Name: 접합 효율 모니터링을 위한 기자 기반 셀룰러 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: 학습하세요 HeLa 세포를 이용한 RNA 접합 효율 모니터링 기자 분석법으로, 질병 관련 돌연변이의 영향을 평가하고 치료적 U1 snRNA 개발을 위한 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 작품은 국립 보건원 (R21CA170786 및 R01GM127464)과 미국 암 학회 (기관 연구 보조금 74-001-34-IRG)와 밸리 연구 파트너십 프로그램 (P1-4009 및 VRP7)의 S.S. 및 W.M에 대한 자금으로 지원되었습니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

<ol><li>Zhuang, Y., Weiner, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+compensatory+base+change+in+U1+snRNA+suppresses+a+5%27+splice+site+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A compensatory base change in U1 snRNA suppresses a 5' splice site mutation.</a> Cell. 46 (6), 827-835 (1986).</li>
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<li>Yamazaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+modified+U1+small+nuclear+RNA+for+rescue+from+exon+7+skipping+caused+by+5%27-splice+site+mutation+of+human+cathepsin+A+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Use of modified U1 small nuclear RNA for rescue from exon 7 skipping caused by 5'-splice site mutation of human cathepsin A gene.</a> Gene. 677, 41-48 (2018).</li>
<li>Yanaizu, M., Sakai, K., Tosaki, Y., Kino, Y., Satoh, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+nuclear+RNA-mediated+modulation+of+splicing+reveals+a+therapeutic+strategy+for+a+TREM2+mutation+and+its+post-transcriptional+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Small nuclear RNA-mediated modulation of splicing reveals a therapeutic strategy for a TREM2 mutation and its post-transcriptional regulation.</a> Science Reports. 8 (1), 6937(2018).</li>
<li>Balestra, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+mutations+impairing+CDKL5+expression+and+activity+can+be+efficiently+rescued+by+U1snRNA-based+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Splicing mutations impairing CDKL5 expression and activity can be efficiently rescued by U1snRNA-based therapy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 20174130(2019).</li>
<li>Donadon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exon-specific+U1+snRNAs+improve+ELP1+exon+20+definition+and+rescue+ELP1+protein+expression+in+a+familial+dysautonomia+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Exon-specific U1 snRNAs improve ELP1 exon 20 definition and rescue ELP1 protein expression in a familial dysautonomia mouse model.</a> Human Molecular Genetics. 27 (14), 2466-2476 (2018).</li>
<li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoDrop+microvolume+quantitation+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), e2565(2010).</li>
<li>Summer, H., Gramer, R., Droge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Denaturing+urea+polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28Urea+PAGE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE).</a> Journal of Visualized Experiments. (32), e1485(2009).</li>
<li>Dominski, Z., Kole, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+splice+sites+in+pre-mRNAs+with+short+internal+exons%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Selection of splice sites in pre-mRNAs with short internal exons.</a> Molecular Cell Biology. 11 (12), 6075-6083 (1991).</li>
<li>Amir-Ahmady, B., Boutz, P. L., Markovtsov, V., Phillips, M. L., Black, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exon+repression+by+polypyrimidine+tract+binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Exon repression by polypyrimidine tract binding protein.</a> RNA. 11 (5), 699-716 (2005).</li>
