Name: 초파리의 후각 회로 어셈블리의 타임랩스 이미징 연구를위한 Explant 시스템 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-13T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: 배우세요 초파리 후각 회로 어셈블리의 타임랩스 라이브 이미징 방법을 단일 축삭 수준에서 관찰하는 기술입니다. 이 프로토콜은 신경 발달의 세포생물학적 기전을 이해하는 데 귀중한 통찰을 제공합니다.

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우리는 N. Özel과 R. Hiesinger에게 explant 문화에 대한 조언에 감사드립니다. M. 이광자 현미경의 기술적 도움을 위한 바그너; D.J. 형질전환 파리를 생성하기 위한 루긴불; D. 피지 소프트웨어 분석의 제안에 대한 프리드만; Y. 비행 작업에 대한 지원을위한 Ge; C. McLaughlin과 K.K.L. Wong 은 원고에 대한 의견을 제시합니다. L.L.은 하워드 휴즈 의학 연구소 연구원입니다. 이 연구는 국립 보건원 보조금 1K99DC01883001 (T.L.) 및 R01-DC005982 (L.L.)에 의해 지원되었습니다.

1. 시약의 제조
참고: 이 프로토콜의 모든 단계는 달리 설명되지 않는 한 실온(20-25°C)에서 수행됩니다.
<ol><li>시간 경과 영상화 동안 외식편을 고정화하기 위한 배양 접시를 준비하기 위해, 0.5 cm 두께의 실가드(사용 전에 10:1 비율로 두 액체 성분을 완전히 혼합)를 60 mm x 15 mm 페트리 접시의 바닥 표면에 놓고 실온에서 48시간 동안 경화시킨다(도 2A, 다음 텍스트에서 실가드 플레이트라고 함).</li>
	<li>이 플레이트에 explant를 고정시키기 위한 마이크로 핀을 준비하려면 한 쌍의 포셉을 사용하여 한쪽에 날카로운 끝이 정렬된 테이프에 여러 개의 마이크로 핀을 붙입니다(그림 2B). 한 쌍의 가위를 사용하여 마이크로 핀의 날카로운 끝에서 ~2mm를 자릅니다(그림 2B'). 포셉을 사용하여 절단된 마이크로 핀을 잡고 미리 만들어진 Sylgard 플레이트의 Sylgard 레이어에 삽입합니다(그림 2C). 두 개의 마이크로 핀이 하나의 explant를 고정시키는 데 사용됩니다.</li>
	<li>브러시를 사용하여 1 시간 이내에 번데기를 형성하는 흰 번데기를 수집하여 hsFLP, 자갈-GAL4 / +; UAS-FRT 100-stop-FRT 100-mCD8-GFP 8 유전자형을 새로운 바이알로 옮긴다. 37°C 수조에서 40분 동안 열 충격을 가하여 무작위 유형으로부터 희소 ORN 클론을 유도하였다. 열 충격 후, 바이알을 25°C에서 30시간 동안 넣고, 번데기 형성 후 30 h에서 숙성된 번데기를 초래하였다(APF).</li>
	<li>식재용 배지를 준비하려면 페니실린-스트렙토마이신 5mL(10,000 U/mL)를 슈나이더 초파리 배지 500mL에 첨가한다. 배지를 여과하고 50 mL 코니컬 튜브에 45 mL 분취량을 만드십시오. 배지는 4°C에서 1-2개월 동안 저장될 수 있다.</li>
	<li>이미징 당일, 슈나이더 초파리 배지 45mL의 튜브 하나를 취하여 소 태아 혈청 5mL(10% v/v), 4mg/mL 인간 인슐린 원액 125μL(최종 농도 10μg), 에탄올에 녹인 1mg/mL 20-하이드록시에키손 원액 50μL(최종 농도 1μg/mL)를 첨가합니다. 잘 섞어서 전체 배지 15mL를 새로운 50mL 코니컬 튜브로 옮깁니다. 전체 배지의 나머지 부분은 일주일 동안 4°C에서 저장할 수 있다. 소 태아 혈청, 인간 인슐린 원액 및 20-하이드록시에키디손 원액을 분취하여 -20°C에서 보관한다.</li>
	<li>액체 표면 아래의 산소 실린더에서 멸균된 5mL 피펫 팁을 통해 20-30분 동안 하나의 기포/s의 속도로 산소 기포를 펌핑하여 15mL 전체 배지에 산소를 공급합니다. 이 과정에서 튜브의 개구부를 덮기 위해 파라핀 필름을 사용하십시오.</li>
	<li>해부 우물 표면 및 실가드 플레이트(단계 A1 및 A2에서 제조된 실가드 층에 마이크로핀이 삽입됨)를 70% 에탄올로 멸균한다. 사용하기 전에 말리십시오.</li>
</ol>2. 추방 해부
<ol><li>브러시를 사용하여 번데기 30 시간 APF (번데기 형성 후 30 시간) 번데기를 종이 조직으로 옮기고 번데기의 외부 표면을 5 분 동안 건조시킵니다.</li>
	<li>유리 슬라이드에 양면 테이프 조각을 놓습니다. 말린 번데기를 테이프의 끈적 끈적한 표면에 조심스럽게 붙이고 등쪽이 위쪽을 향하게하십시오. 번데기의 복부 쪽이 테이프에 잘 부착되도록 브러시로 번데기를 부드럽게 누릅니다(그림 3A). 번데기를 손상시키지 마십시오.</li>
	<li>한 쌍의 포셉을 사용하여 머리의 등쪽을 덮고 있는 갈색 번데기 케이스를 제거합니다(그림 3A,B). 갈색 번데기 케이스와 번데기 사이에 포셉의 날카로운 팁 하나를 옆쪽에서 삽입하고 번데기의 후부 끝까지 선을 통해 갈색 번데기 케이스를 조심스럽게 분리하십시오 (그림 3B, C). 갈색 번데기 케이스를 엽니 다. 한 쌍의 포셉을 사용하여 번데기를 부드럽게 잡고 1 mL의 산소가 함유 된 전체 배지로 해부 웰로 옮깁니다. 중간 표면에 떠 있는 번데기를 잠수시켜 우물 바닥으로 가라앉히도록 합니다(그림 3D). 참고 : 포셉으로 번데기를 다치게하지 않도록 갈색 번데기 케이스 안에 포셉 팁을 너무 깊게 삽입하지 마십시오.</li>
