오티드에서 발생합니다 - 시토신 다음에 구아노 신; 메틸기는 시토신의 5 위치에 추가됩니다. 올바른 DNA 메틸화 패턴, 따라서 적절한 유전자 발현은 적절한 세포 발달 및 기능에 필요합니다. 많은 질병 상태는 정상적인 메틸화 패턴 1,2,3의 변화와 관련이 있습니다. 예를 들어, 암 시작과 진행 및 DNA 메틸화 패턴의 변경 사이에는 연관성이 있습니다. 일반적으로 암세포는 메틸시토신의 전반적인 수치가 낮아 게놈 불안정성에 기여합니다. 동시에, 게놈에 존재하는 메틸 시토신은 종양 억제 유전자의 프로모터 영역에 집중되어 이러한 중요한 단백질의 유전자 침묵을 유도합니다. 특히, 후성유전학적 변화는 종양 발생과 관련된 DNA 돌연변이와 달리 역동적이고 가역적입니다. 이것은 후성 유전 학적 유전자 조절에 관여하는 단백질을 흥미로운 약물 표적 2,4로 만들었습니다.
DNA 메틸트랜스퍼라제(DNMT)는 DNA 메틸화 패턴을 생성하고 유지하는 역할을 하는 단백질입니다. 세 가지 촉매 활성 동종 효소 인 DNMT1, DNMT3a 및 DNMT3b가 인간에게 존재합니다. 개발 및 분화 과정에서 드 노보 메틸 트랜스퍼 라제 인 DNMT3a 및 DNMT3b는 메틸화 패턴을 설정합니다. 두 효소 모두 촉매 적으로 비활성 인 DNMT3L 단백질과 결합하여 증가 된 활성 1,5를 나타내는 복합체를 형성 할 수 있습니다. 세포 분열 후 딸 세포는 새로 합성된 DNA에 메틸화 표시가 없기 때문에 헤미메틸화된 DNA(듀플렉스의 한 가닥에만 메틸시토신을 포함하는 DNA)를 포함합니다. DNMT1의 주요 기능은 이 헤미메틸화 DNA를 메틸화하여 전체 메틸화 패턴 1,5를 재설정하는 것입니다.
DNMT 활동과 암 사이의 연관성은 잘 확립되어 있습니다. 전사 또는 번역 후 메커니즘에 의한 DNMT1의 과발현은 몇 가지 일반적인 발암 경로 6,7,8,9의 결과입니다. 하이포모픽 대립유전자를 사용하여 DNMT1 활성을 낮추기 위한 유전학적 접근은 Apc(Min)마우스10에서 종양 형성을 감소시킵니다. DNMT1을 녹다운시키는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 세포 배양 및 마우스 종양 모델11,12에서 신생물을 억제합니다. 따라서 DNMT1 활성을 억제하는 것은 유망한 암 치료 접근법처럼 보입니다. 그러나 DNMT3 동종 효소가하는 역할은 그렇게 간단하지 않습니다. DNMT3a 돌연변이는 급성 골수성 백혈병13 및 골수이형성 증후군14에서 발견됩니다. 확인된 돌연변이 중 적어도 하나는 효소15의 DNA 메틸화 활성을 감소시키는 것으로 나타났다. 그러나 DNMT3b는 유방암16 및 대장 암17에서 과발현됩니다. 다양한 DNMT 동종 효소가 발암에서 서로 다른 역할을하기 때문에 동종 효소 특이 적 억제제를 식별하는 것이 중요합니다. 이러한 화합물은 치료제 개발에 유용할 뿐만 아니라 동종효소 특이적 억제제는 암 병인학에서 각 DNMT 동종효소의 역할을 해부하는 귀중한 도구가 될 것입니다.
여러 DNMT 억제제가 문헌에보고되었습니다. 공지된 DNMT 억제제는 뉴클레오시드 및 비뉴클레오사이드의 두 가지 부류로 나눌 수 있다. 뉴클레오시드 억제제는 전형적으로 시티딘 유사체이다. 이 화합물은 DNA에 통합되어 DNMT를 공유 결합적으로 포획합니다. 5- 아자 시티 딘 및 5- 아자 -2'- 데 옥시 시티 딘은 골수이 형성 증후군 및 급성 골수성 백혈병 4,18의 치료를 위해 승인되었습니다. 이들 화합물의 높은 독성, 낮은 생체이용률 및 화학적 불안정성은 문제점을 제시한다. 진행중인 연구는 차세대 뉴 클레오 시드 억제제의 효능을 조사하고 있습니다. 5-아자-2'-데옥시시티딘으로부터 유도된 SGI-110은하나의 예 19,20이다. 뉴 클레오 시드 억제제는 동종 효소 특이 적이 지 않으며 발생하는 DNMT 동종 효소를 비활성화합니다. 