Name: 집에서 만든 미니 생물 반응기에서 유도 만능 줄기 세포에서 뇌 오르간성 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: 배우세요 집에서 만든 미니 생물 반응기를 사용하여 유도 만능 줄기 세포에서 뇌 오르간성을 생성하는 방법을. 이 프로토콜은 중추신경계 질환 모델링과 약물 테스트에 활용할 수 있는 고품질 3D 뇌 조직을 대량 생산합니다.

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이 작품은 러시아 연방 과학 고등 교육부 (RT-PCR 분석)의 보조금 075-15-2019-1669 및 러시아 과학 재단 (다른 모든 작업에 대한)에서 19-15-00425 호를 지원했습니다. 저자는 또한 비디오 편집에 대한 그의 도움에 대한 파벨 벨리코프에게 감사드립니다. 원고의 수치는 BioRender.com 함께 만들어졌습니다.

참고 : 1.2 단계와 1.3 단계를 제외하고 프로토콜 전체에 멸균 기술을 사용합니다. 세포 나 오르가노이드에 적용하기 전에 모든 배양 매체와 솔루션을 37 °C로 따뜻하게하십시오. CO2 인큐베이터에서 80% 습도에 따라 5% CO2에서 37°C에서 세포를 재배합니다. 프로토콜 구성표는 그림 1에표시됩니다.
1. 페트리 접시를 미니 바이오 반응기로 변환
<ol><li>높이 7-8mm의 고리에 멸균 15 mL 원심분리기 튜브를 잘라; 링을 자동 복제합니다.</li>
	<li>낮은 접착, 치료되지 않은 또는 미생물 페트리 접시를 부스러기로 나누기. 액체 플라스틱을 준비하기 위해 밤새 10mL의 클로로포름에 플라스틱 부스러기 1 g을 녹입니다. 주의: 연기 후드에서 작업합니다.</li>
	<li>결과 액체 플라스틱이 파이펫팅에 충분히 점성이 있는지 확인하십시오. 그 드롭구형 형태를 유지하고 표면에 확산되지 않습니다. 매우 액체인 경우 플라스틱 부스러기를 더 추가합니다. 두꺼운 경우 클로로폼을 추가합니다.</li>
	<li>멸균 초저 접착 6cm 페트리 접시의 중앙에 플라스틱 손잡이를 만드십시오. 아래에 자세히 설명된 두 가지 적절한 방법이 있습니다.<ol>
<li>오토클레이브 플라스틱 링을 중앙에 놓고 액체 플라스틱을 링 안쪽에 놓습니다.</li>
		<li>플라스틱 링없이 페트리 접시의 중앙에 액체 플라스틱을 떨어 뜨립니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>건조될 때까지 라미나르 플로우 후드에 2-3시간 동안 요리를 열어 둡니다. 말린 요리는 15-20 분 동안 자외선으로 처리하십시오.</li>
</ol>2. iPSC의 신경 분화 유도
<ol><li>다능성 줄기 세포를 위한 매체에서 iPSCs를 35mm 페트리 접시에 세포외 단백질로 구성된 매트릭스로 미리 코팅하여 최대 75-90% 결합하도록 경배합니다.</li>
	<li>중간 크기 A-SR을 준비합니다. 자세한 내용은 표 1을 참조하십시오.</li>
	<li>재배 배지를 흡인하고 0일째에 A-SR 배지2mL를 첨가한다.</li>
	<li>중간 크기 A를 준비합니다(표 2참조).</li>
	<li>2-14일부터 2주 동안 중간 크기의 A에서 세포를 재배하고, 페트리 요리에 매번 상쾌한 매체를 재배합니다.</li>
</ol>3. 14일째에 신경피상전구체 세포에서 스페로이드형성
<ol><li>14일째되는 날, 각우물(도 2C)에약 1,200마이크로웰을 함유한 특수 24웰 배양판을 사용하여 신경전구체로부터 스페로이드를 만듭니다. 아래에 주어진 절차를 따르십시오. 참고 : 이 분화 단계에서 35mm 페트리 접시에는 보통 3 -3.5 x 106 신경 전구체 세포가 들어 있습니다. 따라서, 신경전구체 세포를 가진 35mm 페트리 접시 1개는 마이크로웰이 있는 24웰 배양판의 3-4웰에 충분합니다.</li>
