Name: Caenorhabditis elegans의 집계 정량화 자동화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-14T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: 학습하세요 Caenorhabditis elegans에서 폴리글루타민 응집체를 자동 정량화하는 고속 스크리닝 방법을 CellProfiler를 활용하여 신경퇴행성 질환의 프로테오스타시스 메커니즘을 연구하는 데 활용할 수 있습니다.

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이 연구는 국립 보건원 (1RO3AG069056-01)과 DMC에 대한 미국 전염병 학회 기금에 의해 지원되었습니다. 기금 제공자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할을하지 못했습니다. 원고를 교정해 주신 Czyz Lab 회원들에게 감사드립니다. 만화 수치는 BioRender 유료 라이센스를 사용하여 생성되었습니다.

<ol><li>Soto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unfolding+the+role+of+protein+misfolding+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Unfolding the role of protein misfolding in neurodegenerative diseases.</a> Nature Reviews Neuroscience. 4 (1), 49-60 (2003).</li>
<li>Fang, P., Kazmi, S. A., Jameson, K. G., Hsiao, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microbiome+as+a+modifier+of+neurodegenerative+disease+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">The microbiome as a modifier of neurodegenerative disease risk.</a> Cell Host & Microbe. 28 (2), 201-222 (2020).</li>
<li>Kundu, P., Blacher, E., Elinav, E., Pettersson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Our+gut+microbiome%3A+The+evolving+inner+self%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Our gut microbiome: The evolving inner self.</a> Cell. 171 (7), 1481-1493 (2017).</li>
<li>Sherwin, E., Dinan, T. G., Cryan, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+understanding+the+role+of+the+gut+microbiota+in+brain+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Recent developments in understanding the role of the gut microbiota in brain health and disease.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1420 (1), 5-25 (2018).</li>
<li>Mondal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+microfluidics+providing+high-resolution+and+high-throughput+screening+of+Caenorhabditis+elegans+poly-glutamine+aggregation+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model.</a> Nature Communications. 7 (1), 13023(2016).</li>
<li>Guisbert, E., Czyz, D. M., Richter, K., McMullen, P. D., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+tissue-selective+heat+shock+response+regulatory+network%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of a tissue-selective heat shock response regulatory network.</a> PLoS Genetics. 9 (4), 1003466(2013).</li>
<li>Silva, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screening+strategy+identifies+novel+regulators+of+the+proteostasis+network%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A genetic screening strategy identifies novel regulators of the proteostasis network.</a> PLoS Genetics. 7 (12), 1002438(2011).</li>
<li>Nollen, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNA+interference+screen+identifies+previously+undescribed+regulators+of+polyglutamine+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6403-6408 (2004).</li>
<li>Walker, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonization+of+the+Caenorhabditis+elegans+gut+with+human+enteric+bacterial+pathogens+leads+to+proteostasis+disruption+that+is+rescued+by+butyrate%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Colonization of the Caenorhabditis elegans gut with human enteric bacterial pathogens leads to proteostasis disruption that is rescued by butyrate.</a> PLOS Pathogens. 17 (5), 1009510(2021).</li>
<li>Goya, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probiotic+Bacillus+subtilis+protects+against+%CE%B1-Synuclein+aggregation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Probiotic Bacillus subtilis protects against α-Synuclein aggregation in C. elegans.</a> Cell Reports. 30 (2), 367-380 (2020).</li>
<li>Kumsta, C., Chang, J. T., Schmalz, J., Hansen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormetic+heat+stress+and+HSF-1+induce+autophagy+to+improve+survival+and+proteostasis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Hormetic heat stress and HSF-1 induce autophagy to improve survival and proteostasis in C. elegans.</a> Nature Communications. 8, 14337(2017).</li>
<li>Prahlad, V., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+circuitry+regulates+the+response+of+Caenorhabditis+elegans+to+misfolded+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Neuronal circuitry regulates the response of Caenorhabditis elegans to misfolded proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14204-14209 (2011).</li>
<li>Mohri-Shiomi, A., Garsin, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+signaling+and+the+heat+shock+response+modulate+protein+homeostasis+in+the+Caenorhabditis+elegans+intestine+during+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Insulin signaling and the heat shock response modulate protein homeostasis in the Caenorhabditis elegans intestine during infection.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (1), 194-201 (2008).</li>
<li>Hakim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WorMachine%3A+machine+learning-based+phenotypic+analysis+tool+for+worms%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">WorMachine: machine learning-based phenotypic analysis tool for worms.</a> BMC Biology. 16 (1), 8(2018).</li>
<li>Wählby, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+image+analysis+toolbox+for+high-throughput+C.+elegans+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">An image analysis toolbox for high-throughput C. elegans assays.</a> Nature Methods. 9 (7), 714-716 (2012).</li>
<li>Jones, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler+Analyst%3A+data+exploration+and+analysis+software+for+complex+image-based+screens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">CellProfiler Analyst: data exploration and analysis software for complex image-based screens.</a> BMC Bioinformatics. 9 (1), 482(2008).</li>
<li>CellProfiler: an open-source image analysis software. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.cellprofiler.org">http://www.cellprofiler.org</a> (2021).</li>
<li>Held, K., Ramage, E., Jacobs, M., Gallagher, L., Manoil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-verified+two-allele+transposon+mutant+library+for+Pseudomona+aeruginosa+PA01%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Sequence-verified two-allele transposon mutant library for Pseudomona aeruginosa PA01.</a> Journal of Bacteriology. 194 (23), 6387-6389 (2012).</li>
<li>Schulenburg, H., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+pathogen+avoidance+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The genetics of pathogen avoidance in Caenorhabditis elegans.</a> Molecular Microbiology. 66 (3), 563-570 (2007).</li>
<li>Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorodeoxyuridine+improves+Caenorhabditis+elegans+proteostasis+independent+of+reproduction+onset%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset.</a> PLoS One. 9 (1), 85964(2014).</li>
<li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FUdR+causes+a+twofold+increase+in+the+lifespan+of+the+mitochondrial+mutant+gas-1%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 132 (10), 519-521 (2011).</li>
<li>Haldimann, P., Muriset, M., Vígh, L., Goloubinoff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+novel+hydroxylamine+derivative+ng-094+suppresses+polyglutamine+protein+toxicity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The novel hydroxylamine derivative ng-094 suppresses polyglutamine protein toxicity in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (21), 18784-18794 (2011).</li>
<li>Shinn-Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wrapping+culture+plates+with+Parafilm+M%C2%AE+increases+Caenorhabditis+elegans+growth%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Wrapping culture plates with Parafilm M® increases Caenorhabditis elegans growth.</a> BMC Research Notes. 12 (1), (2019).</li>
<li>Alexander-Floyd, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+cell+type-dependent+effects+of+autophagy+on+polyglutamine+aggregation+revealed+by+natural+genetic+variation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Unexpected cell type-dependent effects of autophagy on polyglutamine aggregation revealed by natural genetic variation in C. elegans.</a> BMC Biology. 18 (1), 18(2020).</li>
<li>Moronetti Mazzeo, L. E., Dersh, D., Boccitto, M., Kalb, R. G., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+and+aging+induce+distinct+polyQ+protein+aggregation+states%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Stress and aging induce distinct polyQ protein aggregation states.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), 10587-10592 (2012).</li>
<li>Sink, R., Gobec, S., Pecar, S., Zega, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((False+positives+in+the+early+stages+of+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">False positives in the early stages of drug discovery.</a> Current Medicinal Chemistry. 17 (34), 4231-4255 (2010).</li>
</ol>