	<li>번데기에서 안테나-뇌 explant를 해부하려면 포셉을 사용하여 한 손으로 번데기를 부드럽게 잡고 한 쌍의 미세 가위를 사용하여 번데기의 뒤쪽에서 작은 구멍을 다른 손으로 자릅니다 (그림 3E). 이 작은 구멍은 번데기 내부의 높은 압력을 방출합니다.</li>
	<li>구멍에서 번데기의 복부 중앙선을 통해 목 (머리와 흉부를 연결하는 좁은 구조)까지 미세 가위로 자릅니다 (그림 3F). 그런 다음 목의 둘레를 잘라 번데기의 몸에서 머리를 분리합니다 (그림 3G). 시체를 제거하고 다른 우물에 놓습니다. 참고 : 뇌를 압박 할 수있는 번데기의 등쪽 / 복부 쪽에서 목을 직접 자르지 마십시오.</li>
	<li>뇌의 등쪽을 덮고 있는 투명한 큐티클을 자릅니다(그림 3H). 이것은 뚱뚱한 몸을 뇌 위에 노출시킵니다. 망막과 안테나가 부착 된 큐티클을 유지하십시오. 뇌의 복부 쪽에 동일한 절차를 반복하십시오. 참고: 가위의 칼날을 큐티클 아래에 너무 깊이 삽입하면 안테나와 뇌를 연결하는 안테나 신경이 절단되므로 삽입하지 마십시오(그림 3H').</li>
	<li>P10 피펫을 사용하여 매질을 머리의 등쪽 및 복부 측면의 열린 영역 쪽으로 피펫팅하여 뇌와 안테나를 덮고 있는 지방체를 부드럽게 씻어냅니다(그림 3I). 참고 : 뇌가 큐티클에서 쉽게 분리 될 수 있으므로 매체를 피펫팅 할 때 매우 부드럽게하십시오. 이 단계에서 모든 뚱뚱한 몸이 제거되었는지 확인하십시오. ORN 축삭의 체포 된 발달은 지방 체가 잘 청소되지 않았을 때, 아마도 매체로부터의 산소 접근이 좋지 않기 때문에 관찰되었습니다.</li>
	<li>PN 수상 돌기 표적화에 대한 양측 ORN 축삭 또는 ORN 축색돌기의 상호작용을 연구하기 위해, 이 단계8 동안 하나 또는 두 개의 안테나 신경을 미세가위로 절단한다(도 3J). 조심스럽게 큐티클과 뇌 사이에 가위의 칼날을 놓고 관심있는 안테나 신경을 절단하십시오.</li>
	<li>해부된 외출물을 실가드 플레이트로 옮기려면 실가드 표면에 산소화된 전체 배지(~200μL)의 물방울을 놓는다. 200 μL 폭의 팁 피펫 팁의 내부 표면을 해부된 트렁크로부터의 지방체와 코팅하여(단계 1.6) 지방체를 여러 번 피펫팅함으로써, 이식 중에 외식편이 피펫 팁에 달라붙는 것을 방지한다. 그런 다음, 이 넓은 팁 피펫 팁을 사용하여 해부 우물에서 배양 플레이트의 배지 액적으로 외출물을 옮깁니다(그림 3K).</li>
	<li>포셉을 사용하여 두 개의 광학 로브의 Sylgard 레이어에 explant를 고정합니다(그림 3L). Sylgard 플레이트를 이미징 스테이션에 조심스럽게 놓고 플레이트를 테이프로 고정시킵니다. P1000 피펫을 사용하여 산소화된 전체 배지 10mL를 Sylgard 플레이트에 천천히 첨가한다. 참고 : Sylgard 플레이트에 배지를 추가 할 때 explant를 방해하지 마십시오.</li>
</ol>3. 이광자 현미경 기반 라이브 이미징
<ol><li>타임랩스 이미징을 수행하려면 이광자 현미경, Ti:Sapphire 레이저, 20x 침수 목표(1.0NA) 및 이미징 소프트웨어를 사용합니다. GFP 단백질을 이미징하기 위해 920nm에서 여기 파장을 사용하십시오. 픽셀 유지 시간을 10μs로 조정합니다.</li>
	<li>이미징 스테이션 위치를 조정하여 외식편이 대략 목표 아래에 있도록 합니다. 이미징하기 전에 70 % 에탄올을 사용하여 렌즈를 멸균하십시오. 외식식물에 가까운 배지 아래에서 목표를 천천히 낮춥니다. 목표렌즈에 거품이 있는지 확인하십시오.<ol>
<li>그렇다면 목표를 매체 위로 들어 올리고 거품이 사라질 때까지 반복하십시오. 접안 렌즈를 사용하여 외식편을 찾고 현장에서 하나의 explant를 중심으로하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>타임랩스 이미징을 위해 드물게 라벨이 붙은 몇 개의 ORN을 가진 외래식을 보장하려면, 매번 ~10개의 외식편을 해부하고 배양 플레이트의 y축에 정렬한다. 목표물을 y축을 따라 움직여 모든 외식물을 스크린하고 이미징을 위해 몇 개의 단일 ORN 축삭이 안테나 로브에 방금 도달한 외래 식물을 선택합니다(그림 4A).<ol>
<li>타원형 모양과 그것을 둘러싸기 시작하는 ORN 축삭으로 안테나 엽을 인식하십시오. xy 평면에서 ~150μm x 150μm 영역을 이미지화합니다(20x 목표치로 3x 줌). 두 안테나 로브의 경계를 추정하고 이미징 영역에 중심을 맞춥니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>스캔의 하단 섹션과 상단 섹션을 정의하여 z축을 따라 초기 이미징 영역을 선택합니다. z축을 따라 이미징 영역을 설정합니다. ORN 축삭 신호가 있는 가장 깊은 구간을 첫 번째 이미징 세션으로 설정하고 100μm 위(더 피상적인 측면)를 마지막 이미징 세션으로 설정합니다(그림 4B). 참고 : 이것은 ORN 축삭의 상단 (피상적 인 측면)에 일부 섹션을 남기고 배양 중 뇌의 성장으로 인해 ORN 축삭이 이미징 영역 밖에서 위쪽으로 이동하는 것을 방지합니다.<ol>
<li>2μm 간격으로 이미지. 이미징 소프트웨어를 사용하여 20분마다 자동 이미징 스캔을 설정합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>이미징 영역을 처음 4시간 이미징 후 z축을 따라 20μm 위쪽으로 이동하고, 16시간 이미징 후 z축을 따라 또 다른 20μm를 위쪽으로 이동시킨다. 이는 이미징 소프트웨어에서 스크립트와 다른 z 스택을 설정하여 달성할 수 있습니다.</li>