따라서, 뉴클레오시드-탈메틸화제로 처리하면 모든 DNMT 동종효소 4,18이 고갈된다. 비-뉴클레오시드 억제제는 억제 효과를 발휘하기 위해 DNA에 혼입될 필요가 없다. 대신, 이러한 분자는 DNMT에 직접 결합하여 동종 효소 특이 적 억제 가능성을 도입합니다. 현재까지 SGI-1027 21, 히드랄라진22, 프로카인아미드 23, RG108 및 유도체 24, 천연물 (-)-에피갈로카테킨 3-갈레이트(EGCG)25 및 락카산 A 26,27을 포함한 여러 비뉴클레오시드 억제제가 발견되었습니다. 현재까지 발견 된 대부분의 비 뉴 클레오 시드 억제제는 동종 효소 선택적이지 않거나 하나의 DNMT 동종 효소에 대해 약한 선호도를 나타냅니다. 또한, 이들 분자의 효능은 특히 세포 4,18에서 개선되어야합니다. 따라서, 보다 강력한 동종효소 선택적 DNMT 억제제를 발견하거나 개발할 필요가 있다.
DNMT의 새로운 소분자 억제제를 발견하는 데 장애물은 전통적으로 DNMT 활성28을 검사하는 데 사용되는 힘든 분석입니다. 분석은 일반적으로 여러 단계로 불연속적입니다. DNMT의 효소 활성은 여전히 방사성 S- 아데노 실 메티오닌 (SAM) 29,30,31,32,33,34를 사용하여 일상적으로 분석됩니다. DNA 메틸화에 대한 비방사성 분석법도 개발되었습니다. 예를 들어, 소화 생성물을 분리하기 위해 메틸 민감성 제한 엔도뉴클레아제 및 전기영동을 활용하는 분석이35,36에 기재되어 있다. 이러한 유형의 불연속, 다단계 분석은 약물 발견에 쉽게 적응할 수 없습니다. 2000년대 중반 이후, 더 높은 처리량을 갖는 여러 DNA 메틸화 분석법이 개발되었다28. 섬광 근접 분석을 사용하여 DNMT1 억제제37을 스크리닝하였다. 메틸 민감성 제한 엔도뉴클레아제를 활용하는 또 다른 분석을 사용하여 DNMT3a 억제제25,38을 스크리닝했습니다. 두 분석 모두 기존 DNA 메틸화 분석보다 더 높은 처리량을 허용하지만 분석에는 여러 단계가 필요하며 메틸화 활성을 실시간으로 관찰할 수 없습니다. 보다 최근에, 메틸화 반응의 한 생성물 인 S- 아데노 실 호모시스테인 (SAH)의 형성을 NADPH 산화와 관련된 340 nm에서의 분광 변화에 결합하는 연속 동역학 분석이 설명되었다39. 이 분석은 분광 신호를 생성하기 위해 세 가지 결합 효소를 사용합니다.
우리는 상업적으로 이용 가능한 단일 결합 효소를 활용하고 실시간으로 데이터를 생성할 수 있는 형광 기반 엔도뉴클레아제 결합 DNA 메틸화 분석을 개발했습니다(그림 1). 3개의 메틸시토신을 함유하는 헤어핀 올리고뉴클레오티드가 기질로서 사용된다. 기질 DNA는 5' 말단에 형광단을 포함하고 3' 말단에 소광제를 포함합니다. 헤미메틸화된 CpG 부위의 메틸화는 엔도뉴클레아제 Gla I에 대한 절단 부위를 생성한다 - 완전히 메틸화된 GCGC. 생성물의 GlaI 절단은 소광제로부터 형광단을 방출하고 실시간으로 형광을 발생시킨다. 분석은 DNMT의 모든 이소형의 활성을 검사하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 DNMT1에서는 이 동종효소가 헤미메틸화된 DNA 1,5를 우선적으로 메틸화하기 때문에 더 높은 활성이 관찰됩니다. 자가 억제 복제 초점 표적화 서열 (RFTS) 도메인이 DNMT1에서 제거되면 더욱 강력한 활성이 관찰됩니다. N- 말단 조절 영역에서 발견되는이 도메인은 촉매 부위에 결합하여 DNA 결합을 방지합니다. 처음 ~600개의 아미노산을 제거하면 전장 효소보다 훨씬 더 활성이 높은 잘린 효소가 생성됩니다(kcat/Kam에서 ~640배 증가)40. RFTS가 결여된 DNMT1(아미노산 621-1616)이라고 하는 이 활성화된 형태의 효소는 증가된 촉매력으로 인해 억제제를 더 쉽게 식별할 수 있습니다. 이 논문은 잠재적인 소분자 억제제를 스크리닝하기 위해 분석에서 RFTS가 부족한 DNMT1을 활용하는 프로토콜을 제시합니다. 