	<li>마이크로웰이 장착된 24웰 배양 판을 준비: 각 웰에 1mL의 중간 A. 원심분리기를 1,300 x g에 5분 간 간단히 추가합니다. 마이크로웰에 거품이 없다는 현미경의 밑에 통제합니다.</li>
	<li>중간 값 B(표 3)를준비합니다.</li>
	<li>신경 피상화 전구체 세포와 페트리 접시에서 배지를 제거; DMEM/F12의 2mL로 셀을 세척합니다. 세포 분리의 경우, PBS에서 제조된 0.48 mM EDTA 용액의 1.5mL로 세포를 치료한다. 현미경의 밑에 세포 분리를 통제합니다.</li>
	<li>세포를 15mL 튜브로 수확합니다. 세포를 세척하기 위해 튜브에 DMEM / F125 mL을 추가합니다. 원심 분리기 200 x g에서 5 분 동안. 중간 형 B의 2 mL에서 상체를 제거하고 세포를 다시 중단합니다.</li>
	<li>Trypan Blue 염색 및 혈종계에 의해 세포 농도 및 생존가능성을 확인하십시오. 총 1 x 106 실행 가능한 셀을 포함하는 데 필요한 서스펜션의 양을 계산합니다.</li>
	<li>마이크로웰이 있는 24웰 플레이트의 각 웰에 1 x 106 세포를 포함하는 세포 현탁액을 전달합니다. 중간 크기 B를 각 우물에 최대 2mL로 추가하고, 부드럽게 파이펫 셀을 여러 번 내리고, 원심분리기는 1분 동안 짧게 100 x g씩 미세웰에서 세포를 포획합니다. 참고: 웰당 셀 수는 1 x 106을초과해서는 안 됩니다. 그렇지 않으면, 이웃 마이크로웰에서 스페로이드퓨즈.</li>
	<li>세포가 마이크로웰에 고르게 분포되어 있다는 현미경의 밑에 확인하십시오. 세포가 고르지 않게 분포되는 경우 파이프팅 및 원심분리를 반복합니다.</li>
	<li>세포를 스페로이드로 집계할 수 있도록 밤새 플레이트를 배양합니다.</li>
</ol>4. 오르가노이드의 획득 및 재배
<ol><li>다음날 아침(15일)은 현미경으로 스페로이드의 품질을 확인합니다. 건강하다면 투명하고 매끄러운지 확인하십시오(그림2A,B). 각 우물에서 15mL 튜브로 스페로이드를 조심스럽게 수집하고, 스페로이드를 2-3분 동안 중력에 의해 침전한 다음 상체를 제거합니다.</li>
	<li>얼음에 동시에 해동 매트릭스의 스페로이드 2 mL에 추가합니다. 피펫팅으로 부드럽게 섞고 실온에서 30분 동안 배양합니다.</li>
	<li>매트릭스의 과잉을 세척하려면, 튜브에 중간 값 B. 파이펫을 부드럽게 추가 한 다음 100 x g에서1 분 동안 튜브를 원심 분리합니다. 참고: 스페로이드의 돌이킬 수 없는 응집을 피하기 위해 원심 분리의 시간과 속도를 초과하지 마십시오.</li>
	<li>상부체를 제거합니다. 튜브에 중간 B, 파이펫을 부드럽게 넣습니다. 스페로이드 현탁액을 2개의 미니 바이오 반응기로 분할하여 각각 4mL의 중간 B를 함유하고 있으며, 미니 바이오액터를 15cm 페트리 접시에 놓아 물의 증발을 방지하고 오염을 방지합니다.</li>
	<li>페트리 접시에 미니 바이오 리액터를 궤도 셰이커에 놓습니다. 70-75 rpm의 회전 속도로 오르가노이드를 재배합니다.</li>
	<li>16일째에 중간C(표 4)를준비한다.</li>
	<li>오가노이드를 15mL 튜브로 옮기습니다. 5 분 동안, 그들은 바닥에 떨어질 수 있도록, 슈퍼 나티를 흡인, 중간 C. 미니 생물 반응기에 오르가노이드를 반환의 5 mL을 추가. 참고: 투명하고 거의 보이지 않는 스페로이드를 잃지 않도록 주의하십시오.</li>
	<li>중간 C에서 2 주 동안 스페로이드를 재배하고 2 일마다 배지를 상쾌하게합니다. 이 2 주 말에, 다음 재배를 위해 미니 생물 반응기 당 약 100 스페로이드를 둡니다. 액체 질소의 동결 배지에 과도한 스페로이드를 동결합니다.</li>
	<li>30일째에 중간D(표 5)를준비합니다.</li>
	<li>성숙 배지인 중간 D로 재배 매체를 변경한다. 3 주 동안 2-3 일마다 재배 배지를 새로 고친 다음 BDNF 및 GDNF없이 중간 D를 사용합니다.</li>
</ol>

