Name: 모기 Aedes aegypti에서 고해상도 용융 분석을 사용하여 CRISPR/ Cas9 돌연변이 발생 에 따른 인델 검출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-10T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: 학습하세요 CRISPR/Cas9 돌연변이를 고해상도 용융 분석(HRMA)으로 빠르게 검출하는 방법을 Aedes aegypti 모기에서 적용하여 유전자 편집 효율성을 높이는 프로토콜입니다.

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모든 수치는 텍사스 A&M 대학에 라이센스에 따라 Biorender.com 만들어졌습니다. 이 작품은 국립 알레르기 및 감염증 연구소 (AI137112 및 AI115138 에서 Z.N.A.), 곤충 벡터 질병 보조금 프로그램에 따른 텍사스 A&M 농업 연구, USDA 국립 식품 농업 연구소, 해치 프로젝트 1018401 기금으로 지원되었습니다.

1. 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP), HRMA 프라이머 설계 및 프라이머 검증을 위한 스캐닝
<ol><li>야생 형 실험실 식민지 모기에서 SNP 식별<ol><li>적절한 폴리펩티드 번역을 방해하기 위해 대상 엑온을 선택합니다. 참고: 대상은 단백질 기능에 필요한 시작 코돈 또는 주요 잔류물 에 가깝습니다. 엑슨이 짧을수록(예: ≤200베이스) 대상이되고 분석하기가 더 어려워진다. 이 인사말 프라이머 중 하나가 인트론을 교차하거나 인트론에있을 강제로, 엑손의 경계에 가까운 편집을 피하십시오. SNP 비율이 해당 지역에서 훨씬 더 큰 경향이 있기 때문에 이것은 바람직하지 않습니다.</li>
		<li>프라이머 디자인<ol>
<li>NCBI 블라스트로 이동 - 프라이머 블라스트 웹 사이트15, 복사 및 페이지 상단의 상자에 붙여 넣기 | PCR 제품 크기를 선택 (그것은 엑슨의 대부분을 포함 확인) | 유기체를 선택합니다.</li>
			<li>고급 매개 변수| 클릭 옵트(PCR 제품 Tm용)를 선택하고 60(최적의 온도 60°C)을 추가| 프라이머를 가져옵니다. 다른 매개 변수를 기본값으로 유지합니다.</li>
		</ol></li>
		<li>야생형 실험실 식민지로부터 게놈 DNA(gDNA)를 얻습니다. 모기 10마리를 따로 놓고 CO2로 마취하고, 페트리 접시에 얼음 위에 놓아 비활성 상태를 유지합니다. 조직으로부터 DNA를 방출하기 위해 시약의 0.5 μL을 포함하는 10개의 튜브와 희석 버퍼의 20 μL을 설정 하여, 둘 다 재료표에 제안된 DNA 방출 키트에 제공됩니다.</li>
		<li>집게를 사용하여 단일 모기에서 한 쪽 다리를 제거하고 DNA 방출 시약의 희석 된 용액의 해당 튜브에 배치 (단계 1.1.3에서), 완전히 용액에 다리를 침수. 나머지 모기와 함께이 단계를 반복, 다음 단계로 진행하기 전에 70 %에탄올로 집게를 닦아.</li>
		<li>2-5 분 동안 실온에서 다리 함유 용액을 배양한 다음 98 °C에서 2 분 동안 배양하고 PCR 반응을 설정하는 동안 냉각 할 수 있습니다. 참고: 방출된 gDNA를 포함하는 플레이트는 -20°C에 저장될 수 있으며, 이 시점에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있다.</li>
		<li>2x PCR 마스터 믹스10 μL을 포함하는 10개의 튜브, 0.5 μM 최종 농도로 프라이머, 분자 등급 의 물을 20 μL의 최종 부피로 준비하고 희석된 시료의 1 μL을 각 튜브로 이송한다. 이러한 사이클링 매개변수에 이어 PCR을 수행하십시오: 5s용 98°C의 40사이클, 60°C 30초, KB당 72°C 20s; 1 분 동안 72 °C의 최종 연장.</li>
		<li>잔류 PCR 프라이머를 저하시키는 효소로 PCR 제품을 정화하고 과도한 dNTP 또는 모든 컬럼 정리 키트를 탈포합니다. 시료 를 시퀀싱하여 진행합니다.</li>
		<li>이중 피크/모호한 베이스가 존재하기 위해 각 전자페로그램을 분석하고 적절한 퇴행성 기본 코드를 사용하여 각 시퀀스에서 베이스 호출을 수동으로 조정합니다. 참고: 기본 호출 소프트웨어가 "true" 기본 호출로 더 눈에 띄는 피크를 선택하는 것이 일반적이기 때문에 이 단계는 여러 시퀀스 정렬 전에 수행해야 하며, 이는 SN의 부재에 대한 잘못된 인상을 줍니다.</li>