<li>Le Guedard-Mereuze, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+contexts+that+determine+the+pathogenicity+of+base+substitutions+at+position+%2B3+of+donor+splice-sites%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutation%22%5BJournal%5D)">Sequence contexts that determine the pathogenicity of base substitutions at position +3 of donor splice-sites.</a> Human Mutation. 30 (9), 1329-1339 (2009).</li>
<li>Sharma, S., Wongpalee, S. P., Vashisht, A., Wohlschlegel, J. A., Black, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-loop+4+of+U1+snRNA+is+essential+for+splicing+and+interacts+with+the+U2+snRNP-specific+SF3A1+protein+during+spliceosome+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Stem-loop 4 of U1 snRNA is essential for splicing and interacts with the U2 snRNP-specific SF3A1 protein during spliceosome assembly.</a> Genes and Development. 28 (22), 2518-2531 (2014).</li>
<li>Steitz, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSteitz%2C+JA+%22Functions+of+the+abundant+U-snRNPs.+Structure+and+function+of+major+and+minor+small+nuclear+ribonucleoprotein+particles%22">Functions of the abundant U-snRNPs. Structure and function of major and minor small nuclear ribonucleoprotein particles</a>. , Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Heidelberg. 115-154 (1988).</li>
<li>Fortes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibiting+expression+of+specific+genes+in+mammalian+cells+with+5%27+end-mutated+U1+small+nuclear+RNAs+targeted+to+terminal+exons+of+pre-mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Inhibiting expression of specific genes in mammalian cells with 5' end-mutated U1 small nuclear RNAs targeted to terminal exons of pre-mRNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 100 (14), 8264-8269 (2003).</li>
<li>Roca, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+recognition+of+5%27+splice+sites+by+noncanonical+base-pairing+to+U1+snRNA+involving+bulged+nucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Widespread recognition of 5' splice sites by noncanonical base-pairing to U1 snRNA involving bulged nucleotides.</a> Genes and Development. 26 (10), 1098-1109 (2012).</li>
<li>Roca, X., Krainer, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+atypical+5%27+splice+sites+by+shifted+base-pairing+to+U1+snRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Recognition of atypical 5' splice sites by shifted base-pairing to U1 snRNA.</a> Nature Structural Molecular Biology. 16 (2), 176-182 (2009).</li>
<li>Taladriz-Sender, A., Campbell, E., Burley, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splice-switching+small+molecules%3A+A+new+therapeutic+approach+to+modulate+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Splice-switching small molecules: A new therapeutic approach to modulate gene expression.</a> Methods. 167, 134-142 (2019).</li>
<li>Hamid, F. M., Makeyev, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+underlying+position-specific+regulation+of+alternative+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A mechanism underlying position-specific regulation of alternative splicing.</a> Nucleic Acids Research. 45 (21), 12455-12468 (2017).</li>
<li>Martelly, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+roles+for+human+U1+snRNA+stem-loops+in+pre-mRNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Synergistic roles for human U1 snRNA stem-loops in pre-mRNA splicing.</a> RNA Biology. , 1-18 (2021).</li>
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저자는 공개 할 것이 없습니다.