엔도뉴클레아제-결합 연속 분석을 사용하여, 초기 속도는 몇 개의 작은 분자의 존재 및 부재 하에서 결정된다. 각 잠재적 억제제는 농도 의존적 DNMT1 억제를 찾기 위해 두 가지 농도에서 검사됩니다. 소분자의 존재 하에 관찰된 활성 퍼센트를 각각의 경우에 계산하였다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62949/62949fig01.jpg"> 그림 1: DNA 메틸화 분석. 5' 말단에 형광단이 있고 3' 말단에 소광제가 있는 헤미메틸화 헤어핀 DNA가 기질로 사용됩니다. DNMT1은 S- 아데노 실 메티오닌에서 비 메틸화 된 CpG 부위로 메틸기의 전달을 촉매하여 S- 아데노 실 호모시스테인과 완전히 메틸화 된 DNA를 생성합니다. DNA 생성물은 완전히 메틸화 된 GCGC 부위를 절단하는 엔도 뉴 클레아 제 Gla I의 절단 부위를 포함합니다. 생성물 DNA의 절단은 3' 소광기로부터 5' 형광단을 방출하여 형광을 생성한다. 약어: Fl = 형광단; Q = 소멸제; DNMT1 = DNA 메틸 트랜스퍼 라제 1; SAM = S- 아데노 실 메티오닌; SAH = S- 아데노 실 호모시스테인. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62949/62949fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>96-well Half Area Black Flat Bottom 폴리스티렌 처리되지 않음 마이크로플레이트</td><td>Corning</td><td>3694</td><td></td></tr><tr><td>96-웰 폴리스티렌 원추형 바닥 플레이트</td><td>ThermoFisher</td><td>249570</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>NEB</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>화합물 1</td><td>ChemBridge</td><td>5812086</td><td>스크리닝 화합물; DMSO에서 10mM</td></tr><tr><td>화합물 2</td><td>로 재현탁ChemBridge</td><td>6722175</td><td>스크리닝 화합물; 10 mM</td></tr><tr><td>화합물 3</td><td>ChemBridge</td><td>5249376</td><td>스크리닝 화합물로 DMSO에 재현탁; 10 mM</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Gla I</td><td>SibEnzyme</td><td>E494</td><td>메틸 민감성 엔도뉴클레아제</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>RPI</td><td>G22025</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘</td>에 DMSO에서 재현탁액<td>Sigma</td><td>M0250</td><td></td></tr><tr><td>올리고뉴클레오티드(5'-FAM-CCTATGCGmCATCAGTTTTCTGATGmCGmCATAGG-3'-아이오와 블랙 담금질제)</td><td>IDT</td><td>맞춤형 합성</td><td>내부 담금질 헤어핀 DNA(기질)</td></tr><tr><td>글루타민산칼</td>륨 <td>시그마</td><td>G1501</td><td></td></tr><tr><td>S-아데노실메티오닌</td><td>시그마</td><td>A4377</td><td>메틸 공여 보조 인자(기질)</td></tr><tr><td>트리스 염기</td><td>RPI</td><td>T60040</td><td></td></tr></tbody></table>