		<li>정렬 소프트웨어인 SeqMan Pro를 사용하여 여러 시퀀스 정렬을 수행하며, 재료 표 또는 ClustalW16 또는 T-Coffee17과 같은 기타 오픈 소스 정렬 소프트웨어에 나열됩니다.<ol>
<li>정렬 소프트웨어 | 엽니다. 시퀀스 추가 | 클릭 원하는 시퀀스를 선택하고 | 추가 를 클릭합니다. 모든 시퀀스를 선택하면 완료를 클릭 합니다.</li>
			<li>어셈블을 클릭하여 정렬을 수행합니다. 정렬을 열려면 Contig 1을 클릭하고 정렬을 분석하고 SN을 식별합니다(그림 1). 참고: 1.1.3-1.1.6 단계의 대안으로, PCR은 대량 샘플에서 얻은 격리된 게놈 DNA로부터 수행될 수 있다(>10개인에게서 파생). 서열 앰플리톤은 전기페로그램에 이중 피크로 나타나는 SNP의 존재를 위해 직접 분석될 수 있지만, 희귀 한 SNP는 검출하기가 더 어려울 것이다.</li>
		</ol></li>
		<li>설계 3-5 단일 가이드 RNA(sgRNA),위에서 식별된 SNP를 포함하는 영역을 피하여 18에 기재된 프로토콜에 따라.</li>
	</ol></li>
	<li>HRMA 프라이머 디자인<ol>
<li>mFold19를 사용하여 PCR 동안 이차 구조물의 가능한 형성을 위해 엑슨 서열을 테스트한다.<ol>
<li>UNAFold 웹 서버 | mFold | 클릭 드롭다운 메뉴에서 응용 프로그램 | 클릭 합니다. DNA 접이식 형태.</li>
			<li>상자에 시퀀스 이름을 입력하고 엑슨을 붙여 넣습니다.</li>
			<li>접이식 온도를 60°C로 변경; 이온 조건에서 [Mg++]를 1.5 로 변경하고 단위는 mM으로 전환합니다. 접힌 DNA를 클릭합니다.</li>
			<li>구조 1 아래출력에서 PDF를 클릭하여 원형 구조 플롯을 엽니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>시공 설계를 위해 초보 블래스트15 - 시공블터15 로 이동하십시오.</li>
		<li>페이지 상단의 상자에 1.1 단계(가장 낮은 수의 SMP 또는 SMP가 없는 시퀀스)에서 시퀀싱하여 결정된 선택한 엑슨 시퀀스를 복사하여 붙여넣습니다.</li>
		<li>기호 < > 사용하여 이차 구조의 가능한 형성이 가능한 SNP, 대상 사이트 및 영역을 포함하는 시퀀스를 표시하고 제외합니다.</li>
		<li>PCR 제품 크기를 80~150bp 사이로 선택하고 유기체를 선택한다. 참고: 큰 조각 크기(~300bp)를 성공적으로 사용할 수 있습니다. 그러나, 더 긴 앰플리콘은 하나 또는 단지 몇 개의 기본 쌍에서 다른 서열 사이 감도 감소시킬 수 있습니다.</li>
		<li>프라이머 받기를 클릭합니다. 테스트할 프라이머 2-3쌍을 선택합니다(이상적으로는 프라이머 사이트는 CRISPR 대상 사이트에서 ≥20-50bp 떨어져 있음).</li>
	</ol></li>
	<li>프라이머 유효성 검사<ol>
<li>단일 개인의 gDNA를 사용하여 그라데이션 PCR을 수행합니다.<ol>
<li>마스터 믹스를 준비하고 별도의 튜브에서 비템플릿 제어(NTC)에 대한 샘플 1개를 제거합니다. 나머지 마스터 믹스에 템플릿을 추가하고 알리따트를 96웰 플레이트에 넣습니다.</li>
			<li>사이클링 매개변수를 따르십시오: 98°C 30s, 10s용 98°C의 34사이클, 55-65°C 30s, 72°C 15s; 10 분 동안 72 °C의 최종 연장.</li>
			<li>매개 변수에 따라 열 용융 프로파일을 생성 : 1 분 동안 95 °C, 1 분 동안 60 °C를 어닐링, 0.2 ° C 단위로 75 °C와 95 °C 사이의 용융 곡선 검출, 각 온도에서 10 s의 홀드 타임을 갖는다. 참고: 열 용융 프로파일이 하나만 있는 온도만 사용해야 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>12년에 설명된 바와 같이 배아 주사를 가진 돌연변이 선을 생성하기 위하여 진행합니다.</li>
</ol>2. 모기 다리에서 게놈 DNA의 준비
<ol><li>G1 모기를 pupal 단계에서 섹스로 분리하여 유전자 를 배우기 전에 짝짓지 않도록하고 연령일치의 야생 식 제어 모기가 참조 및 백크로스에 사용할 수 있는지 확인하십시오. 섹스도 마찬가지입니다.</li>
	<li>필요한 물질(도 2A)을 수집하고 DNA 방출 시약의 0.5 μL및 20 μL의 희석 버퍼(gDNA 방출 키트로부터)를 가진 96개의 잘 PCR 플레이트를 준비하여 유전자형(도 2B)을 유전자형(도 2B)으로 하여 얼음에 둡니다. NTC에 대한 두 가지 반응을 예약합니다.</li>