분석은 HeLa 이외의 세포주에서 접합 분석을 위해 적응될 수 있지만, 세포 합류 및 DNA의 양과 같은 형질 응력에 영향을 미치는 요인은 최적화될 필요가 있다. 리포터에서 U1 구문비는 다른 세포 유형에서 관찰된 발현 수준에 따라 결정되어야 할 수 있는 또 다른 중요한 매개 변수이다. 추출된 RNA의 품질은 접합 분석에 중요합니다. 따라서 RNase 비활성화 제의 로 RNase 가없는 물 및 표면의 오염 제거를 사용하는 것이 좋습니다.
프라이머 확장 또는 형광 RT-PCR에 의한 리포터 성적증명서의 분석은 유사한 결과를 산출하므로 성숙한 성적증명서에 엑슨 2의 포함 변화를 모니터링하기 위해 어느 기술을 사용할 수 있다. 형광 PCR 반응은 초기 RNA 농도에 의존하는 증폭의 기하급수단계에서 중지되고 정량화되어야 합니다. 따라서, 증폭 주기의 수는 여기에 설명된 것과 다른 형질 계류 조건을 가진 저술에 대해 결정되어야 할 수도 있다. 비방사성 특성으로 인한 사용의 용이성은 RT-...

pre-mRNA 접합은 비코딩 인트론을 제거하고 코딩 엑손을 정확하게 리게이트하여 성숙한 mRNA를 형성하는 필수적인 처리 단계입니다. 5′-스플라이스 사이트 및 3′-스플라이스 사이트라고 하는 엑손 인트론 교차로에서 컨센서스 시퀀스를 인식하는 것은 접합 기계의 구성 요소에 의해 접합 과정을 시작합니다. U1 소형 핵리보뉴클레오프로틴(snRNP)은 U1 snRNA를 사전 mRNA1에 기본 페어링하여 5′-스플라이스 부위를 인식합니다. 5′-스플라이스 사이트 서열을 변경하는 유전적으로 승계한 돌연변이는 많은 질병2,3와 연관됩니다. U1 snRNA의 염기 페어링을 돌연변이 5′-스플라이스 사이트로 손상하면 비정상적인 접합이 발생하여 영향을 받는 성적증명서의 번역을 손상시킬 수 있습니다. 접합 결함을 해결하기 위한 잠재적인 치료 접근법은 5′-splice 사이트와 기초가 되는 5′-지구에 있는 보상 뉴클레오티드 변경을 운반하는 수정된 U1 snRNA에 의하여 돌연변이의 억제를 관련시킵니다. 이러한 수정된 U1 snRNAs는 exon 특정 U1 snRNAs라고도 하며, 접합 결함을 반전시키는 데 효과적인 것으로 밝혀졌으며, 그 결과 구조된 mRNA4,5,6,7,8에서 단백질 발현이 증가되는 것으로 나타났다.
여기에서, 우리는 U1 snRNP 보완 분석, 엑슨의 접합에 5′ss 돌연변이의 효과의 평가를 허용하고 또한 엑슨 포함의 구조를 가능하게 하는 수정된 U1 snRNAs의 발달에 사용될 수 있는 기자 기지를 둔 세포 접면 분석서를 기술합니다. 또한 프라이머 확장 및 RT-PCR에 의해 접합된 리포터 성적증명서를 모니터링하고, 프라이머 확장 및 RT-qPCR에 의해 수정된 U1 snRNAs의 발현을 결정하기 위한 프로토콜을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>시약 등급 탈이온수</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23-751628</td><td></td></tr><tr><td>디에틸 피로카보네이트(DEPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) 분말 패킷</td><td>Gibco</td><td>12100-046</td><td></td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS), 호주 출처, 열 비활성화</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-22</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신(P/S)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458-100ML</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨, 표준 용액 1.0N</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2567-16A</td><td></td></tr><tr><td>염산, ACS Plus 인증, 36.5 - 38.0%</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A144-500</td><td></td></tr><tr><td>일회용 PES 병 뚜껑 필터</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FB12566510</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 디소듐 염 디하이드레이트</td><td>Amresco</td><td>0105-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>2.5% 트립신(10x), 페놀 레드 없음</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Fisher Bioreagent</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>Fisher Bioreagent</td><td>BP366-1</td><td></td></tr><tr><td>디소듐 인산수소 헵타하이드레이트</td><td>피셔 바이오시약</td><td>BP332-1</td><td></td></tr><tr><td>포타슘 디하이드로겐 인산</td>염 <td>피셔 바이오시약</td><td>BP362-1</td><td></td></tr><tr><td>트랜스펙션 배지 - Opti-MEM&trade; 나는 혈청 매체, 페놀 레드 없음</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Transfection 시약 - Lipofectamine&trade; 2000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13778150</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol&trade; 시약</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름(방부제/분자생물학으로서의 약 0.75% 에탄올)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>에탄올, 절대(200프루프), 분자생물학 등급, Fisher BioReagents ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>BP2818-4</td><td></td></tr><tr><td>이소프로판올, 분자생물학 등급, Fisher BioReagents</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP2618-212</td><td></td></tr><tr><td>글리코겐 (5 mg/ml)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9510</td><td></td></tr><tr><td>Direct-zol RNA Miniprep Kit</td><td>Zymo