	<li>외래를 영상화 후 추가 기간 동안 배양하고(최대 24시간 ex 생체내) 고정시키고 뉴로필 마커인 N-cadherin으로 염색하여, 사구체에 의한 각각의 단일 ORN의 유전적 동일성을 밝히기 위해 표적으로 한다.</li>
</ol>4. 이미지 처리
<ol><li>피지 소프트웨어를 사용하여 각 시점에서 촬영 한 섹션 시리즈의 z 스택 이미지를 처리하려면 이미지 섹션 시리즈를 열고 이미지를 클릭하십시오 | 스택 | Z 프로젝트 [/].</li>
	<li>문화권 동안 샘플의 측면 드리프트를 수정하려면 피지에 TurboReg 플러그인 을 설치하십시오.<ol>
<li>시리즈에서 z 스택 이미지 시리즈와 단일 z 스택 이미지를 엽니다. 플러그인 열기 | 등록 | 터보레그.</li>
		<li>소스에서 z 스택 이미지 시리즈를 선택하고 대상 |에서 단일 z 스택 이미지를 선택합니다. 번역. Batch 버튼을 클릭하여 열린 z 스택 이미지 시리즈의 모든 이미지를 등록하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>이미지화된 샘플의 유용성을 최대화하려면 3D 이미지 섹션 다음에 나오는 z 스택 이미지에서 서로 부근의 희소하게 레이블이 지정된 단일 축삭을 서로 분리합니다.<ol>
<li>동일한 이미지의 몇 축삭에서 단일 ORN 축삭을 추출하려면 이미지 섹션 시리즈를 열고 플러그인을 클릭하| 세분화 | 세그멘테이션 편집기 [/]. 브러시 도구를 선택하고 각 이미지 섹션에서 "+" 또는 "-" 단추 선택을 사용하여 세그멘테이션 편집기 작업 창에서 관심 있는 ORN 축삭을 마스크합니다.</li>
		<li>프로세스 |을 클릭하십시오. 이미지 계산기 [/]. 이미지 1에서 " 이미지 X", 작업에서 "곱하기", 이미지 2에서 "이미지 X. 레이블" , [/]를 선택합니다. 이렇게 하면 관심 축삭만 있는 새 이미지 시리즈 파일이 생성됩니다. 4.1단계를 수행하여 z 스택 이미지를 처리합니다. 모든 시점에 대해 이 단계를 반복하여 시계열 이미지 파일을 생성합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>동일한 이미지에서 서로 다른 축삭을 의사 컬러링하려면 먼저 4.3단계를 수행하여 각 축삭의 시계열 이미지 파일을 별도로 생성합니다. 동일한 원시 데이터 이미지에서 서로 다른 단일 축삭에 대한 시계열 이미지 파일을 엽니다. 이미지 |를 클릭하십시오. 색상 | 채널 병합. 다른 색상 채널에서 다른 시계열 이미지 파일을 선택하고 확인을 클릭합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+molecules+of+neuronal+wiring%3A+a+primer%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspective+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 3 (6), 001727(2011).</li>
<li>Vosshall, L. B., Stocker, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+smell+and+taste+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of smell and taste in Drosophila.</a> Annual Review Neuroscience. 30, 505-533 (2007).</li>
<li>Hong, W., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+wiring+specificity+in+the+fly+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic control of wiring specificity in the fly olfactory system.</a> Genetics. 196 (1), 17-29 (2014).</li>
<li>Bentley, D., Caudy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pioneer+axons+lose+directed+growth+after+selective+killing+of+guidepost+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pioneer axons lose directed growth after selective killing of guidepost cells.</a> Nature. 304 (5921), 62-65 (1983).</li>
<li>Godement, P., Wang, L. C., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+axon+divergence+in+the+optic+chiasm%3A+dynamics+of+growth+cone+behavior+at+the+midline%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Retinal axon divergence in the optic chiasm: dynamics of growth cone behavior at the midline.</a> Journal of Neuroscience. 14 (11), Pt 2 7024-7039 (1994).</li>