	<li>96 플레이트의 각 우물이 트레이에 있는 각 모기 유리병에 대응되도록 모기 병(Drosophila 바이알)에 대한 트레이에 라벨을 붙입니다.</li>
	<li>G1 모기를 CO2로 마취하고 유리 페트리 접시에 넣고 진정시유지합니다(그림 2C, D). 마취하고 두 번째 페트리 접시에 8 야생 형 모기를 배치합니다.</li>
	<li>70% 에탄올로 핀셋 을 닦고 모기 뒷다리 중 하나를 제거합니다(그림 2E, F).</li>
	<li>DNA 방출 시약 용액에 다리를 잠그고, 해당 유리병에 모기를 배치하고, 스폰지로 닫습니다(도 2G, H).</li>
	<li>70%의 에탄올로 핀셋을 다시 닦고 다음 모기에서 다리를 제거합니다. 96웰 플레이트가 완성될 때까지 2.5-2.7 단계를 반복합니다. 참고: 70%의 에탄올로 핀셋을 닦는 것이 중요합니다. 이것은 DNA 교차 오염을 최소화합니다.</li>
	<li>광학 PCR 플레이트 씰(도 2I)으로 플레이트를 밀봉하고 실온(RT)에서 다리를 함유한 96웰 플레이트를 2-5분 동안 배양한 다음 98°C에서 2분 동안 배양한다. PCR 믹스를 준비하는 동안 접시를 RT로 식힙니다. 참고: 전체 프로세스는 일반적으로 3-4h가 소요됩니다. 모기가 예상 기간(특히 ≥1일)보다 더 많은 시간 동안 바이알에 보관되어야 하는 경우, 확장된 잠복기 동안 모기의 생존을 보장하기 위해 각 모기에 작은 건포도(또는 설탕과 물의 공급원)를 배치합니다.</li>
</ol>3. HRMA
<ol><li>PCR을 수행합니다.<ol>
<li>각 반응당 다음 성분을 포함하는 마스터 믹스를 준비: 2x 버퍼의 10 μL (gDNA 방출 키트에서), 각 프라이머의 0.5 μM, EvaGreen 염료의 1 μL, 폴리머 라제의 0.4 μL (gDNA 방출 키트에서), 분자 등급물로 19 μL로 완료.</li>
		<li>멀티채널 파이펫을 사용하여 마스터 믹스의 19 μL을 각 우물로 옮킨다. 섹션 2에서 제조된 모기 DNA를 포함하는 DNA 방출 용액의 1 μL을 플레이트로 전송한다(도 3A). 광학 PCR 플레이트 씰로 플레이트를 밀봉합니다.</li>
		<li>사이클링 파라미터 다음PCR을 수행: 5분 동안 98°C, 10초 동안 98°C의 39사이클, 선택된 어닐링 온도(72°C)를 30초; 최종 연장 72 °C 2 분.</li>
	</ol>
</li>
	<li>매개 변수에 따라 열 용융 프로파일을 생성 : 1 분 동안 95 °C, 1 분 동안 60 °C를 어닐링, 0.2 ° C 단위로 75 °C와 95 °C 사이의 용융 곡선 검출, 각 온도에서 10 s의 홀드 타임을 갖는다. CFX96 실시간 시스템을 사용하여 HRMA 실행에 대한 소프트웨어 설정에 대한 자세한 설명은 보충 자료 및 보충 도S1-S5 를 참조하십시오.</li>
	<li>용융 프로파일을 검사합니다(그림 3B). 참조 클러스터에 야생 식 컨트롤을 할당합니다. 참고: 소프트웨어( 재료 표 참조)는 자동으로 데이터를 정규화하고 다른 용융 곡선에 대한 색상으로 클러스터를 지정합니다.</li>
	<li>96웰 템플릿에 해당 색상으로 다른 클러스터를 표시합니다(그림 3C).</li>
	<li>관심 있는 곡선이 있는 개인을 선택하고 튜브에서 제거하고 백크로스(그림 3D)를 선택합니다. 짝짓기 암컷에게 혈액을 공급하고 G2 알을 수집합니다.</li>
</ol>4. Sanger 시퀀싱에 의한 서열 검증
<ol><li>선택된 모기(섹션 3.1에 제조된 플레이트에서)로 우물에서 PCR 제품을 정화하고, 효소를 사용하여 잔류 PCR 프라이머를 저하시키고, 과도한 dNTP를 탈포합니다. 또는 컬럼 정리 키트를 사용하고 시료 시퀀싱을 진행합니다. 참고: PCR 제품 크기가 작을 때 직접 시퀀싱이 더 어려울 수 있습니다(≤200 bp). 이러한 경우, 설계 프라이머는 표적 부위(≥250bp)를 포함하는 더 큰 단편을 증폭시키고 96웰 플레이트(2.2단계)에서 DNA를 이용하여 PCR에 의해 증폭된다.</li>
	<li>추적 뷰어 소프트웨어를 사용하여 인델을 분석하고 식별합니다(그림 4). 대안적으로, 폴리 피크 파저 소프트웨어20 은 이종화구균 개인에서 돌연변이를 검출하는 데 도움이 될 수 있다.<ol>
<li>폴리 피크 파저 웹 사이트로 이동 하여 찾아보기 메뉴의 돌연변이 개인에서 시퀀스를 선택하고 상자에 참조 시퀀스를 복사하여 붙여 넣습니다. 참고: 대체 본선과 참조 사이의 정렬이 화면 오른쪽에 자동으로 나타납니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

