모기 Aedes aegypti에서 고해상도 용융 분석을 사용하여 CRISPR/ Cas9 돌연변이 발생 에 따른 인델 검출
2021년 9월 10일
이 문서에서는 CRISPR/Cas9에 의해 유도된 인델의 신속한 식별을 위한 프로토콜과 고해상도 용융 분석을 사용하여 모기 Aedes aegypti 의 돌연변이 라인을 선택하는 것에 대해 자세히 설명합니다.
이 프로토콜은 CRISPR/Cas9 기술로 생성된 돌연변이를 감지하는 매우 간단하고 효율적인 방법입니다. 이 기술의 두 가지 주요 장점은 몇 시간 안에 수행 할 수 있으며 많은 유기체에 적용 가능하다는 것입니다. 특정 유전자에 도전적일 수 있는 프라이머 설계와 HRMA의 효율성을 높이는 데 여러 라운드의 프라이머 설계 및 검증이 필요할 수 있습니다.
그라데이션 PCR을 수행하려면 마스터 믹스를 준비하여 시작합니다. 그런 다음 96웰 플레이트에서 비템플릿 제어 또는 NTC용 마스터 믹스의 19마이크로리터를 제거합니다. 그런 다음 나머지 마스터 믹스에 템플릿을 추가합니다.
96웰 플레이트에 샘플 믹스의 Aliquot 20 마이크로리터. 사이클링 매개 변수에 따라 PCR을 수행한 다음 원고에 언급된 매개 변수를 사용하여 열 용융 프로파일을 생성합니다. 필요한 모든 재료를 수집한 후, DNA 방출 시약의 0.5 마이크로리터와 20 마이크로리터의 유전자형을 가진 마스터 믹스를 준비한다.
멀티채널 파이프를 사용하여 믹스의 20 마이크로리터를 PCR 플레이트에 넣고 PCR 플레이트를 얼음 위에 놓습니다. 다음으로, 마취된 G1 모기를 유리 페트리 접시에 넣고 진정시키고 두 번째 페트리 접시에 8마리의 야생형 모기를 놓습니다. 70%에탄올로 핀셋 을 닦고 소독된 핀셋을 사용하여 모기 뒷다리 중 하나를 제거합니다.
그런 다음, DNA 방출 시약 용액에 다리를 침수. 모기를 해당 바이알에 놓고 스폰지로 유리병을 닫습니다. 완료되면 핀셋을 70%에탄올로 닦은 후 96웰 플레이트가 완성될 때까지 다음 모기에서 다리를 제거합니다.
나중에, 광학 PCR 플레이트 씰로 플레이트를 밀봉하고 2 ~ 5 분 동안 실온에서 다리를 포함하는 PCR 플레이트를 인큐베이션한 다음 2 분 동안 98도에서 배양하십시오. 접시를 실온으로 식힙니다. PCR의 경우, 선호하는 구성 요소를 포함하는 마스터 믹스를 준비한 다음 멀티채널 파이펫을 사용하여 마스터 믹스의 19마이크로리터를 96웰 플레이트의 각 웰로 전송합니다.
이전에 준비된 모기 DNA를 함유한 DNA 방출 용액의 마이크로리터 1개를 플레이트로 옮은 후, 광학 PCR 플레이트 씰로 플레이트를 밀봉한다. 적절한 사이클링 파라미터로 PCR을 수행하여 원고에 설명된 매개 변수에 따라 열 용융 프로파일을 생성한 다음, 기준 클러스터에 야생식 컨트롤을 할당하여 용융 프로파일을 검사합니다. 96웰 템플릿에 해당 색상으로 다른 클러스터를 표시합니다.
다음으로, 관심의 곡선을 가진 개인을 선택하고 다시 십자가튜브에서 선택한 개인을 제거합니다. 혈액 공급 만든 그것은 여성, G2A를 수집 하 여 다음. 대표적인 분석에서 Aedes aegypti의 ZIP11 돌연변이의 서열 분석이 도시된다.
Aedes aegypti ZIP11 이종화구균 돌연변이체의 전전자페로그램은 인델이 발생한 뉴클레오티드 위치를 나타냈다. 다형성 위치가 두 뉴클레오티드를 모두 수반적으로 보여주면서 인델은 단일 에서 이중 피크로의 변화로 표현됩니다. 실행이 끝나면 단일 피크를 계산하여 삭제되거나 삽입된 기본 쌍의 수를 계산했습니다.