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</ol>

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설명된 프로토콜에는 균일한 크기의 고품질 오르가노이드생성을 허용하는 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 오르가노이드는 세포 수와 세포 성숙도에서 거의 동일한 스페로이드에서 증가합니다. 둘째, 집에서 만든 생물 반응기는 각 오르가노이드가 군중이나 함께 붙어 있지 않는 균일 한 환경을 제공합니다.
세포 의 질과 세포 성숙의 상태는 프로토콜을 수행하는 데 필수적이다. iPSC의 75-90% 합류에서 신경 분화를 시작하는 것이 중요합니다. 세포 밀도가 너무 낮은 경우 iPSC는 비 신경 방향으로 분화 할 수 있습니다. 신경 선조는 나중에 더 취약해지기 때문에 iPSCs의 신경 유도의 2 주를 초과하지 않는 것이 중요합니다. 분화 하는 동안, 세포와 오르가노이드는 정기적으로 신선한 매체와 함께 공급 되어야 기아 가 오가노이드 품질의 급격한 감소에 이르게 하기 때문에. 단기 휴식만 동적 재배에 허용됩니다.
프로토콜의 일부 수정이 허용됩...

인간 iPSC 유래 모델은 신경 발달 및 신경 퇴행성 질환1의연구에서 널리 사용된다. 지난 10 년 동안, 3D 뇌 조직 모델, 소위 뇌 오르가노이드, 본질적으로 전통적인 2D 신경 문화를 보완2. 오르가노이드는 배아 뇌의 3D 아키텍처를 어느 정도 재구성하고 보다 정확한 모델링을 허용합니다. 대뇌 피질3,4,5,소뇌6,중뇌, 전뇌, 시상하부7,8,9,해마10: 많은 프로토콜은 다른 뇌 영역을 나타내는 오르가노이드의 생성을 위해 게시된다. 인간 신경계 질환을 연구하기 위해 오르가노이드를 사용하는 여러 가지 예가있었다(11). 또한, 오르가노이드는 약물발견(12)에서 구현되었고 SARS-Cov-213,14를포함한 전염병 연구에 사용되었다.
뇌 오르가노이드는 직경이 최대 몇 밀리미터에 달할 수 있습니다. 따라서 오르가노이드의 내부 영역은 저산소증이나 영양실조로 고생하고 결국 괴사가 될 수 있습니다. 따라서, 많은 프로토콜은 특수 생물 반응기8,셰이커, 또는 미세 유체시스템(15)을포함한다. 이러한 장치는 고가의 세포 배양 매체의 대량을 요구할 수 있다. 또한 이러한 장비의 비용은 일반적으로 높습니다. 일부 생물 반응기는 재사용을 위해 살균하기 어렵게 만드는 많은 기계적 부품으로 구성됩니다.
대부분의 프로토콜은 동일한 iPSC에서 얻은 오르가노이드 간에 상당한 변동성을 생성하는 "배치 효과"16으로인해 어려움을 겪습니다. 이 가변성은 균일성을 요구하는 약물 검사 또는 전임상 연구를 방해합니다. 균일 한 크기의 오르가노이드를 선택할 만큼 충분히 오르가노이드의 높은 수율은 부분적으로이 문제를 해결할 수 있습니다.
시간 계수도 중요한 문제입니다. 마쓰이 외(2018)는 뇌 오르가노이드가 성숙도17에도달하기 위해서는 최소 6개월이 필요하다는 것을 보여주었다. Trujillo 외(2019)는 또한 전기생리활성이 6개월간의 재배 후18일후에만 오르가노이드에서 발생했다는 것을 입증하였다. 긴 오르가노이드 성숙 시간으로 인해 연구자들은 종종 이전 을 완료하기 전에 새로운 차별화를 시작합니다. 차별화의 여러 병렬 프로세스에는 추가 비용, 장비 및 실험실 공간이 필요합니다.
최근에는 19위에 언급된 문제를 주로 해결하는 미니 바이오반응기를개발했습니다. 이 집에서 만든 생물 반응기는 중앙에 플라스틱 노브가있는 초저 접착 또는 처리되지 않은 페트리 접시로 구성되어 있습니다. 이 플라스틱 노브는 셰이커의 회전에 의해 발생하는 페트리 접시의 중심에 오르가노이드의 혼잡과 그들의 응축을 방지합니다. 이 논문은 이 저렴하고 간단한 수제 미니 바이오 리액터가 어떻게 고품질의 뇌 오르가노이드를 대량으로 생성할 수 있는지 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>고급 DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>12634010</td><td>DMEM/F-12</td></tr><tr><td>AggreWell400</td><td>STEMCELL Technologies Inc</td><td>34425</td><td>마이크로웰이 있는 24웰 배양 플레이트</td></tr><tr><td>B-27 보충제</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>뉴런 보충제 B</td></tr><tr><td>GlutaMAX 