Name: 미세 유체 장치를 사용하여 siRNA로드 지질 나노 입자의 생산 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: 배우세요 iLiNP 미세 유체 장치를 사용하여 siRNA 로드 지질 나노입자를 생산하는 방법입니다. 이 기술은 20~100나노미터 크기 조절이 가능하며 95% 캡슐화 효율로 유전자 침묵 효과를 극대화합니다.

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이 작품은 JST, 크레스트 그랜트 번호 JPMJCR17H1, 일본, JST, PRESTO 보조금 번호 JPMJPR19K8, 일본, JST, 스코어, 일본, 교육, 문화, 스포츠, 과학 기술부, JSPS KAKENHI 보조금 번호 JP19KK0140, 그리고 Ikee과학에 의해 지원되었다.

1. iLiNP 장치의 제조
참고: iLiNP 장치는 표준 소프트 리소그래피 방법을 사용하여 제조된다18. 상세한 제조 프로토콜은 이전에보고되었다10,13.
<ol><li>SU-8 금형 제작<ol>
<li>SU-8 3050을 3인치 실리콘 웨이퍼에 붓습니다. 실리콘 웨이퍼를 스핀 코팅하여 100 μm 두께의 SU-8 층을 얻습니다.</li>
		<li>실리콘 웨이퍼를 65°C에서 5분 동안, 95°C에서 45분간 구워줍니다.</li>
		<li>베이킹 후 데스크탑 마스크리스 리소그래피 시스템의 무대에 실리콘 웨이퍼를 놓습니다.</li>
		<li>실리콘 웨이퍼를 365 nm에서 UV 광에 노출하여 1.5s에 1.5s로 한 위치당 노출합니다. 참고: 이 실험에서 데스크톱 마스크리스 리소그래피 시스템이 사용되었습니다. 시스템은 마이크로채널의 분할조사 영역(한 위치)에서 UV 광을 자동으로 노출합니다.</li>
		<li>UV 조사 후, 핫플레이트에 실리콘 웨이퍼를 1분 동안 65°C, 95°C에서 5분간 굽습니다.</li>
		<li>실리콘 웨이퍼를 식힌 다음 SU-8 개발자에게 15분 간 담그고 노출되지 않은 SU-8을 제거합니다.</li>
		<li>건조기와 진공 펌프를 사용하여 트리클로로(1H,1H,2H,2H-퍼플루오로옥틸)의 SU-8 금형을 시란으로 처리합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>iLiNP 장치의 제조<ol>
<li>실리콘 베이스와 폴리디메틸실록산(PDMS) 경화제를 10:1 비율로 혼합한다(w/w).</li>
		<li>진공 펌프와 건조기로 혼합물을 탈가스합니다. 참고: PDMS는 실온에서 10분 동안 진공 펌프를 사용하여 탈유되었습니다.</li>
		<li>탈가스 PDMS를 SU-8 몰드에 최대 0.5~1cm 두께의 페트리 접시에 넣고 80°C에서 1시간 동안 오븐에서 굽는다.</li>
		<li>금형을 식힌 다음 트위저를 사용하여 SU-8 금형에서 PDMS 기판을 벗깁니다.</li>
		<li>PDMS 기판에 3개의 구멍(0.5 mm)을 펀치합니다. iLiNP 장치를 구축하기 위해 산소 플라즈마 클리너를 사용하여 PDMS 기판 및 유리 슬라이드를 결합합니다( 그림 1)13을 참조하십시오.</li>
		<li>3개의 PEEK 모세혈관(I.D. 0.3 mm, O.D. 0.5 mm)을 iLiNP 장치의 입구 및 콘센트에 연결하고 슈퍼 접착제로 치료합니다. 참고: PEEK 모세혈관의 길이는 조절이 가능하며 실험에 따라 다릅니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 지질 솔루션 준비
<ol><li>지질/에탄올 용액 준비: 13.4 mM 1-팔미토일-2-올레오일-센-글리케로-3-인포콜린(POPC), 10mMM 1,2-디스테로일-sn-글리케로-3-인포콜린(DSPC), 2 0 mM 1,2-디오틸록시-3-트리메틸람모늄 프로판(DOTAP), 5mM 1,2-디미리스토틸-락 글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(DMG-PEG2k), 및 20mM 콜레스테롤. 실험 전에 재고 용액을 -20°C로 저장합니다.</li>