저자들은 이해 상충이 존재하지 않는다고 선언했다.

설명된 프로토콜은 오픈 소스 이미지 분석 소프트웨어인 CellProfiler 를 통합하는 C. elegans 배양, 이미징 및 이미지 처리 절차를 간략하게 설명합니다. 대표적인 결과는 재현성, 편향성 감소 및 확장성을 보여줍니다. 이 표준화 된 절차는 대규모 박테리아, 게놈 또는 약물 라이브러리와 함께 사용되는 스크리닝 전략을 향상시킵니다. 다른 자동화된 C. elegans 개체 감지 방법이 존재하지만, 설명된 기술은 배양, 이미지 획득 및 분석을 통합하는 표준화되고 더 높은 처리량의 파이프라인을 제공합니다.
웜 재배의 몇몇 변형은 본원에 기술된 프로토콜을 최적화하기 위해 시험되어야 했다. 초기에, 웜은 연령 동기화 직후(L1 단계) 즉시 샘플 박테리아로 옮겨졌다. 그러나 이러한 접근법은 동일한 우물 내의 웜들 사이에서도 다양한 크기의 웜 집단을 초래했습니다. C. 엘레간은 병원체 회피19로 알려져 있는데, 이는 관찰된 크기 변동성에 기여하고 궁극적으로 다운스트림 이미징-웜 검출에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 가변성을 제거하기 위해, 각 웰의 전체 NGM 영역을 테스트 박테리아로 덮었다. 또한, 웜은 대장균 OP50을 공급하고 25°C에서 48시간 동안 젊은 성인으로 완전히 발달하도록 허용하였다. 웜이 테스트 박테리아로 옮기기 전에 대장균 OP50에서 성인이 될 수 있도록 허용함으로써 신체 크기가 더 일관되게 유지되었습니다. 또한, 자손에 의한 과밀 및 급속한 식량 고갈은 NGM 한천에 FUDR을 보충함으로써 제거되었습니다. FUDR의 구현은 자손을 제거하고 부모 집단과 자손이 섞여서 가려진 자동화 된 웜 식별을 강화했습니다. 그러나 화합물이 C. elegans proteostasis 및 수명20,21에 영향을 미치는 것으로 알려져 있으므로 FUDR을 사용할 때는 신중하고 적절한 대조군을 사용하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜에 기술된 조건 하에서, FUDR은 장내 폴리Q 응집에 영향을 미치지 않았다 (보충 도 5); 따라서, 그의 활용은 기술된 방법에 적합하고 유익하였다.
이미징 전에 샘플을 동결하는 것은 파이프 라인의 성공적인 고용에 중요한 단계로 판명되었습니다. 동결 이전의 집계 카운트는 수동 카운트보다 상당히 높았습니다(그림 3B). 이미징 전에 웜을 -20°C에서 18-48시간 동안 유지하면 배경 형광이 감소하고 궁극적으로 응집체 검출이 개선되었습니다(그림 3A). 응집체 검출에 대한 동결의 효과는 polyQ에 대해서만 조사되었으며 그러한 효과에 대한 추가 조사 없이는 다른 모델로 일반화되어서는 안됩니다.
모든 조건이 동일하게 유지되었음에도 불구하고, 웜당 평균 응집체 수는 상이한 실행마다 변할 수 있는 반면, OP50으로 콜로니화된 동물의 응집체 수 대 MPAO1 사이의 비율은 일관되게 유지되는 것으로 관찰되었다(도 6, 보충 그림 2, 보충 그림 5). 따라서, 매 실행마다 대장균 OP50 대조군 또는 임의의 추가적인 적합한 기준 대조군을 항상 포함하는 것이 필수적이다. 실험 사이의 집계 카운트의 이러한 변동성은 환경 조건 (온도, 습도)22,23 또는 유전 적 배경8에 의해 영향을받을 수 있습니다. 실제로, 장기간 배양 후, 장 형광이 급격히 감소하거나 완전히 소실되는 것이 관찰되었고, 이는 냉동 스톡으로부터 새로운 균주를 해동시킬 필요가 있었다. 형광의 관찰된 감소는 polyQ를 발현하는 것과 같은 독성 전이유전자를 억제하는 유전적 변화의 결과일 수 있다. 그럼에도 불구하고, 상이한 실험자들 사이에서(보충 그림 2), 생물학적 반복실험 사이(도 5), 및 동일한 샘플 내(보충 그림 3) 사이에서 관찰된 결과의 예외적인 재현성은 이 접근법의 강도를 강조한다.
