Name: 펩티도믹스 연구를 위한 아민의 환원 메틸화를 이용한 샘플 준비 및 상대적 수량 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: 학습하세요 프로테아제 열 불활성화를 이용한 펩티드 보존 및 동위원소 표지를 활용한 상대 정량 분석법을. 이 방법은 비용 효율적이며 다양한 생물학적 샘플에 적용 가능합니다.

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여기에 설명 된 기술의 개발 및 사용은 브라질 국가 연구위원회 보조금 420811/2018-4 (LMC)에 의해 지원되었다; Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (www.fapesp.br) 교부금 2019/16023-6 (LMC), 2019/17433-3 (LOF) 및 21/01286-1 (MEME). 기금은 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 게시 결정 또는 문서 작성에 아무런 역할이 없었습니다.

펩티드 추출 및 환원 메틸화를 위한 다음 절차는 이전에 발표된 절차24,25,26,27에서 조정되었다. 이 프로토콜은 국립 동물 실험 통제 위원회 (CONCEA)의 지침을 따랐으며 상파울루 주립 대학의 생물 과학 연구소에서 동물 사용 윤리위원회 (CEUA)의 승인을 받았습니다. 프로토콜 단계는 그림 1에 표시됩니다.
참고: 초순수로 모든 수성 솔루션을 준비합니다.
1. 펩타이드 추출
<ol><li>세포 배양<ol>
<li>15% 태아소 혈청과 1%페니실린-연쇄절제술을 함유한 덜벡코의 수정된 이글 배지에서 37°C에서 15cm 의 접시에 SHSY5Y 세포를 재배한다.</li>
		<li>각 샘플에 대해 2-3 플레이트를 사용합니다. 세포를 100% 합류로 증가시면 됩니다.</li>
		<li>치료 용 후 인산염 완충 식염수로 세포를 두 번 씻으하십시오. 다음으로, 10mL의 인산염 완충식식염을 추가하고 세포를 긁어 내고 15mL 튜브로 수집합니다.</li>
		<li>원심분리기 는 800 x g 에서 5 분 동안 및 상류체를 제거합니다. 80°C에서 초정화 화된 산화수의 1mL에서 펠릿을 재연한다.</li>
		<li>튜브(셀룰러 리세이트)의 내용을 2mL 마이크로퍼지 튜브로 전송한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>동물 조직 (주로 신경 조직):<ol>
<li>야생형 남성 성인 다리오 레리오 (zebrafish)를 치명적인 MS 222(100 mg/L)로 마취하고 즉시 펩티다아제와 프로테아제의 비활성화를 위해 8s의 전자레인지 방사선을 투여합니다. 참고: 가정용 전자레인지를 사용할 수 있습니다. 900 W 전자 레인지는 전원에 8 ~ 10 s에 사용 되었습니다. 사용되는 전자 레인지는 10 s 이내에 뇌 온도를 80 °C&gt; 올릴 수 있어야합니다. 시료 간 가열에 있는 재현성은 또한 전자레인지에 있는 동일 위치에 조직을 두어 유익할 것입니다.</li>
		<li>열 불활성화 후, 2mL 미세 분리 튜브에서 전체 뇌를 수집하고 분석 할 때까지 -80 °C에서 동결하십시오.</li>
		<li>80°C에서 초정화 화된 탈이온수 1mL에서 조직 샘플을 재연한다. 1s의 30 펄스 (4 Hz)를 사용하여 프로브로 조직을 초음파 처리합니다. 참고: 간 및 신장 조직의 경우 20s용 10,000-30,000 rpm에서 기계적 균질화제를 사용하십시오. 근육 조직의 경우, 도자기 도가니와 유봉을 사용하여 액체 질소로 조직을 갈아. 다음 단계는 세포 용해 또는 균주 조직에 대해 동일합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세포 용액 또는 균질 조직을 80 °C에서 20 분 동안 배양합니다. 다음으로, 10-30 분 동안 얼음에 냉각.</li>
	<li>10mMMM의 최종 농도를 얻기 위해 샘플 부피 1mL에 대해 1M HCl 스톡 솔루션 10μL을 추가합니다. 20s를 위해 소용돌이를 가하고 얼음에 15 분 동안 더 인큐베이션하여 섞습니다. 참고: 산성화하기 전에 높은 온도에서 산성화로 인한 펩티드 결합을 깨지 않도록 시료가 완전히 냉각되었는지 확인하십시오.</li>
	<li>세포 용액 또는 12,000 x g 에서 15 분 동안 4 °C에서 균질 조직을 원심 분리합니다. 낮은 결합 단백질 미세 원심 분리기 튜브에서 상체를 수집하고 -80 ° C에 저장합니다.</li>
	<li>물과 원심분리기를 2300 x g 에서 3분 동안 추가하여 초여분 장치(10kDa 컷오프 필터)를 청소하십시오. 이 단계를 두 번 더 반복합니다.</li>
	<li>상체는 미리 세척된 10kDa 컷오프 필터와 원심분리기를 4°C에서 2,300x g에 넣고 냉장고에 50분 간 놓습니다. 플로우루는 펩티드 추출물을 나타낸다.</li>
	<li>아래 설명된 아세토닐(ACN) 및 트리플루오로아세트산(TFA) 솔루션을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 반전 위상 정화 열에 대한 샘플을 탈염합니다.<ol>
<li>1mL의 1mL로 열을 100% ACN으로 보정합니다.</li>
		<li>0.1% TFA로 5% ACN의 1mL 용액으로 컬럼을 세척합니다.</li>
		<li>열에 샘플의 전체 볼륨을 로드합니다.</li>
		<li>0.1% TFA로 5% ACN의 1mL 용액으로 컬럼을 세척</li>
		<li>단백질 저결합 마이크로센심분리기 튜브에서 0.15% TFA로 1.8mL 의 1.8mL 용액으로 컬럼에서 펩티드를 엘테.</li>
	</ol>
</li>
	<li>진공 원심분리기에서 샘플을 완전히 건조시하십시오. 유기 용매 및 온도에 대한 농도 방법을 30 °C에서 설정합니다. 농도 시간은 디스플레이에서 모니터링됩니다.<ol>
<li>다음 단계까지 -80°C에 샘플을 저장합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 플루오스카핀을 가진 펩타이드 정량화