	<li>siRNA로드 LP를 생산하려면 DOTAP, DSPC, 콜레스테롤 및 DMG-PEG2k 용액을 50/10/38.5/1.5의 어금니 비율로 혼합하십시오. 총 지질 농도는 8mM로 조정된다.</li>
</ol>3. 수성 솔루션 준비
<ol><li>수성 용액 준비: 154 mM NaCl (식염수), 25 mM 아세테이트 버퍼 pH 4.0 DNase/RNase 프리 증류수를 사용 하 여.</li>
	<li>0.2 μm 크기의 멤브레인 필터 또는 주사기 필터를 통해 솔루션을 필터링합니다.</li>
</ol>4. siRNA/버퍼 용액 의 준비
<ol><li>siGL4 70 μg를 25m 아세테이트 버퍼(pH 4.0)의 1mL로 녹입니다. 참고: siGL4는 루시파아제 유전자의 녹다운에 사용됩니다.</li>
</ol>5. iLiNP 장치 설정 및 LP 생산
참고: 회로도의 그림 1 을 참조하십시오.
<ol><li>지질 및 수성 솔루션(개별 주사기의 경우 3.1 및 4.1 단계)으로 1mL 유리 주사기를 각각 채웁니다. 참고: LNP 평가 실험에 필요한 양에 따라 지질 및 수성 용액 량을 조정합니다.</li>
	<li>유리 주사기를 주사기 커넥터를 사용하여 PEEK 모세혈관에 연결합니다.</li>
	<li>지질 및 수성 솔루션의 유량을 설정합니다. 참고: 수성상에서 지질상까지의 유량 비율(FRR)은 3:1에서 9:1까지 다양합니다.</li>
	<li>주사기 펌프를 사용하여 iLiNP 장치에 지질 및 수성 용액을 별도로 도입합니다.</li>
	<li>iLiNP 장치의 콘센트에서 마이크로튜브에서 LNP 서스펜션을 수집합니다(그림 1).</li>
</ol>6. LNP 서스펜션 및 LNP 크기 측정의 투석
<ol><li>POPC LP 및 siRNA 로드 LP에 대한 식염수 또는 D-PBS에 대해 하룻밤 사이에 4°C에서 투석 막(12-14 kDa MW 컷오프)을 사용하여 LNP 서스펜션을 투석한다. 참고 : POPC는 식염수로 용해되지 않습니다 (2.1 참조하시기 바랍니다). POPC/에탄올 용액은 iLiNP 장치에서 식염수로 희석된다.</li>
	<li>마이크로튜브에서 투석된 LNP 서스펜션을 수집합니다.</li>
	<li>마이크로 쿼츠 셀에 LNP 서스펜션의 파이펫 20-30 μL.</li>
	<li>동적 광 산란(DLS)을 통해 LNP 크기, LNP 크기 분포 및 다분산지수를 측정합니다.</li>
</ol>7. LNP의 Z 잠재력 측정
참고: Z-잠재력을 측정하기 위해 제조업체의 지시에 따라 입자 분석기( 재료 표 참조)가 사용되었습니다.
<ol><li>10mM HEPES 버퍼(pH 7.4)로 6.1, 35배에서 얻은 LNP 서스펜션을 희석시켰다.</li>
	<li>파이펫 700 ~ 1000 μL의 희석된 LNP 현탁액은 모세관 세포로 한다.</li>
	<li>제조업체의 지시에 따라 Z 가능성을 측정합니다.</li>
</ol>8. 리보그린 분석에 의한 siRNA 캡슐화 효율
참고: 리보그린 분석은 LNPs19로 의 siRNA 캡슐화를 평가하기 위해 수행됩니다. 리보그린 분석은 계면활성제(예: TritonX-100)가 있는 LP 내부 및 외부의 RNA 양을 측정할 수 있습니다.
<ol><li>10m HEPES 버퍼(pH 7.4)에서 500 ng/mL siGL4 용액으로 2 mg/mL을 희석시합니다.</li>
	<li>트리톤(+) 및 트리톤(-) 샘플에 대한 교정 곡선을 만들기 위해 siGL4 솔루션의 희석 계열(0, 12.5, 25, 50, 100, 200 ng/mL)을 준비한다.</li>
	<li>LNP 서스펜션을 10m HEPES 버퍼(pH 7.4)로 100회 희석합니다.</li>
	<li>트리톤(+) 용액에 대해 다음을 혼합합니다: 10mHEPES(pH 7.4)의 980 μL, 10%의 μL w/v TritonX-100, 리보그린 1.25 μL 1.25 μL 96웰 마이크로플레이트의 10웰.</li>