유전자Aedes aegypti ZIP11 및 myo-fem에 돌연변이를 포함하는 모기는 HRMA의 고해상도 용융 분석을 사용하여 유전자형 및 서열 확인하였다. 샘플의 형광 신호는 1대 0의 상대값으로 정규화되었다. 또한 각 곡선은 야생형 참조에서 빼고 해당 배율을 표시했습니다.
실패한 자동 클러스터 할당은 대표 결과에 표시되며 그룹 간의 적절한 구별이 이루어지지 않았습니다. 또한, 각 시료는 이종고트, 동형질및 트랜스헤터로지고테스의 참조 샘플에 대한 유사성에 기초하여 올바른 그룹에 개별적으로 분석되고 할당되었다. HRMA를 수행 한 후, 돌연변이 된 개인으로부터 DNA를 시퀀싱하면 인델을 분석하고 표적 서열에서 다른 돌연변이를 식별해야합니다.
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개요
본 논문은 고해상도 융해 분석(high-resolution melt analysis)을 이용하여 모기 Aedes aegypti에서 CRISPR/Cas9에 의해 유도된 인델(indel)을 신속하게 식별하고 돌연변이 라인을 선별하는 프로토콜을 상세히 설명합니다. 이 방법은 효율적이며 다양한 생물체에 적용 가능하여 돌연변이를 빠르게 검출할 수 있습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 유전학
- 분자생물학
- 곤충학
배경
- CRISPR/Cas9 기술은 유전자 편집에 널리 사용됩니다.
- 돌연변이를 효율적으로 식별하는 것은 유전학 연구에 있어 매우 중요합니다.
- 고해상도 융해 분석(HRMA)은 신속한 검출 방법을 제공합니다.
- 프라이머 설계상의 어려움은 HRMA의 효율성에 영향을 미칠 수 있습니다.
연구 목적
- CRISPR 유도 돌연변이를 식별하기 위한 프로토콜을 제공합니다.
- 다양한 생물체에서 HRMA의 적용 가능성을 입증합니다.
- 돌연변이 라인 선택 과정을 효율화합니다.
사용된 방법
- PCR용 마스터 믹스 준비.
- 96-웰 플레이트에서의 템플릿 미포함 대조군(NTC) 사용.
- 조건 최적화를 위한 그래디언트 PCR.
- 인델(indel) 검출을 위한 고해상도 멜팅 분석.
주요 결과
- 이 프로토콜을 통해 돌연변이체를 신속하게 식별할 수 있습니다.
- HRMA는 몇 시간 내에 완료할 수 있습니다.
- 효율성을 높이기 위해 여러 차례의 프라이머 설계가 필요할 수 있습니다.
- 이 방법은 다양한 종에 걸쳐 다각적으로 적용 가능합니다.
결론
- 이 프로토콜은 돌연변이 검출 효율을 높여줍니다.
- 이는 모기 유전 연구에 유용한 도구를 제공합니다.
- 향후 연구에서는 이 방법을 기반으로 더 광범위한 응용 분야를 구축할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
CRISPR/Cas9으로 유도된 인델(indel)의 신속한 검출은 매개체 제어 연구에서 효율적인 표적 검증을 가능하게 하여, 기능 유전자 연구에 소요되는 시간을 단축합니다. 고해상도 멜팅 분석(High-resolution melt analysis)은 개체를 희생시키지 않고도 확장 가능한 유전자형 분석을 지원하며, 후속 표현형 분석 및 유전적 교배를 용이하게 합니다. 이러한 접근 방식은 최소한의 조직 샘플로부터 정량적인 돌연변이 검출을 제공함으로써 초기 발견 단계에서의 예측 신뢰도를 높여줍니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: CRISPR 돌연변이 유발 후 신속한 indel 검출을 통해 치료 가설의 검증을 가능하게 합니다.
- 운용적 가치: 생물체를 희생시키지 않고 돌연변이 대립유전자를 식별함으로써 생물학적 리스크를 감소시키며, 후속 분석을 위한 샘플을 보존할 수 있도록 지원합니다.
