Name: Y-27632를 사용하여 1차 인간 칭기발 상피 세포의 격리 및 배양 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: 배우세요 Y-27632를 사용하여 1차 인간 칭기발 상피 세포를 효율적으로 격리하고 배양하는 방법을. 이 기법은 줄기세포 특성을 향상시키고 재생의학 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 작품은 산동성 자연과학재단(ZR2019ZD36)과 산동성 의 주요 연구 개발 프로그램(2019GSF108107)에서 X.W.에 의해 지원되었습니다. 산동성 주요 연구 개발 프로그램 (2018GSF118240)에서 J.G.에; 산동성 의료보건과학기술개발사업(2018WS163)과 산동성 의료보건과학기술개발사업(2019WS045)

이 프로토콜에 사용되는 인간 조직은 기관의 인간 연구 윤리위원회의 지침에 따라 맥시안면 외과 부서에서 영향을 받은 치아의 추출에서 버려진 신선한 성인 gingival 조직입니다 (의정서 번호. GR201711, 날짜: 02-27-2017).
1. 준비
<ol><li>3% 페니실린/연쇄상구균(P/S)으로 보충된 10mL의 인산염 완충식식염(PBS)을 포함하는 15mL 튜브에서 신선한 성인 게이발 조직을 수집하고 조직을 4°C로 유지한다. 참고: 절제 후 24시간 이내에 조직에 대해 자세히 설명합니다.</li>
</ol>2. 시약 및 문화 매체 준비
<ol><li>세탁 용액 준비: 페니실린 (100 U/mL) 및 1.5 mL의 페니실린 (100 U/mL)와 1.5 mL (100 mg/L)와 PBS의 3 % P / S. 믹스 50 mL.</li>
	<li>성장인자 함유 배지(G-medium라고 함): DMEM/F12(3:1) 배지1% P/S, 2% B27 보충제, 표피 성장 인자(EGF) 20 ng/mL, 섬유아세포 성장인자 2(FGF2), 40 μg/mL의 40μg/mL을 준비한다.</li>
	<li>새로운 방법에 대한 효소 소화 용액 준비: Dispase 분말 125 mg과 DMEM의 50 mL에 타입 I 콜라게나아제 분말 125 mg을 용해하십시오. 참고: 0.22 μm 여과기를 통해 모든 효소 솔루션을 필터링하고 4°C에 보관하십시오.</li>
	<li>효소 소화를 중화시키기 위해 배지 의 500mL를 준비하십시오: 10% 태아 소 혈청(FBS) 및 DMEM 배지에서 1% P/S.</li>
</ol>3. 직접 적인 절제 방법
<ol><li>깅지발 조직 전처리<ol>
<li>30 s에 대 한 75% 에탄올의 5 mL로 gingival 티슈를 세척. 이어서, 5분 동안 세척용액(2.1단계)으로 2회 헹구세요. 참고: 직경 50mm의 세포 배양 접시에 모든 세초를 수행합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>깅지발 상피 세포 배양<ol>
<li>깅지발 조직을 1mm3개로 자르고 100mm 세포 배양 접시에 뿌립니다. 절삭 작업에 미세 한 뾰족한 집게와 안과 가위를 사용합니다.</li>