고해상도 용융 해석은 벡터 모기 Ae. aegypti에서 CRISPR/Cas9 기술로 생성된 인델을 식별할 수 있는 간단하고 빠른 솔루션을 제공합니다. 그것은 유연성을 제공, 철 물질 대사에 비행 근육에서 유전자의 넓은 범위에 대 한 돌연변이 모기의 유전자를 사용 하 여 13,14. HRMA는 샘플 수집에서 최종 분석에 이르기까지 단 몇 시간 만에 수행할 수 있습니다. 프라이머 설계에는 추가 시간이 필요하며 필요한 시퀀싱 결과(SN 식별), 시퀀스 분석 및 프라이머 주문을 받는 시간에 따라 달라집니다.
여기에 제시된 프로토콜은 성공적인 분석을 위한 단계별 방법을 자세히 설명합니다. 이 프로세스에서 가장 중요한 단계 중 하나는 프라이머의 적절한 설계입니다. HRMA는 증폭된 단편 내에서 단일 SNP의 존재도 돌연변이로 잘못 해석될 수 있는 강한 차이 곡선을 초래...

뎅기열1, Zika2 및 chikungunya3 바이러스와 같은 병원체의 벡터로, 말라리아 기생충4, 모기는 인간에게 중요한 공중 위생 위협을 나타냅니다. 이러한 모든 질병에 대 한, 모기 벡터의 제어에 전송 개입의 상당한 초점이 있다. 예를 들어 병원균, 모기 적합성, 생존, 번식 및 살충제에 대한 내성에 대한 관건성에서 중요한 유전자에 대한 연구는 새로운 모기 통제 전략을 개발하기위한 핵심입니다. 이러한 목적을 위해, 모기에 있는 게놈 편집은 특히 HEs, ZFN, TALENs와 같은 기술의 발달과 함께, 특히, Cas9를 가진 CRISPR와 같은 기술의 발달과 함께 일반적인 사례가 되고 있습니다. 유전자 편집균의 설립은 전형적으로 오프 표적 및 설립자 (병목 현상) 효력을 극소화하기 위하여 몇몇 세대에 대한 원하는 돌연변이를 운반하는 개별을 백교차하는 관련시킵니다, 동형질 또는 이테로지구우스 선을 생성하는 이종화구우스 개별을 교차하는 뒤에. 지배적 인 마커의 부재에서, 분자 지음은 많은 경우에, 이종화 척 돌연변이에 대한 명확한 현상 특성을 검출 할 수 없기 때문에이 과정에서 필요합니다.
시퀀싱은 지노티픽 특성화를 위한 금본위제이지만, 수백 명 또는 수천 명의 개인에게 이 것을 수행하는 것은 상당한 비용, 인건비 및 결과를 얻는 데 필요한 시간을 초래하며, 이는 모기와 같은 수명이 짧은 유기체에게 특히 중요합니다. 일반적으로 사용되는 대안은 측량체 뉴클레아제 분석5 (SNA), T7E1 분석6 및 고해상도 용융 분석 (HRMA, 검토 7)입니다. SNA와 T7E1은 모두 일치하지 않는 베이스만 갈라주는 엔도니슬리스를 사용합니다. 이종수 돌연변이 게놈의 돌연변이 부위가 증폭되면 돌연변이 및 야생 형 알레의 DNA 단편이 불일치된 이중 좌초 DNA(dsDNA)를 만들기 위해 어닐링됩니다. SNA는 불일치 별 엔도누리스와 간단한 아가로즈 젤 전기포고로 소화를 통해 불일치의 존재를 감지합니다. 대안적으로, HRMA는 dsDNA 결합 형광염료에 의해 검출된 dsDNA의 열역학적 특성을 사용하며, 염료의 분리 온도는 돌연변이의 존재 및 유형에 따라 변화한다. HRMA는 단일 뉴클레오티드 다형성(SNPs)8, 얼룩말 fish9, 미생물 응용 프로그램10 및 식물 유전 연구의 돌연변이 유전화 등의 검출을 위해 사용되어 왔다.
이 논문은 CRISPR/Cas9 기술로 생성된 돌연변이 모기에 대한 분자 지노티핑의 간단한 방법인 HRMA를 설명합니다. 대체 기술에 대한 HRMA의 장점은 1) 유연성을 포함, 그것은 다양한 유전자에 유용 입증 된 바와 같이, 인델 크기의 넓은 범위뿐만 아니라 다른 인델 크기와 이질, 동형 구스, 및 트랜스 이테로지구스 분화 사이의 구별12,13,14, 2) 비용, 그것은 일반적으로 사용되는 PCR 에 기초하여, 3) 비용, 저장 그것은 단지 몇 시간 만에 수행 할 수 있습니다. 또한, 프로토콜은 작은 신체 부위(leg)를 DNA의 원천으로 사용하여 모기가 genotyping 공정에서 살아남을 수 있게 하여 돌연변이 선의 확립 및 유지를 허용합니다.