Research</td><td>R2052</td><td></td></tr><tr><td>ATP, [&gamma;-32P]- 6000Ci/mmol 150mCi/ml 납, 1 mCi</td><td>PerkinElmer</td><td>NEG035C001MC</td><td></td></tr><tr><td>T4 폴리뉴클레오티드 키나아제</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>크기 제외 콩 - 세파덱스&reg; G-25</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2580-10G</td><td></td></tr><tr><td>크기 제외 미니 컬럼</td><td>USA Scientific</td><td>1415-0600</td><td></td></tr><tr><td>pBR322 DNA-MspI Digest</td><td>New England Biolabs</td><td>N3032S</td><td></td></tr><tr><td>저분자량 마커, 10-100 nt</td><td>Affymetrix</td><td>76410 100 UL</td><td></td></tr><tr><td>Rnase 비활성화 시약 - RNaseZAP&trade;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2020-250ML</td><td></td></tr><tr><td>dNTP 믹스 (10 mM ea)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18427013</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT&trade; 재조합 리보뉴클레아제 억제제</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>역전사효소 - M-MLV 역전사효소</td> 프라이<td>머 확장에 사용되는</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28025013</td></tr><tr><td>Taq DNA 중합효소</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10342020</td><td></td></tr><tr><td>랜덤 헥사머(50 &micro; M)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>N8080127</td><td></td></tr><tr><td>실시간 PCR 믹스 - SYBR&trade; Master:</td> Mix를 선택하십시오: <td>ThermoFisher Scientific</td><td>4472903</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript&trade; III 역전사 효소</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080093</td><td>cDNA 준비에 사용됨</td></tr><tr><td>디티오트레이톨 (DTT)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080093</td><td></td></tr><tr><td>5X First-Strand Buffer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080093</td><td></td></tr><tr><td>포름아미드 (&ge; 99.5%)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP228-100</td><td>Review 물질안전보건자료</td></tr><tr><td>브로모페놀 블루 나트륨염</td><td>시그마-알드리치</td><td>114405-5G</td><td></td></tr><tr><td>자일렌 시아놀 FF</td><td>시그마-알드리치</td><td>2650-17-1</td><td></td></tr><tr><td>트리스 베이스(백색 결정 또는 결정성 분말/분자생물학)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>붕산(결정성/ 전기영동)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP168-500</td><td></td></tr><tr><td>아크릴아미드: 비스-아크릴아미드 19:1 (40% 용액/전기영동)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP1406-1</td><td>Review 물질안전보건자료</td></tr><tr><td>요소(무색-백색 결정 또는 결정성 분말/mol. biol.)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP169-212</td><td></td></tr><tr><td>과산화이황산암모늄(APS) &ge; 98%, Pro-Pure, 단백질체학 등급</td><td>VWR</td><td>M133-25G</td><td></td></tr><tr><td>시그마코트</td><td>시그마-알드리치</td><td>SL2-100ML</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민(TEMED) &ge; 99%, 초순수</td><td>VWR</td><td>0761-25ML</td><td>검토 재료 안전 데이터 시트</td></tr><tr><td>조절 가능한 슬랩 젤 시스템, Expedeon</td><td>VWR</td><td>ASG-400</td><td></td></tr><tr><td>수직 젤 랩 & 트레이드; 유리 플레이트 세트, 16.5 x 14.5cm</td><td>VWR</td><td>NGP-125NR</td><td></td></tr><tr><td>수직 젤 랩&트레이드; 유리 플레이트 세트, 16.5 x 22.0cm</td><td>VWR</td><td>NGP-200NR</td><td></td></tr><tr><td>수직 젤 랩&트레이드; 유리 플레이트 세트, 16.5 x 38.7cm</td><td>VWR</td><td>NGP-400NR</td><td></td></tr><tr><td>GE 저장 인광 스크린</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE28-9564</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon&trade; FLA 7000 생체 분자 이미저</td>, <td>GE Healthcare</td><td>, 28-9610-73, AB</td><td></td></tr>, <tr><td>Beckman Coulter, LS6500 액체 섬광 계수기,</td><td>GMI</td><td>8043-30-1194</td><td></td></tr>, <tr><td>C1000 터치 열 순환기</td><td>, ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR 시스템</td><td>, ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