		<li>G-배지(2.2단계)를 문화 요리에 넣습니다. 이어서, 문화 접시를 37°C에서 5% CO2 인큐베이터로 배양한다. 반전된 현미경(40x)을 사용하여 24시간마다 조직을 검사합니다.</li>
		<li>상피 세포가 조직 조각 주위직경 2-5 mm로 전파되었을 때 칭기발 조직 조각을 제거하십시오. 2-4일마다 G-배지를 변경합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 새로운 수정 된 효소 방법
<ol><li>깅지발 조직 전처리<ol>
<li>이를 위해, 직접 절제 방법, 단계 3.1.1에 대해 설명된 것과 동일한 단계를 따릅니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>칭기발 조직의 소화<ol>
<li>치지발 조직을 약 <1mm 크기의 작은 조각으로 자르고 두 개의 살균 된 블레이드를 넣습니다. 두 개의 수술 용 블레이드로 파쇄하는 과정을 반복하십시오.</li>
		<li>2.5 mg/mL 디스파스 + 콜라게나아제 용액 1mL을 깅지발 조직 조각을 포함하는 1.5 mL 원심분리기 튜브에 추가한 다음 37°C의 인큐베이터에서 15-20분 동안 튜브를 배양합니다.</li>
		<li>조직이 투명하고 flocculent가되면, 소화를 종료하는 중화 용액의 1 mL을 추가합니다. 10-15회 위아래로 피펫팅하여 용액을 철저히 혼합합니다. 100 μm 메쉬 필터를 통해 솔루션을 전달합니다.</li>
		<li>원심 분리기 200 x g에서 5 분 동안.</li>
		<li>상체를 제거하고 성장 인자 함유 배지의 10mL에서 하단의 세포 펠릿을 재중단한다(단계 2.2). 셀 현탁액을 100mm 세포 배양 접시로 옮기. 세포 배양 접시에 Y-27632의 10 μM을 추가합니다.</li>
		<li>5% CO2 인큐베이터에서 37°C에서 세포를 배양한다. 오래된 G-배지를 2일마다 신선한 G-매체로 교체하십시오. 1일과 3일에 세포를 관찰하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 세포 패시징
<ol><li>인큐베이터에서 접시를 꺼내 소비 한 매체를 제거하고 PBS로 두 번 씻으십시오. 각 100mm 접시에 0.05% 트립신 2mL를 추가합니다. 참고: 접시를 흔들어 트립신 솔루션과 접시 바닥 사이에 충분한 접촉이 있는지 확인합니다.</li>
	<li>소화 과정을 위해 37°C에서 약 5분 동안 인큐베이터에 접시를 둡니다.</li>
	<li>현미경 (40x)을 사용하여 세포를 검사하고 대부분의 세포가 접시의 바닥에서 분리되었는지 확인하십시오.</li>
	<li>중화 용액의 2mL를 추가하여 소화를 멈추고 세포를 15mL 튜브로 옮춥니까. 파이펫 을 위아래로 10-15 번. 5 분 동안 200 x g에서 세포를 원심 분리합니다.</li>
	<li>상체를 천천히 제거합니다. G-배지의 10mL로 세포를 다시 중단하고 세포의 수를 계산합니다.</li>
	<li>G-배지 10mL에 약 1 x 106 셀을 추가하고 각 100mm 접시에 10 μM Y-27632를 추가합니다.</li>
	<li>2일마다 G-배지 및 Y-27632를 갱신합니다. 1일과 5일에 셀을 봅니다.</li>
</ol>

