Name: 아노펠스 감비아모기의 라발 살리보리 땀샘의 해부 및 면역스테인팅 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-30T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: 학습하세요 아노펠스 감비아모기 L4 라발 살리보리 땀샘의 해부 및 면역스테인팅 기법을. 이 방법은 땀샘 형태와 병원체 전달 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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우리는 안감비아애 애벌레에 접근하고 양육한 존스 홉킨스 말라리아 연구소에 감사드립니다.

1. 솔루션 및 도구 준비
<ol><li>해부 용액 의 준비<ol>
<li>해부 용액을 준비하려면 15 개의 플라스틱 튜브에 증류 된 H2O의 7.5 mL에 100 % 에탄올2.5 mL을 추가하십시오. 튜브를 3번 반전하여 섞습니다. 참고: 이 솔루션은 몇 주 동안 실온에서 저장할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>10배 인산완충식염식염수(PBS) 재고 준비<ol>
<li>10x PBS 스톡을 준비하려면 17.8g Na2HPO4• 2H2O, 2.4 g KH2PO4,80g NaCl, 2g KCl을 800mL의 탈온화 수를 추가하십시오. 고체가 완전히 녹을 때까지 저어접시에 저어줄과 섞으세요. 최종 부피를 정수물로 1L로 조정합니다. 참고: 이 솔루션은 몇 달 동안 실온에서 저장할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1x PBS 준비<ol>
<li>멸균 유리 병에 H2O의 90 mL에 10 x PBS의 10 mL을 추가합니다. 뚜껑을 단단히 닫고 3배 반전하여 섞습니다. 참고: 용액은 몇 주 동안 4°C로 저장할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>고정의 준비.<ol>
<li>빙하 아세산 의 200 μL에 메탄올 600 μL을 추가합니다. 매번 솔루션을 신선하게 만드십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>퍼티 플레이트의 건설 (실리콘 고무로 채워진 조직 배양 접시)<ol>
<li>에폭시(1g)와 물(50mL)의 성분(1:50)을 섞어 페트리 접시에 붓습니다. 사용하기 전에 부품이 건조될 때까지 기다립니다. 참고: 일단 제작되면 퍼티 플레이트를 수년간 사용할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 글랜드 해부 (그림1A)
<ol><li>후기 L4 애벌레를 수집합니다(~10일 후 해치; 그림 2) 플라스틱 이송 파이펫을 사용하여 트레이를 먹이기에서. 참고 : 표준 모기 축산 및 애벌레 문화에 대한이 유용한 온라인 매뉴얼을 참조하십시오13.<ol>
<li>해부 현미경의 무대에 퍼티 플레이트를 놓고 퍼티 플레이트에 애벌레를 옮기. 참고: 초기 해부에 대한 애벌레를 알리쿼팅할 때 플라스틱 이송 파이펫을 사용하여 한 번에 ~10개의 애벌레를 슬라이드로 옮기는 것이 좋습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>10개의 애벌레와 는 별도로 해부 용액 한 방울(1:3 EtOH:H2O)을 퍼티 플레이트에 놓습니다.</li>
	<li>플라스틱 이송 파이펫 또는 일회용 유리 파이펫을 사용하여 L4 유충 1개를 25% EtOH 낙하에 넣습니다.</li>
	<li>집게 (#5),각 손에 하나씩, 그리고 지배적이지 않은 손으로 애벌레의 머리를 잡습니다. 지배적 인 손을 사용하여, 머리 바로 아래에 집게로 애벌레를 잡고 머리가 몸의 나머지 부분에서 분리하고 땀샘이 머리에 부착 된 상태로 유지되는 최소한의 일정한 힘으로 부드럽게 당깁니다. 애벌레 시체의 신체 부위를 버리십시오. 참고: 해부할 때 근처에 종이 타월을 놓아 애벌레 시체를 수집합니다.</li>
