Name: 전자 결정학 연구를 위한 지질 단층 방법을 이용한 샘플 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 22 s
Description: 학습하세요 지질 단층을 이용한 단백질 2D 결정화 방법을 통해 막 단백질과 가용성 단백질의 구조를 연구하는 기법을 배우세요. 이 방법은 전자 현미경 영상 분석에 안정적인 플랫폼을 제공합니다.

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이 원고의 준비는 부분적으로 P.-L.C에 미 육군 연구 실 (W911NF2010321)과 애리조나 주립 대학 시작 기금에 의해 지원되었다.

1. 테플론 블록 준비
<ol><li>화학성 PTFE(폴리테트라플루오로로틸렌) 수지로부터 테플론 블록을 준비합니다. 일반 드릴을 사용하여 블록에 구멍을 만들고 그림 1에표시된 치수를 만듭니다.</li>
</ol>2. 모노레이어 지질 제제
참고: 예상 작동 시간: 30-45분
<ol><li>지질 재고 준비<ol>
<li>9:1 (v/v) 클로로폼/메탄올에 0.01 mg/mL 지질 혼합물을 준비하여 8.91mL의 클로로폼, 메탄올 0.99mL, 10 mg/mL 지질의 0.01mL를 사용한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>테플론 플레이트 준비<ol>
<li>메탄올 욕조에서 테플론 접시를 5분간 초음파 처리합니다.</li>
		<li>뜨거운 물로 15분간 씻으시면 됩니다.</li>
		<li>증류수로 헹구는 다.</li>
		<li>데프론 플레이트를 건조기에서 30분 간 건조시키고 사용하지 않을 때진공 상태로 유지하십시오(그림1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 완충 저수지에 지질 단층의 형성
참고: 예상 작동 시간: 1.5시간
<ol><li>실험 당일 클로로폼/메탄올의 9:1 혼합물에서 0.01 mg/mL의 지질 혼합물을 신선하게 준비한다.</li>
	<li>페트리 접시에 Type-1 필터 용지를 놓고 필터 용지 위에 테플론 블록을 정렬합니다.</li>
	<li>테플론 플레이트의 우물을 버퍼의 60 μL로 채웁니다.</li>
	<li>조심스럽게 해밀턴 주사기를 사용하여 드롭 (이상적으로 드롭 당 1 μL)에 의해 드롭 버퍼 표면 드롭의 상단에 지질 혼합물을 추가합니다.</li>
	<li>페트리 접시에 습도를 유지하기 위해 증류수로 필터 용지를 적시십시오.</li>
	<li>실온에서 60분 동안 배양하세요. 클로로폼은 증발해야 하며, 완충제 표면에 지질의 단층이 형성되어야 한다.</li>
</ol>4. 지질 단층상에 EM 그리드 의 적용
참고: 예상 작동 시간: 1.5시간
<ol><li>각 버퍼 저장소의 상단에 빛을 배출하지 않고, 탄소 면을 아래로 가볍게 놓습니다.</li>
	<li>조심스럽게 측면 주입에 단백질을 주입. 단백질의 약 1 μM 주위에 있는 마지막 단백질 농도를 출발점으로 사용하십시오. 실험 전에 단백질 농도를 미리 최적화합니다.</li>
	<li>실온에서 60분 동안 배양하세요.</li>
	<li>측면 사출 포트에 약 20-30 μL의 버퍼를 부드럽게 주입합니다. 이렇게 하면 테플론 블록의 표면 위에 그리드가 올립니다.</li>
	<li>즉시 트위저로 그리드를 들고 물방울에서 수직으로 들어 올립니다.</li>
	<li>음극 염색 또는 저온-TEM 이미징을 위한 단층 샘플을준비(그림 2). 단백질이 2D 어레이를 형성하는 경우, 이미지 파워 스펙트럼 또는 Fourier 주기도는 결정 대칭에 기초하여 공간 주파수에서 회절 강도를 표시합니다. 전력 스펙트럼에 회절 반점이 표시되지 않으면 단백질은 2D 결정을 형성할 가능성이 낮습니다.</li>
	<li>전염 전자 현미경(TEM)을 사용하여 EM 그리드에서 지질 단층의 커버리지를 확인한다. 낮은 확대 전자 이미지는 덮여 단층의 형태를 식별하는 데 도움이됩니다. 일반적으로 단층으로 덮인 영역의 이미지 대비는 발견된 영역보다 약간 낮습니다. 또한, 계산된 2D 이미지 파워 스펙트럼은 2D 결정선의 위치를 식별하는 데 도움이 됩니다.</li>
</ol>

<ol><li>Raunser, S., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+crystallography+as+a+technique+to+study+the+structure+on+membrane+proteins+in+a+lipidic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Electron crystallography as a technique to study the structure on membrane proteins in a lipidic environment.</a> Annual Review of Biophysics. 38 (1), 89-105 (2009).</li>
<li>Avila-Sakar, A. J., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+beta-sheets+and+side-chain+clusters+in+two-dimensional+periodic+arrays+of+streptavidin+on+phospholipid+monolayers+by+electron+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Visualization of beta-sheets and side-chain clusters in two-dimensional periodic arrays of streptavidin on phospholipid monolayers by electron crystallography.</a> Biophysical Journal. 70 (1), 57-68 (1996).</li>
<li>Braun, T., Engel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+electron+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Encyclopedia+of+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional electron crystallography.</a> Nature Encyclopedia of Life Sciences. , (2004).</li>
<li>Wang, H. -W., Wang, J. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+cryo-electron+microscopy+and+X-ray+crystallography+complement+each+other%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%3A+a+publication+of+the+Protein+Society%22%5BJournal%5D)">How cryo-electron microscopy and X-ray crystallography complement each other.</a> Protein Science: a publication of the Protein Society. 26 (1), 32-39 (2017).</li>
<li>Williams, D. B., Carter, C. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWilliams%2C+DB+%22Transmission+electron+microscopy%22">Transmission electron microscopy</a>. , Springer. New York, NY. (2016).</li>
<li>Abeyrathne, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1.15+Analysis+of+2-D+Crystals+of+Membrane+Proteins+by+Electron+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Biophysics%22%5BJournal%5D)">1.15 Analysis of 2-D Crystals of Membrane Proteins by Electron Microscopy.</a> Comprehensive Biophysics. , 277-310 (2012).</li>
<li>Muller, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Lipid-Protein+Interactions+and+Lipid-Mediated+Modulation+of+Membrane+Protein+Function+through+Molecular+Simulation%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Characterization of Lipid-Protein Interactions and Lipid-Mediated Modulation of Membrane Protein Function through Molecular Simulation.</a> Chemical Reviews. 119 (9), 6086-6161 (2019).</li>