<ol><li>Takahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gingival+barrier%3A+regulation+by+beneficial+and+harmful+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Barriers%22%5BJournal%5D)">Gingival barrier: regulation by beneficial and harmful microbes.</a> Tissue Barriers. 7, 1651158(2019).</li>
<li>Michea, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+control+of+the+human+pDC+response+to+extracellular+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Epithelial control of the human pDC response to extracellular bacteria.</a> European Journal of Immunology. 43, 1264-1273 (2013).</li>
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<li>Klingbeil, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+cellular+harvesting+methods+for+primary+human+oral+culture+of+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Banking%22%5BJournal%5D)">Comparison of two cellular harvesting methods for primary human oral culture of keratinocytes.</a> Cell and Tissue Banking. 10, 197-204 (2009).</li>
<li>Qian, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+simple+isolation+method+to+obtain+both+epidermal+and+dermal+stem+cells+from+human+skin+specimen%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">One-step simple isolation method to obtain both epidermal and dermal stem cells from human skin specimen.</a> Methods in Molecular Biology. 1879, 139-148 (2019).</li>
<li>Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Y-27632+simplifies+the+isolation+procedure+of+human+primary+epidermal+cells+by+selectively+blocking+focal+adhesion+of+dermal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12, 1251-1255 (2018).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+and+efficient+method+to+isolate+primary+human+keratinocytes+from+adult+skin+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2018).</li>
<li>Lauer, G., Wiedmann-Al-Ahmad, M., Otten, J. E., Hubner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+study+during+healing+of+free+palatal+mucosa+grafts+on+plastic-embedded+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+Pathology+%26+Medicine%3A+Official+Publication+of+the+International+Association+of+Oral+Pathologists+and+the+American+Academy+of+Oral+Pathology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical study during healing of free palatal mucosa grafts on plastic-embedded samples.</a> Journal of Oral Pathology & Medicine: Official Publication of the International Association of Oral Pathologists and the American Academy of Oral Pathology. 30, 104-112 (2001).</li>
<li>Locke, M., Hyland, P. L., Irwin, C. R., Mackenzie, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+gingival+epithelial+phenotypes+by+interactions+with+regionally+defined+populations+of+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Periodontal+Research%22%5BJournal%5D)">Modulation of gingival epithelial phenotypes by interactions with regionally defined populations of fibroblasts.</a> Journal of Periodontal Research. 43, 279-289 (2008).</li>
<li>Shabana, A. H., Ouhayoun, J. P., Sawaf, M. H., Forest, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokeratin+patterns+of+human+oral+mucosae+in+histiotypic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Oral+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytokeratin patterns of human oral mucosae in histiotypic culture.</a> Archives of Oral Biology. 36, 747-758 (1991).</li>
<li>Kasai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((biopsy+of+human+oral+mucosal+epithelial+cells+as+a+quality+control+of+the+cell+source+for+fabrication+of+transplantable+epithelial+cell+sheets+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Therapy%22%5BJournal%5D)">biopsy of human oral mucosal epithelial cells as a quality control of the cell source for fabrication of transplantable epithelial cell sheets for regenerative medicine.</a> Regenerative Therapy. 4, 71-77 (2016).</li>
<li>Oda, D., Dale, B. A., Bourekis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+oral+epithelial+cell+culture.+II.+Keratin+expression+in+fetal+and+adult+gingival+cells%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology%3A+Journal+of+the+Tissue+Culture+Association%22%5BJournal%5D)">Human oral epithelial cell culture. II. Keratin expression in fetal and adult gingival cells.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology: Journal of the Tissue Culture Association. 26, 596-603 (1990).</li>
