미세 유체 장치를 사용하여 siRNA로드 지질 나노 입자의 생산
2022년 3월 22일
미세유체계 지질나노입자(LNP) 생산 방법은 RNA 전달을 포함한 약물 전달 시스템(DDSs)에서 주목받고 있다. 이 프로토콜은 iLiNP라는 이름의 당사의 원래 미세 유체 장치를 사용하여 제조, LNP(siRNA 로드 LNP) 생산 및 LNP 평가 프로세스를 설명합니다.
지질 나노 입자 크기는 생체 분포, 항 종양 효과 및 유전자 침묵 성능에 영향을 미칩니다. 따라서, LNP 크기 제어 방법은 RNA 전달 시스템을 포함하는 나노 의약품을 생산하는 효과적인 기술이다. iLiNP 장치라는 이 원래의 미세 유체 장치는 10나노미터 간격으로 20~100나노미터에 이르는 LNP 크기를 제어할 수 있었습니다.
iLiNP 장치는 siRNA 로드 LP뿐만 아니라 모든 mRNA 로드 LNPS 및 리보뉴클레오프로틴 로드 LP를 생성할 수 있습니다. 시작하려면, 지질 에탄올 용액을 가지고 50 내지 10 내지 38.5 내지 1.5의 어금니 비율로 DOTAP, DSPC, 콜레스테롤 및 DMG-PEG2k 용액을 혼합하여 siRNA로드 LNP를 생성한다. 총 지질 농도를 8 밀리몰러로 조정합니다.
그런 다음 pH 4에서 154 밀리머 식염수 및 25 밀리머 아세테이트 버퍼의 수성 솔루션을 가져 와서 0.2 마이크로 미터 멤브레인 필터 또는 주사기 필터를 통해 필터링하십시오. siGL4 70 마이크로그램을 25 밀리머 아세테이트 버퍼1밀리리터로 용해하여 siRNA 버퍼 솔루션을 준비합니다. 각각 지질 및 수성 솔루션으로 1 밀리리터 유리 주사기를 채웁니다.
유리 주사기를 주사기 커넥터를 사용하여 피크 모세혈관에 연결한 다음 지질 및 수성 용액의 유량을 설정하고 주사기 펌프를 사용하여 iLiNP 장치에 지질 및 수성 용액을 별도로 도입합니다. iLiNP 장치의 콘센트에서 마이크로 튜브에서 LNP 서스펜션을 수집합니다. 4도에서 12~14킬로달톤의 투석막을 이용한 LNP 서스펜션은 POPC LP 및 siRNA 로드 LNPs에 대한 식염수 또는 DPBS에 대하여 하룻밤 사이에 섭씨이다.
마이크로튜브에서 투석된 LNP 서스펜션을 수집한 다음, LNP 현탁액의 20~30마이크로리터를 마이크로 쿼츠 세포로 배관한다. 마지막으로 동적 광 산란을 통해 LNP 크기, LNP 크기 분포 및 폴리 분산지수를 측정합니다. 총 유량 및 유량 비율과 같은 다양한 유량 조건에서 생산되는 POPC LNP 크기 분포가 여기에 나와 있습니다.
20~100나노미터에 이르는 정확한 LNP 크기는 iLiNP 장치를 사용하여 제어할 수 있다. 소형 LP는 높은 총 유량 조건에서 형성됩니다. 또한, FRR 5에서 형성되는 LNP 크기는 총 유량에 관계없이 FRR 3의 크기보다 작다.
siRNA 로드 LP의 크기 분포는 여기에 도시된다. siRNAs는 양이온 지질 DOTAP와 음전하 siRNAs 사이 정전기 상호 작용에 의해 LP로 캡슐화됩니다. iLiNP 장치는 좁은 분포를 가진 90 나노미터 siRNA 하중 양이온 LP를 생산했습니다.
siRNA 캡슐화 효율은 양이온 지질과 음전하 시RNA 사이의 정전기 상호 작용으로 인해 95%였다. 19나노미터 siRNA 하중 LNPs의 세포 독성 및 유전자 침묵 활성을 평가하였다. siRNA로드 LNPs는 10 에서 100 나노 몰러 siRNA의 복용량에서 세포 독성을 보였다.