<li>Martínez-Ballesta, M. D. C., Carvajal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutual+Interactions+between+Aquaporins+and+Membrane+Components%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Mutual Interactions between Aquaporins and Membrane Components.</a> Frontiers in Plant Science. 7, 1322(2016).</li>
<li>Hite, R. K., Chiu, P. -L., Schuller, J. M., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+lipid+head+groups+on+double-layered+two-dimensional+crystals+formed+by+aquaporin-0%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Effect of lipid head groups on double-layered two-dimensional crystals formed by aquaporin-0.</a> PloS One. 10 (1), 0117371(2015).</li>
<li>Murata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+determinants+of+water+permeation+through+aquaporin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural determinants of water permeation through aquaporin-1.</a> Nature. 407 (6804), 599-605 (2000).</li>
<li>Schenk, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+4.5+A+structure+of+human+AQP2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The 4.5 A structure of human AQP2.</a> Journal of Molecular Biology. 350 (2), 278-289 (2005).</li>
<li>Gonen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-protein+interactions+in+double-layered+two-dimensional+AQP0+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lipid-protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0 crystals.</a> Nature. 438 (7068), 633-638 (2005).</li>
<li>Hiroaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+the+aquaporin-4+structure+on+array+formation+and+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Implications of the aquaporin-4 structure on array formation and cell adhesion.</a> Journal of Molecular Biology. 355 (4), 628-639 (2006).</li>
<li>Gonen, T., Sliz, P., Kistler, J., Cheng, Y., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-0+membrane+junctions+reveal+the+structure+of+a+closed+water+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-0 membrane junctions reveal the structure of a closed water pore.</a> Nature. 429 (6988), 193-197 (2004).</li>
<li>Chiu, P. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+prokaryotic+cyclic+nucleotide-modulated+potassium+channel+MloK1+at+16+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">The structure of the prokaryotic cyclic nucleotide-modulated potassium channel MloK1 at 16 A resolution.</a> Structure. 15 (9), 1053-1064 (2007).</li>
<li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-induced+structural+changes+in+the+cyclic+nucleotide-modulated+potassium+channel+MloK1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Ligand-induced structural changes in the cyclic nucleotide-modulated potassium channel MloK1.</a> Nature Communications. 5, 3106(2014).</li>
<li>Walz, T., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+Crystallography+of+Two-Dimensional+Crystals+of+Membrane+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Electron Crystallography of Two-Dimensional Crystals of Membrane Proteins.</a> Journal of Structural Biology. 121 (2), 142-161 (1998).</li>
<li>Yeager, M., Dryden, K. A., Ganser-Pornillos, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+monolayer+and+sparse+matrix+screening+for+growing+two-dimensional+crystals+for+electron+crystallography%3A+methods+and+examples%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Lipid monolayer and sparse matrix screening for growing two-dimensional crystals for electron crystallography: methods and examples.</a> Methods in Molecular Biology. 955, 527-537 (2013).</li>
<li>Pal, S. Chapter 6 - Structure analysis and visualization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPal%2C+S+%22Fundamentals+of+Molecular+Structural+Biology%22">Fundamentals of Molecular Structural Biology</a>. , 119-147 (2020).</li>
<li>Frey, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+protein+crystallization+via+metal-ion+coordination+by+naturally+occurring+surface+histidines%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional protein crystallization via metal-ion coordination by naturally occurring surface histidines.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (10), 4937-4941 (1996).</li>
<li>Kubalek, E. W., Le Grice, S. F., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+crystallization+of+histidine-tagged%2C+HIV-1+reverse+transcriptase+promoted+by+a+novel+nickel-chelating+lipid%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional crystallization of histidine-tagged, HIV-1 reverse transcriptase promoted by a novel nickel-chelating lipid.</a> Journal of Structural Biology. 113 (2), 117-123 (1994).</li>