<li>Guarino, M., Tosoni, A., Nebuloni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+contribution+of+epithelium+to+organ+fibrosis%3A+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Pathology%22%5BJournal%5D)">Direct contribution of epithelium to organ fibrosis: epithelial-mesenchymal transition.</a> Human Pathology. 40, 1365-1376 (2009).</li>
<li>Hatakeyama, S., Yaegashi, T., Takeda, Y., Kunimatsu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+bromodeoxyuridine-incorporating%2C+p63-+and+p75%28NGFR%29-+expressing+cells+in+the+human+gingival+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+Science%22%5BJournal%5D)">Localization of bromodeoxyuridine-incorporating, p63- and p75(NGFR)- expressing cells in the human gingival epithelium.</a> Journal of Oral Science. 49, 287-291 (2007).</li>
<li>Bayar, G. R., Aydintug, Y. S., Gunhan, O., Ozturk, K., Gulses, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+produced+oral+mucosa+equivalent+by+using+the+direct+explant+cell+culture+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Balkan+Medical+Journal%22%5BJournal%5D)">Ex vivo produced oral mucosa equivalent by using the direct explant cell culture technique.</a> Balkan Medical Journal. 29, 295-300 (2012).</li>
<li>Daniels, J. T., Kearney, J. N., Ingham, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+keratinocyte+isolation+and+cell+culture%3A+a+survey+of+current+practices+in+the+UK%5BTitle%5D)+AND+%22Burns%3A+Journal+of+the+International+Society+for+Burn+Injuries%22%5BJournal%5D)">Human keratinocyte isolation and cell culture: a survey of current practices in the UK.</a> Burns: Journal of the International Society for Burn Injuries. 22, 35-39 (1996).</li>
<li>Carrel, A., Burrows, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+adult+tissues+and+organs+outside+the+body%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Cultivation of adult tissues and organs outside the body.</a> Journal of the American Medical Association. 55, 1379-1381 (1910).</li>
<li>Rheinwald, J. G., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+a+keratinizing+epithelium+in+culture+by+a+cloned+cell+line+derived+from+a+teratoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Formation of a keratinizing epithelium in culture by a cloned cell line derived from a teratoma.</a> Cell. 6, 317-330 (1975).</li>
<li>Oda, D., Watson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+oral+epithelial+cell+culture+I.+Improved+conditions+for+reproducible+culture+in+serum-free+medium%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology%3A+Journal+of+the+Tissue+Culture+Association%22%5BJournal%5D)">Human oral epithelial cell culture I. Improved conditions for reproducible culture in serum-free medium.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology: Journal of the Tissue Culture Association. 26, 589-595 (1990).</li>
<li>Boyce, S. T., Ham, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-regulated+differentiation+of+normal+human+epidermal+keratinocytes+in+chemically+defined+clonal+culture+and+serum-free+serial+culture%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 81, 33-40 (1983).</li>
<li>Guo, A., Jahoda, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+of+human+keratinocyte+culture+from+skin+explants%3A+cell+expansion+is+linked+to+markers+of+activated+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">An improved method of human keratinocyte culture from skin explants: cell expansion is linked to markers of activated progenitor cells.</a> Experimental Dermatology. 18, 720-726 (2009).</li>
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<li>Shwetha, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+culture+of+oral+keratinocytes+using+direct+explant+cell+culture+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+and+Maxillofacial+Pathology%3A+JOMFP%22%5BJournal%5D)">Ex vivo culture of oral keratinocytes using direct explant cell culture technique.</a> Journal of Oral and Maxillofacial Pathology: JOMFP. 23, 243-247 (2019).</li>
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</ol>