보충제</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>200mM L-알라닐-L-글루타민</td></tr><tr><td>인간 BDNF</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-285</td><td></td></tr><tr><td>인간 FGF-2</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-839</td><td></td></tr><tr><td>인간 GDNF</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-290</td><td></td></tr><tr><td>녹아웃 혈청 교체</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td>혈청 교체</td></tr><tr><td>mTESR1</td><td>STEMCELL Technologies Inc</td><td>85850</td><td>다분화능 줄기 세포 배지</td></tr><tr><td>N2 보충제</td><td>Gibco</td><td></td><td></td>17502001</tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>신경 세포 유지를 위한 기저 배지</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Solution</td><td>Gibco</td><td>15140130</td><td></td></tr><tr><td>Plasmocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-mpt-1</td><td>Antimicrobials</td></tr><tr><td>Purmorphamine</td><td>EMD Millipore</td><td>540220</td><td></td></tr><tr><td>StemMACS Y27632</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-106-538</td><td>Y27632</td></tr><tr><td>StemMACS 도르소모르핀</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-466</td><td>도르소모르핀</td></tr><tr><td>StemMACS LDN-193189</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-106-540</td><td>LDN-193189</td></tr><tr><td>StemMACS SB431542</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-106-543</td><td>SB431542</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Versen 솔루션</td><td>Gibco</td><td>15040066</td> PBS&beta;-메르캅토에탄올 Gibco <td>31350010에서 0.48mM EDTA</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

집에서 만든 미니 생물 반응기에서 유도 만능 줄기 세포에서 뇌 오르간성 생성

Brain Organoid Generation from Induced Pluripotent Stem Cells in Home-Made Mini Bioreactors

iPSC 유래 뇌 오르가노이드는 신경계 및 약물 검진의 병리를 모델링하는 시험관 내 유망한 기술입니다. 이 기술은 최근에 등장했습니다. 아직 초기 단계에 있으며 아직 해결되지 않은 몇 가지 제한이 있습니다. 현재 프로토콜은 약물 발견 및 전임상 연구를 위해 오르가노이드를 얻는 것이 충분히 일관되지 않습니다. 오르가노이드의 성숙은 1 년까지 걸릴 수 있습니다, 동시에 여러 분화 프로세스를 시작하는 연구원을 밀어. 그것은 공간과 장비의 측면에서 실험실에 대한 추가 비용을 부과한다. 또한, 뇌 오르가노이드는 종종 중앙에 괴사 영역을 가지고, 이는 영양소와 산소 결핍으로 고통. 따라서, 대부분의 현재 프로토콜은 영양을 개선하기 위해 배양 매체에 대한 순환 시스템을 사용합니다.
한편, 오르가노이드 재배를 위한 저렴한 동적 시스템이나 생물 반응기는 없습니다. 이 논문은 컴팩트하고 저렴한 수제 미니 바이오 리액터에서 뇌 오르가노이드를 생산하기위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 대량으로 고품질 의 오르가노이드를 얻을 수 있습니다.