참고: 펩타이드의 양은 이전에 설명된 바와 같이 pH 6.8에서 플루오레스카핀을 사용하여 추정될 수 있다11,28. 이 방법은 리신(K) 잔류물 및/또는 펩티드의 N 단말에서 존재하는 1차 아민에 플루오스파민 분자의 부착으로 구성된다. 반응은 pH 6.8에서 수행되어 플루오스카민이 펩티드의 아미노산 그룹과만 반응하고 자유 아미노산이 아니라 반응한다는 것을 보장한다. 불소스카핀은 370nm의 포근파장과 480nm의 방출 파장에서 분광성계를 사용하여 측정된다.
<ol><li>표준 펩티드(0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 0.3, 0.5 및 0.7 μg/μg/μL)의 상이한 농도를 준비하고 -20°C에 알리쿼트를 저장한다. 참고: 펩티드 5A(LTLRTKL)는 알려진 조성물 및 농도를 가지고 있기 때문에 제안된다.</li>
	<li>아세톤에 플루오스카핀 스톡 솔루션(0.3 mg/mL)을 준비합니다. Aliquot는 마이크로 원심 분리튜브 (1 mL)에서 신속하게 밀봉하고 파라필름을 사용하여 밀봉하고 어둠 속에서 -20 ° C에 저장합니다.</li>
	<li>pH 6.8에서 0.2 M 인산염 버퍼(PB)를 준비합니다. 참고: 0.1M 인산염 완충p 6.8(Na2HPO3 1M의 26.85mL) 및 0.1M 인산염 완충p 6.8(NaH2PO3 1ML 23.15mL)을 250mL의 물로 추가하여 0.2M PB를 준비하십시오.</li>
	<li>100-200 μL의 초정화 수에서 펩티드 샘플을 재연한다.</li>
	<li>파이펫 2.5 μL 표준 펩티드 농도 및 샘플은 삼중에서 형광 성소에 대한 흰색 96 웰 플레이트에. 0.2 M 인산염 버퍼의 25 μL을 추가합니다.</li>
	<li>멀티채널 파이펫으로 12.5μL의 플루오스카핀을 추가합니다. 궤도 회전기 셰이커에서 1분 동안 부드럽게 균질화합니다.</li>
	<li>다음으로, 반응을 중지 멀티 채널 파이펫과 물 110 μL을 추가합니다. 참고: 플루오레스카핀 스톡 솔루션과 초순수수를 두 개의 저수지로 전송하여 멀티채널 파이펫으로 이러한 솔루션을 피펫합니다.</li>
	<li>분광계에서 다음 판독 매개변수를 조정합니다: 상단에서 샘플을 읽고, 370 nm에서 여기 파장, 480 nm에서 방출 파장.</li>
	<li>분광로계의 판을 읽으십시오.</li>
</ol>3. 아민 라벨링의 환원 메틸화
참고: 이 동위원소 라벨링 방법은 포름알데히드와 시아노보로하이드라이드 나트륨 시약의 유정 및 비증칭 형태를 가진 아민 군의 디메틸화에 기초한다. 이 반응의 최종 생성물은 사용 가능한 각 라벨링 부위(lysine 또는 N-terminal)에서 각 펩타이드의 최종 질량에 28Da, 30 Da, 32 Da, 34 Da 또는 36 Da를 추가합니다. 이러한 반응은 MS 스펙트럼에서 관찰된 상이한 형태로 표지된 펩티드에서 m/z 차이를 생성한다(표 1).
주의: 적절한 안전 장비를 사용하여 이러한 화합물을 처리해야 하며 노출을 최소화하기 위해 주의를 기울여야 합니다. 포름알데히드와 시아노보로하이드라이드 나트륨 시약시약이 매우 독성이 있기 때문에 연기 후드에서 수행해야 합니다(시아노보로하이드라이드 나트륨 계량 포함). 담금질 반응 및 산성화 동안, 독성 가스(시안화수소)가 생성될 수 있다.
<ol><li>초순수수로 시술 당일 주식이나 시약에서 다음과 같은 신선한 솔루션을 준비하십시오.<ol>
<li>37%의 포름알데히드(CH2O)의 육수를 4%로 희석합니다.</li>
		<li>20% 포름알데히드 신체(CD2O)의 주식을 4%로 희석합니다.</li>
		<li>20 % 중화 된 C13 포름알데히드 (13CD2O)의 주식을 4 %로 희석합니다.</li>
		<li>준비 0.6 M NaBH3CN.</li>
		<li>준비 0.6 M NaBD3CN.</li>
		<li>1% 암모늄 중탄산염의 용액을 준비한다.</li>
		<li>용액을 5% 포믹산을 준비합니다. 참고: 펩티드의 상대적 양에 관해서는, 사용되는 라벨의 수에 따라 다른 실험 체계가 수행 될 수 있기 때문에 화학 라벨링 절차 중에주의가 필요합니다. 샘플 튜브에 잘못된 시약을 추가하는 인간의 오류 가능성을 줄이기 위해 라벨을 별도의 랙에 레이블의 작은 알리쿼트(aliquots)를 분리하는 것이 좋습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>펩티드의 최대 25 μg를 포함하는 각 샘플을 준비합니다. 샘플에는 트리스 또는 중탄산암모늄이 포함되어서는 안 됩니다. 참고: 아래에 설명된 양은 100 μL의 부피의 각 샘플에 충분합니다. 연기 후드에서 3.3-3.8 단계로 진행합니다.</li>
	<li>샘플에 1M TEAB의 1/10제부 피를 추가합니다(TEAB의 용액 100mMM의 최종 농도). pH 표시기 용지로 pH를 확인하십시오. 5-8 사이여야 합니다. 필요한 경우 HCl 또는 NaOH로 조정합니다.</li>
	<li>확립된 라벨링 방식에 따라 유정되지 않은, 유정된 포름알데히드 또는 C13 의 4 μL을 추가합니다. 소용돌이에 의해 5 s에 대 한 혼합.</li>
	<li>확립된 라벨링 방식에 따라 NaBH3CN(0.6M) 또는 NaBD3CN(0.6M)의 4μL을 추가합니다. 소용돌이에 의해 5 s에 대 한 혼합.</li>
	<li>실온에서 2시간 동안 연기 후드를 배양하여 30분간격으로 섞어주세요.</li>
	<li>3.4 및 3.5 단계를 반복합니다. 실온에서 밤새 연기 후드에 샘플을 배양합니다.</li>
	<li>암모늄 중탄산염 (1%)의 16 μL을 추가하고 소용돌이에 의해 혼합합니다. 얼음 위에 샘플을 놓고, 포름산(5%)의 8μL을 추가하고, 5s의 소용돌이로 섞습니다.</li>
	<li>샘플을 결합하고 pH를 2-4로 조정하고 이전에 설명된 1.8단계에서와 같이 반전 단계 정리 컬럼에서 결합된 샘플을 탈염한다.</li>
	<li>진공 원심분리기에서 샘플을 완전히 건조시하십시오. 유기 용매 및 온도에 대한 농도 방법을 30 °C에서 설정합니다. 농도 시간은 디스플레이에서 모니터링됩니다.</li>
	<li>샘플을 -20°C에 저장합니다.</li>
</ol>4. 액체 크로마토그래피 및 질량 분광법