<li>Vénien-Bryan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+study+of+the+response+regulator+HupR+from+Rhodobacter+capsulatus.+Electron+microscopy+of+two-dimensional+crystals+on+a+nickel-chelating+lipid%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural study of the response regulator HupR from Rhodobacter capsulatus. Electron microscopy of two-dimensional crystals on a nickel-chelating lipid.</a> Journal of Molecular Biology. 274 (5), 687-692 (1997).</li>
<li>Merritt, E. A., Sarfaty, S., vanden Akker, F., L'Hoir, C., Martial, J. A., Hol, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+cholera+toxin+B-pentamer+bound+to+receptor+GM1+pentasaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%3A+a+publication+of+the+Protein+Society%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of cholera toxin B-pentamer bound to receptor GM1 pentasaccharide.</a> Protein Science: a publication of the Protein Society. 3 (2), 166-175 (1994).</li>
<li>Mosser, G., Mallouh, V., Brisson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+9+A+two-dimensional+projected+structure+of+cholera+toxin+B-subunit-GM1+complexes+determined+by+electron+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A 9 A two-dimensional projected structure of cholera toxin B-subunit-GM1 complexes determined by electron crystallography.</a> Journal of Molecular Biology. 226 (1), 23-28 (1992).</li>
<li>Edwards, A. M., Darst, S. A., Hemming, S. A., Li, Y., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitaxial+growth+of+protein+crystals+on+lipid+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Epitaxial growth of protein crystals on lipid layers.</a> Nature Structural Biology. 1 (3), 195-197 (1994).</li>
<li>Olofsson, A., Mallouh, V., Brisson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+structure+of+membrane-bound+annexin+V+at+8+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional structure of membrane-bound annexin V at 8 A resolution.</a> Journal of Structural Biology. 113 (3), 199-205 (1994).</li>
<li>Ribi, H. O., Ludwig, D. S., Mercer, K. L., Schoolnik, G. K., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+cholera+toxin+penetrating+a+lipid+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of cholera toxin penetrating a lipid membrane.</a> Science. 239 (4845), 1272-1276 (1988).</li>
<li>Celia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+model+of+Escherichia+coli+gyrase+B+subunit+crystallized+in+two-dimensions+on+novobiocin-linked+phospholipid+films%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional model of Escherichia coli gyrase B subunit crystallized in two-dimensions on novobiocin-linked phospholipid films.</a> Journal of Molecular Biology. 236 (2), 618-628 (1994).</li>
<li>Darst, S. A., Kubalek, E. W., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+Escherichia+coli+RNA+polymerase+holoenzyme+determined+by+electron+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of Escherichia coli RNA polymerase holoenzyme determined by electron crystallography.</a> Nature. 340 (6236), 730-732 (1989).</li>
<li>Schultz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+study+of+the+yeast+RNA+polymerase+A.+Electron+microscopy+of+lipid-bound+molecules+and+two-dimensional+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural study of the yeast RNA polymerase A. Electron microscopy of lipid-bound molecules and two-dimensional crystals.</a> Journal of Molecular Biology. 216 (2), 353-362 (1990).</li>
<li>Dryden, K. A., Crowley, C. S., Tanaka, S., Yeates, T. O., Yeager, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+crystals+of+carboxysome+shell+proteins+recapitulate+the+hexagonal+packing+of+three-dimensional+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%3A+a+publication+of+the+Protein+Society%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional crystals of carboxysome shell proteins recapitulate the hexagonal packing of three-dimensional crystals.</a> Protein Science: a publication of the Protein Society. 18 (12), 2629-2635 (2009).</li>
<li>Barklis, E., McDermott, J., Wilkens, S., Fuller, S., Thompson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+HIV-1+capsid+proteins+on+a+lipid+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+BIOLOGICAL+CHemistry%22%5BJournal%5D)">Organization of HIV-1 capsid proteins on a lipid monolayer.</a> The Journal of BIOLOGICAL CHemistry. 273 (13), 7177-7180 (1998).</li>