프로토콜 구성표는 그림 1에표시됩니다. 프로토콜에는 iPSC가 적어도 한 달 동안 뇌 오르가노이드로 분화된 5개의 미디어가 포함되어 있습니다. 차별화는 iPSC가 75-90%의합류(그림 2A,B)에도달한 후 시작되었다. 세포가 "로제트"(도2C)로클러스터되기 시작했을 때 중간 A에서 iPSC 재배의 일 10-11일에 신경을 향한 분화의 첫 징후가 관찰되었다. 14-15 일, iPSCs는 신경 상피 선조로 분화했습니다. 세포의 99%는 신경피상동맥 마커 SOX1에 양성이었고 만능 세포 마커 TRA-1-81 및 OCT4(보충도면 S1)를발현하지 않았다. 그런 다음 EDTA 함유 용액을 사용하여 세포를 수확하고 마이크로웰(그림2D)을함유한 특수 24웰 배양판으로 ...

여기에서 우리는 인간 유도한 다능성 줄기 세포 (iPSCs)에서 두뇌 유기체를 생성하기 위한 프로토콜을 기술합니다. 다량의 뇌 오르가노이드와 고품질의 뇌 오르가노이드를 얻기 위해, 우리는 집에서 만든 미니 생물 반응기를 사용합니다.

The iPSC-derived brain organoid is a promising technology for in vitro modeling the pathologies of the nervous system and drug screening. This technology ...