<ol><li>메틸 태그와 호환되는 MS 계측기와 결합된 나노HPLC 시스템을 사용하여 LC-MS 분석을 수행합니다. 참고: 다양한 MS 계측기는 RMA 라벨링과 호환됩니다. Orbitrap에 결합 된 나노 HPLC 시스템은 일반적으로 나노 전기 분무 이온 소스를 통해 LC-MS 분석을 수행하는 데 사용됩니다. 먼저, 샘플은 분석 컬럼에서 분리된 프리컬럼 및 펩타이드로 로드된다. 펩타이드의 용출은 5%-45% 아세토닐트리어의 선형 그라데이션을 사용하여 수행되며, 0.1% 포믹산, 90분 동안, 200nL/min의 흐름이 수행된다. 질량 분광계는 데이터 종속 모드에서 작동하도록 설정됩니다. 각 전체 스캔은 10-30 eV, 2.3 Kv의 강도로 획득한 다음 충돌 유발 해리(CID) 단편화를 위해 10개의 가장 높은 피크를 선택합니다. 주입 시간은 100 ms에서 이온 트랩에 설정되며, 포리에 변환 (FT)-MS 주입은 m / z 300-1800에서 1000 ms 30,000의 해상도로 고정됩니다. 최소 5,000개의 카운트와 70s의 동적 제외가 조각화 스캐닝을 수행하는 데 사용됩니다.</li>
</ol>5. 펩타이드의 상대적 수량
참고: MS 분광은 질량 분광계 소프트웨어에서 분석됩니다. 다른 태그를 가진 표지된 펩티드의 피크 그룹은 MS 스펙트럼에서 확인됩니다. 상대적 수량은 각 단색 피크의 강도에 의해 계산됩니다. 처리된 각 그룹은 각각의 대조군과 비교된다.
<ol><li>원시 샘플 파일을 마우스 오른쪽 두 번 클릭하여 스펙트럼 분석 소프트웨어를 엽니다. 유지 시간(RT) 및 MS 스펙트럼(EM) 크로마토그램을 각각 상단과 하단의 두 탭에 로드합니다.</li>
	<li>소프트웨어 도구 모음의 디스플레이 및 질량 옵션 아이콘에서 한 번 순차적으로 마우스오른쪽 단추를 클릭하고 질량 정밀도를 4개의 소수점으로 설정합니다.</li>
	<li>RT 탭의 마우스 커서를 어디에나 배치합니다. 분석할 해당 이온의 보존 시간을 찾아 오른쪽 마우스 버튼을 클릭합니다. 선택한 시간의 MS 스펙트럼이 자동으로 EM 탭에 표시됩니다.</li>
	<li>마우스 커서를 EM 탭의 아무 곳에나 배치합니다. 분석할 이온을 찾습니다.</li>
	<li>오른쪽 단추를 클릭하고 이온 근처 왼쪽에 있는 인접 한 지역에서 길게 누를 수 있습니다. 그런 다음 마우스를 원하는 범위에서 오른쪽으로 드래그하여 관심 영역을 확대합니다.</li>
	<li>마우스를 EM 탭에 배치하고 오른쪽 또는 왼쪽 키보드 화살표를 클릭하여 분석할 이온 범위를 정의합니다.</li>
	<li>마우스 커서를 원하는 시간 간격의 시작 부분에 RT 탭을 다시 배치합니다.</li>
	<li>마우스를 마우스를 선택한 시간 값까지 마우스를 버튼을 둡니다. 이온의 누적 된 강도는 자동으로 EM 탭에 표시됩니다.</li>
	<li>스프레드시트에서 m/z, z 및 이온 강도 데이터를 수집합니다. 참고: 추가된 메틸 군없이 각 펩티드의 단이국 질량은 다음 공식에서 계산됩니다. 질량 수정되지 않은 펩티드 = (m/z a x z) - (C a x T) - (1.008 x z) m/zais는 다양한 태그 조합으로 표지된 각 펩타이드에 대한 단화 피크에 대한 값을 충전하는 관찰된 질량(샘플 번호에 대응하는 =1, 2, 3, 4 또는 5). z 는 충전 상태입니다. Ca는 한 쌍의 메틸 그룹의 단색 질량입니다. a=1의 경우 Ca = 28.0313(1차 아민에 두 개의 CH3 그룹의 순 추가) a=2의 경우 두 CHD2 그룹의 경우 Ca = 30.0439 a=3의 경우 두 CD2H 그룹에 대한 Ca = 32.0564 a=4의 경우 두 CD3 그룹에 대한 Ca= 34.0690 a=5의 경우 Ca = 13개의 CD3 그룹 2개에 대해 36.0757 T 는 펩티드에 통합된 메틸 그룹의 쌍의 수이다. T=z*(m/z5 - m/z1)/8이라는 다섯 개의 태그를 사용할 때 다음 수식에서 계산할 수 있습니다. 단일 기본 아민을 포함 하 고 따라서 두 개의 메 틸 그룹으로 표시 되는 펩 티 드에 대 한 인접한 라벨을 사용 하는 경우 MS 스펙트럼에 피크 중복 존재. 각 표지된 펩타이드의 피크 강도는 타시마와 프리커25에 의해 기술된 방정식을 사용하여 교정될 수 있다.</li>
</ol>6. 펩타이드 식별
<ol><li>펩타이드를 식별하려면 데이터베이스 검색 엔진을 사용하여 MS/MS 데이터를 분석합니다29,30.</li>
	<li>미끼 융합 방법을 사용하여 거짓 발견 속도(FDR)를 계산하려면 미끼 데이터베이스를 검색합니다. 참고: 일반적으로 사용되는 검색 매개 변수는 효소 특이성이 없습니다. 전구체 질량 공차는 15-50 ppm을 설정; 0.5 Da의 단편 이온 질량 허용 오차; 변수 수정: 펩티드 이소토성 메틸화 라벨(L1(+28), L2(+30), L3(+32), L4(+34) 및 L5(+36), 산화 메타히오닌(+15.99 Dceta)의 반응성 아민 및 펩타이드 이소토성 메틸리세이트 라벨의 N-terminus</li>
	<li>그런 다음 펩티드를 현지 신뢰도의 평균으로 정렬하여 FDR ≤5%에 의해 최고의 스펙트럼을 선택하여 이를 필터링합니다.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62971/62971fig01.jpg"> 그림 1: 펩티도믹 연구 워크플로우. 아민의 펩티드 추출 및 환원 메틸화단계. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62971/62971fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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<li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+mass+tags%3A+a+novel+quantification+strategy+for+comparative+analysis+of+complex+protein+mixtures+by+MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tandem mass tags: a novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS.</a> Analytical Chemistry. 75, 1895-1904 (2003).</li>
</ol>