접합 효율 모니터링을 위한 기자 기반 셀룰러 분석

A Reporter Based Cellular Assay for Monitoring Splicing Efficiency

유전자 발현 동안, pre-mRNA 접합의 중요한 단계는 성숙한 mRNA의 세포질 수출 의 앞에 엑손에 합류하고 인트론을 제거하기 위하여 스플라이스 사이트의 정확한 인식 및 pliceosomal 복합체의 능률적인 조립을 관련시킵니다. 접합 효율은 스플라이스 부위의 돌연변이 존재, 트랜스 작용 접합 인자의 영향 또는 치료제의 활동에 의해 변경될 수 있다. 여기에서는 주어진 exon의 접합 효율을 모니터링하기 위해 적용할 수 있는 셀룰러 분석프로토콜을 설명합니다. 분석법은 적응형 플라스미드 인코딩된 3-엑손/2-intron 미니진 리포터를 사용하며, 이는 일시적인 과도 경질에 의해 포유류 세포에서 발현될 수 있다. 전염 후, 총 세포 RNA는 단리되고, 기자 mRNA에서 결합하는 엑슨의 효율은 프라이머 확장 또는 반정량 역전사-폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)에 의해 결정된다. 우리는 어떻게 관련된 질병의 충격을 설명합니다 5′ 스플라이스 사이트 돌연변이는 기자에 그(것)들을 소개하여 결정될 수 있습니다; 그리고 이러한 돌연변이의 억제는 U1 작은 핵 RNA (snRNA)와 의 결합에 의해 달성 될 수있는 방법 5′ 지역에서 보상 돌연변이를 운반 하는 구성 은 사전 mRNAs에 있는 엑손 인 트론 접합부에서 5′splice 사이트와 기질. 따라서, 리포터는 돌연변이 5′ 스플라이스 사이트의 인식을 향상시키기 위해 치료 U1 입자의 설계에 사용될 수 있다. 인핸서 또는 소음기 시퀀스를 접합하는 것과 같은 시스 작용 규제 사이트를 리포터에 삽입하여 특정 대체 접합 계자에 의해 중재된 규제에서 U1 snRNP의 역할을 검사하는 데도 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 세포를 발현하는 기자는 소분자로 배양하여 구성적인 사전 mRNA 접합 또는 돌연변이 5′ 스플라이스 부위를 운반하는 엑슨에 잠재적 인 치료법의 효과를 결정할 수 있습니다. 전반적으로, 리포터 분석은 기본적인 접합 기계장치 및 접합 관련 질병을 연구하기 위하여 다양한 조건에서 접합 효율을 감시하기 위하여 적용될 수 있습니다.

접합 기자 Dup51, 3 개의 엑손-2 인트론 미니진은 인간 β-글로빈 유전자로부터 유래되었으며 이전에 설명되었다(그림 1A)11,12. 우리는 돌연변이 기자, Dup51p, 프로토 카데린 의 엑슨 3에서 발생하는 Usher 증후군 과 관련된 5'splice 사이트 돌연변이를 도입하여 15 (PCDH15) gene13. 엑손 2-인트론 2 접합부에서의 5'splice 사이트 서열은 CAG/GUUGGUAUC에서 AUG/GUGUGUAUC로 변경되었습니다(//엑손인트론 경계)(그림 1B)14. 이러한 서열 변화는 내인성 U1 snRNA와 5'-스플라이스 부위 베이스페어링의 예측 패턴을 변경하고 성숙한 성적증명서에서 엑슨 2...

이 프로토콜은 5'splice 사이트 돌연변이가 접합에 미치는 영향을 모니터링하기 위한 미니유전자 기자 분석체를 설명하고 돌연변이 유발 접합 억제를 위한 억제기 U1 snRNA를 개발한다. 리포터 및 억제기 U1 snRNA 구조는 HeLa 세포에서 발현되고, 접합은 프라이머 확장 또는 RT-PCR에 의해 분석된다.

During gene expression, the vital step of pre-mRNA splicing involves accurate recognition of splice sites and efficient assembly of spliceosomal complexes ...