<li>Harris, W. A., Holt, C. E., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+axons+with+and+without+their+somata%2C+growing+to+and+arborizing+in+the+tectum+of+Xenopus+embryos%3A+a+time-lapse+video+study+of+single+fibres+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Retinal axons with and without their somata, growing to and arborizing in the tectum of Xenopus embryos: a time-lapse video study of single fibres in vivo.</a> Development. 101 (1), 123-133 (1987).</li>
<li>Ozel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filopodial+dynamics+and+growth+cone+stabilization+in+Drosophila+visual+circuit+development%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development.</a> Elife. 4, 10721(2015).</li>
<li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+bases+of+olfactory+circuit+assembly+revealed+by+systematic+time-lapse+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular bases of olfactory circuit assembly revealed by systematic time-lapse imaging.</a> Cell. 184, 5107-5121 (2021).</li>
<li>Chen, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lattice+light-sheet+microscopy%3A+Imaging+molecules+to+embryos+at+high+spatiotemporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution.</a> Science. 346 (6208), 1257998(2014).</li>
<li>Liu, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observing+the+cell+in+its+native+state%3A+Imaging+subcellular+dynamics+in+multicellular+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Observing the cell in its native state: Imaging subcellular dynamics in multicellular organisms.</a> Science. 360 (6386), (2018).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+adaptive+optical+recovery+of+optimal+resolution+over+large+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid adaptive optical recovery of optimal resolution over large volumes.</a> Nature Methods. 11 (6), 625-628 (2014).</li>
<li>Kohl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+tissue+staining+with+chemical+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Ultrafast tissue staining with chemical tags.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 111 (36), 3805-3814 (2014).</li>
<li>Sutcliffe, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second-Generation+Drosophila+Chemical+Tags%3A+Sensitivity%2C+Versatility%2C+and+Speed%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Second-Generation Drosophila Chemical Tags: Sensitivity, Versatility, and Speed.</a> Genetics. 205 (4), 1399-1408 (2017).</li>
<li>Grimm, J. B., Brown, T. A., English, B. P., Lionnet, T., Lavis, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+Janelia+Fluor+HaloTag+and+SNAP-Tag+Ligands+and+Their+Use+in+Cellular+Imaging+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthesis of Janelia Fluor HaloTag and SNAP-Tag Ligands and Their Use in Cellular Imaging Experiments.</a> Methods Molecular Biology. 1663, 179-188 (2017).</li>
</ol>