	<li>트리톤(-) 용액을 혼합합니다: 10mHEPES의 1000 μL(pH 7.4) 및 리보그린의 1.25 μL은 96웰 마이크로플레이트의 10개의 웰에 대해 이렇게 한다.</li>
	<li>파이펫 100 μL 의 희석 계열의 siGL4 용액과 희석 LNP 서스펜션은 블랙 96웰 마이크로 플레이트의 우물에 들어갔다. 참고: siGL4 용액희석 시리즈와 희석 된 LNP 서스펜션은 조건당 4 개의 마이크로웰로 분배되었습니다.</li>
	<li>검출 용액(TritonX-100(+) 또는 트리톤(-)의 파이펫 100 μL이 우물안으로 들어갑니다. 참고: 검출 용액(TritonX-100(+)은 조건당 샘플당 2개의 우물로 분배되었고, TritonX-100(-) 용액은 샘플 조건당 나머지 두 개의 우물에 분배되었다.</li>
	<li>실온에서 5분 동안 마이크로플레이트를 배양합니다.</li>
	<li>마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 475 nm의 파장을 사용하여 형광 강도를 측정합니다.</li>
	<li>다음 방정식19로부터 siRNA 캡슐화 효율을 계산한다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62999/62999eq01.jpg">
</li>
</ol>9. 세포 배양
<ol><li>DMEM, 열 불활성 10% FBS, 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 연쇄절제술, 400μg/mL G418을 포함하는 성장 매체를 준비한다.</li>
	<li>배양 HeLa 세포는 5% CO2 인큐베이터에서 37°C에서 성장 배지를 함유하는 100mm TC 처리세포 배양식에서 반딧불및 레닐라 루시파라제(HeLa-dluc)를 안정적으로 표현한다.</li>
</ol>10. 셀 생존 가능성 분석
<ol><li>종자 100 μL의 성장 배지에서 HeLa 세포의 현탁액(6 x 103 세포/웰) 96웰 마이크로 플레이트. 참고: 세포는 세포 카운터 플레이트와 현미경을 사용하여 계산되었습니다.</li>
	<li>마이크로 플레이트를 37°C에서 37°C에서 5% CO2 인큐베이터로 배양합니다.</li>
	<li>10 및 100 nM siRNAs의 농도에서 DMEM (-)으로 siRNA로드 LN을 희석시 희석시.</li>
	<li>희석된 siRNA 로드 LNP 서스펜션의 100 μL을 양호한 것으로 분배한다.</li>
	<li>마이크로 플레이트를 37°C에서 37°C에서 5% CO2 인큐베이터로 배양합니다.</li>
	<li>LNP 서스펜션을 제거하고 DMEM(FBS(+)의 100 μL을 추가합니다.</li>
	<li>마이크로 플레이트를 37°C에서 5% CO2 인큐베이터로 배양합니다.</li>
	<li>제조업체의 프로토콜에 따라 시판되는 키트를 사용하여 셀 생존 가능성을 측정합니다. 참고: D-PBS(-)는 음수 제어로 사용되었다.</li>
</ol>11. 루시파라제 유전자 녹다운 분석
<ol><li>종자 75 μL성장 배지에서 HeLa 세포의 현탁액(4.5 x 103 세포/웰) 96웰 마이크로 플레이트.</li>
	<li>마이크로 플레이트를 37°C에서 37°C에서 5% CO2 인큐베이터로 배양합니다.</li>
	<li>10 및 100 nM siRNAs의 농도에서 DMEM (-)으로 siRNA로드 LN을 희석시 희석시.</li>
	<li>희석된 siRNA 로드 LNP 서스펜션의 75 μL을 1개당 잘 분배합니다.</li>
	<li>마이크로 플레이트를 37°C에서 37°C에서 5% CO2 인큐베이터로 배양합니다.</li>
	<li>LNP 서스펜션을 제거하고 75 μL의 DMEM(FBS(+)을 추가합니다.</li>
	<li>마이크로 플레이트를 37°C에서 5% CO2 인큐베이터로 배양합니다.</li>
	<li>제조업체의 프로토콜에 따라 시판되는 키트를 사용하여 루시파라제 식을 측정합니다. 참고: D-PBS(-)를 음수 제어로 사용했습니다.</li>
</ol>