	<li>1.5 mL 마이크로 센심 분리기 튜브에서 1 x PBS의 1 mL로 머리 / 땀샘을 수집합니다. 부착된 헤드가 있는 ~40개의 해부된 땀샘에 PBS 1mL을 사용하십시오. 헤드/SG가 버퍼의 맨 아래로 가라앉을 때까지 기다립니다.</li>
</ol>3. 항체 염색에 대한 고정 (도1B)
<ol><li>유리 이송 파이펫을 사용하여 마이크로 센심 분리기 튜브의 상단에서 시작하여 끈적끈적한 모기 조직을 피하고 조직을 손상시키지 않고 가능한 한 많은 PBS 솔루션을 제거하십시오. 메탄올의 3:1 혼합물의 800 μL을 빙하 아세트산으로 바꿉니다. 튜브를 하룻밤 사이에 4°C로 놓습니다(권장 12-24시간; 19h 선호).</li>
	<li>다음 날, 용액을 배출하고 차가운 100 % 아세톤1 mL로 교체하십시오. 90 년대를 남겨주세요.</li>
	<li>아세톤을 제거하고 매번 1mL의 1mL로 조직을 세 번 부드럽게 헹구십시오. 참고: 샘플은 흐름과 함께 천천히 떠서 각 PBS 추가가 완료될 때까지 튜브 바닥으로 되돌아갑니다.</li>
</ol>4. 면역 염색 (그림1B)
<ol><li>1x PBS의 총 부피의 200 μL에서 적절한 희석(1:100)에 1차 항체(예를 들어, Rab11)를 추가한다. 파이펫 끝으로 튜브 내용물들을 부드럽게 소용돌이시다. 4 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.</li>
	<li>1차 항체 용액을 제거하고 1x PBS 1mL로 세 번 세척하십시오(파이펫 안팎으로 용액을 부드럽게 피펫으로 피펫).</li>
	<li>총 부피의 200 μL에 적절한 희석 (1:200)에 이차 항체 (Alex Fluor 488 염소 안티 토끼)를 추가합니다. 파이펫 끝으로 튜브 내용물들을 부드럽게 소용돌이시다. 실온에서 90분 동안 배양하십시오.</li>
	<li>나일 레드 (지질, 1 μg /μL의 5 μL) 및 / 또는 Hoechst (DNA, 1 μg /μL의 3 μL)와 같은 염료를 이 단계에서 PBS200 μL에 추가합니다. 실온에서 60분 간 추가로 배양합니다. 1x PBS로 3회 부드럽게 씻으십시오.</li>
</ol>5. 현미경 검사법을 위해 얼룩진 땀샘 장착 (그림1C)
<ol><li>피펫 200 μL 의 100% 글리세롤을 현미경 슬라이드에. 참고: 글리세롤은 점성이 있으므로 적절한 부피에 도달할 때까지 파이펫 팁을 액체에 둡니다. 100% 글리세롤로 곧장 들어갈 때 조직 수축이 관찰되지 않았습니다. 그러나, 연구원은 통해 갈 수 있습니다 30% 그리고 50% 글리세롤 튜브에 있는 글리세롤 세공 100% 글리세롤로 샘플을 이동 하기 전에.</li>
	<li>스테인드 헤드(슬라이드당 최대 20개)를 부착된 땀샘(다른 내부 구조와 함께)으로 소프트브러시(그림 3A)를사용하여 현미경 슬라이드로 옮긴다. 샘플을 유리 슬라이드를 따라 균등하게 분배되도록 분산합니다. 참고: 브러시로 커버 슬라이드에 땀샘을 증착할 때 집게를 사용하여 SGs를 부드럽게 방향을 지정하여 모두 동일한 방향으로 방향을 지정할 수 있습니다.</li>
	<li>해부 현미경으로 보고, 두 쌍의 집게를 사용하여 땀샘에서 애벌레 머리를 분리하고 두 조직을 반대 방향으로 조심스럽게 당깁니다. 참고: SG를 완전히 분리하는 것이 어렵기 때문에 머리를 제거하여 SGs 및 관련 내부 구조를 남깁니다. SGs가 다른 조직과 연관되어 있더라도 Hoechst 및 기타마커(그림 3B,C)로염색될 때 쉽게 인식할 수 있습니다.</li>
	<li>머리를 제거하고 버리고 각 SG에 대한 분리 프로세스를 반복합니다. 참고: 머리를 제거할 때 근처에 종이 타월을 설치하여 수집합니다.</li>
	<li>1.5mm 두께의 커버슬립을 상단에 부드럽게 놓고(기포를 피하십시오) 명확한 매니큐어로 밀봉합니다.</li>
	<li>4°C에 저장하여 방광 용기에 보관하십시오. 참고: 스테인드 땀샘의 준비된 슬라이드는 품질에 주목할 만한 변화 없이 최대 6개월에서 1년 동안 어둠 속에서 4°C로 보관할 수 있습니다. 글리세롤이 몇 달이 되면 누출되기 시작하면 커버슬립과 파이펫을 더 글리세롤에 들어 올려 구멍을 메웁니다.</li>
</ol>