현재까지, 다능성 줄기 세포에서 분화된 대뇌 오르간노이드는 토착 인간 뇌 조직에 가장 가까운 시험관 3D 모델이다. 또한 대뇌 오르가노이드는 다양한 중추 신경계 병리학을 모델링하고, 약리활성 물질을 테스트하며, 재생 의학에도 사용하기에도 똑같이 적합합니다. 한편,이 기술은 여전히 개발의 초기 단계에있다.프로토콜은 골재를 획득하는 방법과 분화와 함께 추가 재배 방법에 따라 두 그룹으로 나눌 수 있다. 첫 번째는 시장 관 또는 플레이트와 같은 특수 저접착 장치에서 셰이커에서 가이너의 후속 성숙을 가진 재배 시간 및 분화 유도제에서 상이한 분화프로토콜 및 구성 방식을 포함한다. 또 다른 그룹은 특수 생물 반응기 사용을 포함한다.다양한 프로토콜의 분석은 오르가노이드가 순환 영양소 매체와 조건하에서 재배되어야한다는 것을 보여 주었다. 그러나 표준 크기 및 형태와 함께 organoid를 얻기위한 간단하고 저렴한 시스템의 부재는 프로세스를 확장하기 위한 이러한 장치의 개발이 필요합니다. 이 작업에서는 다량의 고품질 오르가노이드를 얻을 수 있도록 간단하고 저렴한 미니 바이오 반응기를 획득하고 테스트하는 방법을 설명합니다.멸균 15 밀리리터 원심분리기 튜브를 7밀리미터 높이 또는 8밀리미터 높이로 자릅니다. 링을 자동 복제합니다. 처리된 또는 미생물학적 페트리 접시에 대한 낮은 응집을 부스러기로 나누기.액체 플라스틱을 준비하기 위해 밤새 10 밀리리터의 클로로폼에 약 1 그램의 플라스틱 부스러기를 녹입니다. 멸균 울트라 저접착 6센티미터 페트리 접시의 중앙에 플라스틱 노브를 만드십시오. 두 가지 똑같이 적합한 방법이 있습니다.첫 번째, 중앙에 플라스틱 링에 오토 클레이브를 넣고 반지의 내부에 액체 플라스틱의 절반 밀리리터를 적용합니다. 두 번째, 어떤 플라스틱 반지없이 페트리 접시의 중심에 액체 플라스틱의 절반 밀리리터를 드롭. 전체 건조가 될 때까지 라미나르 플로우 후드에 2~ 3시간 동안 요리를 열어 둡니다.만능 줄기 세포를 위한 배지에서 유도된 다능성 줄기 세포를 육성하고, 35mm 페트리 접시에 최대 75 또는 90%의 결합을, 감기 덜베코 변형 이글 배지에 용해된 매트릭스로 미리 코팅된 및 피셔-12 배지. 중간 크기 A 플러스 혈청 교체를 준비합니다. 혈청 교체를 통해 배지에서 1일 동안 유도된 만능 줄기 세포를 육성한다.다능성 줄기 세포를 위한 배지를 분화의 제로일0에서 혈청 대체 배지로 변경한다. 준비 매체 A.환분2일에 중간 정도의 A로 변경합니다. 중간 크기 A에서 2 주 동안 세포를 재배하고 2 일마다 페트리 요리에서 중간 정도의 상쾌한 매체를 재배하십시오.14일째에는 각 웰에 약 1, 200 마이크로웰이 들어 있는 특수 24웰 배양판을 사용하여 스페로이드 형성을 시작합니다. 마이크로웰로 24웰 배양판을 준비합니다. 중간 크기의 1 밀리리터 에 추가, 원심분리기는 플레이트 홀더가 장착 된 스윙 버킷 로터에 5 분 동안 1, 300g에서 간단히 합니다.마이크로웰에 거품이 없다는 현미경의 밑에 통제합니다. 중간 크기의 B.페트리 접시에서 매체를 제거합니다. 세포 분리의 경우 PBS에서 제조된 1.5 밀리리터 EDTA 용액으로 세포를 치료하십시오.현미경의 밑에 세포 분리를 통제합니다. 세포를 15 밀리리터 튜브로 수확하십시오. 튜브에 5 밀리리터 혼합 덜벡코와 피셔 배지를 세포쪽으로 넣습니다.원심 분리기 200g에서 5 분 동안. 미디엄 B.의 2 밀리리터에서 상체및 재중단 세포를 제거하여 마이크로웰이 있는 24웰 플레이트의 각 웰에 10억 개의 세포를 함유한 세포 현탁액을 전달한다. 부드럽게 파이펫 셀을 여러 번 위아래로 부드럽게 피펫하고 원심분리기는 1분 동안 100g짧게 100g을 짧게 하여 마이크로웰에서 세포를 포획합니다.세포가 마이크로웰에서 균등하게 분포되는 현미경의 밑에 통제합니다. 스페로이드의 세포 응집용밤새 플레이트를 배양합니다. 