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초파리 안테나-뇌 explant는 후각 회로의 정상적인 표적을 유지합니다. 우리는 발달이 생체 내에서보다 2 배 느린 생체 외 발달을 알아 차렸다. explant 시스템은 여섯 가지 유형의 ORN을 호스팅하는 상악 마비를 유지하지 않습니다. 정상적인 발달이 생체 외에서 되풀이되도록하기 위해, 안테나 신경의 스트레칭은 explant 해부 중에 피할 필요가 있습니다. 생체외 배양 동안 박테리아 성장은 일반적으로 후각 회로의 체포 된 발달을 일으킨다. 따라서, 영상화 전에 배양접시와 핀을 철저하게 살균하고 영상실을 청결하고 단리하여 유지하는 것이 중요하다.
이 explant는 장기 이광자 현미경 검사 기반 타임랩스 이미징을 지원합니다. 단일 ORN의 희소 라벨링을 위해 새로 개발된 리포터와 결합된 explant 시스템은 단일 축삭 종점에서 고해상도 이미징을 가능하게 합니다. 이 시스템은 후각 회로 어셈블리...

뉴런은 뇌의 적절한 기능에 필수적인 회로를 형성하기 위해 정확하게 상호 연결되어 있습니다. 100 년 이상 동안 신경 과학자들은 신경돌기가 극도의 정밀도로 중간 및 최종 목표를 향해 어떻게 확장되는지 이해하려고 노력해 왔습니다. 결과적으로, 그들은 신경 세포 과정을 개발하기위한 안내 단서를 인코딩하는 중요한 유전자를 확인했습니다1. Drosophila 후각 시스템은 후각 수용체 뉴런 (ORNs, 일차 감각 뉴런)이 고정 관념의 크기, 모양 및 상대적 위치를 가진 50 개의 식별 가능한 사구체에 투사하여 50 가지 유형의 2 차 투영 뉴런 (PN)에서 수상 돌기와 시냅스 연결을 형성하기 때문에이 과정을 조사하는 데 탁월한 모델을제공합니다 (그림 1A ). 따라서, 파리 후각 시스템에서 시냅스(사구체) 분해능에서 돌연변이 표현형을 확인하는 것은 비교적 쉽다. 이로 인해 후각 회로 어셈블리를 조절하는 중요한 유전자가 발견되었습니다3.
플라이 후각 회로의 조립은 시간적, 공간적으로 조정 된 발달 과정3에 의존합니다. ORN과 PN은 뚜렷한 세포 운명을 획득하여 배선 특이성에 대한 프로그램을 설정합니다. 다음으로, PN 수상 돌기는 안테나 로브를 미리 패턴화합니다(그림 1B). ORN의 축삭은 동측성 안테나 엽을 우회하고 뇌의 중간 선을 교차하여 대측 안테나 엽에 도달합니다. 그 후, ORN 축삭은 ipsi- 및 대측성 안테나 엽 모두를 침범하고 특정 사구체에서 파트너 PN의 수상 돌기와 함께 시냅스를 형성합니다. 후각 회로 조립을 위한 이 거친 모델은 개발 중 중간 시점으로부터 고정된 샘플의 특성화를 기반으로 제안되었다. 열악한 시간적 분해능과 고정 조직으로부터 발달 전반에 걸쳐 동일한 뉴런 과정을 따를 수 없다는 것은 회로 조립 공정에 대한 기계론적 이해를 제한한다.
안테나 로브가 번데기 케이스 내부의 불투명 한 지방체로 둘러싸여있을 때 번데기 단계의 전반부에서 배선 과정이 발생하기 때문에 생체 내에서 ORN 및 PN 프로세스를 라이브하는 것은 기술적으로 어렵습니다. 따라서 손상되지 않은 번데기에서 발달하는 후각 회로를 직접 이미지화하는 것은 불가능합니다. 생체외에서 배양된 해부된 조직은 조직 불투명도를 회피할 수 있고, 신경 발달4,5,6을 연구하는데 성공적으로 이용되었다. 번데기 뇌에서 뉴런 배선을 연구하기 위해 유사한 생체외 외래 배양 전략을 사용하는 과제는 배양 조건에서 정확한 뉴런 표적화를 되풀이하는지 여부입니다. 플라이 안구-뇌 복합체(7)에 대한 이전에 보고된 생체외 배양 조건에 기초하여, 번데기 전체 뇌, 안테나, 및 연결 안테나 신경을 온전하게 포함하는 외래 식물이 최근에 개발되어 후각 회로의 정확한 표적화를 유지하고 매 20분마다8의 주파수에서 최대 24시간 동안 이광자 현미경 기반 라이브 이미징을 실시할 수 있다. . 여기에서, explant 배양 및 이미징의 상세한 프로토콜이 설명된다. explant 시스템은 후각 회로 및 중앙 뇌의 잠재적으로 다른 회로의 어셈블리를 연구하는 강력한 방법을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>20-하이드록시엑다이손</td><td>시그마</td><td>H5142</td><td></td></tr><tr><td>카멜레온 Ti:사파이어 레이저</td><td>코히런트</td><td>코히런트 MRU X1</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>인간 인슐린</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12585014</td><td></td></tr><tr><td>이미징 소프트웨어</td><td>Prairie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro Scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>501778</td><td></td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>산소 실린더</td><td>Praxair</td><td>OX M-E</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Schneider' s Drosophila Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21720024</td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184 실리콘 엘라스토머</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC0162601</td><td></td></tr><tr><td>이광자 현미경 Bruker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>침수 대물렌즈(20X)</td><td>Zeiss</td><td>421452-9800-000</td><td></td></tr></tbody></table>