<li>Barklis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+membrane-bound+retrovirus+capsid+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of membrane-bound retrovirus capsid proteins.</a> The EMBO Journal. 16 (6), 1199-1213 (1997).</li>
<li>Kelly, D. F., Dukovski, D., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer+purification%3A+a+rapid+method+for+isolating+protein+complexes+for+single-particle+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Monolayer purification: a rapid method for isolating protein complexes for single-particle electron microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (12), 4703-4708 (2008).</li>
<li>Reis, A., Rudnitskaya, A., Blackburn, G. J., Mohd Fauzi, N., Pitt, A. R., Spickett, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+five+lipid+extraction+solvent+systems+for+lipidomic+studies+of+human+LDL%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">A comparison of five lipid extraction solvent systems for lipidomic studies of human LDL.</a> Journal of Lipid Research. 54 (7), 1812-1824 (2013).</li>
<li>Ueda, E. K. M., Gout, P. W., Morganti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+and+prospective+applications+of+metal+ion-protein+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography.+A%22%5BJournal%5D)">Current and prospective applications of metal ion-protein binding.</a> Journal of Chromatography. A. 988 (1), 1-23 (2003).</li>
<li>Dietrich, J., nien-Bryan, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDietrich%2C+J+%22Strategies+for+Two-dimensional+Crystallization+of+Proteins+Using+Lipid+Monolayers%22">Strategies for Two-dimensional Crystallization of Proteins Using Lipid Monolayers</a>. , Imperial College Press. (2005).</li>
<li>Kuang, Q., Purhonen, P., Hebert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-Dimensional+Crystallization+Procedure%2C+from+Protein+Expression+to+Sample+Preparation%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Two-Dimensional Crystallization Procedure, from Protein Expression to Sample Preparation.</a> BioMed Research International. 2015, 693869(2015).</li>
<li>De Zorzi, R., Nicholson, W. V., Guigner, J. -M., Erne-Brand, F., Vénien-Bryan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+large+and+highly+ordered+2D+crystals+of+a+K%2B+channel%2C+structural+role+of+lipidic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Growth of large and highly ordered 2D crystals of a K+ channel, structural role of lipidic environment.</a> Biophysical Journal. 105 (2), 398-408 (2013).</li>
<li>Johnson, M. C., Schmidt-Krey, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+crystallization+by+dialysis+for+structural+studies+of+membrane+proteins+by+the+cryo-EM+method+electron+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional crystallization by dialysis for structural studies of membrane proteins by the cryo-EM method electron crystallography.</a> Methods in Cell Biology. 113, 325-337 (2013).</li>
<li>Rémigy, H. -W., Caujolle-Bert, D., Suda, K., Schenk, A., Chami, M., Engel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+protein+reconstitution+and+crystallization+by+controlled+dilution%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Membrane protein reconstitution and crystallization by controlled dilution.</a> FEBS Letters. 555 (1), 160-169 (2003).</li>
<li>Braun, T., Kaufmann, T. C., Rémigy, H., Engel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+Crystallization+of+Membrane+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Encyclopedic+Reference+of+Genomics+and+Proteomics+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional Crystallization of Membrane Proteins.</a> Encyclopedic Reference of Genomics and Proteomics in Molecular Medicine. , 1936-1942 (2006).</li>
<li>Lebeau, L., Vénien-Bryan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer+two-dimensional+crystallization+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Monolayer two-dimensional crystallization of membrane proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 955, 59-71 (2013).</li>
<li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proteins%2C+lipids+and+detergents%3A+not+just+a+soap+opera%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).</li>
<li>Lebeau, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+crystallization+of+a+membrane+protein+on+a+detergent-resistant+lipid+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional crystallization of a membrane protein on a detergent-resistant lipid monolayer.</a> Journal of Molecular Biology. 308 (4), 639-647 (2001).</li>
</ol>

저자는 선언할 이해상충이 없습니다.