경쟁적인 재정적 이익은 존재하지 않습니다.

대부분의 펩티도믹스 연구에서, 중요한 단계 중 하나는 의심할 여지없이, 몇 분 후 프로테아제에 의해 생성 된 펩티드 단편의 존재를 피하기 위해 신중하게 수행해야하는 샘플 준비입니다. 비전자래드 샘플에서 제조된 뇌 추출물에 대한 초기 연구는 10kDa 마이크로필로테스에 존재하는 많은 단백질 단편을 보여주었다. 단백질 분해로부터 펩티드 스펙트럼을 피하기 위해 다른 접근법이 설명되었습니다: 집중 된 전자 레인지 조사 동물 희생6,8, 극저온 해부 다음 끓는 추출 버퍼31, 가정용 전자 레인지 오븐을 사용하여 조직의 전자 레인지 조사 후 9,26 . 세포 배양 및 일부 조직의 경우, 프로테아제 비활성화는 80°C에서 물을 첨가하여 직접 수행할 수 있다. 그러나, 신...

"Omics" 과학은 DNA, RNA, 단백질, 펩타이드, 대사 산물 등과 같은 분자 세트의 심층 분석을 특징으로 합니다. 이러한 생성된 대규모 데이터 세트(유전체학, 전사학, 프로테오믹스, 펩티도믹스, 메타볼로믹스 등)는 생물학에 혁명을 일으켰으며 생물학적 과정에 대한 고급 이해로 이어졌다1. 용어 펩티도믹스는 20 세기 초에 소개되기 시작하고, 몇몇 저자는 proteomics2의 분기로 그것을 언급했습니다. 그러나, 펩티도믹스는 세포 과정 동안 자연적으로 생성된 펩티드 함량뿐만 아니라 이들 분자의 생물학적 활성의 특성화를 조사하는 것이 주요 관심사인 뚜렷한 특수성을 갖는다3,4.
처음에, 생리 활성 펩티드 연구는 에드먼 분해 및 방사선 면역을 통해 신경 펩티드와 호르몬 펩티드에 제한되었다. 그러나, 이들 기술은 고농도각 펩티드의 절연에 따라, 항체의 생성을 위한 시간, 교차 반응성 가능성 외에 글로벌 분석을 허용하지 않는다5.
펩티도믹스 분석은 프로테오믹스/펩티도믹스 연구를 위한 포괄적인 데이터 풀을 전달한 액체 크로마토그래피 결합 질량 분광법(LC-MS) 및 게놈 프로젝트에서 몇 차례 발전한 후에만 가능하였다6,7. 더욱이, 펩티돔에 대한 특정 펩티드 추출 프로토콜은 뇌 샘플에서 전 세계적으로 신경펩티드를 분석한 첫 번째 연구결과에 따라 검출이 단백질의 대규모 분해에 의해 영향을 받았기 때문에 확립될 필요가 있었으며, 이는 주로 이 조직에서 발생하며, 이는 사후 1분 후에 주로 발생한다. 이러한 펩티드 단편의 존재는 신경 펩티드 신호를 마스크하고 생체 내펩티돔을 나타내지 않았다. 이 문제는 주로 전자 레인지 조사를 사용하여 프로테아제의 빠른 가열 불활성화의 적용으로 해결되었으며, 이는 이러한 유물 조각의 존재를 크게 감소시키고 신경 펩티드 조각의 식별뿐만 아니라 세포세포, 미토콘드리아 및 핵 단백질의 존재를 드러냈으며, 데그라돔6,8,9의 다른.
이러한 방법론적 절차는 잘 알려진 신경 펩티드를 넘어 펩티돔의 확장을 허용했으며, 프로테좀의 작용에 의해 주로 생성된 수백 개의 세포내 펩타이드가 효모10, 제브라피시11, 설치류 조직12 및 인간 세포13에서 확인되었다. 이러한 세포 내 펩티드의 수십 광범위하게 생물학적 및 약리학적 활동을 모두 가지고 표시되었습니다14,15. 더욱이, 이들 펩타이드는 질병 바이오마커로 사용될 수 있으며, 두개내 실동맥류16환자로부터 뇌척수액에서 입증된 바와 같이 임상적 중요성을 가질 수 있다.
현재, 펩티드 서열의 식별 외에도 질량 분석법을 통해 절대 및 상대적 수량의 데이터를 얻을 수 있다. 절대 수량에서, 생물학적 샘플의 펩티드 수준은 합성 표준과 비교되며, 상대적 수량에서 펩티드 수준은 2개 이상의 샘플 중에서 비교된다17. 상대적 수량은 다음 방법을 사용하여 수행 할 수 있습니다 : 1) "레이블 무료"18; 2) 생체 내 대사 라벨링 또는 3) 화학 라벨링. 마지막 두 펩티드19,20에 통합된 안정적인 동위원소 형태의 사용을 기반으로 한다. 라벨프리 분석에서 펩타이드 수준은 LC-MS18 동안 신호 강도(스펙트럼 수)를 고려하여 추정된다. 그러나, 동위원소 라벨링은 펩티드의 보다 정확한 상대적 수준을 얻을 수 있다.
많은 펩티도믹 연구는 트리메틸람모늄 부티레이트(TMAB)를 화학 라벨링으로 라벨링하는 시약을 사용했으며, 최근에는 포름알데히드와 시아노보하이드라이드 나트륨 시약의 유정 및 비유화 된 형태를 가진 아민 (RMA)의 환원 메틸화를 사용했습니다111,21,22. 그러나, TMAB 라벨은 상업적으로 사용할 수 없으며, 합성 과정은 매우 힘들다. 한편, RMA에서 시약은 시판되고, 다른 라벨에 비해 저렴하며, 절차는 수행하기가 간단하며, 표지된 펩타이드는 안정23,24이다.
RMA의 사용은 펩티드가 포름알데히드와 반응할 수 있도록 함으로써 쉬프 기지를 형성하는 것을 포함하고, 그 다음에 시아노보로하이드라이드를 통해 환원 반응에 선행됩니다. 이 반응은 N 단자 및 리신 사이드 체인및 단백석 N 단자 프롤라인에 무료 아미노 그룹의 디메틸화를 일으킵니다. 프롤린 잔류물이 N 단자에서 자주 드물며, N-terminus에 무료 아민이 있는 거의 모든 펩타이드는 두 개의 메틸 군23,24,25로 표시된다.