<table><tbody><tr><td>70% 에탄올</td><td></td><td></td><td>70% 에탄올 용액</td></tr><tr><td>물 96-well PCR 및 Real-time PCR 플레이트</td><td>VWR</td><td>82006-636</td><td>게놈 DNA를 얻기 위해(모기 다리에서)</td></tr><tr><td>96-웰 플레이트 템플릿</td><td></td><td></td><td>집에서 만든 인쇄, 유전자형 기록용</td></tr><tr><td>Bio Rad CFX96</td><td>Bio Rad</td><td></td><td>PCR 그라디언트 및 HRMA 기능이 있는</td></tr> <tr><td>기계다양한 생명공학 시약 저장소</td><td>VWR</td><td>490006-896</td><td></td></tr><tr><td>Exo-CIP Rapid PCR Cleanup Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E1050S</td><td></td></tr><tr><td>유리 페트리 접시</td><td>VWR</td><td>89001-246</td><td>150mm x 20mm</td></tr><tr><td>하드 쉘 얇은 벽 96웰 스커트 PCR 플레이트</td><td>Bio-rad</td><td>HSP9665</td><td>HRMA용</td></tr><tr><td>다중 채널 피펫터(P10)</td><td>Integra Biosciences</td><td>4721</td><td></td></tr><tr><td>다채널 피펫터 (P300)</td><td>Integra Biosciences</td><td>4723</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 폴리올레핀 아크릴레이트 밀봉 테이프, Thermo Scientific</td><td>VWR</td><td>37000-548</td><td>96-웰과 함께 사용하기 위해&nbsp; 게놈 DNA를 얻기 위한 PCR 플레이트</td></tr><tr><td>광학 밀봉 테이프</td><td>Bio-rad</td><td>2239444</td> HRMA Phire Animal tissue direct PCR Kit(샘플링 도구 제외)<td>용 96웰 스커트 PCR 플레이트와 함께 사용</td></tr><tr><td>Thermo</td> <td>Fisher</td><td>F140WH</td><td>게놈 DNA 수집 및 PCR 플라스틱</td></tr><tr><td>플라이 바이알 분배기</td> 수행용 <td>Genesee</td><td>59-128W</td><td></td></tr><tr><td>정밀 용융 분석 소프트웨어</td><td>Bio Rad</td><td>1845025</td><td>모기 DNA 샘플의 유전형 분석 및 이중 가닥 DNA의 열 변성 특성 분석에 사용됨(프로토콜 단계 3.3 참조)</td></tr><tr><td>SeqMan Pro</td><td>DNAstar Lasergene 소프트웨어</td><td></td><td>다중 염기서열 정렬용</td></tr><tr><td>단일 채널 피펫터</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>핀셋 Dumont #5 11cm</td><td>WPI</td><td>14098</td><td></td></tr><tr><td>흰색 폼 플러그</td><td>VWR</td><td>60882-189</td><td></td></tr><tr><td>와이드 초파리 바이알, 폴리스티렌</td><td>Genesee</td><td>32-117</td><td></td></tr><tr><td>와이드 플라이 바이알 트레이, 블루</td><td>Genesee</td><td>59-164B</td><td></td></tr></tbody></table>