다음날 아침인 15일, 건강하면 투명하고 매끄러운 스페로이드의 품질을 현미경으로 확인합니다.각 우물에서 15 밀리리터 튜브로 스페로이드를 조심스럽게 수집하고, 스페로이드를 2 분 과 3 분 동안 중력으로 침전한 다음 상체를 제거하십시오. 매트릭스의 스페로이드 2 밀리리터에 추가, 얼음에 해동 및 전 템포. 피펫팅으로 부드럽게 섞고 실온에서 30분 동안 배양합니다.매트릭스의 과잉을 세척하려면 중간 크기의 B.Pipette의 튜브 8 밀리리터를 부드럽게 추가 한 다음 100g에서 1 분 동안 튜브를 원심 분리합니다. 상부체를 제거합니다. 중간 크기의 B, 파이펫의 튜브 20 밀리리터에 추가한 다음 스페로이드 서스펜션을 미니 바이오 리액터로 분할합니다.그런 다음 미니 바이오 반응기를 15센티미터 페트리 접시에 넣고 물과 오염의 증발을 방지합니다. 페트리 접시에 미니 바이오 리액터를 궤도 셰이커에 놓습니다. 회전 속도 70, 75rpm에서 오르가노이드를 재배합니다.16일째에는 중간 C.Transfer 오가노이드를 50밀리리터 튜브로 준비합니다. 5분 동안 바닥에 떨어지게 합니다. 수퍼네티드를 흡습하고 중간 C.의 5 밀리리터를 추가하여 미니 생물 반응기에서 오르가노이드에 다시 참여합니다.중간 C에서 2 주 동안 스페로이드를 재배하고 2 일마다 배지를 상쾌하게합니다. 이 2 주 동안, 다음 재배를 위해 미니 생물 반응기 당 약 100 스페로이드를 선택합니다. 30일째에, 성숙배지인 중간D로 중간D를 준비한다.3 주 동안 2 또는 3 일마다 재배 배지를 새로 고칩니다. 그런 다음 F 및 GDNF에 용해된 배지 D를 사용합니다. 중간 A 와 B에서 연속 재배 의 1 개월 후, 크기와 형태에 표준화 된 오르가노이드를 얻을 수 있습니다.성장함에 따라 매체를 더 자주 변경해야 하며, 일주일에 최대 4회까지 증가합니다. 재배 2 개월 후, 그들은 직경 4 및 5 밀리미터에 도달합니다. 그리고 또 다른 달 후, 5 및 6 밀리미터 와 성장 중지.그림은 헤마톡신과 에오신으로 그려진 오르가노이드 효소, 명확한 섹션의 모양을 보여줍니다. 1개월 동안의 면역집중화학적 분석은 내부 중앙 부분을 포함한 전구 세포의 SOX2 양성 클러스터의 존재를 나타낸다. 오르가노이드의 말초에서, 글리아 피동산성 단백질, 마이크로투알 관련 단백질 2, 티아진 하이드로라제 양성.세포는 뉴런의 성숙한 형태에 해당하는 농축된다. 어떤 경우에는 괴사 부위에 흰색 클러스터가 중앙 부분에 형성됩니다. 이는 더 큰 오르가노이드를 얻기 위한 이 프로토콜의 한계를 나타냅니다.가장 가능성이, 성장의 제한 요소는 영양소와 산소의 확산의 속도. 다양한 미디어 및 세포 유형의 스페로이드및 일부 종류의 오르가노이드에 대한 우리의 시스템을 테스트합니다. 많은 뇌와 망막, 간 암종 세포와 중간 엽 줄기 세포에서 결합 된 오르가노이드, 자본 폭발 중간 엽 줄기 호출및 유도 된 다능성 줄기 세포및 장 오르가노이드에서 분화되는 조혈 줄기 세포에서 결합 된 오르가노이드.세포의 초기 조성에서 변수였습니까? 분화 인자, 배양 및 중간, 세포외 매트릭스 및 가스 혼합물 조성물, 플랫폼 회전속도 및 기타 파라미터. 다양한 장기 및 조직에서 동일한 모양, 크기 또는 형태학적 모델로 오르가노이드를 얻을 수 있을 것입니다.이 작업에 제안 된 미니 생물 반응기의 사용.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 비디오는 유도 만능 줄기 세포에서 인간 뇌 오가노이드를 생성하는 방법을 보여줍니다. 그것은 신경권이 어떻게 다른 세균층의 형성을 억제하는 신경외배엽층을 형성하는지 보여줍니다. 신경구는 3D 젤 매트릭스에 내장되어 신경 상피 새싹을 형성합니다. 오가노이드 배지로 배양하면 이러한 신경 상피 새싹은 특정 뇌 영역으로 분화되어 성숙한 뇌 오가노이드를 형성합니다.