<table><tbody><tr><td>10kDa 차단 필터</td>, <td>Merck Millipore</td><td>UFC801024</td><td>Amicon Ultra-4, PLGC, Ultracel-PL 멤브레인, 10kDa</td></tr><tr><td>아세톤</td><td>시그마-알드리치</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>아세토니트릴</td><td>시그마-알드리치</td><td>1000291000</td><td></td></tr><tr><td>중탄산암모늄</td><td>시그마-알드리치</td><td>11213</td><td></td></tr><tr><td>분석 컬럼(EASY-컬럼)</td><td>EASY-컬럼</td><td>(SC200)</td><td>&nbsp; 10cm, ID75 &마이크로; m, 3 &마이크로; m, C18-A2</td></tr><tr><td>에틸 3-아미노벤조에이트 메탄설포네이</td>트 <td>시그마-알드리치</td><td>E10521</td><td>MS-222</td></tr><tr><td>플루오레스카민</td><td>시그마-알드리치</td><td>F9015</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드 용액</td><td>시그마-알드리치</td><td>252549</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드-13C, d2, 용액</td><td>시그마-알드리치</td><td>596388</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드-d2 용액</td><td>: Sigma-Aldrich</td><td>492620</td><td></td></tr>, <tr><td>포름산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33015</td><td></td></tr><tr><td>흄 후드</td><td>Quimis</td><td>Q216</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid - HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148</td><td></td></tr><tr><td>LoBind-Protein retention tubes</td><td>Eppendorf</td><td>EP0030108116-100EA</td><td></td></tr><tr><td>LTQ-Orbitrap Velos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LTQ Velos</td><td></td></tr><tr><td>전자 레인지</td><td>Panasonic</td><td>NN-ST67HSRU</td><td></td></tr><tr><td>n Easy-nLC II nanoHPLC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LC140</td><td></td></tr><tr><td>PEAKS Studio</td><td>Bioinformatics Solutions Inc.</td><td>버전 8.5</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Invitrogen</td><td>3002</td><td>정제</td></tr><tr><td>precolumn (EASY-Column)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>(SC001)</td><td>2 cm, ID100 &micro; m, 5 &마이크로; m, C18-A1</td></tr><tr><td>냉장 원심분리기</td><td>Hermle</td><td>Z326K</td><td>원뿔형 튜브용</td></tr><tr><td>냉장 원심분리기</td><td>Vision</td><td>VS15000CFNII</td><td>마이크로튜브용</td></tr><tr><td>역상 정리 컬럼&nbsp; &nbsp; (오아시스 HLB 1cc 카트리지)</td><td>Waters</td><td>186000383</td><td>Oasis HLB 1 cc 카트리지</td></tr><tr><td>시아노보로하이드리드나트륨 - NaBD3CN</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>190020</td><td></td></tr><tr><td>시아노보로하이드리드나트륨 - NaBH3CN</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>156159</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td>참고: 0.2 M PB = 0.1 M 인산염 완충액 pH 6.8 (26.85 mL의 Na2HPO3 1M) 및 0.1 M 인산염 완충액 pH 6.8 (NaH2PO3 1M 23.15 mL)에서 물 250 ml까지</td></tr> 인<tr><td>산나트륨 단일염기</td><td>성 Sigma-Aldrich</td><td>S3139</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Qsonica</td><td>Q55-110</td><td></td></tr><tr><td>표준 펩타이드</td><td>프로테이맥스</td><td></td><td>아미노산 서열: LTLRTKL</td></tr><tr><td>트리에틸암모늄 완충액 - TEAB 1 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7408</td><td></td></tr><tr><td>트리플루오로아세트산 - TFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>초정제수</td><td>Milli-Q</td><td>Direct-Q 3UV</td><td></td></tr><tr><td>진공 원심분리기</td><td>GeneVac</td><td>MiVac DNA 농축기</td><td></td></tr><tr><td>수조</td><td>Cientec</td><td>266</td><td></td></tr><tr><td>Xcalibur 소프트웨어</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>OPTON-30965</td><td></td></tr></tbody></table>