초파리의 후각 회로 어셈블리의 타임랩스 이미징 연구를위한 explant 시스템

An Explant System for Time-Lapse Imaging Studies of Olfactory Circuit Assembly in Drosophila

~ 뉴런은 뇌의 적절한 기능에 필수적인 회로를 형성하기 위해 정확하게 상호 연결되어 있습니다. Drosophila 후각 시스템은 안테나와 상악 마비의 50 가지 유형의 후각 수용체 뉴런 (ORNs)이 안테나 엽의 50 식별 가능한 사구체에 축색돌기를 투사하고 50 가지 유형의 이차 프로젝션 뉴런 (PN)의 수상 돌기와 시냅스 연결을 형성하기 때문에이 과정을 조사하는 훌륭한 모델을 제공합니다. 이전의 연구는 주로 고정 된 조직을 사용하여 후각 회로에서 정확한 표적화를 조절하는 중요한 분자를 확인하는 데 중점을 두었습니다. 여기에서는 문화에서 후각 회로 조립의 주요 발달 이정표를 되풀이하는 안테나 - 뇌 explant 시스템이 설명됩니다. 외부 큐티클을 해부하고 번데기 뇌를 덮고있는 불투명 한 지방체를 청소함으로써 살아있는 뇌에서 단일 뉴런의 고품질 이미지를 이광자 현미경을 사용하여 수집 할 수 있습니다. 이를 통해 살아있는 조직으로부터 단일 ORN 축삭 표적화의 타임랩스 이미징이 가능합니다. 이 접근법은 이전에 확인 된 중요한 유전자의 중요한 세포 생물학적 맥락과 기능을 밝히고 회로 조립의 동적 과정을 뒷받침하는 메커니즘을 식별하는 데 도움이됩니다.

ORN 축삭은 18 h와 36 h APF 사이의 안테나 엽에 도착합니다. 그런 다음 안테나 엽을 탐색하고 미드 라인을 건너 사구체를 신경질합니다. 비디오 1은 24시간 동안 매 20분마다 촬영된 여러 개의 개별적으로 식별 가능한 축삭에 대한 전체 과정을 보여주는 대표적인 비디오 입니다. TurboReg를 사용하여 등록하기 전에, 축삭은 뇌가 발달함에 따라 측면 표류를 나타냅니다 (비디오의 전반부). 등록 후 표류가 수정됩니다 (비디오의 후반부).
동일한 외식편으로부터 몇 개의 ORN 축삭을 분리하기 위해, 한 가지 예가 그림 5에 도시되어 있다. 단계 4.3의 절차에 따라, 도 5A에 도시된 외래식으로부터 VA1d 및 VA1v 축삭을 추출하여 이들 두 축삭만을 갖는 새로운 z 스택 이미지를 생성하였다(도 5...

이 프로토콜은 후각 회로 어셈블리의 연구를 위한 안테나-뇌 explant 시스템의 해부 절차, 배양 조건 및 라이브 이미징을 기술한다.

초파리의 후각 회로 어셈블리의 타임랩스 이미징 연구를위한 Explant 시스템

~Neurons are precisely interconnected to form circuits essential for the proper function of the brain. The Drosophila olfactory system provides an ...