인간 뇌 오가노이드를 생성하는 체외 방법

이 동영상은 유도만능줄기세포(iPSC)에서 대뇌 오가노이드를 생성하는 분석을 보여줍니다. 인간 iPSC는 배아체(EB)를 형성하도록 유도됩니다. EB는 유도 배지를 사용하여 고분자 골격 위에서 배양되어 신경 줄기 세포, 전구 세포 및 미성숙 뉴런으로의 분화를 촉진합니다. 마지막으로, EB는 매트릭스에 삽입되어 대뇌 오가노이드 형성을 위한 유지 배지로 전달됩니다.

유도 만능 줄기 세포 유래 대뇌 오가노이드 생성

이 동영상은 일회용 3D 바이오리액터를 사용하여 유도만능줄기세포(iPSC)에서 성숙한 소뇌 오가노이드를 생성하는 기술을 보여줍니다. 바이오리액터는 iPSC 응집체 형성을 촉진한 다음, 성장 인자와 케모카인이 풍부한 일련의 배양 배지로 처리하여 iPSC 응집체가 성숙한 소뇌 오가노이드로 분화되도록 유도합니다. 그 후, 오가노이드를 수확하고 추가 분석을 위해 동결 보존합니다.

Single-Use Bioreactors를 사용하여 유도 만능 줄기 세포에서 성숙한 소뇌 오가노이드 생성

대뇌 organoids 초기 인간의 두뇌 개발에서 체 외에서조사 하는 새로운 모델 시스템을 나타냅니다. 이 문서는 효율적으로 중요 한 특성 및 유효성 검사 단계를 포함 하 여 인간 유도 만능 줄기 세포에서 균질 등 개 형 organoids를 생성 하는 상세한 방법론을 제공 합니다.

인간에서 표준화 되 고 재현 가능한 개 타입 대뇌 Organoids의 생성 유도 만능 줄기 세포

이 프로토콜은 여전히 뇌 세포 유형과 세포 조직의 많은 기능의 다양성을 유지하면서 외인성 성장 인자 또는 지하 막 매트릭스없이 단순화, 저렴한 비용으로 뇌 오르가노이드를 생산하는 수단으로 생성되었다.

인간 배아 줄기 세포에서 뇌 오르가노이드를 생성하기위한 정적 자기 지향 방법

이 프로토콜은 인간 다능성 줄기 세포의 제어된 크기 응집을 생성하고 단일 사용 생물 반응기를 사용하여 화학적으로 정의되고 피더가 없는 조건하에서 소뇌 유기체의 분화를 더욱 자극하는 동적 배양 시스템을 설명합니다.

인간 다능성 줄기 세포에서 성숙한 소뇌 오르가노이드의 확장 가능한 생성 및 면역 염색에 의한 특성화

이 프로토콜은 인간 만능 세포를 장내 오가노이드로 분화할 수 있습니다. 이 프로토콜은 세포를 최종 내배엽, 후장 내배엽 및 장 상피의 집단으로 분화하여 정상적인 인간 발달을 모방합니다. 따라서 이 프로토콜은 장 발달과 질병 모델링 응용 분야를 모두 연구하는 데 적합합니다.

발달 및 질병 모델링 응용 분야를 위한 hiPSC 유래 장 오가노이드 생성

당사는 2D 및 3D 인간 유도 다능성 줄기세포(hIPSC)의 생성 및 특성화에 대한 상세한 프로토콜뿐만 아니라 1차 실슘(PC) 생체 발생 및 기능의 질적 및 정량적 분석을 가능하게 하는 보완적 방법론을 제시합니다.

2D 및 3D 인간 유도 만능 줄기 세포 기반 모델은 신코르티컬 개발 중 1 차용성 개입을 해부합니다.

여기에서는 인간 만능 줄기 세포 유래 소장 및 결장 오가노이드를 생성, 유지 및 특성화하는 자세한 방법에 대해 설명합니다. 이러한 방법은 재현성을 개선하고, 확장성을 확장하며, 오가노이드의 도금 및 패시징에 필요한 작업 시간을 단축하도록 설계되었습니다.

인간 만능 줄기 세포 유래 장 및 결장 오가노이드의 생성, 유지 및 특성화

여기서, 우리는 자기 조직에 의하여 인간 다능성 줄기 세포를 사용하여 발달적으로 관련있는 인간 심장 오르가노이드 (hHOs)를 만드는 프로토콜을 기술합니다. 이 프로토콜은 발달 단서의 순차적 활성화에 의존하고 매우 복잡하고 기능적으로 관련된 인간 심장 조직을 생성합니다.

다능성 줄기 세포에서 파생된 자가 조립 인간 심장 오르가노이드 생성

이 프로토콜은 인간 만능 줄기세포를 사용하여 혈관 오가노이드를 생성하는 방법을 제시합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포(Human-Induced Pluripotent Stem Cells)에서 혈관 오가노이드 생성

배우세요 집에서 만든 미니 생물 반응기를 사용하여 유도 만능 줄기 세포에서 뇌 오르간성을 생성하는 방법을. 이 프로토콜은 중추신경계 질환 모델링과 약물 테스트에 활용할 수 있는 고품질 3D 뇌 조직을 대량 생산합니다.

집에서 만든 미니 생물 반응기에서 유도 만능 줄기 세포에서 뇌 오르간성 생성

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