수많은 보고들이 프로테오스타시스9,11,12,13,24,25를 연구하기 위해 장내 polyQ를 사용했다. 그러나 실험 접근법과 판독 방법 간의 변동성으로 인해 결과 간의 직접적인 비교는 이루어질 수 없습니다. 그럼에도 불구하고, 이전에 공개된 데이터로부터의 몇몇 결과들은 응집(9,13) 및 대등한 수의 응집체(11)의 박테리아 유도를 포함하는 본원에 기술된 자동화된 정량화에 의해 재요약된다. 총체적으로, 설명 된 파이프 라인은 프로테오스타시스를 연구하는 데 유용한 도구를 제공합니다.
본원에 기재된 방법은 몇 가지 고유한 과제를 갖는다. 예를 들어, 이 프로토콜의 모든 구성 요소를 마스터하는 데 충분한 시간이 필요하며, 이는 특히 프로토콜의 섹션 8에 해당되며, 획득한 이미지가 파이프라인 분석에 적합한지 여부를 결정하기 위해 분석에 익숙해야 합니다. 이 프로토콜에 사용되는 이미지 획득 설정으로부터의 편차가 가능합니다. 그러나 설정 및 웜 학습 집합을 수정해야 할 수 있습니다. 이 파이프라인은 다양한 크기의 집계와 터치하는 집계를 구별할 수 있으므로 집계의 "혼합"을 제한하고 궁극적으로 감지 감도를 높일 수 있습니다. 그러나 허용된 크기 범위를 초과하는 큰 집계를 식별하려고 할 때 상위 크기 임계값을 확장하면 터치하는 집계를 구분할 수 없는 등의 식별 불량으로 인해 오류가 발생할 수 있으므로 문제가 발생할 수 있습니다. 이미지 분석 전에 정확도, 크기 및 강도 간의 균형을 찾아야 합니다. 집계 식별의 효율성은 기계 학습을 통합하여 집계 탐지를 향상시킬 수 있는 신경망을 생성함으로써 더욱 향상될 수 있습니다. 이러한 개선은 현재 탐구되고 있으며 다른 초점면에 놓여 있거나 비정상적인 모양을 가진 응집체의 탐지와 같은 현재 문제를 해결하는 데 크게 도움이 될 것입니다.
설명 된 방법의 한 가지 주목할만한 약점은 자동화 된 집계 수의 변동성인데, 이는 다른 박테리아 균주를 먹인 웜의 수동 카운트에 의해 항상 되풀이되는 것은 아니기 때문입니다. 예를 들어, 자동화된 카운트에 기초하여, P. aeruginosa 돌연변이체 53(M53)을 먹인 웜은 야생형 균주(MPAO1)에 비해 상당히 적은 응집체를 가졌다(도 7); 그러나 히트의 확인은 큰 차이를 보이지 않았다 (보충 그림 4). 일반적으로, 고처리량 약물 스크린은 높은 위양성 히트 검출률을 가지며, 기술된 방법은 예외는 아니다(26). 따라서 모든 잠재적 인 히트를 확인하는 것이 프로토콜의 중요한 부분입니다.
이 프로토콜은 숙주 프로테오스타시스에 영향을 미치는 박테리아를 확인하기 위한 스크리닝 전략에 맞게 최적화되었지만, 각 단계는 게놈 RNAi 라이브러리, 소분자 또는 다른 조건의 효과를 시험하기 위해 추가로 변형될 수 있다. 특정 스크리닝 전략의 요건에 맞게 각 단계에서 추가적인 수정이 이루어질 수 있다. 또한이 기술은 특정 모델에 맞게 각 단계를 최적화 할 수있는 수준의 유연성을 제공합니다. 예를 들어, 이러한 접근법은 다른 조직에서의 폴리Q 응집으로 확장되거나 유도성 형광 리포터(예를 들어, 열 충격 유전자)를 사용하여 유전자 발현을 모니터링하거나, 단백질의 세포내 국소화를 평가하고(예를 들어, DAF-16의 핵 국소화), 다른 질병 모델에서의 응집을 연구(Aβ1-42, α-synuclein, TDP-43 등) 또는 생리학적 표현형을 평가하는 것과 같은 이미지에서 검출된 다른 특징들을 추출할 수 있고, 웜 크기와 같은.