펩티도믹스 연구를 위한 아민의 환원 메틸화를 이용한 샘플 준비 및 상대적 수량

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

펩티도믹스는 생물학적 샘플에서 펩타이드의 정성적 및 정량적 분석으로 정의될 수 있다. 주요 응용 분야에는 질병 또는 환경 스트레스의 펩티드 바이오마커 를 식별하고, 신경 펩티드, 호르몬 및 생리 활성 세포 내 펩티드를 식별하고, 단백질 가수분해제에서 항균 및 영양 펩티드를 발견하고, 프로테올리틱 프로세스를 이해하는 연구에 사용될 수 있습니다. 최근 시료 제제, 분리 방법, 질량 분석 기술 및 단백질 시퀀싱과 관련된 계산 도구의 사전은 확인된 펩티드 수 및 펩티돔의 증가에 기여하였다. 펩티도믹 연구는 세포에서 자연적으로 발생하는 펩티드를 자주 분석합니다. 여기서, 열불활성화에 기초한 샘플 준비 프로토콜이 기재되어 프로테아제 활성을 제거하고 온화한 조건으로 추출하므로 펩티드 결합 분열이 없다. 또한, 아민의 환원 메틸화에 의한 안정적인 동위원소 라벨링을 이용한 펩타이드의 상대적 양도 도시된다. 이 라벨링 방법은 시약이 시판되고, 다른 사람에 비해 저렴하고, 화학적으로 안정적이며, 단일 LC-MS 실행에서 최대 5개의 시료를 분석할 수 있기 때문에 몇 가지 장점이 있다.

질량 분광계에서 수행된 실행에서 얻은 결과는 질량 분광계 소프트웨어에서 열 수 있는 원시 데이터 파일에 저장됩니다. MS 스펙트럼에서, 2-5 라벨에 이르기까지 사용되는 라벨링 방식에 따라 표지된 펩티드를 나타내는 피크 그룹을 관찰할 수 있다. 예를 들어 그림 2에서 크로마토그래피 시간에서 검출된 피크 쌍은 동일한 실행에서 두 개의 동위원소 레이블만 사용된 실험에서 표시됩니다. 그림 3 은 각 LC-MS 런에서 3 및 4개의 서로 다른 레이블을 사용하여 긍정적인 결과의 다른 가능성을 보여줍니다. LC/MS 런에서 4 개 또는 5 개의 라벨을 사용하는 경우, 각 피크의 실제 강도 값을 얻기 위해 수정해야 하는 다른 태그와 표지된 펩타이드의 피크가 겹칠 수 있습니다(그림 4).
동위원소 라벨링은 <strong class="x...

이 문서에서는 열 불활성화를 기반으로 한 시료 준비 방법을 설명하여 내인성 펩티드를 보존하여 분해 후 모독을 피하고, 동위원소 라벨링과 LC-MS를 사용하여 상대적 수량을 유지합니다.

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...