<ol><li>World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. World Health Organization. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://apps.who.int/iris/handle/10665/337660">https://apps.who.int/iris/handle/10665/337660</a> (2020).</li>
<li>Feachem, R. G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+eradication+within+a+generation%3A+ambitious%2C+achievable%2C+and+necessary%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Malaria eradication within a generation: ambitious, achievable, and necessary.</a> Lancet. 394 (10203), 1056-1112 (2019).</li>
<li>Adolfi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+population+modification+gene-drive+rescue+system+in+the+malaria+mosquito+Anopheles+stephensi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi.</a> Nature Communications. 11, 5553(2020).</li>
<li>Kyrou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR-Cas9+gene+drive+targeting+doublesex+causes+complete+population+suppression+in+caged+Anopheles+gambiae+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes.</a> Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).</li>
<li>Rostami, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+gene+drive+technology+to+control+transmission+of+vector-borne+parasitic+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Parasite+Immunology%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 gene drive technology to control transmission of vector-borne parasitic infections.</a> Parasite Immunology. 42 (9), 12762(2020).</li>
<li>Bhatt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coverage+and+system+efficiencies+of+insecticide-treated+nets+in+Africa+from+2000+to+2017%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Coverage and system efficiencies of insecticide-treated nets in Africa from 2000 to 2017.</a> Elife. 4, 09672(2015).</li>
<li>Mellink, J. J., Vanden Bovenkamp, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+aspects+of+mosquito+salivation+in+blood+feeding+of+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Mosquito+News%22%5BJournal%5D)">Functional aspects of mosquito salivation in blood feeding of Aedes aegypti.</a> Mosquito News. 41 (1), 115(1981).</li>
<li>Ribeiro, J. M., Rossignol, P. A., Spielman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+mosquito+saliva+in+blood+vessel+location%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Role of mosquito saliva in blood vessel location.</a> Journal of Experimental Biology. 108, 1-7 (1984).</li>
<li>Yamamoto, D. S., Sumitani, M., Kasashima, K., Sezutsu, H., Matsuoka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+malaria+infection+in+transgenic+Anopheline+mosquitoes+lacking+salivary+gland+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Inhibition of malaria infection in transgenic Anopheline mosquitoes lacking salivary gland cells.</a> PLoS Pathogens. 12 (9), 1005872(2016).</li>
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<li>Jensen, D. V., Jones, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+the+salivary+glands+in+Anopheles+albimanus+Wiedemann+%28Diptera%2C+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Entomological+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">The development of the salivary glands in Anopheles albimanus Wiedemann (Diptera, Culicidae).</a> Annals of the Entomological Society of America. 50 (5), 40824(1957).</li>
<li>Chiu, M., Trigg, B., Taracena, M., Wells, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+cellular+morphologies+during+lumen+maturation+in+Anopheles+gambiae+larval+salivary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Diverse cellular morphologies during lumen maturation in Anopheles gambiae larval salivary glands.</a> Insect Molecular Biology. 30 (2), 210-230 (2021).</li>
<li>Benedict, M. Q. MR4. Methods in Anopheles research. Center for Disease Control. , Available from: 
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<li>Wells, M. B., Andrew, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salivary+gland+cellular+architecture+in+the+Asian+malaria+vector+mosquito+Anopheles+stephensi%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">Salivary gland cellular architecture in the Asian malaria vector mosquito Anopheles stephensi.</a> Parasites & Vectors. 8, 617(2015).</li>
<li>Wells, M. B., Villamor, J., Andrew, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salivary+gland+maturation+and+duct+formation+in+the+African+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Salivary gland maturation and duct formation in the African malaria mosquito Anopheles gambiae.</a> Scientific Reports. 7 (1), 601(2017).</li>
<li>Wells, M. B., Andrew, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anopheles+salivary+gland+architecture+shapes+plasmodium+sporozoite+availability+for+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Anopheles salivary gland architecture shapes plasmodium sporozoite availability for transmission.</a> mBio. 10 (4), 01238(2019).</li>
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<li>Imms, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+larval+and+pupal+stages+of+Anopheles+maculipennis%2C+meigen%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">On the larval and pupal stages of Anopheles maculipennis, meigen.</a> Parasitology. 1 (2), 103-133 (1908).</li>
<li>Favia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteria+of+the+genus+Asaia+stably+associate+with+Anopheles+stephensi%2C+an+Asian+malarial+mosquito+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Bacteria of the genus Asaia stably associate with Anopheles stephensi, an Asian malarial mosquito vector.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (21), 9047-9051 (2007).</li>
<li>Neira Oviedo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+salivary+transcriptome+of+Anopheles+gambiae+%28Diptera%3A+Culicidae%29+larvae%3A+A+microarray-based+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The salivary transcriptome of Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) larvae: A microarray-based analysis.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 39 (5-6), 382-394 (2009).</li>
<li>Linser, P. J., Smith, K. E., Seron, T. J., Neira Oviedo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbonic+anhydrases+and+anion+transport+in+mosquito+midgut+pH+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Carbonic anhydrases and anion transport in mosquito midgut pH regulation.</a> Journal of Experimental Biology. 212 (11), 1662-1671 (2009).</li>
<li>Linser, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slc4-like+anion+transporters+of+the+larval+mosquito+alimentary+canal%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Slc4-like anion transporters of the larval mosquito alimentary canal.</a> Journal of Insect Physiology. 58 (4), 551-562 (2012).</li>
</ol>