알츠하이머, 파킨슨병, 헌팅턴병과 같은 연령 의존적 신경퇴행성 단백질 형태 질환(PCD) 또는 근위축성 측삭 경화증은 응집, 세포 사멸 및 조직 변성을 유발하는 단백질 오폴딩을 특징으로 한다1. 단백질 미스폴딩이 범인으로 인식되지만, 이러한 질병의 병인은 명확하지 않습니다. 따라서 효과적인 치료법의 개발은 질병 발병 및 진행에 기여하는 요인과 상태에 관한 지식이 부족하여 방해 받고 있습니다. 최근 연구에 따르면 미생물의 변화는 PCD 2,3,4의 발병, 진행 및 중증도에 영향을 미친다고 합니다. 그러나 인간 또는 심지어 뮤린 미생물의 복잡성으로 인해 미생물이 숙주에 미치는 정확한 영향을 밝혀내는 연구를 수행하기가 어렵습니다. 따라서 Caenorhabditis elegans와 같은 더 단순한 유기체는 종종 발견 도구 5,6,7,8로 사용됩니다. 최근 연구는 숙주 프로테오스타시스 및 질병 병인에 대한 박테리아의 효과를 조사하기 위해 C. elegans를 고용했다 9,10. 박테리아 콜로니화, 호메시스 및 게놈 변화는 폴리글루타민(polyQ) 관로9,11,12의 응집에 영향을 미치는 예시적 조건 중 하나이다. 추가적으로, 이들 미스폴딩된 단백질 클러스터는 숙주 내에서 polyQ 길이- 및 연령-의존적 축적을 나타내며, 손상된 운동성 9,13과 연관된다. 형광 표지된 누자를 정량화하는 비교적 간단한 접근법은 단백질 폴딩 및 응집에 영향을 미치는 조건, 인자 또는 약물에 대한 중요한 데이터를 생성할 수 있다.
형광 누점의 정량화가 신뢰할 수 있고 비교적 간단한 절차로 입증되었지만, 단백질 응집에 영향을 미치는 화합물, 박테리아 또는 조건의 대규모 스크리닝을 용이하게하는 프로토콜을 개발하는 것은 여전히 과제입니다. 자동화 된 C. elegans 이미지 처리 및 누점 정량화의 개념은 많은 실용적인 지원 도구가 개발되었으므로 완전히 새로운 것은 아닙니다14,15. 그러나 컬쳐링, 이미지 획득 및 처리 파이프라인의 통합은 결과의 변동성을 제거하고 더 높은 처리량의 스크린을 허용하는 데 필수적입니다.
따라서이 원고의 의도는 프로테오스타시스의 변화를 탐지하기위한 프록시로서 C. elegans 에서 polyQ 응집을 정량화하는 데 사용되는 절차를 표준화하는 것입니다. 이 태스크는 자동화된 웜 및 집계 식별이 가능한 오픈 소스 이미지 분석 소프트웨어(16 )인 CellProfiler를 채용함으로써 달성되었으며, 웜을 배양하고, 이미지를 획득하고, 데이터를 처리하기 위한 더 큰 프로토콜에 통합된다.