여기서, 우리는 천연 세포 내 펩티드를 보존하고, 세포및 조직에서 분해를 피하고, 동위원소 라벨링을 사용하여 펩타이드의 상대적 양에 이어 프로테아제의 빠른 열 비활성화에 기초한 교육 방법을 설명합니다. 이 라벨링 방법은 많은 장점이 있습니다. 시약은 시판되고 저렴하며 화학적으로 안정되며 단일 혈청에서 최대 5개의 샘플을 분석할 수 있습니다.15%FBS 와 1%페니실린 연쇄상 구균신을 포함하는 DMEM에 있는 15센티미터 접시에 있는 인간 신경 모세포종 세포를 육성하는 것으로 시작합니다. 5%의 이산화탄소 하에서 섭씨 37도에서 세포를 유지합니다. PBS로 세포를 두 번 씻은 다음 PBS 10 밀리리터를 추가하고 세포를 긁어 내고 15 밀리리터 튜브로 수집합니다.원심분리기는 세포를 800배 G로 5분간 제거하고 상부체를 제거합니다. 80°C에서 매우 정제된 탈이온수 1밀리리터로 펠릿을 다시 한 번 회수한 다음 튜브의 내용물을 2밀리리터 마이크로퍼지 튜브로 옮기습니다. 제브라피시의 열 불활성화 후, 2 밀리리터 미세 분리 튜브에서 전체 뇌를 수집하고 분석 할 때까지 영하 80도에서 동결.80°C에서 초정화 된 산화 수의 1 밀리리터에서 조직 샘플을 다시 중단하고 1 초의 30 펄스를 사용하여 프로브로 초음파 처리하십시오. 세포 용해 또는 균질 조직을 섭씨 80도에서 20 분 동안 배양 한 다음 얼음에서 10 ~ 30 분 동안 식힙니다. 샘플 볼륨 의 각 1 밀리리터에 대해 하나의 어금니 염산 스톡 솔루션 10 마이크로 리터를 추가합니다.20초 동안 소용돌이를 섞고 얼음에 15분 간 배양합니다. 세포 용액 또는 균주 조직을 12, 000 배 G에서 15 분 동안 섭씨 4도에서 원심분리합니다. 낮은 결합 단백질 미세 원심 분리기 튜브에서 상체를 수집하고 영하 80도에서 저장합니다.물과 원심분리기로 3분 동안 2, 300회 G로 초여과 장치를 청소한 다음 초여분 장치에서 물을 폐기합니다. 상체피 미리 세척된 10킬로달톤 컷오프 필터로 피펫을 넣고 섭씨 4도에서 냉장 원심분리기에서 회전합니다. 샘플의 pH를 확인합니다.100%의 아세토나이트 1밀리리터로 컬럼을 양립한 다음, 0.1%의 트리플루오로아세트산으로 5%아세토나이트 1밀리리터로 세척합니다. 컬럼에 샘플의 전체 부피를 적재하고 0.1%의 트리플루오로아세산으로 5%아세토나이트 1밀리리터로 컬럼을 세척합니다. 0.15%의 트리플루오로아세트산을 단백질 저결합 미세센트심분리기 튜브로 1.8 밀리리터의 1.8 밀리리터로 열로부터 펩티드를 엘테.30°C의 진공 원심분리기에서 샘플을 완전히 건조하고 디스플레이의 농도 시간을 모니터링합니다. 샘플을 영하 80도에 보관하십시오. 표준 펩타이드 농도 및 샘플의 100~200마이크로리터에서 펩티드 샘플을 백색 96웰 플레이트에 재차 리페드 시료를 재중단한다.0.2 개의 어금니 산염 버퍼의 25 마이크로 리터와 12.5 마이크로 리터의 플루오스카핀을 추가하십시오. 궤도 회전기에서 1분 동안 부드럽게 균질화합니다. 다음으로, 반응을 중지하기 위해 물 110 마이크로 리터를 추가합니다.분광로계의 설정을 조정한 다음 판을 읽습니다. 펩타이드의 최대 25 마이크로그램을 가진 각 펩티드 샘플에 1개의 어금니 트리메틸람모늄 브로마이드의 1/10제 부피를 추가합니다. pH가 5에서 8 사이인지 확인하여 필요한 경우 염산 또는 수산화 나트륨으로 조정하십시오.비증, 유정 포름알데히드 또는 탄소-13 의 미성수 포름알데히드의 4개의 마이크로리터를 추가합니다. 소용돌이를 통해 5초 동안 섞으세요. 펩타이드 시료에 시아노보로하이드라이드 나트륨 또는 중질나트륨 시아노보로하이드라이드 4마이크로리터를 첨가한다.그런 다음 소용돌이를 통해 샘플을 5초 동안 섞습니다. 펩티드 샘플을 실온에서 2시간 동안 연기 후드에 배양하여 30분마다 소용돌이를 가합니다. 비유정, 유족, 또는 탄소-13 유정 포름알데히드 나트륨 시아노보로하이드라이드 또는 유정된 나트륨 시아노보로하이드라이드의 첨가를 반복하여 각 첨가 후 소용돌이를 가한다.실온에서 밤새 연기 후드의 샘플을 배양합니다. 중탄산암보네이트 16마이크로리터를 넣고 소용돌이에 섞으세요. 샘플을 얼음 위에 놓습니다.5%의 포름산과 소용돌이의 8마이크로리터를 추가하여 5초 간 추가합니다. 펩티드 샘플을 결합하고, pH를 2-4 사이로 조정한 다음, 이전에 설명한 바와 같이 아세토닐및 삼플루오로아세트산을 사용하여 반전된 위상 정화 컬럼에 결합된 샘플을 탈염한다. 샘플을 섭씨 30도에서 진공 원심분리기에서 완전히 건조한 다음 영하 20도에 보관하십시오.표지된 펩타이드는 질량 스펙트럼을 사용하여 관찰된다. 적색 화살표는 각각 두 개의 서로 다른 샘플 S1과 S2 사이의 비교를 위해 두 개의 동위 원소 형태인 L1 및 L5로 표지된 상이한 펩타이드의 피크 쌍의 존재를 나타낸다. 3개의 상이한 샘플, S1, S2 및 S3에 존재하는 펩타이드의 질량 스펙트럼은 각각 L1, L3 및 L5 태그로 표지된다.쿼드러플렉스 라벨링이 수행되었습니다. 제어 샘플 S1 및 S3은 각각 L1 및 L3로 표지되었고 두 개의 실험 샘플, L2 및 S4로 표지된 S2 및 S4와 비교하여 상당한 차이를 L4.No 관찰하였다. 동위원소 라벨링은 주어진 프로테제 또는 펩티다아제에 대한 시험관 내 의 제품에 기판을 표시하는 데 사용되었다.신경리신 효소의 존재에서 변하지 않는 펩티드가 여기에 나타난다. 효소의 존재에서 사라지거나 감소하는 펩티드는 기질이며, 증가하는 펩타이드는 제품으로 간주됩니다. 이 그림은 세 가지 형태의 태그로 레이블이 부착된 데이터베이스 검색 엔진에 의해 수행되는 펩티드 서열을 식별하는 예입니다.정의되기 전에, 단단한 산성화로 인한 펩티드 결합을 깨는 것을 피하기 위해 샘플이 완전히 시원하다는 것을 확인하십시오. 또한, 초여제 장치의 세척이 필수적입니다. 질량 분광법은 펩티다아제 기판을 식별하여 상이한 실험 조건과 분석 연구를 위해 펩티드를 정량화하는 훌륭한 방법입니다.