모든 저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

gingival 조직은 치주 무결성 및 건강을 유지하는 중요한 구조입니다. Gingival 상피 세포는 치주 조직의 수리 및 재생에 중요한 역할을 하며 경구 생물학, 약리학, 독성학 및 구강 점막 결핍을 포함한 과학 연구 및 임상 응용 프로그램 및 관련 분야에서 사용될 수 있다18. 따라서 경구상피세포(19)를수확하는 안정적이고 효율적인 방법을 개발할 필요가 있다. 1 차상 세포는 몇몇 통로 및 짧은 수명을 가진 완전히 분화한 세포의 종류입니다. 상피 세포를 배양하는 것은 섬유아세포5를배양하는 것보다 더 복잡한 것으로 입증되었습니다.
현재, 출판 된 문헌은 상피 세포의 격리 및 문화에 대한 다양한 프로토콜이 존재한다는 것을 보여줍니다. 그러나, 두 가지 방법, 직접 절제 방법 및 효소 방법은 이러한 프로토콜 중 가장 자주 사용 됩니다. 1910년, Ca...

치주 조직을 보호하는 제1라인 방어 구조인 인간 칭기바는 물리적 및 화학적 장벽1일뿐만 아니라 면역 반응에 참여하고 면역 장벽2,3을구성하는 다양한 종류의 염증 중물질을 분비한다. gingival 상피는 치주 조직의 수리 및 재생에 중요한 역할을한다. 따라서, 칭기발 상피의 방어 및 면역을 공부하는 것은 치주염의 발생, 진단 및 처리를 이해하는 데 큰 의미가 있습니다. 인간 칭기질 조직에서 gingival 상피 세포의 격리 및 배양은 칭기발 상피를 연구하는 데 필요한 첫 번째 단계입니다. 이러한 절차는 조직 공학을 위한 종자 세포 생산, 치주 관련 질병의 체외 모델 및 치주 결함을 복구하기 위한 재료와 같은 기본적인 수술이 필요합니다.
1 차적인 gingival 상피 세포는 시험관 4에 있는낮은 분할 비율에 의해 특징지이며, 연구원은 수십 년 동안 최적 격리 및 재배 방법을 찾고 있습니다. 현재까지, 두 개의 상이한 기술, 직접 절제 방법 및 효소 방법, 일반적으로 시험관 4에서1차 칭기발 상피 세포를 얻기 위해 실험실에서 사용된다4,5. 직접 적인 절제 방법은 낮은 양의 조직 시편과 간단한 격리 절차의 요구 사항과 같은 장점을 가지고 있지만, 더 긴 배양 시간과 오염에 대한 감수성의 단점이5. 효소 방법은 필요한 배양 시간을 단축하지만, 효율은 상대적으로 낮으며 사용되는 효소 및 매체에 따라 다릅니다. Kedjarune외. 6 서브컬쳐 (2 주) 전에 더 많은 시간을 필요로 하는 직접 적인 절제 방법은 효소 방법에 비해 칭기발 상피 세포를 배양하는 데 더 성공한 것으로 나타났다. 그러나, 이들 두 가지 방법을 비교하면, 클링베일 외7은 효소 방법이 경구 상피 세포의 1차 배양에 가장 좋은 결과를 가져온 것으로 나타났으며, 최단 기간(11.9일 대 14.2일) 내에 최적의 세포 수율을 얻을 수 있었다.
따라서, 경구 상피 세포의 격리 및 배양에 대한 보다 편리하고 효과적인 방법을 개발하는 것이 중요했다4. 우리는 이전에 Y-27632, Rho 관련 단백질 키나아제 (ROCK)의 억제제, 성인 피부 조직에서 인간 1 차형 표피 세포 및 각질 세포의 격리 절차를 단순화한다는 것을보고8,9,10. 우리는 G-배지를 개발, 자발적으로 진피 세포에서 표피를 분리하고 1 차성 표피 세포의 성장과 수율을 지원하는 새로운 조건부 접종 배지8,9,10. 본 연구에서는 G-배지와 Y-27632를 결합하여 gingival 상피 세포를 위한 새로운 혈청 없는 격리 및 배양 기술을 개발했습니다. 본질적으로, 우리의 방법은 기존의 2 단계 효소 방법의 단순화를 기반으로, 그래서 우리는 직접 절제 방법과 우리의 새로운 방법을 비교했다. 이 수정된 효소 방법은 칭기발 조직으로부터 칭기발 상피 세포를 분리하는 데 필요한 시간을 현저히 단축하고 칭기발 상피 세포를 배양하는 효율을 증가시킵니다.