모기 aedes aegypti에서 고해상도 용융 분석을 사용하여 crispr/ cas9 돌연변이 발생 에 따른 인델 검출

Indel Detection following CRISPR/Cas9 Mutagenesis using High-resolution Melt Analysis in the Mosquito Aedes aegypti

모기 유전자 편집은 전사 활성제 와 같은 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 아연 핑거 뉴클레아제(ZFNs), 호밍 엔토뉴리스(HEs)와 같은 시스템을 구축하여 여러 실험실에서 일상화되고 있다. 최근에는 정기적으로 간격이 있는 짧은 palindromic 반복(CRISPR)/CRISPR 관련 단백질 9(Cas9) 기술이 정밀 게놈 엔지니어링을 위한 보다 쉽고 저렴한 대안을 제시했습니다. 핵작용에 따라 DNA 수리 경로는 깨진 DNA 끝을 고치고 종종 인델을 도입합니다. 이러한 프레임 외 돌연변이는 표적 유기체에서 유전자 기능을 이해하는 데 사용됩니다. 그러나 단점은 돌연변이 개인이 지배적인 마커를 가지고 있지 않으며, 특히 많은 실험에 필요한 비늘에서 돌연변이 알을 식별하고 추적하는 데 어려움을 겪고 있다는 것입니다. 
고해상도 용융 해석(HRMA)은 핵산 서열의 변이를 식별하고 PCR 용융 곡선을 활용하여 이러한 변이를 검출하는 간단한 방법입니다. 이 포스트 PCR 분석 방법은 온도 램프 제어 데이터 캡처 기능을 가지고 쉽게 96 웰 플레이트 형식으로 확장되는 계측과 형광 이중 좌초 DNA 결합 염료를 사용합니다. 여기에 설명된 CRISPR/Cas9 유도 인델의 신속한 검출과 모기 Ae. aegypti에 돌연변이 선의 확립을 위해 HRMA를 사용하는 간단한 워크플로우입니다. 비판적으로, 모든 단계는 다리 조직의 소량으로 수행 될 수 있으며 유전 성 후 수행 될 유전 십자가 또는 phenotyping 애술을 허용, 유기체를 희생 할 필요가 없습니다.

유전자 AaeZIP11 (putative iron transporter21)와 myo-fem (비행 근육13과 관련된 여성 편향된 묘신 유전자)에 돌연변이를 함유한 모기는 CRISPR/Cas9 기술을 사용하여 수득하였고, HRMA를 이용한 유전자형, 서열 검증(도 5)을 얻었다. 도 5A 및 도 5C 는 야생식 컨트롤과 함께 각각 AaeZIP11 및 myo-fem 돌연변이 샘플의 HRM 곡선으로부터 정규화된 형광 강도를 보여 준다. 도 4B 및 도 4D 는 야생형 참조로부터 각 곡선을 빼낸 후 소프트웨어가 할당한 상이...

이 문서에서는 CRISPR/Cas9에 의해 유도된 인델의 신속한 식별을 위한 프로토콜과 고해상도 용융 분석을 사용하여 모기 Aedes aegypti 의 돌연변이 라인을 선택하는 것에 대해 자세히 설명합니다.

모기 Aedes aegypti에서 고해상도 용융 분석을 사용하여 CRISPR/ Cas9 돌연변이 발생 에 따른 인델 검출

Mosquito gene editing has become routine in several laboratories with the establishment of systems such as transcription-activator-like effector nucleases ...