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</ol>

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LNP 크기는 LNP 생체 분포, 항 종양 효과 및 유전자 침묵 성능에 영향을 미칩니다. 따라서, LNP 크기 제어 방법은 RNA 전달 시스템을 포함하는 DDS 나노 의약품을 제조하는 중요한 기술이다. 이 논문의 목적은 LP의 정확한 크기 튜닝을 위한 iLiNP 장치와 siRNA 로드 LNPs 생산에 응용 프로그램을 도입하는 것입니다. iLiNP 장치는 20nm(그림 2)13범위의 LNP 크기를 제어할 수 있었다. 총 유량 및 FRR과 같은 유동 조건이 LNP 크기를 제어하도록 변경되면, LNP 서스펜션은 약 5~10s 후에 수집하여 용액 흐름을 안정화시켜야 한다. iLiNP 장치의 콘센트에서 수집된 LNP 서스펜션은 완충액에 대해 즉시 투석되어 에탄올을 제거하고 LNP 응집을 방지했습니다.
LNP 크기 제어는 DDS 분야의 주요 과제 중 하나입니다. 일반적으로, 지질필름 수화 방법과 같은 기존의 LNP 생산 공정은 LNP 제작 후 크기 튜닝 공정이 필요하다20. 한편, 미세유체계 LNPs 생산 방법은 지질 및 수성 용액을 미세유체 장치에 도입하여 크기 조절 LP를 생성할 수 있다6,11,13. 투석 공정은 LNP 서스펜션에서 에탄올을 제거해야 하지만, 접선 유동 시스템과 결합된 미세유체 장치에 의한 지속적인 공정은 LNP 생산 공정의 자동화를 약속한다14. 문헌에 따르면, POPC LNP 크기는 50-60 nm와 30-60 nm, 유동-집중 미세 유체 장치21 및 혼돈믹서 장치에 대해 각각10이었다. 다른 미세 유체 장치에 비해 iLiNP 장치는 20nm에서 100 nm까지 넓은 범위에서 POPC LNP 크기 제어를 가능하게합니다.
iLiNP 장치의 제조 과정은 표준 소프트 리소그래피였습니다. 따라서 iLiNP 장치는 신속한 프로토타이핑 기술에 의해 대량 생산될 수 있으며 일회용 장치를 사용하여 용액의 교차 오염을 방지할 수 있다. iLiNP 장치는 POPC LNP 생산 방법과 동일한 방식으로 siRNA 로드 LP를 생성할 수 있다. iLiNP 장치를 사용하는 LNP 생산 방법의 경우 사용자는 복잡한 절차를 필요로 하지 않습니다. 이러한 이유로 iLiNP 장치를 포함한 미세 유체 기반 LNP 생산 방법은 표준 LNP 생산 방법으로 사용될 것으로 예상됩니다. 이 논문의 프로토콜은 LNP 생산을 위한 다른 미세 유체 장치에 적용될 수 있습니다. 또한, mRNA 로드 LP의 생산은 siRNA/버퍼 용액을 mRNA를 포함하는 완충액으로 변경하여 활성화된다.

지질 나노 입자 (LNP)는 RNA 전달 시스템에 가장 널리 사용되는 나노 캐리어 중 하나입니다. 최근에는 mRNA-로드 LP가 COVID-191,2,3의 예방을 위한 백신으로 승인되었습니다. 일반적으로, LNP의 크기는 유전자 침묵 또는 단백질 발현을 포함하는 바이오 분배 및 약물 전달 시스템(DDS) 성능에 중요한 역할을 한다4,5,6. 따라서 LNP 생산 공정에 대해 정확한 LNP 크기 제어 방법이 필요합니다.
크기 제어 LP의 생산을 위해, 미세 유체 장치는 수년에 걸쳐 관심을 끌고있다7. 2018년, 최초의 식품의약국(FDA)이 승인한 siRNA-로드 LP(예를 들어, 온파트로)는 미세유체 장치를 사용하여 개발되었다8,9. 미세유체 계 LNP 생산 방법에서, 지질 용액 및 수성 용액은 마이크로 유체 장치로 별도로 도입된 다음 마이크로채널에 혼합된다. 혼합 효율을 향상시키기 위해 혼란스러운 믹서 장치는 LNP 생산10,11,12에 사용되었습니다. 혼란스러운 믹서 장치를 사용하면 특정 크기의 LP를 생성할 수 있습니다.
배플 구조를 갖춘 침습지질 나노입자 생성(iLiNP)이라는 간단한 미세유체 장치는 LNP 크기를 정밀하게 제어하기 위해 개발되었다13,14. 혼란스러운 믹서 장치에 비해 iLiNP 장치는 10 nm 간격으로 20~100nm 범위의 LNP 크기를 제어할 수 있었습니다. 또한, iLiNP 장치는 siRNA 로드 LNPs6, mRNA 로드 LNPs15, 리보뉴클레오프로틴 로드 LNPs16 및 엑소솜 같은 LNPs17을 생산했다. 이 논문의 목적은 iLiNP 장치의 제조 및 SiRNA 로드 LNP 생산 공정을 소개하고 iLiNP 장치에 의해 생성된 LNP 평가 프로세스를 설명하는 것입니다.