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

본 명세서에서 기재된 프로토콜은 Drosophila SG 해부 프로토콜 및 성인 모기 해부프로토콜(14,15,16)으로부터적응되었다. 그러나, 대부분의 마커는 성인 해부 및 SG 염색 방법을 사용할 때 지하 멤브레인(도시되지 않은 데이터)을 관통하지 않았다. 성인 프로토콜의 적응은 25% EtOH 용액에서 땀샘을 해부하고, MeOH와 빙하 아세트산의 조합으로 땀샘을 세척하고, 90 년대 아세톤 세척을 갖는 것을 포함했다. 원래 성인 프로토콜에서 성인 SG는 1x PBS14,15,16로해부되었다. 25% EtOH 솔루션에서 해부하여 SG를 보존하고 염색 기간 동안 손상을 방지했습니다. 초기 해부를 수...

말라리아는 2019년 1년에 거의 2억 3천만 건의 감염과 추정된 409,000명의 죽음을 일으키는 원인이 되는 중요한 공중 위생위협입니다. 사망자의 대부분은 사하라 사막 이남아프리카에 있으며, 곤충 벡터가 아노펠스 감비아인기생충 플라스모듐 팔시파룸에의해 발생하며, 이 비디오 데모의 주제입니다. 이 수치는 세기의 전환기 이후 연간 사망률이 현저한 감소(>300,000명 감소), 2000년부터 2015년까지 관찰된 질병 비율의 유망한 감소는 가늘어지며, 질병전염을제한하는 새로운 접근법의 필요성을 시사합니다 2. 말라리아를 통제하고 가능하게 제거하기 위한 유망한 추가 전략 중 CRISPR/Cas9 기지를 둔 유전자 편집 및 유전자 드라이브3,4,5를사용하여 모기 벡터 용량을 표적으로 하는 것입니다. 실제로, 질병전염감소에 가장 큰 영향을 미쳤던 모기 벡터(오래 지속되는 살충제 처리된 침대 그물의 확장된 사용을 통해)의 표적화이다 6.
여성 모기는 혈액 식사 도중 감염된 인간에게서 플라스모듐 게임토사이클을 취득합니다. 수정, 성숙, 미드구트 상피 통과, 인구 확장 및 헤모코엘 항비에 이어 수백 에서 수만 개의 플라스모듐 스포로조이트가 모기 SGs를 침범하고 구성 분비 세포의 분비 충치를 채웁니다. 일단 분비 구멍 안쪽에, 기생충은 침골 덕트에 직접 접근할 수 있고 이렇게 다음 혈액 식사에 새로운 척추 동물 호스트로 전송을 위한 태세입니다. SGs는 말라리아를 일으키는 산포로조이트를 인간 호스트에게 전달하는 데 중요하기 때문에, 실험실 연구에 따르면 SGs는 혈액 공급, 모기 생존 또는 fecundity7,8,9에필수적이지 않다고제안하며,전송 차단 측정을 위한 이상적인 표적을 나타냅니다. 성인 모기 SGs는 초기 pupal SG 히스토시스10을넘어 지속되는 애벌레 SGs의 "덕트 싹"잔재의 정교화로 형성되어 애벌레 SG가 성인 단계 질병 전염을 제한하는 중재를위한 이상적인 표적이됩니다.
SG 발달의 애벌레 단계를 특성화하면 형태와 기능적 적응에 대한 더 나은 이해를 개발할 뿐만 아니라 주요 SG 조절기의 유전자 편집을 통해 이 기관을 대상으로 하는 새로운 개입을 평가하는 데 도움이 될 수 있습니다. 애벌레 침샘 건축의 모든 이전 연구는 면역 염색 및 현대 이미징 기술10,11을선행하기 때문에, 우리는 다양한 항체 및 세포마커(12)를가진 타액 샘을 분리하고 염색하기위한 프로토콜을 개발하였다. 이 비디오는 공초점 화상 진찰을 위한 Anopheles 감비아E L4 애벌레에서 애벌레 SGs의 추출, 고정 및 염색에 이 접근을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; KH2PO4</td><td>Millipore 시그마</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Na2HPO4 &; 2H2O</td><td>밀리포어 시그마</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; NaCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>아세톤</td><td>Millipore 