이 프로토콜은 CRISPR/Cas9 기술로 생성된 돌연변이를 감지하는 매우 간단하고 효율적인 방법입니다. 이 기술의 두 가지 주요 장점은 몇 시간 안에 수행 할 수 있으며 많은 유기체에 적용 가능하다는 것입니다. 특정 유전자에 도전적일 수 있는 프라이머 설계와 HRMA의 효율성을 높이는 데 여러 라운드의 프라이머 설계 및 검증이 필요할 수 있습니다.그라데이션 PCR을 수행하려면 마스터 믹스를 준비하여 시작합니다. 그런 다음 96웰 플레이트에서 비템플릿 제어 또는 NTC용 마스터 믹스의 19마이크로리터를 제거합니다. 그런 다음 나머지 마스터 믹스에 템플릿을 추가합니다.96웰 플레이트에 샘플 믹스의 Aliquot 20 마이크로리터. 사이클링 매개 변수에 따라 PCR을 수행한 다음 원고에 언급된 매개 변수를 사용하여 열 용융 프로파일을 생성합니다. 필요한 모든 재료를 수집한 후, DNA 방출 시약의 0.5 마이크로리터와 20 마이크로리터의 유전자형을 가진 마스터 믹스를 준비한다.멀티채널 파이프를 사용하여 믹스의 20 마이크로리터를 PCR 플레이트에 넣고 PCR 플레이트를 얼음 위에 놓습니다. 다음으로, 마취된 G1 모기를 유리 페트리 접시에 넣고 진정시키고 두 번째 페트리 접시에 8마리의 야생형 모기를 놓습니다. 70%에탄올로 핀셋 을 닦고 소독된 핀셋을 사용하여 모기 뒷다리 중 하나를 제거합니다.그런 다음, DNA 방출 시약 용액에 다리를 침수. 모기를 해당 바이알에 놓고 스폰지로 유리병을 닫습니다. 완료되면 핀셋을 70%에탄올로 닦은 후 96웰 플레이트가 완성될 때까지 다음 모기에서 다리를 제거합니다.나중에, 광학 PCR 플레이트 씰로 플레이트를 밀봉하고 2 ~ 5 분 동안 실온에서 다리를 포함하는 PCR 플레이트를 인큐베이션한 다음 2 분 동안 98도에서 배양하십시오. 접시를 실온으로 식힙니다. PCR의 경우, 선호하는 구성 요소를 포함하는 마스터 믹스를 준비한 다음 멀티채널 파이펫을 사용하여 마스터 믹스의 19마이크로리터를 96웰 플레이트의 각 웰로 전송합니다.이전에 준비된 모기 DNA를 함유한 DNA 방출 용액의 마이크로리터 1개를 플레이트로 옮은 후, 광학 PCR 플레이트 씰로 플레이트를 밀봉한다. 적절한 사이클링 파라미터로 PCR을 수행하여 원고에 설명된 매개 변수에 따라 열 용융 프로파일을 생성한 다음, 기준 클러스터에 야생식 컨트롤을 할당하여 용융 프로파일을 검사합니다. 96웰 템플릿에 해당 색상으로 다른 클러스터를 표시합니다.다음으로, 관심의 곡선을 가진 개인을 선택하고 다시 십자가튜브에서 선택한 개인을 제거합니다. 혈액 공급 만든 그것은 여성, G2A를 수집 하 여 다음. 대표적인 분석에서 Aedes aegypti의 ZIP11 돌연변이의 서열 분석이 도시된다.Aedes aegypti ZIP11 이종화구균 돌연변이체의 전전자페로그램은 인델이 발생한 뉴클레오티드 위치를 나타냈다. 다형성 위치가 두 뉴클레오티드를 모두 수반적으로 보여주면서 인델은 단일 에서 이중 피크로의 변화로 표현됩니다. 실행이 끝나면 단일 피크를 계산하여 삭제되거나 삽입된 기본 쌍의 수를 계산했습니다.유전자Aedes aegypti ZIP11 및 myo-fem에 돌연변이를 포함하는 모기는 HRMA의 고해상도 용융 분석을 사용하여 유전자형 및 서열 확인하였다. 샘플의 형광 신호는 1대 0의 상대값으로 정규화되었다. 또한 각 곡선은 야생형 참조에서 빼고 해당 배율을 표시했습니다.실패한 자동 클러스터 할당은 대표 결과에 표시되며 그룹 간의 적절한 구별이 이루어지지 않았습니다. 또한, 각 시료는 이종고트, 동형질및 트랜스헤터로지고테스의 참조 샘플에 대한 유사성에 기초하여 올바른 그룹에 개별적으로 분석되고 할당되었다. HRMA를 수행 한 후, 돌연변이 된 개인으로부터 DNA를 시퀀싱하면 인델을 분석하고 표적 서열에서 다른 돌연변이를 식별해야합니다.

indel-detection-following-crisprcas9-mutagenesis-using-high

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

이 동영상은 DNA 샘플에서 indel 돌연변이를 식별하는 데 있어 디지털 액적 중합효소 연쇄 반응의 역할을 보여줍니다. ddPCR의 높은 정밀도와 감도는 낮은 수준에서도 샘플에 존재하는 희귀 돌연변이를 정확하고 일관되게 검출할 수 있습니다. 게놈의 여러 영역에서 indel 돌연변이를 식별하고 정량화할 수 있으며, 이를 통해 돌연변이의 메커니즘과 이러한 돌연변이의 기능적 결과에 대한 귀중한 통찰력을 얻을  수 있습니다.

타겟 유전자의 Indel 돌연변이 검출을 위한 디지털 액적 중합효소 연쇄 반응

이 비디오는 웰을 따라 그래디언트 어닐링 온도를 설정하는 프라이머의 어닐링 온도 최적화를 위한 그래디언트 중합효소 연쇄 반응을 보여줍니다. 다양한 어닐링 온도의 효과는 반응 조건을 최적화하는 데 도움이 되는 증폭된 산물의 수율에 의해 결정됩니다.