<table><tbody><tr><td>1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC)</td><td>NOF Corp.</td><td>MC-6081</td><td></td></tr><tr><td>1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000 (DMG-PEG2K)</td><td>NOF Corp.</td><td>GM-020</td><td></td></tr><tr><td>1,2-디올레오일옥시-3-트리메틸암모늄 프로판(DOTAP)</td><td>NOF Corp.</td><td>CL-8181TA</td><td></td></tr><tr><td>1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린예프(DSPC)</td><td>NOF Corp.</td><td>MC-8080</td><td></td></tr><tr><td>10 x D-PBS (-)</td><td>후지필름 와코 퓨어 케미컬</td><td>048-29805</td><td></td></tr><tr><td>아세트산</td><td>후지필름 와코 퓨어케미컬</td><td>017-00251</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Blue 세포 생존도 분석</td><td>Promega</td><td>G8081</td><td></td></tr><tr><td>콜레스테롤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8667-5G</td><td></td></tr><tr><td>데스크탑 마스크리스 리소그래피 시스템</td><td>NEOARK CORPORATION</td><td>DDB-701-DL4</td><td></td></tr><tr><td>투석막</td><td>Repligen 132697</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dual-Glo Luciferase 분석 시스템</td><td>Promega</td><td>E2940</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Lot: 42G6587K</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Nacalai Tesque</td><td>08973-14</td><td></td></tr><tr><td>Glass substrate</td><td>Matsunami Glass Ind., Ltd.</td><td>S1111</td><td></td></tr><tr><td>유리 주사기</td><td>Hamilton</td><td>GASSTIGHT 1002</td><td></td></tr><tr><td>HeLa 세포</td><td></td><td></td><td>HeLa-dluc 세포는 홋카이도 대학</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp</td>.의 사토 유스케 박사로부터 제공되었습니다.<td>342-01375</td><td></td></tr><tr><td>저혈당 둘베코 s 수정된 이글 매체 (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6046-500ML</td><td></td></tr><tr><td>산소 플라즈마 클리너</td><td>펨토 사이언스</td><td>CUTE-1MP/R</td><td></td></tr><tr><td>페니실린&ndash; 스트렙토마이신, 트립신(2.5%)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT RiboGreen RNA 시약</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R11491</td><td></td></tr><tr><td>siGL4</td><td>Hokkaido System Science Co., Ltd</td><td>siGL4의 센스 및 안티센스 가닥 서열은 각각 5'-CCGUCGUAUUCGUGAGCAATsT -3' 및 5'-UUGCUCACGAAUACGACGGTsT -3'입니다.</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 웨이퍼</td><td>GTC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SILPOT 184 W/C (PDMS)</td><td>다우코닝도레이(주)</td><td></td><td>실리콘베이스 및 경화제가 포함되어 있습니다</td></tr><tr><td>: 아세트산 나트륨,</td><td>후지 필름, Wako Pure Chemical Corp.</td><td>192-01075</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>후지필름 와코퓨어케미칼</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3050</td><td>일본 짜쿠 주식회사</td><td></td><td></td></tr><tr><td>주사기 커넥터</td><td>Institute of microchemical Technology Co., Ltd.</td><td>ISC-011</td><td></td></tr><tr><td>주사기 펌프</td><td>Chemyx</td><td>CX07200</td><td></td></tr><tr><td>trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)실란</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448931-10G</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Nacalai Tesque</td><td>35501-15</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure&nbsp; DNase/RNase-Free 증류수</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>&nbsp; Malvern Instruments</td><td>ZEN3600</td><td></td></tr></tbody></table>

미세 유체 장치를 사용하여 sirna로드 지질 나노 입자의 생산

Production of siRNA-Loaded Lipid Nanoparticles using a Microfluidic Device

기능성 지질 나노 입자 (LP)의 개발은 약물 전달 시스템 (DDS)의 분야에서 주요 과제 중 하나입니다. 최근에는 LNP 계 RNA 전달 시스템, 즉 RNA 로딩 LNPs가 RNA 치료에 관심을 모으고 있다. 특히, mRNA-로드 LNP 백신은 COVID-19를 방지하기 위해 승인되어 차세대 나노의약품의 개발을 향한 패러다임 전환을 초래했다. LNP 기반 나노 의약품의 경우 LNP 크기는 LNP 바이오 분배 및 LNP 성능을 제어하는 중요한 요소입니다. 따라서 LNP 생산 공정에 는 정확한 LNP 크기 제어 기술이 필수적입니다. 여기서는 iLiNP라는 미세 유체 장치를 사용하여 크기 제어 LNP 생산을 위한 프로토콜을 보고합니다. siRNA 로드 된 LP는 또한 iLiNP 장치를 사용하여 생성되고 시험관 내 실험에 의해 평가된다. 대표적인 결과는 SiRNA-로드LNP, Z-잠재력, siRNA 캡슐화 효율, 세포 독성 및 표적 유전자 침묵 활성을 포함하는 LNP 크기에 대해 도시된다.