지질 단층은 생물학적 거대 분자의 구조 연구를 위한 대형 2D 결정의 성장을 용이하게 하는 강력한 도구입니다. 공기-물 인터페이스에서 온전한 지질 단층층을 성공적으로 준비하기 위해 지질 아실 체인의 산화가 단층의 포장 중단으로 이어질 수 있고 그로 인한 결정 형성에 악영향을 미칠 수 있기 때문에 실험 당일에 지질을 신선하게 준비하는 것이 좋습니다. 분말 형태로 구입한 지질은 일반적으로인지질(35)을용해시키는 데 사용되는 클로로폼:메탄올 용매의 혼합물을 사용하여 용해되어야 한다. 클로로폼:메탄올 용매는 밀봉된 유리 바이알에 미리 만들어 보관할 수 있다. 용존지질은 공기-물 인터페이스에 적용되는 동안 클로로폼:메탄올 용매가 완충제에서 완전히 증발할 때까지 기다립니다. 지질 단층의 형성과 2D 결정의 형성을 위한 적당한 대기 시간은 이 실험에서 필수적입니다. 전형적으로, 지질 단층 및 2D 어레이의 형성은 인큐베이션 시간18의약 30 60 분 이내에...

2D 결정 또는 단백질의 헬릭 어레이를 통한 전자 회절은 유리한 경우1,2,3에서하위 나노미터 분해능을 달성할 수 있다. 특히 관심은 근원 환경1에서2D 멤브레인 단백질 어레이 또는 결정으로 재구성된다. 결정은 특정 공간 주파수에서 구조 적 인자의 강도를 향상시키는 신호 증폭기역할을하기 때문에, 전자 결정학은 단일 입자 저온-EM에 대한 것보다 작은 분자와 같은 고해상도에서 더 작은 크기로 대상을 프로빙 할 수 있습니다. 전자 빔은 주문된 2D 단백질 배열에 의해 확산될 수 있으며, 검출기4에이미지 평면이 기록되는 위치에 따라 회절 패턴 또는 격자 이미지를 생성한다. 그 때 디질화 된 강도는 추출 및 크리스탈의 2D 프로젝션 구조를 재구성하기 위해 처리 될 수있다. 전자는 엑스레이보다 더 큰 산란 단면을 가지며, 그 산란은 주로 분자5에서전자와 충전된 원자 사이의 쿨롬 상호 작용을 기반으로 하는 러더포드 모델을 따릅니다. 2D 멤브레인 결정의 두께는 일반적으로 100 nm 미만이며, 표본6내에서 발생하는 동적 산란없이 전자 전송에 적합합니다. 전자 결정학적 연구는 멤브레인 단백질및 지질 단백질 상호작용7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17의고해상도 구조 정보를 조사하는 강력한 도구로 나타났다.