이 프로토콜은 살아있는 이미지, 발달하는 두뇌에서 단일 축삭 수준에서 후각 회로 어셈블리를 비행하는 방법을 제시합니다. 개발 뇌를 덮고있는 조직을 청소하기 위해 해부, 우리는 내부 뇌에서 고품질의 이미지를 수집 할 수 있습니다. 이 방법은 회로 개발의 세포 생물학적 기초에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다.다른 회로의 개발을 연구하기 위해 쉽게 수정할 수 있습니다. 사람이 미세 해부에서 안정적인 손 제어를 수행하는 데는 약간의 시간이 걸립니다. 더 많은 연습이 도움이 될 것입니다.먼저 페트리 접시의 바닥면에 0.5cm 두께의 실가드를 깔고 상온에서 48시간 동안 경화시켜 타임랩스 이미징 동안 외식편을 동원하기 위한 배양 접시를 준비한다. 포셉을 사용하여 이 플레이트에 explant를 고정시키기 위한 마이크로 핀을 준비하려면 한쪽에 날카로운 끝이 정렬된 테이프에 여러 개의 마이크로 핀을 붙이고 가위로 두 밀리미터의 날카로운 끝을 자릅니다. 그런 다음 포셉을 사용하여 절단 된 마이크로 핀을 미리 만들어진 Sylgard 플레이트의 Sylgard 층에 삽입하십시오.브러시를 사용하여 한 시간 안에 번데기를 형성하는 흰 번데기를 모아 새 약병으로 옮깁니다. 번데기를 섭씨 37도에서 40분 동안 템퍼링된 수조에서 인큐베이션하여 무작위 유형으로부터 희소 ORN 클론을 유도한다. 열 충격 후, 바이알을 섭씨 25도에 30 시간 동안 두어 번데기 형성 후 30 시간 동안 번데기가 숙성됩니다.그런 다음 텍스트 원고에 설명 된대로 explant를위한 배양 배지를 준비하고 섭씨 네 도에 보관하십시오. 이미징 당일, 태아 소 혈청, 인간 인슐린 원액 및 에탄올에 용해된 20개의 하이드록시에크디손 원액을 슈나이더 초파리 배지 45밀리리터가 들어있는 50밀리리터 바이알에 첨가한다. 잘 섞어서 전체 매체 15 밀리리터를 새로운 50 밀리리터 원뿔형 튜브로 옮기고 나머지 전체 매체를 섭씨 4도에 일주일 동안 보관하십시오.이어서, 전체 배지를 함유하는 튜브 개구부를 파라핀 필름으로 덮고, 20 내지 30분 동안 초당 하나의 기포의 속도로 멸균된 오밀리리터 피펫 팁을 통해 액체 표면 아래에 산소 버블을 펌핑함으로써 배지를 산소화한다. 다음으로, 해부 우물 표면을 살균하고 이전에 준비된 Sylgard 플레이트를 70 % 에탄올로 소독하고 사용 전에 건조시킵니다. 브러시를 사용하여 30 시간 APF 번데기를 티슈 페이퍼로 옮겨 번데기의 외부 표면을 5 분 동안 건조시킵니다.유리 슬라이드에 양면 테이프를 적용한 후 말린 번데기를 등쪽이 위쪽을 향하게하여 테이프의 끈적 끈적한 표면에 조심스럽게 부착했습니다. 번데기를 브러시로 부드럽게 눌러 번데기를 손상시키지 않고 복부 측면을 테이프에 올바르게 부착하십시오. 갈색 번데기 케이스와 번데기 사이에 포셉의 날카로운 팁 하나를 옆쪽에서 삽입하고 번데기의 후부 끝까지의 선을 통해 갈색 번데기 케이스를 조심스럽게 부수십시오.갈색 번데기 케이스가 열리면 포셉을 사용하여 번데기를 부드럽게 잡고 산소가 함유 된 전체 배지 한 밀리리터가 들어있는 해부 우물로 옮깁니다. 번데기를 배지에 담그고 우물 바닥에 가라 앉히십시오. 번데기에서 안테나 뇌를 해부하려면 한 손으로 포셉을 사용하여 번데기를 부드럽게 잡고 한 쌍의 미세 가위를 사용하여 번데기 안쪽에 높은 압력을 방출하는 번데기의 뒤쪽에서 작은 구멍을 만듭니다.구멍에서 시작하여 복부 미드 라인을 통해 목까지 자른 다음 목의 둘레를 잘라 번데기의 몸에서 머리를 분리하고 몸을 다른 우물에 놓습니다. 다음으로, 뇌의 등쪽을 덮고있는 투명한 큐티클을 잘라 뇌의 상부에 지방체를 노출시켜 망막과 안테나가 부착 된 큐티클을 유지하고 유사하게 뇌의 복부 쪽에서 큐티클을 자릅니다. P10 피펫을 사용하여 머리의 등쪽 및 복부 측면의 열린 영역을 향해 매체를 피펫하여 뇌와 안테나를 덮고있는 지방체를 부드럽게 씻어냅니다.PN 수상 돌기 표적화에 대한 양측 ORN 축삭 또는 ORN 축삭의 상호 작용을 연구하기 위해, 큐티클과 뇌 사이에 미세 가위의 블레이드를 조심스럽게 배치하고 관심있는 안테나 신경을 절단하여 단계 동안 안테나 신경을 절단하십시오. 해부된 explant를 Sylgard 플레이트로 옮기려면 산소가 공급된 전체 배지의 약 200 마이크로리터 물방울을 Sylgard 표면에 놓습니다. 해부된 트렁크로부터 유래된 지방체를 200 마이크로리터 피펫 팁을 통해 여러 번 피펫 내부 표면을 코팅하여 해부로부터 실가드 플레이트 상의 배지 액적으로 이송하는 동안 외식편이 피펫 팁에 달라붙는 것을 방지한다.포셉을 사용하여 두 개의 광학 로브의 Sylgard 층에 explant를 고정시킨 다음 Sylgard 플레이트를 이미징 스테이션에 조심스럽게 배치하고 테이프로 플레이트를 고정시킨 다음 P1000 피펫을 사용하여 산소가 공급된 전체 매체 10밀리리터를 Sylgard 플레이트에 천천히 추가합니다. ORN 축삭은 18 시간에서 36 시간 APF 사이에 안테나 엽에 도착한 다음 안테나 엽을 탐색하고 미드 라인을 건너 사구체를 혁신합니다. 등록 전에, 축삭은 뇌가 발달함에 따라 약간의 측면 표류를 나타 냈고, 등록 후 표류가 수정되었습니다.추출된 ORN 축색돌기의 사구체 동일성은 뉴로필 마커 및 카데린의 면역염색에 의해 밝혀졌다. 내부 엽 지도와 비교함으로써, 각 사구체의 정체가 결정될 수 있었다. 생체외 배양 동안, 박테리아 성장은 보통 후각 회로의 휴식 발달을 일으킨다.따라서 영상화 전에 문화용 접시와 핀을 철저히 살균하고 영상실을 깨끗하고 격리된 상태로 유지하는 것이 중요하다. 더 높은 공간 시간 분해능을 달성하기 위해,이 explant 시스템은 적응 광학 격자 광 현미경 인 고급 현미경을 사용하여 이미징 할 수 있습니다. 공장 회로 개발이 예로 여기에 표시되었지만,이 시스템은 잠재적으로 개발 중추 뇌의 다른 회로 및 발달 과정에 대한 연구로 확장 될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

Mesoscopic 형광 tomography는 조직 sectioning 형광 현미경의 침투 제한없는 운영하고 있습니다. 이 기술은 다중 투영 조명 및 광자 수송 설명을 기반으로합니다. 우리의 morphogenesis의 인 - 생체내 전체 - 몸 3D 시각화 GFP - 표현에 날개 imaginal 디스크를...

