Name: DNA에 조립되는 EWS-FLI1 응축수의 단일 분자 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: 배우세요 DNA 커튼 단일 분자 이미징으로 EWS-FLI1 응축수의 DNA 상에서의 상분리 동역학을 관찰하는 방법을. 이 기법은 육종 종양에서 유전자 전사 조절 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

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<li>Zuo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loci-specific+phase+separation+of+FET+fusion+oncoproteins+promotes+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Loci-specific phase separation of FET fusion oncoproteins promotes gene transcription.</a> Nature Communications. 12 (1), 1491(2021).</li>
<li>Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+curtains%3A+novel+tools+for+imaging+protein-nucleic+acid+interactions+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA curtains: novel tools for imaging protein-nucleic acid interactions at the single-molecule level.</a> Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).</li>
<li>Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+curtains+for+high-throughput+single-molecule+optical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">DNA curtains for high-throughput single-molecule optical imaging.</a> Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).</li>
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<li>Roy, R., Hohng, S., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+single-molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical guide to single-molecule FRET.</a> Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).</li>
<li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).</li>
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<li>Zhao, Y. L., Jiang, Y. Z., Qi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+biological+reaction+intermediates+with+DNA+curtains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics+D%3A+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">Visualizing biological reaction intermediates with DNA curtains.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 50 (15), 153001(2017).</li>
</ol>

저자는 이해 상충이 없습니다.

단일 분자 접근법은 반응 시스템의 내용물에 매우 민감하기 때문에 DNA 커튼 실험 중에 모든 물질과 용액, 특히 섹션 1과 2에서 준비된 지질과 섹션 5에서 사용된 완충액의 우수한 품질을 보장하기 위해 추가 노력을 투자해야 합니다. 완충액을 준비하려면 더 높은 순도의 시약을 사용해야 하며, 완충액은 단일 분자 분석을 위해 새로 준비해야 합니다.
500 nM mCherry-표지된 EWS-FLI1을 챔버 내로 플러싱했을 때, 25× GGAA 서열을 포함하는 람다 DNA에 여러 개의 자홍색 반점이 나타났다. 블랭크 버퍼로 10분 동안 세척한 후에도 전체 DNA에 걸쳐 마젠타 신호의 연속적인 비특이적 분포가 있음을 알 수 있습니다(그림 1B, C). 흥미롭게도 EWS-FLI1 분자는 완충액 흐름 없이 10분 배양 동안 DNA에 재배열되어 여러 개의 반점으로 수집되었습니다(<strong class="xfi...