이 프로토콜은 적응형 관리 리포터를 사용하여 접합 효율을 모니터링하기 위한 셀룰러 분석서를 설명합니다. 이 기자 분석은 엑손 또는 스플라이스 부위에 있는 질병 관련 돌연변이의 효력을 연구하고, 5점 스플라이스 사이트로 돌연변이의 인식을 향상시키기 위하여, 특정 한 입자를 디자인하기 위하여 이용될 수 있다. Hela 세포의 통로는 소비된 매체를 흡인하고 3분 동안 섭씨 37도에서 1밀리미터 EDTA를 포함하는 0.2 5%의 3밀리리터로 세포를 배양합니다.신선한 DMEM의 7 밀리리터에서 배양 후 10 밀리리터 튜브로 세포 현탁액을 전송합니다. 세포를 원심분리합니다. 그런 다음 신선한 DMEM의 10 밀리리터에서 세포 펠릿을 다시 중단하고, 과도 성 과도 성 전환에 대한 20 %의 합류로 새로운 조직 배양 접시에 세포를 플레이트.깨끗한 헤모 세포계 슬라이드로 헬라 세포를 계산하고 밀리리터 당 5 세포에 2.5 배 10의 밀도로 현탁액을 준비하고, 셀 서스펜션의 1 밀리리터를 12 웰 플레이트의 각 우물로 시드하고 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 소비 된 매체를 흡인하고 접시에 세럼으로 신선한 DMEM 800 마이크로 리터를 추가합니다. 15초 동안 배분 믹스를 준비하고 소용돌이를 준비합니다.그런 다음 원심 분리를 혼합하고 실온에서 5 분 동안 배양합니다. 배양 후 200 마이크로리터를 모두 12웰 헬라 세포 플레이트중 하나의 우물에 추가하여 1밀리리터당 1밀리리터의 최종 부피를 달성하고 48시간 동안 37°C에서 플레이트를 배양한다. 준비된 라벨링 반응이 인큐베이팅되고 있습니다.25킬로 달튼 분자량 컷오프 크기 제외 구슬을 10초 동안 부드럽게 소용돌이에 의해 재중단합니다. 다음으로 재매달된 구슬 600마이크로리터를 일회용 미니 컬럼으로 옮기고 1.5밀리리터 수집 튜브에 넣고 구슬 재고를 섭씨 4도로 되돌려 놓습니다. 열을 원심 분리하고 열을 통해 흐름을 삭제합니다.그런 다음 기둥에 RNA 프리 워터 300 마이크로리터를 추가하여 구슬을 두 번 씻는다. 두 번째 세척 후 미니 컬럼을 새로운 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기고 컬럼에 키나아제 반응 믹스를 추가합니다. 원심분리기 컬럼을 원심분리하고 P32 표지된 올리고뉴클레오티드를 함유하여 흐름을 수집한다.헬리 세포에서 추출한 RNA 2마이크로그램을 200마이크로리터 마이크로 원심분리기 튜브에 추가하고 RNA 프리 워터를 추가하여 6.55 마이크로리터에 볼륨을 구성합니다. 다음으로 RNA 샘플을 포함하는 각 PCR 튜브에 마스터 믹스 1개를 추가하고, 튜브를 섭씨 65도에서 5분 동안 먼저 배양한 다음 얼음에 1분 동안 배양합니다. 다음으로 2.55 마이크로리터, 마스터 믹스 2, RNA및 마스터 믹스 를 포함하는 각 튜브에 10 분 동안 실온에서 튜브를 배양한다.인큐베이션 후 튜브를 열 사이클러로 옮기고 먼저 섭씨 50도에서 60분 동안 배양한 다음 섭씨 70도에서 15분 동안 배양합니다. 인큐베이션 후, 각 샘플에 2X 폼아미드 RNA 로딩 염료의 10 마이크로리터를 추가하고 UIA 페이지별로 조각을 분리한다. 퍼시 DNA 합성.200 마이크로리터 미크론심심분리기 튜브에 대용량 헬라 세포에서 추출한 RNA 2마이크로그램을 추가하고, RNA가 없는 물을 추가하여 11마이크로리터에 부피를 만회합니다. 다음으로, 두 개의 마이크로리터를 추가하고, 마스터 믹스를 각 샘플에 하나씩 넣고 5분 동안 섭씨 65도에서 먼저 배양한 다음 1분 동안 얼음위에 누배합니다. 