시그마</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>브러시 with soft bristles</td><td>Amazon (SN NJDF) 디테일 페인트 브러시 세트</td><td>B08LH63D89</td><td></td></tr><tr><td>커버 슬립 (22 x 50 mm)</td><td>VWR</td><td>48393-195</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (DNA)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>에틸 알코올 200 proof</td><td>Millipore Sigma</td><td>EX0276</td><td></td></tr><tr><td>Gilson Pipetman P200 피펫</td><td>Gilson</td><td>P200</td><td></td></tr><tr><td>빙하 아세트산</td><td>시그마 Aldrich</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>보석상 겸자, Dumont No. 5</td><td>Millipore 시그마</td><td>F6521</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Millipore 시그마</td><td>58221</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Millipore 시그마</td><td>1414209</td><td></td></tr><tr><td>매니큐어</td><td>아마존 (샐리 한센)</td><td>B08148YH9M</td><td></td></tr><tr><td>나일 레드 (지질)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>N1142</td><td></td></tr><tr><td>종이 타월 / 물티슈</td><td>ULINE</td><td>S-7128</td><td></td></tr><tr><td>페트리 플레이트 (퍼티 플레이트 만들기)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁</td><td>Gilson</td><td>팁 E200ST</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 전사 피펫</td><td>Fisher 과학적</td><td>S304671</td><td></td></tr><tr><td>일차 항체 (예: Crb, Rab11)</td><td>발달 연구 하이브리도마 은행(DSHB); Andrew Lab</td><td>Mouse anti-Crb (Cq4) 또는 Rabbit anti-Rab11</td><td></td></tr><tr><td>형광 태그가 있는 2차 항체 (예: Alexa Fluor 488 Goat-anti Rabbit)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>퍼티 플레이트용 실리콘 수지 및 경화제</td><td>Dow Chemicals - Ximeter Silicone</td><td>PMX-200</td><td></td></tr><tr><td>슬라이드, 한쪽 끝에 서리 덥음, VWR 라벨링용</td><td>20 X 50 mm</td><td>48393-195</td><td></td></tr><tr><td>밀 배아 Agglutinin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>W834</td><td></td></tr></tbody></table>

