DNA에 조립되는 EWS-FLI1 응축수의 단일 분자 이미징

우리는 DNA에 대한 전사 인자의 상 분리를 관찰하기 위한 단일 분자 분석을 제공합니다. 이 기술을 사용하면 DNA에 액체 방울로 조립되는 전사 인자의 동적 과정을 실시간으로 실현할 수 있습니다. EWS-FL1은 유잉 육종 종양 발생에 가장 자주 관여하는 융합 유전자 중 하나입니다. 우리의 연구는 DNA 모티프 번호와 종양 세포의 불모의 유전자 전사와 관련된 EWS-FL1 축합물 형성 사이의 관계를 확인할 수 있으며 예후에 도움이 될 수 있습니다.

이 방법은 P53 및 MED1과 같은 시험관 내 전사 응축수 또는 복합체를 연구하는 데 적용될 수 있습니다. DNA 커튼 실험을 위해 지그재그 나노 제작 장벽이 있는 플로우 셀을 준비하려면 입력 및 출력 튜브를 올바른 방향으로 연결하십시오. 그런 다음 2.5 밀리리터 주사기를 사용하여 2.5 밀리리터의 지질 완충액으로 플로우 셀을 세척하여 플로우 셀에 기포가 없는지 확인합니다.

출력물에서 주사기를 제거하고 각 주사 사이에 5 분 배양으로 리포좀 용액 1 밀리리터를 3 회 주입합니다. 치유를 위해 유동 세포를 2.5ml의 지질 완충액으로 천천히 다시 씻고 실온에서 30 분 동안 배양하십시오. 배양 동안, 텍스트 원고에 언급된 바와 같이 BSA 완충액을 준비한다.

그런 다음 30 분의 치유 후 출력 측에서 2.5ml의 BSA 버퍼로 플로우 셀을 세척합니다. 다음으로, 800 마이크로리터의 스트렙타비딘 완충액을 입력 측에서 플로우 셀에 주입하고 각 단계 후 10분간 배양하여 두 단계로 한다. 그런 다음 2.5 밀리리터의 BSA 버퍼로 플로우 셀을 세척하여 모든 유리 스트렙타비딘 분자를 제거합니다.

다음으로, BSA 버퍼를 사용하여 클로닝된 모티프로 비오틴 람다 DNA를 희석하고 5분 간격으로 천천히 4회 주입합니다. 주입하는 동안 과학적인 보완 금속 산화물 반도체 시스템에서 현미경을 켭니다. 그런 다음 이중 증류수 10ml로 튜브를 씻고 프리즘과 튜브 커넥터를 물, 2% 액체 큐벳 클리너 및 99% 에탄올로 헹굽니다.

다음으로, 최소 20 밀리리터의 이미징 버퍼를 30 밀리리터 주사기에 넣습니다. 현미경 스테이지에 플로우 셀을 설치하고 미세 유체 시스템에 연결합니다. 분당 0.03 밀리리터의 유속을 사용하여 DNA 분자를 10 분 동안 장벽으로 플러시합니다.

그런 다음 미세 유체 시스템을 끄고 30 분 동안 배양하십시오. 흐름이 멈춘 상태에서 DNA가 옆으로 확산되도록합니다. DNA 커튼에서 EWS-FLI1 응결 형성을 이미지화하려면 이미징 소프트웨어를 열고 명시야 아래에서 9개의 지그재그 패턴의 위치를 찾아 표시합니다.

그런 다음 분당 0.2 밀리리터의 흐름을 켜서 이중 가닥 DNA 염료로 DNA를 10 분 동안 염색합니다. 다음으로, mCherry EWS-FLI1 단백질을 100 마이크로리터에서 100 나노몰 농도의 이미징 버퍼로 희석한다. 그런 다음 100 마이크로 리터 유리 주사기로 밸브를 통해 단백질 샘플을 넣고 유속을 분당 0.4 밀리리터로 변경하십시오.

488 나노미터 레이저를 켠 후 각 영역을 미리 스캔하여 DNA 분포 상태를 확인하고 DNA 분자가 고르게 분포하는 영역을 선택합니다. 그런 다음 레이저 출력을 10 나노 미터 레이저의 경우 488 %, 20 나노 미터 레이저의 경우 561 %로 설정하십시오. 그리고 파워 미터를 사용하여 프리즘 근처의 실제 레이저 출력을 측정하십시오.

488 및 561 나노미터 레이저를 동시에 사용하여 2초 간격으로 이미지 수집을 시작합니다. 그런 다음 밸브를 수동 모드에서 주입 모드로 변경하여 이미징 버퍼가 60초 후에 단백질 샘플을 플로우 셀로 플러시하도록 합니다. 비어 있는 EWS-FLI1을 제거하려면 561나노미터 레이저만 켠 상태에서 이미징 버퍼로 플로우 셀을 5분 동안 계속 세척하십시오.

그런 다음 흐름을 멈추고 섭씨 37도에서 10 분 동안 배양하십시오. 10분 후 분당 0.4밀리리터의 유량을 켜서 DNA가 확장되고 서로 다른 프레임 간에 2초 간격으로 이미지를 획득하여 EWS-FLI1 응축수 형성에 대한 높은 처리량 데이터를 얻습니다. EWS-FLI1 분자는 561 나노미터 레이저로 얻은 mCherry 표지된 EWS-FLI1 신호를 검출하여 시각화되었습니다.

DNA 기질에서 25개의 GGAA 반복 부위에서 EWS-FLI1 축합물의 시험관 내 형성을 직접 시각화할 수 있었습니다. DNA 커튼에 사용된 mCherry EWS-FLI1의 특이성은 25개의 GGAA 반복이 별도로 있거나 없는 DNA 주형을 사용하는 전기영동 이동성 이동 분석법에 의해 확인되었습니다. EWS-FLI1 농도를 20 내지 500 나노몰로 적정하였을 때 EWS-FLI1 강도는 극적으로 증가하였다.

FLI 1 DBD 강도의 변화는 단백질이 GGAA 반복을 덮도록 포화되었을 때 무시할 수 있는 반면, 이는 EWS-FLI1이 DNA에 응축물을 형성했음을 시사합니다. 주입은 리포솜과 DNA가 유동 세포에 고르게 분포 할 수 있도록 매우 느리고 부드러워 야합니다. 정제된 전사 인자는 시험관 내에서 표적 서열과 특이적으로 결합하는지 확인하기 위해 MSA를 수행하는 것이 중요합니다.

이 기술을 통해 사람들은 응축수가 전사 인자의 표적 검색을 용이하게하는지 여부와 전사에 미치는 영향을 탐색 할 수 있습니다.