다음으로, 각 튜브에 마스터 믹스 2인 7개의 마이크로리터를 추가하고 실온에서 10분 동안 튜브를 배양한 다음, 60분 동안 50도, 섭씨 70도에서 15분 동안 인큐베이션을 합니다.다음으로, PCR의 경우 C DNA 반응을 희석하여 마이크로리터당 100나노그램의 농도를 산출하고 각 CDNA 샘플의 마이크로리터 1개를 새로운 PCR 튜브로 전송한다. CDNA를 포함하는 각 튜브에 마스터 믹스의 10.5 마이크로리터를 추가하고 PCR을 수행합니다. PCR이 완료된 후 열순환기 사용.각 튜브에 2X 폼아미드 DNA 로딩 염료의 12.5 마이크로리터를 추가합니다. 샘플을 섭씨 95도에서 5분간 가열하고 UIA 페이지를 진행합니다. 96웰 qpcr 플레이트 트리플리케이트의 개별 우물에 희석 된 CDNA의 파이펫 5 마이크로 리터.다음으로 각 웰에 실시간 PCR 믹스 10 마이크로리터를 추가하고, 광학 필름으로 플레이트를 밀봉하고, 원심분리기를 사용하여 우물 바닥에 대한 반응을 수집한 다음, 대상 앰플리콘의 임계 정량화 주기 값을 수집하는 동안 qpcr를 수행합니다. 마커와 샘플을 로드하기 전에 TBE 버퍼로 우물을 플러시하여 정착된 우레아를 제거합니다. 그런 다음 각 샘플당 10 마이크로리터를 적재하고 2~3시간 동안 300~500볼트로 젤을 실행하거나 자일렌이 바닥에 닿을 때까지 실행합니다.전기전도후 전기포고가소장치에서 유리판을 제거하고 두 판을 조심스럽게 분리하여 젤이 유리 표면에 평평하게 놓이도록 한 다음, 젤을 필터 용지에 옮기고 플라스틱 랩으로 덮어 젤 건조기 진공을 사용하여 30분 동안 젤을 건조시하고, 그런 다음 건조 된 젤을 실내 온도에서 하룻밤 잠식용 인광 화상 진찰 카세트에 놓습니다. 헬라 세포에서 발현되면, 슬라이스 리포터 dup 51 minnijean은 엑손 2가 효율적으로 접합되는 성숙한 전체 길이 의 성적 증명서를 표현한다. 5개의 주요 스플라이스 사이트 돌연변이 및 dup 51 P는 엑손2개의 포함을 95에서 30%로 감소시켜 더 짧은 성적증명서의 형성으로 이끌어 냅니다.U15A SNRNA를 가진 dup 51 P의 공동 발현은 엑손2개의 접합을 구출하고, 전체 길이 성적증명서의 형성을 복원합니다. 대조적으로, 야생 형 U1 또는 U15G 변종과의 공동 발현은 dup 51P 접합에 유사한 영향을 미치지 않습니다. U15A 변이체 전사체의 검출은, 1차 연장에 의하여 U1 7~26개의 올리고 뉴클레오티드를 사용하며, 이는 U1 SNRNA의 다섯 번째 위치에서 아데닌 근처의 20개의 뉴클레오티드 및 기저쌍이다.DATP단독으로, U1 7 내지 26은 내인성 야생형 U1 SNRNA에 대해 2내지 3개의 뉴클레오티드를 통합하여 22 또는 23뉴클레오티드 롱 생성물을 산출할 수 있다. U15A 및 U15G 변이체의 경우 21개의 뉴클레오티드 생성물을 생산하는 단일 아데노신을 첨가한 후 확장이 종료된다. U2 SNRNA 발현으로 의정상화 한 후, 내생SNRNA를 통해 3~5배의 내생SNRNA를 통해 U1 야생형 U1 5g 및 U15A 변이체를 3~5배로 발현했다.추출된 RNA의 품질은 접합 분석에 매우 중요합니다. 따라서 RNA 가없는 물의 사용 및 RNA 비활성화 제로 서비스의 오염 제거가 매우 권장됩니다. 여기에 설명된 보고 시스템은 수정 U1SN RNA를 사용하여 유전자 침묵에 대한 돌연변이를 접합하기 위한 규정을 접합하기 위한 규정을 접합하는 U1 SN RNA의 역할을 연구하기 위하여 적용될 수 있다.