- 포트폴리오 영향: 타겟 검증 워크플로우를 가속화하여 질병 관련 시스템 내 유전자 타겟의 우선순위 결정을 빠르게 수행할 수 있게 합니다.
스크리닝 및 어세이 개발
- 과학적 가치: 야생형과 돌연변이 유전자형의 정량적 비교를 가능하게 하는 표준화된 형광 멜트 곡선을 생성합니다.
- 운용적 가치: 96-웰 플레이트 형식과 호환되어, 편집된 개체들의 중간 처리량 스크리닝을 지원합니다.
- 분석 준비도: 이형접합체, 동형접합체 및 트랜스-이형접합체에 대해 구별 가능한 멜트 프로파일을 생성하여 신뢰할 수 있는 클러스터 할당을 가능하게 합니다.
중개 및 전임상 연구
- 중개적 연속성: 유전자형 분석 후 표현형 분석이나 흡혈을 가능하게 하여, 질병 모델에서 유전적 변형과 기능적 결과 사이의 연결 고리를 제공합니다.
- 기전적 리스크 감소: 하위 시퀀싱을 통한 indel 특성 분석을 용이하게 하여, 온타겟(on-target) 효과를 확인하고 잠재적인 오프타겟(off-target) 변형을 식별합니다.
- 전임상 모델 지원: 아르보바이러스 전파 연구의 핵심 매개체인 Aedes aegypti의 돌연변이 라인 구축을 가능하게 합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
이 방법은 CRISPR 뮤타제네시스로부터 리드 화합물 식별에 이르는 발굴 연속체 내에 적합하며, 기능적 검증 전의 유전형 분석 체크포인트를 제공합니다.
- 발견 생물학: 표적 경로 내 유전자 기능을 파괴하는 인델(indel)을 빠르게 식별하여 가설 검증을 지원합니다.
- 스크리닝: 정규화된 멜트 커브 분석 및 참조 기반 클러스터링을 통해 분석법의 표준화를 가능하게 합니다.
- 분석: 인델 크기와 상관관계가 있는 정량적 멜트 프로파일 이동을 생성하여 샘플 간 비교 분석을 가능하게 합니다.
- 중개 연구: 유전자형 분석 후 살아있는 생물체를 사용할 수 있게 함으로써 유전자 변형과 표현형 평가를 연결합니다.
- 기업적 재사용: 다양한 생물체와 유전자에 걸쳐 재사용이 가능하며, 프라이머 설계의 적응성을 통해 광범위한 표적 적용성을 지원합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 유전자 편집 결과에 대한 직접적인 증거를 제공함으로써 표적 검증의 예측 신뢰도를 높입니다.
- 운영적 가치: 내장된 대조군을 포함한 표준화된 PCR 및 멜트 분석 프로토콜을 통해 재현성을 향상시킵니다.
- 전략적 가치: 돌연변이 스크리닝에 필요한 시간과 자원을 줄여 자본 효율성을 개선합니다.
- 포트폴리오 영향: 표현형 분석에 투자하기 전 돌연변이 존재 여부를 확인함으로써 리스크가 조정된 개발 진행을 가능하게 합니다.
실행 시 고려 사항
- 특정 유전자의 경우 효율적인 HRMA를 위해 여러 차례의 설계 반복이 필요할 수 있으므로, 프라이머 설계 및 최적화에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 고해상도 멜팅 분석을 위해 정밀한 온도 램프 제어 및 형광 검출 기능을 갖춘 장비에 의존합니다.
- 일관된 입력 품질을 보장하기 위해 다리 조직과 DNA 방출 시약을 사용한 표준화된 시료 준비가 필수적입니다.
- 정확한 클러스터 할당 및 멜팅 프로파일 정규화를 위해 야생형 참조 시료가 필요합니다.
- 인델(indel)을 완전히 특성화하고 표적 서열 내 추가 변이를 검출하기 위해 HRMA 이후 시퀀싱이 필요하다는 제한점이 있습니다.
바이오 제약 자주 묻는 질문(FAQ)
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:33
A Gradient PCR Using Genomic DNA (gDNA) from a Single Individual
1:09
Preparation of Genomic DNA from Mosquito Legs
2:31
Perform PCR
3:35
Results: Detection of CRISPR/Cas9-Induced Indels and the Establishment of Mutant Lines in the Mosquito Aedes aegypti
5:02
Conclusion