도 2A, B 는 다른 유동 조건에서 생산된 POPC LNP 크기 분포를 나타낸다. 상기 미세유체계 LNP 제제 방법은 총 유량(TFR) 및 FRR과 같은 유량 조건에 의해 LP의 크기를 조절할 수 있다. iLiNP 장치는 혼돈믹서 장치 및 유동 초점 미세 유체 장치를 포함한 일반적인 미세 유체 장치와 비교하여 20~100nm(그림 2)에 이르는 정밀한 LNP 크기 제어를 가능하게 했습니다. 총 유량 조건에서 형성된 소형 LN. 또한, FRR에서 형성된 LNP 크기는 총 유량13에 관계없이 3의 FRR보다 작아졌다.
siRNA-로드 된 LP는 또한 iLiNP 장치를 사용하여 준비되었다 (도 3A). siRNA 로드 LNP 제제를 위해, 양이온 지질인 DOTAP는 SiRNA를 LN에 효과적으로 캡슐화하는 데 사용되었습니다. iLiNP 장치는 좁은 분포를 가진 90 nm 크기의 siRNA 로드 된 양이온 LP를 생산 (그림 3A, B). siRNA 캡슐화 효율은 양이온 지질과 음전하 siRNAs(도 3C)사이의 정전기 상호 작용으로 인해 95%였다.
90nm 크기의 siRNA-로드 LP의 세포독성 및 유전자 침묵 활성은 도 4 및 도 5에 도시된 바와 같이 평가되었다. siRNA 로드 LNP의 복용량에서 세포 독성을 보여주었다 10 그리고 100 nM siRNA. 또한 siRNA 농도에 따라 루시파라제의 발현 수준이 감소된 것을 확인했습니다. siRNA 로드 LNPs 억제 80% luciferase 발현의 복용량에서 100 nM siRNA. 유전자 침묵 활동에 LNP 크기의 효과는 이전에보고되었다6,13,17.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62999/62999fig01.jpg"> 도 1: (A) iLiNP 장치의 회로도 일러스트레이션 및 (B) 사진. iLiNP 장치는 PDMS 및 유리 기판을 포함한다. iLiNP 장치는 슈퍼 접착제와 PEEK 모세 혈관에 연결되어 있습니다. 지질 및 siRNA/버퍼 솔루션은 주사기 펌프를 사용하여 iLiNP 장치에 별도로 도입됩니다. LNP 서스펜션은 마이크로튜브로 수집됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62999/62999fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62999/62999fig02.jpg"> 그림 2: iLiNP 장치에 의해 생성된 POPC LNP 크기 분포는 서로 다른 유량 비율(FRR)에서 생성된다. POPC LNP 크기는 동적 광 산란(DLS)에 의해 측정됩니다. POPC LP는 총 유량 및 FRR: (A) 3 FRR 및 (B) 5 FRR을 변경하여 제조됩니다. 소형 LP는 높은 총 유량 조건에서 형성됩니다. 또한, 5의 FRR에서 형성된 LNP 크기는 3의 FRR에 있는 것보다 작습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62999/62999fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62999/62999fig03.jpg"> 도 3: siRNA 로드 LNPs. (A) siRNA 로드 LNPs의 크기 분포의 특성화. siGL4(siGL4)는 양이온 지질(DOTAP) 및 음전하 시RNA 사이의 정전기 상호 작용에 의해 LP로 캡슐화된다. (B) siRNA 로드 LP의 Z-잠재력. LNP 서스펜션은 측정 전에 10m HEPES 버퍼(pH 7.4)로 희석하였다. 데이터는 sD(표준 편차)± 의미로 표시됩니다. n = 3. (C) DOTAP 기반 LP의 siRNA 캡슐화 효율. 캡슐화 효율은 RiboGreen 분석에 의해 결정되었습니다. 데이터는 SD. n = 3에 ± 의미로 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62999/62999fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62999/62999fig04.jpg"> 그림 4: siRNA 로드 LP의 세포 독성. siRNA-로드 된 LP는 DMEM (-)으로 희석되어 10 및 100 nM의 siGL4 농도를 얻었다. LNP 현탁액은 HeLa-dLuc 세포에 첨가되고 5% CO2 인큐베이터에서 37°C에서 4시간 동안 배양됩니다. N.T.: 비처리(D-PBS(-). 데이터는 SD. n = 3에 ± 평균으로 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62999/62999fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62999/62999fig05.jpg"> 도 5: siRNA 로드 LNPs로 처리된 루시파라제 유전자 녹다운 활성. siRNA-로드 LNPs는 세포 생존 가능성 분석과 동일한 방식으로 제조된다. 루시파라제식 레벨은 듀얼 글로 루시파아제 분석 시스템을 사용하여 측정됩니다. N.T.: 비처리(D-PBS(-). 데이터는 평균 ± SD. n = 3으로 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62999/62999fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

미세유체계 지질나노입자(LNP) 생산 방법은 RNA 전달을 포함한 약물 전달 시스템(DDSs)에서 주목받고 있다. 이 프로토콜은 iLiNP라는 이름의 당사의 원래 미세 유체 장치를 사용하여 제조, LNP(siRNA 로드 LNP) 생산 및 LNP 평가 프로세스를 설명합니다.