a-reporter-based-cellular-assay-for-monitoring-splicing-efficiency

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

강력한, 소규모 HELA 핵 추출물의 준비를위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 이러한 약물이나 RNAi로 치료 세포와 같은 세포의 작은 인구의 사용을 요구 assays를위한 가치있는 것입니다. 방법은 유전자 발현 assays 및 환자 세포 등 다른 세포 유형의 다양한 적용해야합니다.

유전자 표현 기계의 기능 Assays을위한 소규모 핵 추출물

선택적 접합 조절은 다양한 생리학적 및 병리학적 과정에서 필수적인 세포 프로그램인 상피-중간엽 전이(EMT)에 기여하는 것으로 나타났습니다. 여기에서는 EMT 중 선택적 접합을 감지하기 위해 유도 가능한 EMT 모델을 사용하는 방법에 대해 설명합니다.

상피 - 간엽 전환시 선택적 스 플라이 싱 (alternative splicing)의 검출

탠덤 접합 이벤트는 뉴클레오티드가 12개 미만으로 떨어져 있는 부위에서 발생합니다. 이러한 스플라이스 변형체의 비율을 정량화하는 것은 절대 정량적 PCR 접근법을 사용하여 가능합니다. 이 원고는 두 개의 스플라이싱 이벤트로 인해 Serine-701 포함/배제 및 α/β C-말단이 발생하는 STAT3 유전자의 스플라이스 변이체를 정량화할 수 있는 방법을 설명합니다.

절대 및 상대 정량 PCR 데이터를 병합 STAT3 스플 라이스 변형 성적 증명서를 정량화하기

여기에서 우리는 고형 종양 및 혈액 악성 종양에서 약물 내성에 비정상적인 스 플라이 싱의 영향을 조사하기위한 프로토콜을 설명합니다. 이 목표를 위해, 우리는 RNA-서열을 통해 부모와 체외에서 저항 모델의 transcriptomic 프로필을 분석 후보 유전자를 확인하기 위해 QRT-PCR 기반의 방법을 설립했다.

에 약물 저항 관련 소설 스플 라이스 변종을 감지하는 RNA 시퀀싱을 사용하여<em&gt; 체외</em&gt; 암 모델

현장에서 교 잡 (ISH) 사용 하는 프로토콜 짧은 센스 oligonucleotides 마우스 뇌 섹션에 대체 이전 mRNA 접합 패턴을 감지 하는 설명 되어 있습니다.

대체 사전 mRNA 접합 교 잡 시험 현장에서 RNA를 사용 하 여 마우스 뇌 섹션에서의 정량 분석

SINEUPs는 합성 센스 비 코딩 RNAs는 바인딩 도메인 (BD)와 이펙터 도메인 (ED)를 포함 하 고 최대 조절의 번역 대상 mRNA. 여기, 우리 교양된 셀 라인, 서양 오 점 및 이미징 시스템 반자동된 높은 처리량의 번역 홍보 활동의 분석에 SINEUPs에 대 한 검색 방법을 설명 합니다.

셀 기반 비 코딩 RNAs 특히 mRNA 번역을 향상 시킬 수 있는 SINEUP의 분석 실험

이 프로토콜은 화학 요법 치료 후 대체 접합 조절에서 특징이 없는 기능을 가진 단백질의 역할을 평가하기 위한 신속하고 유용한 도구를 제공합니다.

E1A 미니진 도구를 사용하여 mRNA 접합 변화를 연구합니다.

구리 성장 분석인 ACT1-CUP1 분석은 전구체 메신저 RNA(pre-mRNA) 스플라이싱과 돌연변이 스플라이싱 인자가 스플라이세오솜 기능에 미치는 영향에 대한 빠른 판독을 제공합니다. 이 연구는 프로토콜을 제공하고 관심 있는 접합 문제를 해결하기 위해 가능한 사용자 정의를 강조합니다.

ACT1-CUP1 분석은 신진 효모에서 스플라이세오솜 돌연변이체의 기질 특이적 민감도를 결정합니다.

우리는 네 개의 플라스미드를 가진 시험관 내에서 세포에서 사용되는 인트로닉 마이크로RNA 생물발생 리포터 어세이를 개발하였다: 하나는 인트로닉 miRNA를 가지고 있고, 하나는 표적을 가지고 있고, 다른 하나는 조절 단백질을 과발현하기 위해, 다른 하나는 레닐라 루시페라제이다. miRNA를 처리하고, 표적 서열에 결합함으로써 루시퍼라제 발현을 조절할 수 있었다.

포유류 세포에서 인트로닉 마이크로RNA 성숙을 분석하기 위한 리포터 분석

우리는 발광 기반 염색체 외 리포터 기질 세트를 사용하여 세포에서 이중 가닥 절단 복구 경로 숙련도를 평가하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

고처리량 및 정량적 발광 기반 리포터 분석을 사용한 DNA 이중 가닥 파손 복구 활성 평가

학습하세요 HeLa 세포를 이용한 RNA 접합 효율 모니터링 기자 분석법으로, 질병 관련 돌연변이의 영향을 평가하고 치료적 U1 snRNA 개발을 위한 연구에 활용할 수 있습니다.

접합 효율 모니터링을 위한 기자 기반 셀룰러 분석

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