<table><tbody><tr><td>이름</td><td></td><td></td><td>약어 & 코멘트</td></tr><tr><td>백작 자동 세포 계수기</td><td>상하이 Ruiyu Bio-science& 기술 Co.Ltd.</td><td>BBA0218AC</td><td>자동 세포 계수</td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터</td><td>Thermo Scientific</td><td>51026333</td><td>세포 배양용</td></tr><tr><td>Sorvall ST 16R 원심분리기</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004380</td><td>세포 원심분리기</td></tr><tr><td>세포 배양 접시</td><td>Eppendorf</td><td>30702115</td><td>세포 배양용</td></tr><tr><td>50 ml 원심분리기 튜브</td><td>KIRGEN</td><td>171003</td><td>세포 원심분리용</td></tr><tr><td>1.5 ml 마이크로 원심 분리기 튜브</td><td>KIRGEN</td><td>190691J</td><td>세포 소화를 위해</td></tr><tr><td>Cell Strainer</td><td>Corning은</td><td>431792</td><td>세포 여과</td></tr><tr><td>인산염 완충 용액</td>을 통합했습니다 <td>Solarbio Life Science</td><td>P1020-500</td><td>세척 용액</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Scientific</td><td>C11995500</td><td>중화 매체의 구성 요소</td></tr><tr><td>정의 된 K-SFM</td><td>수명 Technologies</td><td>10785-012</td><td>치은 상피&nbsp; 세포 배양 배지</td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토마이신</td><td>Thermo Scientific</td><td>15140-122</td><td>항생제</td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>생물학 산업</td><td>04-001-1AC5</td><td>중화 매체</td></tr><tr><td>0.05% Trypsin</td><td>Life Technologies</td><td>25300-062</td><td>HGGEPCs 해리</td></tr><tr><td>희석 매체</td><td>Life Technologies</td><td>50-9701</td><td>코팅 매트릭스</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Gibco</td><td>17105-041</td><td>HGGEPC 절연</td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 유형 I</td><td>Life Technologies</td><td>17100-017</td><td>HGGEPC 절연</td></tr><tr><td>F12 영양 혼합물, Hams</td><td>Life Technologies</td><td>31765035</td><td>G-medium</td></tr><tr><td>B27 Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>구성 요소 17504044</td><td>G-medium</td></tr><tr><td>FGF-2 Millipore</td><td>Merck Biosciences</td><td>341595</td><td>G-medium</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>유전자 조작</td><td>IAD1011</td><td>ROCK 억제제</td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Gibco</td><td>15290026</td><td>G-medium</td></tr><tr><td>EGF 재조합 인간 단백질</td><td>Gibco</td><td>PHG0311</td><td>G-medium</td></tr><tr><td>Cell Counting Kit-8</td><td>의 성장 인자 준비Dojindo Molecular Technologies</td><td>CK04</td><td>세포 증식 분석용</td></tr><tr><td>Rabbit Anti-Human CK18</td><td>Abcam</td><td>ab82254</td><td>HGGEPC의 분화 마커를 확인하기 위한 면역형광 염색용</td></tr><tr><td>Rabbit Anti-Human Cytokeratin10</td><td>Abcam</td><td>ab76318</td><td>HGGEPC의 분화 마커를 확인하기 위한</td></tr> 면역형광 염색용 <tr><td>Vimentin</td><td>세포 신호 전달 기술</td><td>3390</td><td>치은 섬유아세포의 면역</td></tr>형광 염색용<tr><td>, Rabbit Anti-Human pan-ck</td><td>BD</td><td>550951</td><td>HGGEPCs</td></tr><tr><td>rabbit anti-Ki67</td><td>Abcam</td>의 분화 마커를 확인하기 위한 면역형광 염색용, <td>15580</td> HGGEPCs rabbit anti-p63 Biolegend 619002<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>의 분화 마커를 확인하기 위한 면역형광 염색용HGGEPC의 분화 마커를 확인하기 위한 면역형광 염색</td></tr>용, <tr><td>토끼 anti-p75NGFR</td>, <td>Abcam</td><td>ab52987</td>, <td>HGGEPC의 분화 마커를 확인하기 위한 면역형광 염색용, HGGEPC의 분화 마커를 확인하기 위한 면역형광 염색용</td></tr></tbody></table>

y-27632를 사용하여 1차 인간 칭기발 상피 세포의 격리 및 배양

Isolation and Culture of Primary Human Gingival Epithelial Cells using Y-27632

gingival 조직은 치주 조직을 보호하고 많은 구강 기능에 있는 의미 있는 역할을 하는 첫번째 구조물입니다. gingival 상피는 치지항 조직의 중요한 구조, 특히 치주 조직의 수리 및 재생에서. gingival 상피 세포의 기능을 연구하는 것은 구강 결함을 복구하고 생체 재료의 호환성을 검출하는 것과 같은 중요한 과학적 가치가 있습니다. 인간 gingival 상피 세포는 높게 분화된 각질 세포이기 때문에, 그들의 수명은 짧고, 통과하기 어렵습니다. 지금까지, 분리 및 배양 gingival 상피 세포, 직접 절제 방법 및 효소 방법이 있는 두 가지 방법이 있습니다. 그러나, 직접 적인 절제 방법을 사용하여 상피 세포를 얻는 데 필요한 시간은 더 길고, 효소 방법의 세포 생존율은 낮다. 임상적으로, gingival 조직의 취득이 제한되어 있으므로 안정적이고 효율적이며 간단한 체외 격리 및 배양 시스템이 필요합니다. 상피 세포의 성장을 선택적으로 촉진할 수 있는 Rho-관련 키나아제(ROCK) 억제제인 Y-27632를 첨가하여 전통적인 효소 방법을 개선했습니다. 당사의 변형된 효소 방법은 기존의 효소 방법의 단계를 단순화하고 직접 적인 절제 방법 및 효소 방법에 비해 상당한 이점을 갖는 상피 세포를 배양하는 효율성을 증가시킵니다.