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서브 세포 해상도 손상 Drosophila의 애벌레의 생체내 이미징에서

이 비디오는 초파리 유충의 뇌 이식 부위를 해부하고 장착하는 방법을 보여줍니다. 안구 디스크에 부착된 중추신경계(CNS)를 유충에서 추출한 다음 생리식염수 용액의 유리 슬라이드에 장착합니다.

초파리 유충 뇌 이식의 해부 및 장착

출처: Ing-Esteves, S. &amp; Lefebvre, J. L. 유전적으로 표적화된 망막 세포 집단의 희소 아데노 관련 바이러스 라벨링을 사용한 뉴런 수목화의 타임랩스 이미징. J. Vis. Exp. (2021)이 비디오는 살아있는 쥐 망막 외식식물에서 수지상 역학을 시각화하기 위해 컨포칼 현미경을 사용하는 방법을 보여줍니다. 컨포칼 현미경으로 망막을 안정화하고, 별이 터진 무축삭 중간뉴런을 시각화하기 위해 에피형광 이미징을 수행하고, 무축삭 수지상 형태의 변화를 모니터링하기 위해 타임랩스 3D 이미지를 캡처하는 단계를 간략하게 설명합니다.

마우스 망막 외식에서 뉴런 수지상 역학의 타임랩스 컨포칼 이미징

이 프로토콜은 그대로 애벌레 뇌의 맥락에서 라이브 세포 이미징을 수행하는 데 사용하는 효율적인 방법을 자세히 설명합니다. 라이브 세포 이미징 방식은 지속적으로 이전에 간과 된 메커니즘을 밝혀, 비대칭 신경 줄기 세포 분열의 연구뿐만 아니라 다른 신경 인성과 발달 과정에 대한 귀중한 있습니다.

의 라이브 영상<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레 Neuroblasts

이 프로토콜은 살아있는 초파리 번데기 눈 신경 상피를 이미징하는 효율적인 방법을 제시합니다. 이 방법은 조직의 움직임과 불균일한 토폴로지를 보상하고, 여러 GFP 태그가 지정된 접합 단백질을 사용하여 세포 경계의 시각화를 향상시키며, 쉽게 조립할 수 있는 이미징 장비를 사용합니다.

의 라이브 영상 초파리 번데기 눈

이 프로토콜의 목표는 ex vivo 초파리 애벌레 뇌 문화를 장기 형광 시간 경과 영상 분자 circadian 리듬을 모니터링 하기 위해 최적화 설정입니다. 이 방법의 약리학 분석 응용 프로그램 또한 토론 된다.

단일 셀 해상도 형광 애벌레 뇌 문화에 살고 있는 초파리 Circadian Clock의 이미징

이 프로토콜은 과일 파리가 변형을 겪으면서 Drosophila 복부 상피에서 세포 배향 및 조직 성장의 역학을 이미징 및 분석하기 위해 설계되었습니다. 여기에서 기술된 방법론은 Drosophila 또는 그밖 모형 유기체에 있는 다른 발달 단계, 조직 및 subcellular 구조물의 연구 결과에 적용될 수 있습니다.

푸팔 단계 동안 개발 초파리 에피텔리아에서 조직 방향 과 성장 역학의 이미징 및 분석

여기에서는 Drosophila 애벌레 뇌의 실시간 준비에서 매우 운동성 수지상 필로포디아를 이미지화하기 위해 사용한 방법과 수상돌기의 정량적 평가를 위해 시간 경과 3D 이미징 데이터 세트를 정량화하기 위해 개발한 프로토콜을 설명합니다. 신경 세포 개발에 역학.

초파리 뉴런 개발시 빠른 수지상 분지 역학의 시간 경과 라이브 이미징 및 정량화

여기에서 우리는 Drosophila 학습 및 기억의 맥락에서 pre-및/또는 후성 칼슘이 구상될 수 있는 프로토콜을 제시합니다. 합성 국소화 된 칼슘 센서를 사용하여 생체 내 칼슘 이미징은 이러한 유형의 연관 학습의 기초가되는 시냅스 가소성이 결정될 수 있도록 고전적인 후각 조절 패러다임과 결합됩니다.

초파리 멜라노가스터에서 학습 유발 시냅스 가소성의 생체 내 광학 칼슘 이미징

우리는 고정을 위해 국소 조직 접착제를 사용하여 초파리 유충 후각 뉴런에 대한 칼슘 이미징 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 안정성을 향상시켜 신뢰할 수 있는 생체 내 및 생체 외 실험을 용이하게 합니다. 맞춤형 R 스크립트는 칼슘 신호를 분석하여 상세한 신경생리학적 연구를 위한 효율적인 플랫폼을 제공합니다.

3령 초파리 멜라노가스터 유충에서 후각 회로 뉴런의 생체 내 및 생체 외 칼슘 이미징

배우세요 초파리 후각 회로 어셈블리의 타임랩스 라이브 이미징 방법을 단일 축삭 수준에서 관찰하는 기술입니다. 이 프로토콜은 신경 발달의 세포생물학적 기전을 이해하는 데 귀중한 통찰을 제공합니다.

초파리의 후각 회로 어셈블리의 타임랩스 이미징 연구를위한 Explant 시스템

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