아노펠스 감비아모기의 라발 살리보리 땀샘의 해부 및 면역스테인팅

Dissection and Immunostaining of Larval Salivary Glands from Anopheles gambiae Mosquitoes

모기 침샘 (SGs)은 곤충 매개 병원체의 전송을 위한 필수 게이트웨이 기관입니다. 말라리아를 일으키는 원인이 되는 바이러스 및 Plasmodium 기생충을 포함하여 질병을 일으키는 에이전트는, SG 세포의 분비 구멍에 축적됩니다. 여기에서, 그(것)들은 후속 혈액 식사 도중 그들의 척추 동물 호스트에게 전송을 위한 태세입니다. 성인 땀샘이 초기 pupal SG 히스토시스를 넘어 지속되는 애벌레 SG 덕트 싹 잔재의 정교화로 형성됨에 따라, 애벌레 SG는 질병 전염을 제한하는 내정간섭을 위한 이상적인 표적입니다. 애벌레 SG 개발을 이해하면 형태학과 기능적응에 대한 이해를 높이고 이 장기를 대상으로 하는 새로운 개입 평가에 도움이 될 수 있습니다. 이 비디오 프로토콜은 Anopheles 감비아 모기에서 애벌레 SGs를 분리, 고정 및 염색하는 효율적인 기술을 보여줍니다. 25% 에탄올 용액으로 애벌레에서 해부된 땀샘은 메탄올 빙하 아세트산 혼합물에 고정되고 차가운 아세톤 세척이 뒤따릅니다. 인산염 완충식식염수(PBS)에서 몇 가지 헹구면 SG는 SG 발현 단백질에 대한 광범위한 마커 염료 및/또는 항세라로 염색될 수 있습니다. 애벌레 SG 절연을 위한 이 방법은 또한 시투 혼성화 분석, 그밖 전사 응용 프로그램 및 proteomic 연구 결과에 있는 조직을 수집하는 것을 이용될 수 있었습니다.

타액선은 4단계 유충에서 해부하기 가 비교적 쉽습니다. 남성과 여성 애벌레는 여성의 등쪽 흉부하지만 남성의 등쪽 흉부를 따라 빨간색 줄무늬에 의해 후반 L4 애벌레 단계에서 구별 될 수 있지만 남성(그림 2). 우리는 또한 안테나 형태가 성인 모기에서 이 구조에서 관찰된 다름과 유사한 여성 L4 애벌레(그림2)보다남성에서 훨씬 더 정교하다는 것을 관찰합니다. L4 단계 동안 상당한 전반적인 성장과 함께, 타액 선은 L412동안 루멘을 형성한다. Hoechst로 염색된 초기 L4 단계 유충에서 분리된 침샘은 좁은수축(도 3B,C)에의해 분리된 근위 및 탈모엽을 드러낸다. 성형 루멘은 가장 근접한 끝에 있는 타액 덕트에서 (도시되지 않음)에서 단상 엽을 통해 모든 방법을 확장합니다. 성형 루멘은 중후반...