루시파라제의 발현 수준은 siRNA 농도에 따라 감소하였다. siRNA로드 LNP는 100 나노 몰라 siRNA의 복용량에서 80% 루시파라발현을 억제하였다. 유량 조건의 최적화는 원하는 크기의 LP를 얻기 위한 프로토콜에서 가장 중요한 단계입니다.
iLiNP 장치를 포함하는 미세 유체 기반 LNP 생산 방법은 복잡한 절차를 필요로하지 않으며 표준 LNP 생산 방법으로 사용될 것으로 예상된다.
개요
본 논문은 iLiNP라고 불리는 미세유체 장치를 사용하여 siRNA가 탑재된 지질 나노입자(LNP)를 제조하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 효율적인 약물 전달 시스템에 필수적인 LNP 크기를 정밀하게 제어할 수 있게 해줍니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 약물 전달 시스템
- 지질 나노입자
- 미세 유체 기술
배경
- 지질 나노입자의 크기는 생체 내 분포와 치료 효능에 영향을 미칩니다.
- LNP 크기 조절은 RNA 전달을 최적화하는 데 필수적입니다.
- iLiNP 장치를 통해 20에서 100나노미터까지 크기 조절이 가능합니다.
- 정전기적 상호작용은 LNP 내 siRNA 캡슐화를 촉진합니다.
연구 목적
- siRNA가 탑재된 LNP를 제조하기 위한 신뢰할 수 있는 방법을 개발합니다.
- LNP 크기가 유전자 침묵 효율에 미치는 영향을 평가합니다.
- 원하는 LNP 특성을 얻기 위해 유속 조건을 최적화합니다.
사용된 방법
- LNP 제조를 위한 지질 및 수용액 준비.
- 혼합 및 LNP 형성을 위한 iLiNP 장치 사용.
- 과량의 물질을 제거하기 위한 LNP 현탁액의 투석.
- LNP 크기 및 분포 측정을 위한 동적 광산란법.
주요 결과
- iLiNP 장치를 통해 크기 90 nanometers, 봉입 효율 95%의 siRNA 탑재 LNP를 제조하였습니다.
- 총 유속이 높은 조건에서 작은 크기의 LNP가 형성되었습니다.
- siRNA 탑재 LNP는 세포 독성과 효과적인 유전자 억제 성능을 나타냈습니다.
- 원하는 LNP 크기를 달성하기 위해서는 최적화된 유속 조건이 매우 중요했습니다.
결론
- iLiNP 장치를 이용한 미세유체 방식은 LNP 제조 공정을 간소화합니다.
- 이 접근 방식은 연구 분야에서 LNP 생산의 표준화를 가능하게 할 것으로 기대됩니다.
- 추후 연구를 통해 다양한 RNA 전달 시스템에 이 방법을 적용하는 방안을 탐색할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
지질 나노입자(LNP) 크기의 정밀한 제어는 RNA 기반 약물 전달 시스템의 생체 내 분포, 치료 효능 및 유전자 억제 성능을 최적화하는 데 매우 중요합니다. iLiNP 미세유체 장치는 20에서 100 nanometer까지 크기 조절이 가능한 재현성 있는 LNP 생산을 가능하게 하여, 초기 단계의 타겟 검증 및 리드 물질 확인 워크플로우를 지원합니다. 이러한 기능은 나노입자 성능의 변동성을 줄임으로써 전임상 모델의 예측 신뢰도를 높이며, 이는 중개 연구의 위험을 낮추는 핵심 요소입니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 표적 검증 분석에서 siRNA가 탑재된 LNP의 크기 의존적 생물학적 활성을 조사할 수 있게 합니다.