전사 조절은 살아있는 세포에서 정확한 유전자 발현을 위한 중요한 단계입니다. 염색체 변형, 전사 인자(TF) 및 비코딩 RNA와 같은 많은 요인이 이복잡한 과정에 참여합니다1,2,3. 이러한 요인 중 TF는 프로모터 또는 인핸서로 알려진 특정 DNA 서열을 인식하고 결합한 다음 전사 4,5,6,7을 활성화하거나 억제하기 위해 다른 기능성 단백질을 모집함으로써 전사 조절의 특이성에 기여합니다. 이러한 TF가 인간 게놈에서 표적 부위를 검색하고 히스톤 및 비 히스톤 DNA 결합 단백질로 코팅 된 DNA와 상호 작용하는 방법은 수십 년 동안 과학자들을 당혹스럽게했습니다. 지난 몇 년 동안, TF의 표적 검색 메커니즘에 대한 몇 가지 고전적인 모델이 DNA 사슬 8,9,10,11을 따라 "미끄러지는", "홉", "점프"또는 "세그먼트 간 전달"하는 방법을 설명하기 위해 구축되었습니다. 이 모델은 단일 TF 분자의 DNA에 대한 검색 행동에 중점을 둡니다. 그러나 최근 연구에 따르면 일부 TF는 핵에서 단독으로 또는 매개체 복합체12와 함께 액체-액체 상 분리 (LLPS)를 겪습니다. TF의 관찰된 액적은 프로모터 또는 인핸서 영역과 연관되어, 전사 및 3차원 게놈13,14,15에서 생체분자 축합물 형성의 역할을 강조한다. 이러한 생체 분자 응축수는 생체 내 및 시험관 내에서 막이 없는 구획과 연결되어 있습니다. 이들은 LLPS를 통해 형성되며, 여기서 모듈식 생체 거대분자와 단백질의 내재적으로 무질서한 영역(IDR)은 다가 상호 작용의 두 가지 주요 원동력입니다16. 따라서 TF는 DNA를 검색 할뿐만 아니라 이러한 응축수 4,17,18 내에서 상승 작용을합니다. 현재까지 DNA에 대한 이러한 전사 응축 물의 생물 물리학 적 특성은 불분명하다.
따라서 이 연구는 단일 분자 방법인 DNA 커튼을 적용하여 시험관 내 DNA에서 TF에 의해 형성된 전사 응축물의 형성과 역학을 직접 이미지화하는 것을 목표로 했습니다. 단백질과 DNA 간의 상호 작용을 연구하기 위한 고처리량 체외 이미징 플랫폼인 DNA 커튼은 DNA 복구 19,20,21, 표적 검색 22 및 LLPS17,23,24에 적용되었습니다. DNA 커튼의 플로우 셀은 바이오 티닐화 지질 이중층으로 코팅되어 표면을 부동 태화하고 생체 분자가 표면에 확산되도록합니다. 나노 가공 된 지그재그 패턴은 DNA의 움직임을 제한합니다. 비오틴화된 람다 DNA 기질은 장벽 가장자리를 따라 정렬될 수 있으며 배향된 완충액 흐름에 의해 늘어날 수 있습니다. 모든 분자의 동일한 시작 및 끝 서열은 DNA 상의 단백질의 추적을 허용하고 결합 이벤트(25, 26)의 위치 분포를 설명한다. 또한 DNA 커튼과 전반사 형광 현미경(TIRFM)의 조합은 배경 노이즈를 최소화하고 단일 분자 수준에서 신호를 감지하는 데 도움이 됩니다. 따라서 DNA 커튼은 DNA 모티프에서 전사 응축수 형성의 역학을 조사하는 유망한 방법이 될 수 있습니다. 이 논문은 염색체 전좌에 의해 생성된 FUS/EWS/TAF15(FET) 패밀리 융합 종양단백질, EWS-FLI1의 예를 설명합니다. EWS-FLI1의 결합 서열인 25× GGAA를 함유하는 람다 DNA27-를 DNA 커튼 실험에서 DNA 기질로 사용하여 EWS-FLI1 분자가 DNA에서 LLPS를 겪는 방식을 관찰하였다. 이 원고는 실험 프로토콜 및 데이터 분석 방법에 대해 자세히 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>488nm 다이오드펌핑 고체 레이저</td><td>Coherent</td><td>OBIS488LS</td><td></td></tr><tr><td>561nm 다이오드펌핑 고체 레이저</td><td>Coherent</td><td>OBIS561LS</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Rhawn</td><td>R003215-50g</td><td></td></tr><tr><td>비오틴화 도프</td><td>Avanti</td><td>870273P</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>Amresco</td><td>1595C027</td><td></td></tr><tr><td>코팅 Electra 92</td><td>Allresist GmbH</td><td>AR-PC 5090.02</td><td>전도성 보호 코팅</td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I bovine</td><td>Sigma</td><td>D5139-2MG</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti</td><td>850375P</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>유리 커버슬립</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>Hellmanex III</td><td>시그마</td><td>Z805939-1EA</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>시그마</td><td>60130</td><td></td></tr><tr><td>람다 DNA</td><td>NEB</td><td>N3013S</td><td></td></tr><tr><td>람다 패킹 추출물</td><td>진원지</td><td>MP5120</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>시그마</td><td>s3014</td><td></td></tr><tr><td>나노포트</td><td>Idex</td><td>N-333-01</td><td></td></tr><tr><td>NheI-HF</td><td>NEB</td><td>R3131S</td><td></td></tr><tr><td>니콘 도립 현미경</td><td>니콘</td><td>이클립스 Ti</td><td></td></tr><tr><td>NZCYM 육수</td><td>시그마</td><td>N3643-250G</td><td></td></tr><tr><td>PEG-2000 도프</td><td>Avanti</td><td>880130P-1G</td><td></td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Amresco</td><td>25322-68-3</td><td></td></tr><tr><td>PMMA 200K, 에틸 락테이트 4%</td><td>Allresist GmbH</td><td>AR-P 649.04</td><td></td></tr><tr><td>PMMA 950K, ANISOLE 2%</td><td>Allresist GmbH</td><td>AR-P 672.02</td><td></td></tr><tr><td>Prime 95B Scientific CMOS 카메라</td><td>PHOTOMETRICS</td><td>Prime95B</td><td></td></tr><tr><td>proteinase K</td><td>NEB</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>실리카 유리 슬라이드</td><td>G.Finkenbeiner</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6방향 주입 밸브</td><td>Idex</td><td>MXP9900-000</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Thermo</td><td>S888</td><td>ddH2O</td></tr><tr><td>주사기 펌프</td>로 희석 <td>Harvard Apparatus</td><td>Pump11 Elite</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>NEB</td><td>R0146V</td><td></td></tr><tr><td>YOYO-1 Iodide (491/509)</td><td>Invitrogen</td><td>Y3601</td><td>DMSO로 희석</td></tr></tbody></table>