성인 모기 침샘 (SG)은 바이러스와 기생충을 포함하여 모든 모기 매개 병원균을 인간 숙주에게 전염시키는 데 필요합니다. 이 비디오는 애벌레 (L4) 단계 Anopheles 감비아모기에서 SGs의 효율적인 격리와 추가 분석을 위한 L4 SGs의 준비를 보여줍니다.

Mosquito salivary glands (SGs) are a requisite gateway organ for the transmission of insect-borne pathogens. Disease-causing agents, including viruses and ...

곤충의 타액선은 많은 인간 질병을 전염시키는 데 필요합니다. 따라서 급여 선생물학에 대한 더 나은 이해가 질병 예방을 위한 기존 전략에 추가하는 데 도움이 될 것입니다. 이 기술은 우리가 후보자 규제 기관의 돌연변이가 모기 애벌레 침샘의 형태에 영향을 미치는지 신속하게 물어 볼 수 있으며 말라리아 기생충의 전송에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있습니다.모기 애벌레와 함께 일하는 처음 몇 번, 그들은 빠르게 움직일 때 파악하기가 어렵습니다. 연습을 할수록 더 좋습니다. 절차로 시작하는 것은 마리솔 루체티, 내 실험실에 대한 학부 연구 조수가 될 것입니다.실험을 시작하려면 해부 현미경의 단계에 변기 접시를 놓고 10 개의 모기 L4 애벌레를 변기 판에 옮기. 그런 다음 해부 용액 한 방울을 애벌레와 분리된 변기 판에 놓습니다. 집게를 사용하여 L4 애벌레 1개를 25%에탄올의 해부 용액 방울에 넣습니다.각 손에 숫자 5 개의 집게를 잡고, 지배적 인 손으로 머리 바로 아래에 집게로 애벌레를 잡고, 비 지배적 인 손으로 애벌레의 머리를 잡고, 부드럽게 최소한의 일정한 힘으로 머리를 당겨, 땀샘은 머리에 부착 남아있는 동안 몸의 나머지 부분에서 분리. 애벌레 시체의 신체 부위를 폐기한 후, 머리 또는 타액 땀샘을 PBS의 1밀리리터로 수집하고, 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로, 타액땀샘을 기다린 후 완충제의 바닥으로 가라앉습니다. 다음 날, 90 초 동안 차가운 100 % 아세톤의 1 밀리리터와 조직을 고정하기 위해 솔루션을 배출하십시오.아세톤을 제거한 후 PBS 의 1 밀리리터로 조직을 세 번 부드럽게 헹구십시오. 면역 염색을 위해, 적절한 희석에서 Rab 11과 같은 1차 항체를 PBS의 총 부피의 200 마이크로리터에 추가한다. 파이펫 끝으로 튜브 내용물들을 부드럽게 소용돌이시다.1차 항체를 4도에서 하룻밤 동안 배양한 다음 PBS의 1밀리리터에서 세 번 세척합니다. 그런 다음 총 부피의 200 마이크로 리터에, 적절한 희석에 보조 항체, 알렉사 플루어 488 염소 안티 토끼를 추가합니다. 내용기를 파이펫 팁과 혼합한 후, 나일 레드, Hoechst 와 같은 염료로 조직을 실내 온도에서 60분 동안 PBS20 마이크로리터로 배양한 다음 PBS로 세 번 세척합니다.피펫으로 100% 글리세롤의 200마이크로리터를 추가하고, 연약한 브러시를 사용하여 현미경 슬라이드당 부착된 땀샘과 내부 구조로 최대 20개의 염색된 헤드를 전달하여 현미경 슬라이드를 준비합니다. 헤드 샘플을 펴서 유리 슬라이드를 따라 고르게 분배합니다. 해부 현미경으로 보고, 조심스럽게 반대 방향으로 두 조직을 당겨 서 두 쌍의 포셉을 사용하여, 땀샘에서 애벌레 머리를 분리합니다.모든 샘플이 완료되면 1.5mm 두께의 커버 슬립을 슬라이드 위에 부드럽게 놓고 기포가 형성되는 것을 피한 다음 명확한 매니큐어로 슬라이드를 밀봉하십시오. 타액선은 4단계 애벌레에서 해부하기 가 비교적 쉽습니다. 남성과 여성 애벌레는 여성의 등쪽 흉부를 따라 빨간색 줄무늬로 늦은 L4 애벌레 단계에서 구별 될 수 있습니다.안테나 형태는 또한 더 정교하다, 여성 L4 애벌레에서보다 남성에서 볼 수 있듯이, 흰색 화살표를 지적, 왼쪽 이미지에 여성 안테나, 오른쪽에 남성 안테나. 초기 L4 단계 애벌레에서 분리 된 타액 선은 Hoechst로 얼룩진 좁은 수축으로 분리 된 근위와 황실 을 드러냅니다. 형성 루멘은 중후반 L4 애벌레의 면역 염색 된 황실 타액 선에서 검사되었습니다.분비 세포의 정색 영역, 형성 lumen을 둘러싼 강렬한 나일 붉은 얼룩을 했다, 구조 처럼 마이크로 빌리의 암시. Rab 11 염색은 근면, 정색 표면에 가깝게 관찰되었다. 시간이 지나면 한 걸음밖에 되지 않으며, 차가운 아세톤에 있는 조직의 90초 인큐베이션입니다.이 프로토콜은 최근에 개발되었지만 모기 침선에서 일하는 사람에게 도움이 될 것으로 기대합니다. 우리는 완전히 자주 사용할 것으로 예상.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