<table><tbody><tr><td>1.7 mL 마이크로튜브</td><td>, Olympus Plastics</td>, <td>Cat#24-282</td><td>마이크로 원심분리기 튜브</td></tr>, <tr><td>10 mL 혈청학 피펫,</td><td>GenClone</td>, <td>Cat#12-104</td><td>플라스틱 피펫,</td></tr><tr><td>15 mL 원심분리기 튜브, 랙형</td><td>Olympus Plastics</td>, <td>Cat#28-101</td>, <td>원뿔형 튜브</td></tr>, <tr><td>5-플루오로-2&프라임;-데옥시우리딘</td>, <td>Fisher Scientific</td><td>D2235100MG</td><td>FUDR</td></tr><tr><td>Accu-jet Pro 피펫 컨트롤러</td><td>Genesee Scientific</td><td>91-600RB</td><td>피펫 건</td></tr><tr><td>한천</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat#BP1423-2</td><td>과립 한천</td></tr><tr><td>BioRender</td><td>BioRender</td><td></td><td>그래픽 피규어 생성기</td></tr><tr><td>표백제(일반)</td><td>클로록스</td><td>바# 044600324111, 스플래쉬 리스 표백제</td><td>4.5% 차아염소산나트륨</td></tr><tr><td>C. elegans: AM140: rmIs132 [unc-54p::q35::yfp]</td><td>Morimoto Lab (Northwestern University)</td><td>AM140, Q35::YFP</td><td>Muscle polyQ</td></tr><tr><td>C. elegans: AM738: rmIs297[vha-6p:: q44::yfp; rol-6(su1006)]</td><td>모리모토 연구실 (노스웨스턴 대학)</td><td>AM738, Q44::YFP</td><td>장 polyQ</td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat#C79-500</td><td>염화칼슘 이수화물</td></tr><tr><td>CellProfiler</td><td>Broad Institute</td><td></td><td>이미지 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>콜레스테롤</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat#ICN10138201</td><td>콜레스테롤</td></tr><tr><td>순환 수조 헤드</td><td>Lauda</td><td>26LE</td><td>Lauda E 100</td></tr><tr><td>CoolLED pE300lite 365 dir 마운트 STEREO</td><td>CoolLED</td><td>8114931</td><td>형광등 제어 및 이미터</td></tr><tr><td>16 mL 배양 튜브</td><td>Olympus Plastics</td><td>21-129</td><td>배양 튜브, 17 mm x 100 mm</td></tr><tr><td>대장균 OP50</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>OP50</td><td>E. coli control 균주</td></tr><tr><td>에탄올, 200 Proof</td><td>Decon Labs, Inc.</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>접안렌즈 10x/23B, 조정 가능, 3d gen</td><td>Leica Microsystems</td><td>10450910</td><td>접안 렌즈 세트</td></tr><tr><td>필터 세트 ET GFP - MZ10F</td><td>Leica Microsystems</td><td>10450588</td><td>필터 큐브</td></tr><tr><td>GraphPad Prism v9.2.0</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td></td><td>통계 분석 도구</td></tr><tr><td>Heratherm Incubator IMP180</td><td>Thermo</td><td>51031562</td><td>Refrigerated Incubator</td></tr><tr><td>Innova 4000</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>M1192-0000</td><td>Shaking incubator</td></tr><tr><td>K5 Camera</td><td>Leica Microsystems</td><td>11547112</td><td>Stereomicroscope camera</td></tr><tr><td>KH2P04</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat#P285-3</td><td>인산칼륨 일염기성</td></tr><tr><td>LAS X 이미징 소프트웨어</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>현미경 이미징 소프트웨어</td></tr><tr><td>Leica MZ10 F 광학 캐리어</td><td>Leica Microsystems</td><td>10450103</td><td>실체 현미경</td></tr><tr><td>Levamisole</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat#0215522805</td><td>Levamisole hydrochloride</td></tr><tr><td>Luria Broth (Lennox)</td><td>Apex Bioresearch Products</td><td>Cat#11-125</td><td>LB</td></tr><tr><td>자기 젓는 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-100-49S</td><td>젓는 접시</td></tr><tr><td>MgSO4&middot; 7H2O</td><td>Alfa Aesar</td><td>A14491</td><td>마그네슘 황산염 헵타하이드레이트</td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>Premiere</td><td>8205</td><td>단일 서리 현미경 슬라이드</td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 7H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat#S373-500</td><td>인산나트륨 이염기성 헵타하이드레이트</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat#S671-500</td><td>염화나트륨</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat#S318-3</td><td>수산화나트륨 펠릿</td></tr><tr><td>대물렌즈 Achromat, f = 100 mm</td><td>Leica Microsystems</td><td>10411597</td><td>대물렌즈</td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Genesee Scientific</td><td>Cat#32-107G</td><td>100 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa 돌연변이 도서관</td><td>Manoil Lab (University of Washington)</td><td></td><td>P. aeruginosa 돌연변이 라이브러리</td></tr><tr><td>현탁 배양 플레이트 24-Well, Flat</td><td>Bottom Olympus Plastics</td><td>25-102</td><td>벌레 성장 및 이미징에 사용</td></tr><tr><td>삼안 튜브 100% M 시리즈</td><td>Leica Microsystems</td><td>10450043</td><td></td></tr><tr><td>Trypticase, Peptone</td><td>ThermoFisher, Difco</td><td>Cat#211921</td><td></td></tr><tr><td>TX-400 Rotor</td>, <td>Thermo Scientific</td><td>Cat#75003181</td><td>Swing bucket rotor</td></tr>, <tr><td>진공 구동 필터 시스템</td>, <td>GenClone</td><td>Cat#25-227</td><td>500 mL, PES Membrane, .22 &micro; C</td></tr><tr>마운트 <td>Leica Microsystems</td><td>10447367</td><td>0.63x 카메라 어댑터 튜브</td><td>가 있는 M 비디오 대물렌즈</td></tr></tbody></table>