미세 유체 장치를 사용하여 siRNA로드 지질 나노 입자의 생산

The development of functional lipid nanoparticles (LNPs) is one of the major challenges in the field of drug delivery systems (DDS). Recently, LNP-based ...

지질 나노 입자 크기는 생체 분포, 항 종양 효과 및 유전자 침묵 성능에 영향을 미칩니다. 따라서, LNP 크기 제어 방법은 RNA 전달 시스템을 포함하는 나노 의약품을 생산하는 효과적인 기술이다. iLiNP 장치라는 이 원래의 미세 유체 장치는 10나노미터 간격으로 20~100나노미터에 이르는 LNP 크기를 제어할 수 있었습니다.iLiNP 장치는 siRNA 로드 LP뿐만 아니라 모든 mRNA 로드 LNPS 및 리보뉴클레오프로틴 로드 LP를 생성할 수 있습니다. 시작하려면, 지질 에탄올 용액을 가지고 50 내지 10 내지 38.5 내지 1.5의 어금니 비율로 DOTAP, DSPC, 콜레스테롤 및 DMG-PEG2k 용액을 혼합하여 siRNA로드 LNP를 생성한다. 총 지질 농도를 8 밀리몰러로 조정합니다.그런 다음 pH 4에서 154 밀리머 식염수 및 25 밀리머 아세테이트 버퍼의 수성 솔루션을 가져 와서 0.2 마이크로 미터 멤브레인 필터 또는 주사기 필터를 통해 필터링하십시오. siGL4 70 마이크로그램을 25 밀리머 아세테이트 버퍼1밀리리터로 용해하여 siRNA 버퍼 솔루션을 준비합니다. 각각 지질 및 수성 솔루션으로 1 밀리리터 유리 주사기를 채웁니다.유리 주사기를 주사기 커넥터를 사용하여 피크 모세혈관에 연결한 다음 지질 및 수성 용액의 유량을 설정하고 주사기 펌프를 사용하여 iLiNP 장치에 지질 및 수성 용액을 별도로 도입합니다. iLiNP 장치의 콘센트에서 마이크로 튜브에서 LNP 서스펜션을 수집합니다. 4도에서 12~14킬로달톤의 투석막을 이용한 LNP 서스펜션은 POPC LP 및 siRNA 로드 LNPs에 대한 식염수 또는 DPBS에 대하여 하룻밤 사이에 섭씨이다.마이크로튜브에서 투석된 LNP 서스펜션을 수집한 다음, LNP 현탁액의 20~30마이크로리터를 마이크로 쿼츠 세포로 배관한다. 마지막으로 동적 광 산란을 통해 LNP 크기, LNP 크기 분포 및 폴리 분산지수를 측정합니다. 총 유량 및 유량 비율과 같은 다양한 유량 조건에서 생산되는 POPC LNP 크기 분포가 여기에 나와 있습니다.20~100나노미터에 이르는 정확한 LNP 크기는 iLiNP 장치를 사용하여 제어할 수 있다. 소형 LP는 높은 총 유량 조건에서 형성됩니다. 또한, FRR 5에서 형성되는 LNP 크기는 총 유량에 관계없이 FRR 3의 크기보다 작다.siRNA 로드 LP의 크기 분포는 여기에 도시된다. siRNAs는 양이온 지질 DOTAP와 음전하 siRNAs 사이 정전기 상호 작용에 의해 LP로 캡슐화됩니다. iLiNP 장치는 좁은 분포를 가진 90 나노미터 siRNA 하중 양이온 LP를 생산했습니다.siRNA 캡슐화 효율은 양이온 지질과 음전하 시RNA 사이의 정전기 상호 작용으로 인해 95%였다. 19나노미터 siRNA 하중 LNPs의 세포 독성 및 유전자 침묵 활성을 평가하였다. siRNA로드 LNPs는 10 에서 100 나노 몰러 siRNA의 복용량에서 세포 독성을 보였다.루시파라제의 발현 수준은 siRNA 농도에 따라 감소하였다. siRNA로드 LNP는 100 나노 몰라 siRNA의 복용량에서 80% 루시파라발현을 억제하였다. 유량 조건의 최적화는 원하는 크기의 LP를 얻기 위한 프로토콜에서 가장 중요한 단계입니다.iLiNP 장치를 포함하는 미세 유체 기반 LNP 생산 방법은 복잡한 절차를 필요로하지 않으며 표준 LNP 생산 방법으로 사용될 것으로 예상된다.

production-sirna-loaded-lipid-nanoparticles-using-microfluidic

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

생쥐의 양이온 liposomes/siRNA/ITSN-1s 단지 24 일 동안 72 시간마다 반복적으로 복고풍 궤도 주사 효율적으로 75 %에 ITSN - 초 발현 및 단백질 발현을 감소 마우스 폐 미세 혈관에 siRNA의 양면을 제공합니다. 이 기술은 동물 모델에서 높은 재현성, 부작용이없고 사망을 방지합니다.