도 1은 직접 절제 방법 및 수정된 효소 방법의 회로도도를 나타낸다. 직접 적인 절제 방법은 전체 과정에서 소화 효소가 필요하지 않습니다. 대조적으로, 전통적인 효소 방법은 일반적으로 기형 섬유아세포 층에서 상피 시트를 분리하기 위해 소화 효소, 디스파제 및 콜라게나아제 의 두 세트를 필요로하고, 다음 트립신은 현탁액으로 상피 세포를 방출합니다. 우리의 새로운 방법은 분리 단계를 생략하고 단순화 된 효소 방법입니다. 더욱이, G-배지에 Y-27632를 첨가하면 상피 세포 성장을 효과적으로 촉진한다. 직접 적인 박리 방법은 일반적으로 통과하기에 충분히 성장하는 gingival 상피 세포에 대한 약 2 주가 걸리고 쉽게 오염된다. 그러나, 새로운 방법에 의해 얻어진 진피세포의 수는 직접 적인 절제 방법에 의해 얻어진 것보다 훨씬 크며, 패혈증요건을 충족시키기 위해 평균 8일만 소요된다.
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여기서 우리는 전통적인 방법에 록 억제제 Y-27632를 추가하여 인간 칭기발 상피 세포의 격리 및 배양에 대한 변형된 방법을 제시한다. 이 방법은 더 쉽고 시간이 많이 걸리며 줄기 세포 특성을 향상시키며 실험실과 임상 응용 분야에서 더 많은 수의 고잠재 상피 세포를 생성합니다.

Y-27632를 사용하여 1차 인간 칭기발 상피 세포의 격리 및 배양

The gingival tissue is the first structure that protects periodontal tissues and plays meaningful roles in many oral functions. The gingival epithelium is ...

따라서 이 세포 기반 프로토콜의 일반적인 목표는 직접 가지 방법의 단점을 개선하기 위해 인간 칭기발 상피 세포를 분리하고 만나는 것입니다. 새로운 수정된 내피법에서, 우리는 우리의 재료 및 장비에 근거를 둔 상대적으로 짧은 시간에 1 차적인 gingival 상피 세포의 더 많은 수를 얻을 수 있습니다. 그래서 이 프로토콜에 사용된 인간 조직은 기관의 인간 연구 윤리위원회의 지침에 따라 맥실로면 외과 부에 있는 영향 받은 치아의 추출에서 버려진 신선한 성인 gingival 조직이었습니다.새로운 수정된 효소 방법.Gingival 조직 전처리.30초 동안 75%에탄올로 조직을 세척합니다. 그리고, 각각 5 분 동안 두 번 세척 용액. 깅기발 티슈의 소화.두 개의 수술 블레이드와 작은 조각으로 조직을 잘라. 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브에 2.5mg/밀리리터 디스파스및 콜라게나아제-1 용액을 넣습니다. 조직 조각을 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브에 넣습니다. 37분 동안 15-20분 동안 배양

isolation-culture-primary-human-gingival-epithelial-cells-using-y

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 비디오는 마우스 모델에서 치은 면역 세포 네트워크의 분리 절차를 보여줍니다. 효소 소화는 부착된 치아와 뼈에서 잇몸 조직을 방출하고, 이는 더 기계적으로 소화되어 치은에서 면역 세포를 방출합니다. 분리된 세포는 면역학 실험을 할 준비가 되었습니다.