dna에 조립되는 ews-fli1 응축수의 단일 분자 이미징

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

염색체 전좌로 인한 융합 유전자는 많은 고형 종양 또는 백혈병에서 발견되었습니다. 융합 종양 단백질의 FUS / EWS / TAF15 (FET) 계열에 속하는 EWS-FLI1은 유잉 육종에서 가장 자주 관여하는 융합 유전자 중 하나입니다. 이러한 FET 패밀리 융합 단백질은 일반적으로 N-말단에 FET 단백질의 저복잡성 도메인(LCD)을, C-말단에 DNA 결합 도메인(DBD)을 가지고 있습니다. EWS-FLI1은 LCD-LCD 및 LCD-DBD 상호 작용으로 인해 표적 결합 유전자좌에서 생체 분자 축합 물을 형성하는 것으로 확인되었으며, 이러한 축합 물은 RNA 중합 효소 II를 모집하여 유전자 전사를 향상시킬 수 있습니다. 그러나 이러한 응축수가 결합 부위에서 어떻게 조립되는지는 불분명합니다. 최근에는 EWS-FLI1 응축물의 이러한 조립 과정을 시각화하기 위해 단일 분자 생물 물리학 방법인 DNA 커튼이 적용되었습니다. 여기에서는 표적 DNA에 조립되는 생체 분자 응축수를 연구하는 데 DNA 커튼을 적용하기 위한 상세한 실험 프로토콜 및 데이터 분석 접근 방식에 대해 논의합니다.

DNA 커튼의 개략도는 그림 1A, 그림 1B 및 그림 1D에 나와 있습니다. GGAA의 25개의 중단되지 않은 반복을 함유하는 클로닝된 표적 서열은 유잉 육종의 NORB1 프로모터에서 발견된다. 이 표적 서열은 EWS-FLI1 모집28에 결정적이다. EWS-FLI1 분자는 561nm 레이저로 얻은 mCherry 표지된 EWS-FLI1 신호를 검출하여 시각화되었습니다(그림 1C 및 그림 1E). DNA 커튼 실험이 설정된 후, DNA 기질의 1× GGAA 부위에서 EWS-FLI25의 생체 분자 응축수의 시험관 내 형성을 직접 시각화 할 수있었습니다 (그림...

여기에서는 DNA에 조립되는 EWS-FLI1 응축수의 생물물리학적 메커니즘을 연구하기 위해 단일 분자 이미징 방법인 DNA 커튼의 사용에 대해 설명합니다.

DNA에 조립되는 EWS-FLI1 응축수의 단일 분자 이미징

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...