sample-preparation-relative-quantitation-using-reductive-methylation

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

환원적으로 13C- 메틸화 된 N- 말단 라이신의 α- 및 ε- 디메틸 아민 핵 자기 공명 신호를 할당하는 두 가지 방법이 설명됩니다. 한 가지 방법은 환원성 메틸화 반응의 pH 유도 선택성을 활용하고, 다른 방법은 아미노펩티다아제를 사용하여 N 말단 라이신을 선택적으로 제거합니다.

의 NMR 공명 확인하는 방법<sup&gt; 13</sup환원 메틸을 단백질에&gt; C-디메틸 N-말단 아민

환원 디메틸 화 (REDI 라벨)에 의해 펩티드의 안정 동위 원소 표지 정확한 질량 분석 기반의 정량 프로테오믹스에 대한 신속하고 저렴한 전략이다. 여기에서 우리는 거의 모든 샘플 유형에 적용 할 수있는 한 Redi 방식을 사용하여 단백질의 혼합물의 제조 및 분석을위한 강력한 방법을 보여준다.

안정 동위 원소 라벨링 환원성 디메틸 화를 사용하여 정량 프로테오믹스

이 프로토콜은 선택된 반응 모니터링을 사용하여 복잡한 생물학적 샘플 내 표적 단백질의 절대 정량화 분석을 수행하는 방법을 설명합니다. 마우스 대식세포 화학주성 신호전달 경로의 단백질을 정확하게 정량화하는 데 사용되었습니다. 표적 펩타이드 선택, 분석 개발, 정성적 및 정량적 분석이 자세히 설명되어 있습니다.

절대 단백질 정량 질량 분석을 모니터링 선정 반응

결합 전구체 동위 원소 라벨 및 동중 태그 (cPILOT)은 동중 태그의 샘플 다중화 기능을 향상 정량 프로테오믹스 전략이다. 이 프로토콜은 알츠하이머 병 마우스 모델 및 야생 형 컨트롤에서 조직에 cPILOT의 응용 프로그램을 설명합니다.

향상된 샘플 복합 전구체 동위 원소 표지 및 동중 태그를 사용하여 조직의 다중 (cPILOT)

여기서 우리는 긴 길이의 정전 기적 반발력 친수성 상호 작용 크로마토 그래피 탠덤 질량 분석법 (LERLIC-MS / MS)에있어서의 단계적인 프로토콜을 제시한다. 이 산탄 총 단백질 체학에 의한 글루타민과 아스파라긴 탈 아미드 화 이소 형의 첫 번째 시간 정량화 및 특성화를 위해 할 수있는 새로운 방법입니다.

산탄 프로테오믹스 자세하게 특성화 LERLIC-MS / MS 및 글루타민 정량 아스파라긴 탈 아미드

결합된 전구체 동위원소 라벨링 및 동위원소 태그(cPILOT)는 사용 가능한 동면 태그와 함께 동시에 분석할 수 있는 샘플 수를 증가시킬 수 있는 향상된 샘플 멀티플렉스 전략입니다. 로봇 플랫폼의 통합은 실험 처리량, 재현성 및 정량적 정확도를 크게 증가시켰습니다.

결합된 전구체 이소토픽 라벨링 및 동서성 태그(cPILOT)를 사용하여 자동화된 샘플 멀티플렉스

이 프로토콜은 임상 샘플에서 단백질의 다중 반응 모니터링 (MRM)에 대한 트리플 쿼드러폴 질량 분광계의 사용을 소개하는 것을 목표로합니다. 우리는 샘플 준비에서 임상 샘플을 위한 데이터 분석에 이르기까지 필요한 모든 예방 조치를 취하도록 체계적인 워크플로우를 제공했습니다.

인간 뇌 조직에서 단백질의 다중 반응 모니터링 기반 검출을 이용한 정량적 프로테오믹스 워크플로우

단백질 아르기닌 (R)- 메틸화는 여러 생물학적 경로를 조절하는 광범위한 번역 후 변형입니다. 질량분석법은 변형된 펩타이드 농축을 위한 생화학적 접근법과 결합될 때 R-메틸-프로테옴을 전 세계적으로 프로파일링하는 최고의 기술입니다. 인간 세포에서 글로벌 R-메틸화의 높은 신뢰도 식별을 위해 설계된 워크플로우가 여기에 설명되어 있습니다.

글로벌 및 신뢰도가 높은 단백질 R-메틸화 분석을 위한 질량분석법 기반 단백질체학 접근법

본 프로토콜은 1H-NMR 분광법에 의한 유리 및 단백질 결합 아르기닌 및 메틸 아르기닌의 제조 및 정량 측정을 설명합니다.

핵자기공명분광법에 의한 아르기닌 메틸롬 탐구

우리는 RNA 의무적인 단백질을 확인 하 고 중재 하는 UV photocrosslinking 및 질량 분석을 사용 하 여 라이브 셀에서 그들의 RNA 바인딩 영역 지도를 프로토콜을 설명 합니다.

질량 분석 기반 식별 RNA 바인딩 영역에 대 한 샘플 준비

학습하세요 프로테아제 열 불활성화를 이용한 펩티드 보존 및 동위원소 표지를 활용한 상대 정량 분석법을. 이 방법은 비용 효율적이며 다양한 생물학적 샘플에 적용 가능합니다.

펩티도믹스 연구를 위한 아민의 환원 메틸화를 이용한 샘플 준비 및 상대적 수량

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