양이온 성 리포좀을 통해 특정의 siRNA 반복 전달하여 마우스 폐 Intersectin-1의 장기 침묵. 전자 현미경에 의한 넉다운 효과의 평가

이 연구에서는 생체 적합성 나노 입자의 초소형 집단을 합성하는 방법과 세포 상호 작용을 평가하기 위한 몇 가지 시험관 내 방법을 설명했습니다.

고체 지질 나노 입자 (SLNs) 세포 내 타겟팅을위한 응용 프로그램

이 프로토콜의 목표는 신경 표적 펩타이드가 있는 양이온성/음이온성 리포좀을 CNS 전달 시스템으로 사용하여 siRNA가 BBB를 통과할 수 있도록 하는 것입니다.  siRNA와 같은 치료를 위한 전달 시스템의 최적화는 프리온 및 기타 신경 퇴행성 질환에 대한 더 많은 치료 옵션을 가능하게 할 것입니다.

양이온과 음이온 리포좀을 사용 CNS에 치료의 siRNA 배달

여기 우리가 드라이 필름 방식에 기반 하 고 안전에 대 한 사용할 수 있습니다 양이온 nanoliposomes의 생성에 대 한 프로토콜을 설명 하 고 효율적인 전달 체 외에 문자 메신저 RNA.

체 외에서 의 효율적인 배달 양이온 Nanoliposomes의 세대 문자 메신저 RNA

우리는 효과적인 생체 외에서 그리고 vivo에서 oligonucleotide 배달 fusogenic 다공성 실리콘 나노 입자의 합성을 보여 줍니다. 다공성 실리콘 나노 껍질을 형성 하기 위하여 압출을 통해 fusogenic 지질에 의해 코팅은 핵심을 형성 하는 siRNA와 함께 로드 됩니다. 타겟팅 moiety 기능화 및 입자 특성화 포함 되어 있습니다.

합성과 기능화, Oligonucleotide 배달에 대 한 Fusogenic 다공성 실리콘 나노 입자의 특성

화학적 성질을 준비 및 특성화 하는 방법 및 중성 충전 된, pH 반응 siRNA 나노 입자의 생물 활성이 제시 된다. 성공적인 siRNA에 대 한 기준은 크기, 형태학, 표면 전 하, siRNA 하 중 및 유전자 침묵과 같은 나노 의약품에 대해 논의 된다.

사이토 솔 릭 siRNA 전달을 위한 중성 충전, pH 반응 형 고분자 나노 입자의 제조

이 프로토콜은 엇갈인된 헤링본 마이크로믹서 미세유체 장치를 사용하여 열감도 리포좀을 준비하기 위한 최적화된 파라미터를 제시합니다. 이것은 또한 리포솜으로 독소루비신과 인도시아닌 녹색의 공동 캡슐화와 통제/트리거된 약물 방출을 위한 독소루비신의 광열 트리거 방출을 허용합니다.

리소리피드 함유 온도 민감성 리포좀의 미세유체 생산

지질 나노 입자는 mRNA 및 DNA 캡슐화를 위한 미세유체 혼합 플랫폼 접근 방식을 사용하여 개발됩니다.

미세 유체 혼합 플랫폼을 사용하여 유전자 전달을 위한 지질 나노 입자 제조 및 특성화

여기에서, 반딧불이 루시페라아제를 인코딩하는 mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자(LNP)를 제형화하기 위한 프로토콜이 제시된다. 이 LNP는 HepG2 세포의 in vitro 및 C57BL/6 마우스의 in vivo 에서 효능을 테스트했습니다.

미세유체 혼합으로 제조된 mRNA-지질 나노입자의 In vitro 및 In vivo 효율 테스트

2제트 CIJ 및 4제트 다중 입구 와류 믹서(μMIVM)를 포함한 CIJ(Confined Impact Jet) 믹서 기술을 사용하여 지질 나노입자(LNP)를 합성하기 위한 자세한 프로토콜이 시연됩니다. CIJ 믹서는 재현 가능한 난류 마이크로 혼합 환경을 생성하여 단분산 LNP를 생산합니다.

Synthesisizing Lipid Nanoparticles by Turbulent Flow in Confined Impact Jet Mixers(밀폐 충돌 제트 믹서에서 난류에 의한 지질 나노입자 합성)

배우세요 iLiNP 미세 유체 장치를 사용하여 siRNA 로드 지질 나노입자를 생산하는 방법입니다. 이 기술은 20~100나노미터 크기 조절이 가능하며 95% 캡슐화 효율로 유전자 침묵 효과를 극대화합니다.

미세 유체 장치를 사용하여 siRNA로드 지질 나노 입자의 생산

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