우리는 DNA에 대한 전사 인자의 상 분리를 관찰하기 위한 단일 분자 분석을 제공합니다. 이 기술을 사용하면 DNA에 액체 방울로 조립되는 전사 인자의 동적 과정을 실시간으로 실현할 수 있습니다. EWS-FL1은 유잉 육종 종양 발생에 가장 자주 관여하는 융합 유전자 중 하나입니다. 우리의 연구는 DNA 모티프 번호와 종양 세포의 불모의 유전자 전사와 관련된 EWS-FL1 축합물 형성 사이의 관계를 확인할 수 있으며 예후에 도움이 될 수 있습니다.이 방법은 P53 및 MED1과 같은 시험관 내 전사 응축수 또는 복합체를 연구하는 데 적용될 수 있습니다. DNA 커튼 실험을 위해 지그재그 나노 제작 장벽이 있는 플로우 셀을 준비하려면 입력 및 출력 튜브를 올바른 방향으로 연결하십시오. 그런 다음 2.5 밀리리터 주사기를 사용하여 2.5 밀리리터의 지질 완충액으로 플로우 셀을 세척하여 플로우 셀에 기포가 없는지 확인합니다.출력물에서 주사기를 제거하고 각 주사 사이에 5 분 배양으로 리포좀 용액 1 밀리리터를 3 회 주입합니다. 치유를 위해 유동 세포를 2.5ml의 지질 완충액으로 천천히 다시 씻고 실온에서 30 분 동안 배양하십시오. 배양 동안, 텍스트 원고에 언급된 바와 같이 BSA 완충액을 준비한다.그런 다음 30 분의 치유 후 출력 측에서 2.5ml의 BSA 버퍼로 플로우 셀을 세척합니다. 다음으로, 800 마이크로리터의 스트렙타비딘 완충액을 입력 측에서 플로우 셀에 주입하고 각 단계 후 10분간 배양하여 두 단계로 한다. 그런 다음 2.5 밀리리터의 BSA 버퍼로 플로우 셀을 세척하여 모든 유리 스트렙타비딘 분자를 제거합니다.다음으로, BSA 버퍼를 사용하여 클로닝된 모티프로 비오틴 람다 DNA를 희석하고 5분 간격으로 천천히 4회 주입합니다. 주입하는 동안 과학적인 보완 금속 산화물 반도체 시스템에서 현미경을 켭니다. 그런 다음 이중 증류수 10ml로 튜브를 씻고 프리즘과 튜브 커넥터를 물, 2% 액체 큐벳 클리너 및 99% 에탄올로 헹굽니다.다음으로, 최소 20 밀리리터의 이미징 버퍼를 30 밀리리터 주사기에 넣습니다. 현미경 스테이지에 플로우 셀을 설치하고 미세 유체 시스템에 연결합니다. 분당 0.03 밀리리터의 유속을 사용하여 DNA 분자를 10 분 동안 장벽으로 플러시합니다.그런 다음 미세 유체 시스템을 끄고 30 분 동안 배양하십시오. 흐름이 멈춘 상태에서 DNA가 옆으로 확산되도록합니다. DNA 커튼에서 EWS-FLI1 응결 형성을 이미지화하려면 이미징 소프트웨어를 열고 명시야 아래에서 9개의 지그재그 패턴의 위치를 찾아 표시합니다.그런 다음 분당 0.2 밀리리터의 흐름을 켜서 이중 가닥 DNA 염료로 DNA를 10 분 동안 염색합니다. 다음으로, mCherry EWS-FLI1 단백질을 100 마이크로리터에서 100 나노몰 농도의 이미징 버퍼로 희석한다. 그런 다음 100 마이크로 리터 유리 주사기로 밸브를 통해 단백질 샘플을 넣고 유속을 분당 0.4 밀리리터로 변경하십시오.488 나노미터 레이저를 켠 후 각 영역을 미리 스캔하여 DNA 분포 상태를 확인하고 DNA 분자가 고르게 분포하는 영역을 선택합니다. 그런 다음 레이저 출력을 10 나노 미터 레이저의 경우 488 %, 20 나노 미터 레이저의 경우 561 %로 설정하십시오. 그리고 파워 미터를 사용하여 프리즘 근처의 실제 레이저 출력을 측정하십시오.488 및 561 나노미터 레이저를 동시에 사용하여 2초 간격으로 이미지 수집을 시작합니다. 그런 다음 밸브를 수동 모드에서 주입 모드로 변경하여 이미징 버퍼가 60초 후에 단백질 샘플을 플로우 셀로 플러시하도록 합니다. 비어 있는 EWS-FLI1을 제거하려면 561나노미터 레이저만 켠 상태에서 이미징 버퍼로 플로우 셀을 5분 동안 계속 세척하십시오.그런 다음 흐름을 멈추고 섭씨 37도에서 10 분 동안 배양하십시오. 10분 후 분당 0.4밀리리터의 유량을 켜서 DNA가 확장되고 서로 다른 프레임 간에 2초 간격으로 이미지를 획득하여 EWS-FLI1 응축수 형성에 대한 높은 처리량 데이터를 얻습니다. EWS-FLI1 분자는 561 나노미터 레이저로 얻은 mCherry 표지된 EWS-FLI1 신호를 검출하여 시각화되었습니다.DNA 기질에서 25개의 GGAA 반복 부위에서 EWS-FLI1 축합물의 시험관 내 형성을 직접 시각화할 수 있었습니다. DNA 커튼에 사용된 mCherry EWS-FLI1의 특이성은 25개의 GGAA 반복이 별도로 있거나 없는 DNA 주형을 사용하는 전기영동 이동성 이동 분석법에 의해 확인되었습니다. EWS-FLI1 농도를 20 내지 500 나노몰로 적정하였을 때 EWS-FLI1 강도는 극적으로 증가하였다.FLI 1 DBD 강도의 변화는 단백질이 GGAA 반복을 덮도록 포화되었을 때 무시할 수 있는 반면, 이는 EWS-FLI1이 DNA에 응축물을 형성했음을 시사합니다. 주입은 리포솜과 DNA가 유동 세포에 고르게 분포 할 수 있도록 매우 느리고 부드러워 야합니다. 정제된 전사 인자는 시험관 내에서 표적 서열과 특이적으로 결합하는지 확인하기 위해 MSA를 수행하는 것이 중요합니다.이 기술을 통해 사람들은 응축수가 전사 인자의 표적 검색을 용이하게하는지 여부와 전사에 미치는 영향을 탐색 할 수 있습니다.