모기 midgut과 침샘 주요 항목과 Plasmodium falciparum과 뎅그열 바이러스 벡터 병원균에 대한 출구 점입니다. 이 동영상은 Aedes aegypti 모기 midgut과 침샘을 제거하기위한 해부 기술을 보여줍니다.

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인간 말라리아 기생충에 설치류 말라리아 기생충의 생활 주기 그리고 생물학의 눈에 띄는 유사성 때문에, 설치류 말라리아 모형은 말라리아 연구를 위해 필수불가결하게 되었습니다. 본 명세서에서, 우리는 야생형 및 형질전환 설치류 말라리아 종의 표현형 분석에 사용되는 가장 중요한 기술중 일부를 표준화하였다.

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말라리아 기생충의 모기 단계에 대한 상세한 조사는 효과적인 전송 차단 전략을 설계하는 데 중요합니다. 이 프로토콜은 전염성 있는 게임토세포를 효과적으로 배양한 다음 이러한 게임토세포에 먹이를 주어 P. falciparum의모기 단계를 생성하는 방법을 보여줍니다.

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성인 모기에 있는 배설 시스템의 Neuropeptides 및 그밖 규제기관의 활동을 공부하기

미세 주입 기술은 모기의 게놈에 외인성 유전자를 소개하는 데 필수적입니다. 이 프로토콜은 제임스 실험실에서 DNA 구조를 Anopheles 감비아아에 미세 주입하여 변형된 모기를 생성하는 방법을 설명합니다.

아노펠레 감비아에 배아를 위한 미세 주입 방법

세균에 의해 생산된 dsRNA의 경구 투여는, 예쁜꼬 마선충에서 일상적으로 사용되는 RNA 간섭(RNAi)에 대한 전달 방법으로서, 성인 모기에 성공적으로 적용되었다. 우리의 방법은 주사를 사용하지 않고도 강력한 역 유전학 연구 및 전송 차단 벡터 연구를 가능하게합니다.

성인 Anopheles 감비아 모기에 효과적인 경구 RNA 간섭 (RNAi) 투여

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Anopheles 모기의 정자 형성을 연구하기 위한 전체 장착 형광 In Situ 교잡

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장기 수준의 마이크로바이옴 분석을 위한 모기 난소, 중장 및 타액선 해부

학습하세요 아노펠스 감비아모기 L4 라발 살리보리 땀샘의 해부 및 면역스테인팅 기법을. 이 방법은 땀샘 형태와 병원체 전달 메커니즘 연구에 활용됩니다.

아노펠스 감비아모기의 라발 살리보리 땀샘의 해부 및 면역스테인팅

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