dna 메틸트랜스퍼라제 억제제를 스크리닝하기 위한 연속 형광 기반 엔도뉴클레아제 결합 dna 메틸화 분석

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

후성유전학적 유전자 조절의 한 형태인 DNA 메틸화는 정상적인 세포 기능에 중요합니다. 세포에서 DNA 메틸 전이 효소 (DNMT)라고하는 단백질은 DNA 메틸화 패턴을 설정하고 유지합니다. 정상적인 DNA 메틸화 패턴의 변화는 암 발생 및 진행과 관련이 있어 DNMT를 잠재적인 항암제 표적으로 만듭니다. 따라서 이러한 효소의 새로운 소분자 억제제를 식별하고 특성화하는 것이 매우 중요합니다. 이 논문은 DNA 메틸 트랜스퍼 라제 억제제를 스크리닝하는 데 사용할 수있는 프로토콜을 제시합니다. 연속 결합 동역학 분석은 잠재적인 소분자 억제제의 존재 및 부재 하에서 DNA 메틸화의 초기 속도를 결정할 수 있도록 합니다. 이 분석은 메틸 민감성 엔도 뉴 클레아 제 Gla I을 사용하여 헤미 메틸화 된 DNA 기질의 메틸화를 형광 생성에 결합시킵니다.
이 연속 분석을 통해 효소 활성을 실시간으로 모니터링할 수 있습니다. 마이크로타이터 플레이트에서 소량으로 분석을 수행하면 시약 비용이 절감됩니다. 이 분석을 사용하여 인간에서 가장 풍부한 DNMT 동종 효소 인 DNMT1의 억제제에 대한 작은 예제 스크린이 수행되었습니다. 고도로 치환 된 안트라 퀴논 천연 제품 인 락카산 A는 DNMT1의 강력한 DNA 경쟁 억제제입니다. 여기에서는 분석 프로토콜을 설명하기 위해 세 가지 잠재적 소분자 억제제(안트라퀴논 또는 1-3개의 치환기가 있는 안트라퀴논 유사 분자)를 두 가지 농도로 검사합니다. 초기 속도는 각 분자의 존재에서 관찰되는 백분율 활성을 계산하는 데 사용됩니다. 조사된 세 가지 화합물 중 하나는 DNMT1 활성의 농도 의존적 억제를 나타내며, 이는 DNMT1의 잠재적 억제제임을 나타냅니다.

활성 DNMT1은 이 분석의 전제 조건입니다. RFTS-결여된 DNMT1을 대장균에서 발현시키고, 이전에 공개된 절차41에 따라 균질성으로 정제하였다. 정제된 효소가 활성인지 확인하기 위해, 불연속 엔도뉴클레아제-결합 분석을 사용하여 DNA 메틸화 활성을 조사하였다36. 이 분석은 Sau3A1 절단 부위에 위치한 단일 반메틸화 CpG를 갖는 32 염기쌍 이중 DNA를 활용합니다. Sau3A1은 헤미 메틸화 된 기질 DNA를 절단 할 수 있습니다. 그러나 DNA가 완전히 메틸화되면 절단이 차단됩니다. RFTS-결여된 DNMT1을 1 μM DNA 및 0.5 mM SAM을 함유하는 분석에 첨가하고, 분취량을 제거하고, 30분에 걸쳐 급속 냉동하였다. 샘플을 이어서부터 Sau3A1로 분해하고, 생성물을 겔 전기영동으로 분리하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, DNA는 반응 시간이 증...

DNA 메틸트랜스퍼라제는 잠재적인 항암제 표적입니다. 여기에서, DNA 메틸 트랜스퍼 라제 억제에 대한 소분자를 평가하기위한 프로토콜이 제시된다. 이 분석은 엔도뉴클레아제를 활용하여 DNA 메틸화를 형광 생성에 결합하고 효소 활성을 실시간으로 모니터링할 수 있도록 합니다.

DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제를 스크리닝하기 위한 연속 형광 기반 엔도뉴클레아제 결합 DNA 메틸화 분석

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

당사와 같은 강력한 플레이트 리더 분석은 잠재적인 메틸트랜스퍼라제 억제제의 초기 스크리닝에 매우 유용합니다. 실시간으로 데이터를 수집하는 능력은 연속 엔도뉴클레아제-결합 분석의 큰 장점이다. 먼저 얼음 위의 마이크로원심분리 튜브에 20마이크로몰 및 50마이크로몰 화합물을 별도로 포함하는 600마이크로리터의 분석 조건을 준비합니다.이렇게 하려면 각 튜브에 이중 증류수와 5X 메틸화 버퍼를 추가하여 1X 메틸화 버퍼의 최종 농도를 달성합니다. 다음으로, 3.15 마이크로 리터의 밀리리터 소 혈청 알부민 또는 BSA를 각 샘플에 밀리리터 당 20 밀리그램 첨가하십시오. 그런 다음 2마이크로리터의 3.15마이크로몰 헤어핀 DNA 기질과 1.33마이크로리터의 4.75마이크로몰 S-아데노실메티오닌 또는 SAM을 각 샘플에 추가합니다.억제제를 적절한 샘플에 첨가하여 21 마이크로 몰 또는 52.5 마이크로 몰의 최종 농도와 동등한 양의 디메틸 설폭 시드 또는 DMSO를 대조군 샘플에 첨가 한 후 3 초 동안 분당 3, 000 회전으로 와동하여 용액을 혼합합니다. 그런 다음 테이블 테이블 미니 원심 분리기에서 1, 200 배 G에서 샘플을 몇 초 동안 회전시켜 용액이 튜브 바닥에 수집되도록합니다. 각 분석 용액 95 마이크로리터를 검정 반쪽 영역 96 웰 플레이트에서 6개의 연속적인 웰로 분취한다.75 마이크로 리터의 Gla I 또는 DNMT1 플러스 Gla I 효소 용액을 1 회 완충액의 최종 농도로 앞에서 설명한 바와 같이 마이크로 원심 분리 튜브에 준비합니다. 다음으로, 마이크로 리터 당 10 단위의 1.2 마이크로 리터 Gla I을 각 용액에 첨가하여 마이크로 리터당 0.16 단위의 최종 농도를 달성한다. 0.6 마이크로 리터의 5 마이크로 몰 RFTS 결핍 DNMT1을 DNMT1과 Gla I 용액에 추가하여 최종 농도 40 나노 몰을 만듭니다.부드럽게 혼합 한 후 탁상 미니 원심 분리기에서 1, 200G의 샘플을 몇 초 동안 회전시켜 용액이 튜브 바닥에 수집되도록합니다. 이어서, 각 효소 용액 12 마이크로리터를 원뿔형 바닥의 96웰 플레이트에서 6개의 웰로 분취한다. DNA 샘플의 메틸화 분석을 위해 플레이트 리더를 섭씨 37도로 예열합니다.그런 다음 분석 용액이 포함된 검은색 플레이트를 플레이트 판독기에 삽입합니다. 플레이트를 425 CPM에서 진탕한 후, 485 나노미터의 여기 파장 및 528 나노미터의 방출

continuous-fluorescence-based-endonuclease-coupled-dna-methylation

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 동영상은 methylated DNA의 immunoprecipitation (MeDIP)에 대한 프로토콜을 보여줍니다. MeDIP가 선택 (안티 - 5 MC) 5 methylcytosine에 대한 특이성과 항체를 사용하여 게놈 DNA 샘플에서 methylated DNA 조각을 추출 두 하루 절차입니다.

Methylated DNA의 Immunoprecipitation

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing은 시토신 중아황산염 변환과 결합된 제한 효소 분해를 기반으로 DNA 메틸화 분석을 위한 염기서열분석 라이브러리를 준비하는 방법입니다. 이 프로토콜은 50ng의 시작 물질이 필요하며 GC가 풍부한 게놈 영역에서 염기쌍 분해능 데이터를 생성합니다.

자료 쌍 해상도에서 DNA 메틸화의 평가에 대한 표현 바이 설 파이트 시퀀싱을 감소 향상

BSAS(Bisulfite amplicon sequencing)Bisulfite 앰플리콘 염기서열분석(BSAS)은 관심 대상 게놈 영역에서 시토신 메틸화를 정량화하는 방법입니다. 이 방법은 차세대 염기서열분석 전에 표적 영역의 PCR 증폭과 쌍을 이루는 중아황산염 변환을 사용하여 염기 특이적 수준에서 DNA 메틸화의 절대 정량을 생성합니다.