- 운영적 가치: 표현형 스크리닝 및 기전적 리스크 감소 연구에서 노이즈를 줄이기 위해 표준화된 LNP 제형을 제공합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 과학적 가치: 정의된 크기와 95%의 봉입 효율을 갖는 단분산 siRNA-LNP를 생성하여 신뢰성 있는 화합물 평가를 가능하게 합니다.
- 운영적 가치: iLiNP 장치의 유속 조절을 통해 재현 가능한 LNP 크기 제어를 구현함으로써 어세이 표준화를 지원합니다.
중개 및 전임상 연구
- 과학적 가치: 질병 관련 시스템에서 LNP 크기와 유전자 침묵 효율 및 세포 독성 간의 상관관계 분석을 용이하게 합니다.
- 운영적 가치: 전임상 연속성을 위해 mRNA, siRNA 및 리보핵산단백질이 탑재된 LNP의 확장 가능한 생산을 가능하게 합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
iLiNP 미세유체 방법은 초기 표적 검증부터 선도물질 발굴, 전임상 개발에 이르는 발견 연속체 과정에 부합하며, 특히 크기에 따른 전달 효율이 효능에 영향을 미치는 RNA 치료제 분야에서 유용합니다.
- 발견 생물학: LNP 크기를 체계적으로 변화시켜 세포 섭취 및 표적 결합에 미치는 영향을 평가함으로써 가설 검증을 지원합니다.
- 스크리닝: 일관된 크기 분포와 높은 siRNA 봉입률을 갖춘 분석 준비 완료 LNP 제형을 제공하여 재현 가능한 화합물 스크리닝을 가능하게 합니다.
- 분석: 동적 광산란을 통해 크기, 다분산 지수 및 제타 전위의 정량적 결과물을 제공하여 진행 여부(go/no-go) 결정의 근거를 마련합니다.
- 중개 연구: 표준화된 크기 제어 나노 의약품을 통해 발견 단계의 LNP 최적화를 전임상 평가와 연결합니다.
- 기업 내 재사용: 여러 프로젝트에 걸쳐 다양한 RNA 로딩 LNP(siRNA, mRNA, RNP)를 생산할 수 있는 재사용 가능한 플랫폼을 구축합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: LNP의 물리화학적 특성을 유전자 억제와 같은 기능적 결과와 연결함으로써 표적 신뢰도를 향상시킵니다.
- 운영적 가치: 마이크로플루이딕 정밀 제어를 통해 LNP 생산의 재현성과 확장성을 높입니다.
- 전략적 가치: 전달체 성능의 조기 위험 제거를 가능하게 하여 후기 단계의 생물학적 리스크를 줄입니다.
- 포트폴리오 영향: 전달 효율을 기반으로 RNA 치료제 후보 물질의 리스크 조정 우선순위 결정에 정보를 제공합니다.
구현 시 고려 사항
- 지질 제형, 미세유체 제어 및 핵산 로딩에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- LNP 정제를 위해 시린지 펌프, 유리 시린지 및 투석 인프라에 의존합니다.
- 팀 간의 유량 비율 및 총 유량 조건의 표준화가 필요합니다.
- 지질 조성이나 RNA 화물 유형을 변경할 때 적응 고려 사항이 수반됩니다.
- 생산 후 투석 및 품질 관리를 위한 동적 광산란 측정의 필요성으로 인해 제한적입니다.
바이오 제약 FAQ
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:54
Preparation of Lipid Solutions and the siRNA/ Buffer Solution
1:58
Set-Up of the iLiNP Device and Production of LNPs
2:35
Dialysis of the LNP Suspension and LNP Size Measurement
3:24
Results: POPC LNP Size Distributions Produced by the iLiNP Device at Different Flow Rate Ratios and Characterization and Cytotoxicity of siRNA-Loaded LNPs
5:22
Conclusion