caenorhabditis elegans의 집계 정량화 자동화

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

신경 퇴행성 단백질 형태 질환 (PCD)의 유병률의 증가는 수년에 걸쳐이 주제에 대한 큰 관심을 불러 일으켰습니다. 이러한 관심의 증가는 PCD를 가진 인간에서 관찰 된 질병 표현형을 재현 할 수있는 동물 모델의 다양 화와 개선을 요구하고있다. 뮤린 모델은 매우 귀중한 것으로 입증되었지만 비용이 많이 들고 힘들고 처리량이 낮은 방법과 관련이 있습니다. PCD를 연구하기 위해 Caenorhabditis elegans 선충류 모델을 사용하는 것은 유지 보수가 상대적으로 용이하고 비용이 저렴하며 빠른 생성 시간으로 인해 높은 처리량의 응용 프로그램을 사용할 수 있기 때문에 정당화되었습니다. 또한, C. elegans 와 인간 게놈 사이의 높은 보존은이 모델을 귀중한 발견 도구로 만듭니다. 형광 태깅된 조직 특이적 폴리글루타민(polyQ) 관을 발현하는 선충류는 형광 초점이 특징인 연령- 및 polyQ 길이 의존적 응집을 나타낸다. 이러한 기자들은 종종 조직 전반에 걸친 프로테오스타시스의 변화를 모니터링하기 위해 프록시로 고용된다. 수동 집계 정량화는 시간이 많이 걸리므로 실험 처리량이 제한됩니다. 또한, 수동 초점 정량화는 집계 식별이 매우 주관적일 수 있기 때문에 편향을 도입할 수 있습니다. 본원에서, 웜 배양, 이미지 획득 및 데이터 처리로 구성된 프로토콜은 장특이적 polyQ를 발현하는 C. elegans 를 이용한 고처리량 응집체 정량화를 지원하도록 표준화되었다. 이미지 분석 소프트웨어인 CellProfiler를 사용하여 C. elegans 기반 이미지 처리 파이프라인을 구현함으로써 이 방법은 개별 웜을 분리 및 식별하고 각각의 집계를 열거하도록 최적화되었습니다. 자동화의 개념이 완전히 독특하지는 않지만 재현성, 수동 계산에서 편향을 제거하고 처리량을 늘리기 위해 이러한 절차를 표준화해야 할 필요성이 높습니다. 이러한 방법은 C. elegans 모델을 사용하여 대규모 박테리아, 게놈 또는 약물 라이브러리의 스크리닝 과정을 크게 단순화 할 수 있다고 예상됩니다.

다음 프로토콜은 프로테오스타시스의 변화 평가로서 폴리글루타민 응집체를 정량화하기 위한 웜 배양, 형광 이미징 및 자동화된 이미지 처리를 위한 고처리량 워크플로우의 개발 및 최적화를 설명합니다.