쥐 치아 블록에서 치은 면역 세포 네트워크 분리

이 비디오는 혐기성 병원성 박테리아인  Porphyromonas gingivalis가 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)에 부착하고 침입하는 능력을 평가하는 기술을 보여줍니다. 숙주 세포를 박테리아로 감염시킨 후, 숙주 세포를 용해시켜 부착된 박테리아와 내재화된 박테리아를 모두 방출합니다. 용해물이 적절한 배지에 도말링되면 콜로니의 존재는 박테리아-숙주 세포 상호 작용이 성공했음을 나타냅니다.

혐기성 박테리아-숙주 세포 상호 작용을 연구하기 위한 박테리아 감염 분석

이 연구는 단일 셀 문화를 생산하기 위해 마우스 구강의 잇몸 조직을 분리하고 처리 할 수​​있는 효율적인 방법을 설명합니다. 그 결과 세포는 더욱 유동 세포 계측법 분석 및 분자 연구에 사용할 수 있습니다.

쥐과 잇몸 세포의 분리, 처리 및 분석

이 기사에서는 두 가지 프로토콜을 제시합니다: 하나는 숙주 내에서 성공적으로 침입하여 생존할 수 있는 혐기성 박테리아를 측정하기 위한 것이고, 다른 하나는 숙주 세포와 상호 작용하는 혐기성 박테리아를 시각화하기 위한 것입니다. 이 연구는 모든 배양 가능한 혐기성 및 모든 진핵 세포 유형에 적용할 수 있습니다.

숙주 세포와 혐기성 세균의 상호 작용을 평가하기위한 모델 생물로 포피 진지 발리

우리는 분리, 표현형 특성화 및 쥐의 잇몸에서 면역 세포의 기능 분석을위한 기술을 설립했다.

절연, 특성화 및 잇몸 면역 세포 네트워크의 기능 시험

여기 선물이 주 인간의 keratinocytes 성인 피부 조직에서 효율적으로 격리 하는 프로토콜. 이 메서드는 접종 매체에 자연스럽 게 피부 세포에서 상피 세포를 분리 하 록 억제 물 Y-27632를 사용 하 여 기존의 절차를 단순화 합니다.

성인 피부 조직에서 기본 인간의 Keratinocytes를 분리 하는 단순 하 고 효율적인 방법

우리는 1 차적인 인간 타액 선 파생된 상피 세포를 격리하고 기양하는 방법을 제시합니다. 이들 세포는 침상 피유래의 유전자 발현 패턴을 나타내며 엥겔브레스-홀름-군단 종양 세포에서 유래한 지하 막 매트릭스 또는 처리된 배양 요리의 단층으로서 살리스피어로 성장될 수 있다.

침또는 단층으로 시험관 내 성장을 위한 인간 타액 선에서 타액 상피 세포의 격리

본 프로토콜은 성인용 마우스 입맛에서 파생된 구강 각질 세포의 격리 및 배양을 설명합니다. 면역스테인링을 이용한 평가 방법도 보고된다.

성인 마우스 입천장에서 1 차 구강 각막 세포의 격리 및 문화

치과 여포에는 상피 인구와 중간 엽 세포가 포함되어 있습니다. 상피 인구는 뚜렷한 배양 배지를 제공함으로써 이질적인 치과 여포 세포 집단으로부터 선택되었다. 상피 세포는 혈청이없는 배지에서 생존하고 식민지를 형성했다.

인간 치과 여포에서 상피 세포의 격리

본 연구는 소량의 유방 조직에서 주요 인간 유방 상피 세포(HMEC)를 효율적으로 분리하고 성장시키기 위한 더 쉽고 시간을 절약하며 경제적인 프로토콜을 보고합니다. 이 프로토콜은 실험실 및 임상 응용 분야 모두를 위한 1차 HMEC를 신속하게 생산하는 데 적합합니다.

Isolation and Culture of primary human mammary epithelial cells(원발성 인간 유방 상피세포의 분리 및 배양)

배우세요 Y-27632를 사용하여 1차 인간 칭기발 상피 세포를 효율적으로 격리하고 배양하는 방법을. 이 기법은 줄기세포 특성을 향상시키고 재생의학 연구에 활용할 수 있습니다.

Y-27632를 사용하여 1차 인간 칭기발 상피 세포의 격리 및 배양

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