최적의 어닐링 온도를 결정하기 위한 그래디언트 중합효소 연쇄 반응

이 프로토콜 편집 시스템 복구에 대 한 포유류 세포에 있는 점 돌연변이의 CRISPR/Cas9 기반 유전자의 워크플로 설명 합니다. 여기, 우리 유전자 편집 대상 사이트에서 indel 형성을 측정 하기 위한 상세한 후속 실험 전략으로 조합 방식을 사용-본질적으로, 현장 mutagenesis 분석.

점 돌연변이 수리 CRISPR/Cas9 및 SsODN 인간 세포에 의해 촉매의 기능으로 현지 변이 검사 하는 표준 방법론

이 프로토콜은 CRISPR/Cas9 유전자 편집 도구와 함께 작동하도록 최적화된 Culex quinquefasciatus 태아를 위한 미세 주입 절차를 기술합니다. 이 기술은 이 저학질병 벡터에 있는 유전 기술을 구축하는 데 사용될 수 있는 사이트 특정, 유전성, 생식선 돌연변이를 효율적으로 생성할 수 있습니다.

컬렉스 퀸케파시아투스의 효율적인 부위 별 돌연변이 발생을 위한 배아 미세 주입 기술

CRISPR/Cas9는 비모델 유기체에서 유전자 기능을 특성화하는 데 점점 더 사용됩니다. 이 프로토콜은 주입 믹스 준비에서 모기 배아를 획득하고 주입하는 것뿐만 아니라 주입 된 모기와 원하는 돌연변이에 대한 자손을 후면, 교차 및 선별하는 방법에 이르기까지 Culex pipiens의녹아웃 라인을 생성하는 방법을 설명합니다.

CRISPR/Cas9를 사용하여 Null 돌연변이를 생성하기 위해 컬렉스 모기의 배아를 준비하고 주입합니다.

여기에 제시 헬 리코파 armigera 의 프로토콜입니다 (Hübner) 태아 미세 주입 및 CRISPR / Cas9 게놈 편집에 의해 생성 된 녹아웃 돌연변이 식별. 돌연변이 곤충은 생체 내의 다른 유전자 들 사이에서 유전자 기능 및 상호 작용의 추가 연구를 가능하게 합니다.

CRISPR/Cas9 게놈 편집 헬리코파 아르미게라 의 배아 미세 주입 및 녹아웃 돌연변이 식별 (휘브너)

이 프로토콜은 φC31 시스템을 사용하여 Anopheles 말라리아 모기의 게놈에서 사이트 지향적 인 수정을 달성하는 방법을 설명합니다. 설명된 수정은 attP 베어링 도킹 라인의 게놈에 있는 형질전환 카세트의 통합 그리고 교환둘 다 포함됩니다.

말라리아의 아노필스 벡터에서 사이트 지향 φC31 중재 통합 및 카세트 교환

이 프로토콜은 gRNA 유도 Cas9 분열 및 DNA 수리 에 따른 표적 부위에서 비균성 최종 결합(NHEJ) 이벤트의 식별 및 정량화를 위한 분석을 포함하여 디지털 물방울 PCR(ddPCR)에 대한 실험용 설정에 DNA 추출에서 단계를 제공합니다. 이 방법의 그밖 용도는 다형성 검출 및 유전자 편집 이체 확인과 같은 응용을 포함합니다.

유전자 변형 된 Anopheline 모기 인구에서 인델 돌연변이를 감지하는 디지털 물방울 PCR

여기에서는 CRISPR-Cas9 기술을 사용하여 모기 A. aegypti 에서 배아 미세주입을 통한 게놈 편집을 위한 자세한 프로토콜에 대해 설명합니다.

CRISPR-Cas9을 이용한 황열병 모기 이집트숲모기(Mosquito Aedes aegypti )의 게놈 편집

유전자 인코딩 히스톤 - miniSOG는 푸른 빛 의존적으로 게놈 전체의 유전 변이를 유도한다. 이 돌연변이 유발 방법은 빠르고 간단 독성 화학 물질의 자유, 앞으로 유전자 검사 및 유전자 통합에 적합합니다.

히스톤 - miniSOG에서 사용 Optogenetic 무작위 돌연변이 유발<em&gt; C. 엘레</em

학습하세요 CRISPR/Cas9 돌연변이를 고해상도 용융 분석(HRMA)으로 빠르게 검출하는 방법을 Aedes aegypti 모기에서 적용하여 유전자 편집 효율성을 높이는 프로토콜입니다.

모기 Aedes aegypti에서 고해상도 용융 분석을 사용하여 CRISPR/ Cas9 돌연변이 발생 에 따른 인델 검출

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