Caenorhabditis elegans의 집계 정량화 자동화

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...

폴리글루타민 응집을 평가하고 높은 처리량 응용 분야에 사용할 수 있는 프레임워크를 제공함으로써 프로테오스타시스의 변화를 모니터링하기 위한 간단한 접근법이 취해졌습니다. 나에 의해 집계의 수와 같은 표현형을 채점하는 것은 주관적이 될 수 있다. 집계 카운팅을 자동화하면 이러한 편향을 제거하고 처리량과 재현성을 높일 수 있습니다.이 방법은 숙주 프로테오스타시스 파괴에 기여하는 박테리아 유전자를 확인하는 데 도움이 된다. 개별 박테리아 유전자 기여도를 이해하면 알츠하이머 병, 파킨슨 병 및 헌팅턴과 같은 질병의 발병기전에서 그 의미를 이해하는 데 도움이됩니다. 먼저 냉동실에서 웜이 들어있는 플레이트를 제거하고 실온에서 해동시킵니다.그런 다음 이미징하기 전에 과도한 결로를 닦아내고 뚜껑을 제거하십시오. 노출 시간 500밀리초, 0.63 X 카메라 어댑터로 40 X 배율, 이미지 캡처 중에 GFP 강도를 100%로 설정한 현미경 설정을 사용합니다. 이제 웜이 어두운 배경과 비교하여 밝게 비춰질 때까지 전송 된 조명 컨트롤을 조정하여 과다 노출을 피하십시오.우물 내의 웜의 위치를 변경하여 10 마이크로 리터 피펫 팁을 사용하여 웜을 원하는 위치로 부드럽게 밀어 넣어 과도한 덩어리를 방지하십시오. 채널을 GFP 필터로 설정하여 두 이미지 모두에 대한 초점 평면을 설정합니다. 밝은 필드 이미지를 캡처합니다.플레이트를 방해하거나 현미경의 초점을 변경하지 않고 상응하는 형광 이미지를 촬영하십시오. 이제 이미지를 평가하려면 먼저 CellProfiler를 다운로드하십시오. 소프트웨어를 열고 관심 있는 이미지를 이미지 상자에 끌어다 놓습니다.파일 목록에서 이미지를 클릭하여 엽니다. 돋보기 유리를 선택하여 관심 영역을 강조 표시하고 화살표 아이콘을 선택하여 웜과 응집체의 길이를 측정합니다. 원하는 오브젝트 위로 마우스를 가져가면 화면 하단에서 볼 수 있는 강도 값을 결정합니다.CellProfiler 이미지 분석 파이프라인을 활용하려면 공식 웹 사이트에서 CellProfiler를 다운로드한 후 텍스트 원고에 설명된 대로 이미지 쌍의 이름을 올바르게 지정합니다. 파이프라인을 다운로드하고 파일에서 파일, 가져오기 및 파이프라인을 선택하여 CellProfiler에 업로드합니다. 얽히지 않은 웜 모듈을 선택하여 설정을 열어 얽히지 않은 웜 모듈에서 웜을 식별하는 데 사용되는 교육 세트를 로드합니다.그런 다음 학습 집합 파일 이름을 식별합니다. 파일 업로드 아이콘을 선택하고 보충 파일도 업로드하십시오. 왼쪽 상단 모서리에 있는 이미지 모듈을 선택하여 이미지를 업로드합니다.그런 다음 제대로 명명 된 이미지를 끌어다 놓습니다. 이미지를 분석하기 전에 프로그램의 왼쪽 하단 모서리에있는 출력 설정 버튼을 클릭하여 결과를 저장하는 데 사용할 원하는 출력 폴더를 선택하십시오. 그런 다음 기본 출력 오른쪽의 폴더 아이콘을 선택하여 원하는 출력 위치를 선택하십시오.이미지 분석 아이콘을 선택하여 이미지 분석을 시작합니다. 분석을 완료하는 데 너무 오래 걸리고 단일 이미지를 처리하는 데 멈춘 경우 실행을 중단하고 출력 폴더를 정렬하고 찾을 수 없는 이미지 이름을 기록하여 처리되지 않은 이미지를 식별합니다. 완전한 분석 후, 소프트웨어는 N 열의 개별 웜과 K 열의 각 집계 수를 포함하는 Excel 스프레드 시트로 결과를 구성합니다.메타 데이터 구성 도우미를 다운로드하여 CellProfiler의 출력 CSV 파일에서 데이터를 편리하게 구성 할 수 있습니다.Windows OS의 경우 다운로드한 파일을 찾아 원하는 위치로 압축을 풉니다. gui_Windowsos_64x이라는 이름의 추출된 폴더를 찾아 엽니다. GUI 응용 프로그램 아이콘을 클릭하여 응용 프로그램을 시작하십시오.실행 권한을 요청하는 프롬프트가 열릴 수 있습니다. 더 많은 정보를 선택한 다음 어쨌든 실행을 클릭하십시오. 이제 메타데이터 구성 도우미가 CellProfiler 출력 CSV 파일을 끌어다 놓을 준비가 되었습니다.Mac OS의 경우 다운로드한 파일을 찾아 파일 메타데이터 조직자 응용 프로그램 파일의 압축을 풉니다. 다운로드에서 찾을 수 있는 추출된 폴더를 엽니다. GUI 응용 프로그램을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 열기를 선택하십시오.공식 라이센스가 없기 때문에 개봉 허가를 요청하는 프롬프트가 나타납니다. 열기를 선택합니다. 메타 데이터 주최자 응용 프로그램이 해당 OS에서 열리면 여기에 파일 업로드를 클릭하거나 원하는 CellProfiler CSV 파일을 끌어다 놓습니다.구성 버튼을 클릭하면 파일 다운로드 버튼이있는 새 화면으로 사용자를 안내합니다. 버튼을 클릭하고 출력 파일을 저장할 원하는 위치를 선택하십시오. 출력 파일은 파일 이름에 확장명이 추가_organized 원래 파일 이름으로 나타납니다.FUDR의 존재하에, 다양한 박테리아를 먹인 웜은 더 균일하고 정확한 웜 검출을 허용하는보다 일관된 신체 크기를 가졌으며, 따라서 과밀의 문제를 해결했습니다. 웜을 동결하면 배경 형광을 제거하여 polyQ 응집체 검출을 향상시켰을 뿐만 아니라 수동 카운팅에 필적하는 자동 계수의 정확도도 향상되었습니다. 반전된 브라이트필드 조명은 폴리Q YFP 응집체를 이미지화하기 위해 전체 C.elegans 및 GFP 채널을 검출하는데 사용되었다.각 웜에 대한 웜 탐지, 엉킴 해제 및 집계 정량화는 최적화된 CellProfiler 이미지 처리 파이프라인을 적용하여 수행되었으며, 이를 통해 개별 웜당 집계 수를 얻을 수 있습니다. 자동화된 집계 정량화의 효능과 CellProfiler 파이프라인을 사용하는 것의 차이는 미미했으며, 이는 자동화된 방법을 대규모 스크린에 적용할 수 있음을 나타냅니다. 시험된 90개의 박테리아 균주 중에서, 하나의 후보물질을 사용한 C.elegans 장의 콜로니화는 응집체 수의 현저한 감소를 보였다.수동 카운팅에 의한 확인 실험은 응집체의 수를 유의하게 감소시킨 돌연변이체를 포함하여 돌연변이체 중 어느 것도 polyQ 응집에 영향을 미치지 않는다는 것을 밝혀냈다. 이 프레임 워크를 사용하기로 결정한 연구원은 설명 된 단계가 절대적이지 않다는 것을 이해해야합니다. CellProfiler를 조작하는 방법에 대한 수정과 근본적인 이해는 성공을 위해 필수적입니다.웨스턴 블롯팅과 같은 추가적인 생화학적 접근법이 폴리Q 응집을 확인하기 위해 사용될 수 있다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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단일 및 벌크 C.의 고처리량 정량적 RT-PCR. 나노 유체 기술을 사용하여 샘플