single-molecule-imaging-of-ews-fli1-condensates-assembling-on-dna

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

우리는 미래의 핵산 기반 치료제를위한 균일한 및 사용자 정의 polyplexes보다 제어하고 합성을 제공하는 것으로 예상된다 고분자 전해질의 polyplexes의 형성을 조사하기 위해 nanophotonics (QD - 걱정)와 microfluidics의 소설과 강력한 통합을 제시한다.

결합 QD - 걱정과 Microfluidics 실시간으로 DNA의 Nanocomplex 자체 어셈블리를 모니터하기 위해

이 비디오는 단일 분자 이미징을 사용하여 특정 유전자 자리에서 DNA 분자의 융합 단백질 응축물 어셈블리를 시각화하는 방법을 설명합니다. 이러한 응축물은 LCD-LCD 및 LCD-DBD 상호 작용으로 인해 형성되며, 이를 통해 RNA 중합효소 II를 동원하고 유전자 전사를 향상시킬 수 있습니다.

DNA 커튼에서 융합 단백질 응축물 어셈블리를 시각화하기 위한 단일 분자 이미징

여기에서 우리는이 광학적으로 포획 된 마이크로 스피어 사이 일시 중지 하나의 DNA 분자와 상호 작용하는 하나의 형광 표지 단백질 분자를 검출하기위한 장비 및 방법에 대해 설명합니다.