DNA 메틸화 분석 차세대 시퀀싱 대상

여기서 우리는 프로토콜이 메틸 바인딩 DNA 캡처 시퀀싱 (MBDCap-서열 또는 MBD-SEQ) 기술과 이후의 생물 정보학 분석 파이프 라인을 사용하여 대규모 임상 환자 스크리닝 연구에서 게놈 전체 DNA 메틸화를 조사하기 위해 제시한다.

환자 조직에 대한 메틸 결합 DNA 캡처 시퀀싱

Islet β 세포 사멸은 제1형 당뇨병의 발병보다 먼저 발생하며, 이 과정을 감지하면 조기 치료 개입이 가능할 수 있습니다. 여기에서는 세포 사멸의 바이오마커로서 인간 혈청에서 차등 메틸화된 INS DNA 종을 측정하는 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다β.

된 유의 메틸화 측정<em&gt; INS</em&gt; 바이오 마커 작은 섬의 β 세포 죽음 등 인간의 혈청 샘플에서 DNA 종

이 연구는 만성 림프 구성 백혈병 (CLL) 환자에서 차별적으로 메틸화 된 CpG가 풍부한 부위를 확인하기 위해 최적화 된 메틸 -CpG 결합 도메인 (MBD) 시퀀싱 프로토콜과 계산 파이프 라인을 설명합니다.

만성 림프 성 백혈병 환자에서 Methyl-CpG- 결합 도메인 포착 기반 방법을 이용한 포괄적 인 DNA 메틸화 분석

여기, 우리는 활성 태그 인간의 효율적인 단일 단계 정화에 대 한 프로토콜 10-11 전 2 (TET2) 제시 5-methylcytosine dioxygenase 이온-교환 크로마토그래피와 액체 크로마토그래피 탠덤 질량을 사용 하 여 그 분석 결과 사용 하 여 분석 (LC-MS/MS)-기반 접근.

효율적인 정화와 10-11 전-2 5-Methylcytosine Dioxygenase에 대 한 LC-MS/MS 기반 분석 결과 개발

여기에서, 우리는 환자 생물학적 유체 (biofluids)에 존재하는 순환 DNA에 있는 종양 체세포 돌연변이를 검출하는 프로토콜을 제시합니다. 우리의 액적 디지털 중합효소 연쇄 반응 (dPCR) 기지를 둔 방법은 종양 돌연변이 allelic 주파수 (MAF)의 정량화를 가능하게 하고, 종양 반응의 진단 그리고 시간적 감시에 최소침습 적인 보충을 촉진하.

환자 생체 유체에서 종양 관련 순환 DNA의 검출 및 모니터링

여기서, 합성 또는 시험관내 전사 RNA에 대한 메틸트랜스퍼라제 활성의 직접 분석을 위한 항체-무체질 시험관내 분석이 기재되어 있다.

RNA 메틸 트랜스퍼라제 활성 분석을 위한 항체 무첨가 분석

본명, 위장관암에서 DNA 메틸화의 게놈 전체 분석을 위한 절차를 기술하고 있다. 절차는 유전자의 메틸화 패턴과 위장암에 있는 발암발생에 기여하는 요인 사이 관계를 조사하는 연구 결과에 관련성입니다.

위장암에서 DNA 메틸화의 게놈 전체 분석

이 프로토콜은 FEN1(Flap Endonuclease 1) 활성 및 억제제 개발을 측정하기 위한 겔 시프트 생화학적 분석을 설명합니다.

FEN1 nuclease 활성의 형광 기반 검출 및 소분자 억제제의 스크리닝

학습하세요 연속 형광 기반 엔도뉴클레아제 결합 DNA 메틸화 분석을 통해 DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제를 스크리닝하는 방법을 배우세요. 실시간 형광 모니터링으로 암 치료제 후보 물질을 효율적으로 선별할 수 있습니다.

DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제를 스크리닝하기 위한 연속 형광 기반 엔도뉴클레아제 결합 DNA 메틸화 분석

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