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미토콘드리아 질환의 카노르하비티스 예르간 모델에서 동물 활동을 정량화하는 실험 방법의 비교 분석

여기에서, 선충류 예쁜꼬마선충에서의 단백질 응집 동역학의 분석을 위한 방법이 제시 된다. 연령 동기화 된 집단의 동물은 서로 다른 시점에서 이미지화되고 CellProfiler에서 반자동 포함 계수가 수행되고 AmyloFit의 수학적 모델에 적합합니다.

Caenorhabditis elegans에서 자동 포함 계수를 사용하여 생체 내에서 단백질 응집 동역학 모니터링

이 프로토콜은 자아 Caenorhabditis 선충류의 대규모 생태 조사를 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 자연에서 수집 된 선충류와 관련된 생태 및 분자 데이터의 효율적인 조직 및 분석입니다.

Selfing caenorhabditis 선충류의 생태 조사를 수행하기위한 고도로 확장 가능한 접근법

학습하세요 Caenorhabditis elegans에서 폴리글루타민 응집체를 자동 정량화하는 고속 스크리닝 방법을 CellProfiler를 활용하여 신경퇴행성 질환의 프로테오스타시스 메커니즘을 연구하는 데 활용할 수 있습니다.

Caenorhabditis elegans의 집계 정량화 자동화

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