단백질-DNA 상호 작용의 연구에 대한 단일 분자 조작 및 이미지를 결합

이 연구 결과는 단일 분자 형광 공명 에너지 전달 (FRET)를 사용하여 이중 가닥 DNA의 반복 역학을 측정하는 상세한 실험 절차를 제공합니다. 이 프로토콜은 또한 J 인자라는 반복 확률 밀도를 추출하는 방법에 대해 설명합니다.

단일 분자 FRET에 의해 DNA 루핑을 공부

전자 분광 이미징은 나노미터 해상도로 핵산과 단백질을 이미지화하고 구별할 수 있습니다. 이 시스템은 투과 전자 현미경 샘플에서 태그가 지정된 단백질을 특이적으로 라벨링할 수 있는 miniSOG 시스템과 결합할 수 있습니다. 이중 가닥 파단 복구 초점을 예로 들어 이러한 기술의 사용을 설명합니다.

전자 분광 이미징과 결합 miniSOG 태그 DNA 복구 단백질의 시각화 (ESI)

이 프로토콜은 빠른 세포 롤링 접착 중에 접착 이벤트를 이미지화하기 위해 접착 발자국 분석기를 수행하는 실험 절차를 제시합니다.

접착 발자국 분석에 의한 세포 압연의 이미징 분자 접착

미세 유체 챔버를 통해 연구 된 시각적 단일 분자 생화학은 유리 배럴, 기밀 주사기, 튜브와 플로우 셀의 안정적인 연결 및 주사기와 튜브 사이에 스위칭 밸브를 배치하여 기포 제거를 사용하여 크게 촉진됩니다. 이 프로토콜은 DNA 거래 및 분자간 상호 작용의 시각화를 가능하게 하는 이중 광학 트랩을 설명합니다.

단일 분자 연구를 위한 이중 광학 핀셋 및 미세 유체 공학 사용

원형질막 수용체 키나아제의 막 이동 이벤트를 연구하기 위해 일반적으로 사용되는 몇 가지 방법이 여기에 소개됩니다. 이 원고는 식물 재료 준비, 약리학적 처리 및 컨포칼 이미징 설정을 포함한 자세한 프로토콜을 설명합니다.

기공 계통 세포에서 막 트래피킹 사건을 연구하기 위한 이미지 기반 방법

많은 본질적으로 무질서한 단백질은 수많은 세포 과정에 중요한 행동인 매우 역동적인 생체 분자 응축물의 형성에 관여하는 것으로 나타났습니다. 여기에서, 우리는 살아있는 세포에 있는 생체 분자 응축물에서 단백질이 서로 상호 작용하는 동역학을 정량화하기 위한 단 하나 분자 화상 진찰 근거한 방법을 제시합니다.

생체 분자 응축물 내 단백질 상호 작용 역학의 단일 분자 측정

이 기사에서는 단일 분자 상관력 및 형광 현미경을 위해 뉴클레오솜 함유 DNA 테더를 재구성하는 자세한 실험 절차를 제시합니다. 또한 염색질 상호 작용 단백질의 결합 거동을 시각화하고 뉴클레오솜의 물리적 특성 변화를 분석하기 위해 수행할 수 있는 여러 다운스트림 실험에 대해 설명합니다.

In Situ Nucleosome Assembly for Single-Molecule Correlative Force and Fluorescence Microscopy

이 프로토콜은 CMG helicase에 의한 DNA 풀림의 실시간 시각화를 위한 단일 분자 분석을 수행하는 방법을 보여줍니다. (1) DNA 기질 준비, (2) 형광 표지된 Drosophila melanogaster CMG helicase를 정제하는 방법, (3) 전반사 형광(TIRF) 현미경 검사를 위한 미세유체 플로우 셀을 준비하는 방법, (4) 단일 분자 DNA 풀기 분석에 대해 설명합니다.

CMG Helicase를 이용한 DNA 풀림의 단일 분자 실시간 시각화

배우세요 DNA 커튼 단일 분자 이미징으로 EWS-FLI1 응축수의 DNA 상에서의 상분리 동역학을 관찰하는 방법을. 이 기법은 육종 종양에서 유전자 전사 조절 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

DNA에 조립되는 EWS-FLI1 응축수의 단일 분자 이미징

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