지질 단층은 공기-물 인터페이스6에서조밀하게 포장된 인지질으로 구성된 단일 지질 층으로, 용해성 단백질 또는 말초막단백질(18)에대한 2D 어레이 형성을 지원할 수 있다. 지질의 밀도와 측면 압력에 따라 지질 분자는 수성 용액1,6,19에노출된 공기 및 친수성 헤드그룹에 확장된 아실 사슬을 사용하여 공기-물 인터페이스에 정렬된 2D 어레이를 형성할 수 있다. 지질 헤드그룹은 정전기 상호작용을 통해 단백질과 상호작용할 수 있거나 특정 단백질 도메인을 결합하기 위한 친화성 태그를 제공하기 위해 변형될 수 있다. 예를 들어, DOGS-NTA-Ni (1,2-dioleoyl-sn-글리세로-3-[(N-(5-아미노-1-카박스티펜틸)이 iminodiacetic acid]]2-Ni 2+)는폴리-히티딘 태그20,21로단백질을 묶는 지질 단층층을 형성하는 데 자주 사용된다. 또한, 콜레라 독소 B는 구조적 연구를 위한 지질 단층에서 간질산 GM1의 특정 펜타카라이드를 결합할 수있다(23,24). 지질 헤드그룹에 단백질을 고정함으로써 지질 단층은 고해상도 전자 결정연구를 위해 얇은 2D 어레이의 형성을 지원할 수 있습니다. 지질 단층 기술은 단백질의 구조 연구를 위한 전자 결정학에서 사용되었습니다, 예를 들어 스트렙타비딘2,25,부속서 V26,콜레라 독소27, 대장균 RNA 폴리머라제25,29,30,카박스형 쉘 단백질31 및 HIV-132 및 몰론 황두균 바이러스의 캡시드 단백질 33.지질 단층의 안정성 과 화학적 특성으로 인해, 시료 준비를 위한 다른 응용 분야는 극저온-EM이미징(34)에대해 탐구되었다. 그러나, 단백질 어레이 형성을 위해 최적화가 필요합니다.
여기에서, 우리는 극저온-EM 화상 진찰을 위한 지질 단층의 일반적인 준비의 광대한 세부 사항 및 형성된 단층의 질에 영향을 미칠 수 있는 몇몇 고려사항을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>14:0 PC (DMPC)</td><td>Avanti Lipids</td><td>850345</td><td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1 x 25 mg, 10 mg/mL, 2.5</td></tr><tr><td>mL 소형 피펫용 전구</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-448-21</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>데시케이터 진공</td><td>Southern Labware</td><td>55207</td><td></td></tr><tr><td>EM 그리드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>CF413-50</td><td>CF-1.2/1.3-4C 1.2 &마이크로; M 홀, 1.3 &마이크로; m 공간</td></tr><tr><td>여과지</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>1001-090</td><td>직경 90mm</td></tr><tr><td>유리 파스퇴르 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 주사기(25 &마이크로; L)</td><td>Hamilton Company</td><td>80465</td><td></td></tr><tr><td>해밀턴 주사기(250 &마이크로; L)</td><td>Hamilton Company</td><td>81165</td><td></td></tr><tr><td>해밀턴 주사기 (5 &micro; L)</td><td>Hamilton Company</td><td>87930</td><td></td></tr><tr><td>해밀턴 주사기 (500 &micro; L)</td><td>Hamilton Company</td><td>203080</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>시그마-알드리치</td><td>M1775-1GA</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td>100 mm &times; 15 mm</td></tr><tr><td>테플론 블록</td><td>Grainger</td><td>55UK05</td><td>60 &micro; 측면 주입 포트가 있는 L 웰, 수동으로 만든</td></tr><tr><td>핀셋</td><td>전자 현미경 과학</td><td>78325</td><td>다양한 스타일</td></tr><tr><td>초순수</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>초음파 세척기</td><td>VWR</td><td>97043-996</td><td></td></tr></tbody></table>

전자 결정학 연구를 위한 지질 단층 방법을 이용한 샘플 준비

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

전자 결정학은 고해상도 구조 측정을 위한 강력한 도구입니다. 수용성 또는 막 단백질과 같은 거대 분자는 유리한 조건하에서 고도로 정렬된 2차원(2D) 결정으로 재배될 수 있다. 2D 이미지 처리를 통해 최종 재구성의 해상도에 성장된 2D 결정의 품질은 매우 중요합니다. 수년에 걸쳐, 지질 단층은 용해성 단백질뿐만 아니라 말초 막 단백질의 2D 결정화를 촉진하기 위해 지원 층으로 사용되었습니다. 이 방법은 또한 일체형 막 단백질의 2D 결정화에 적용될 수 있지만 단층으로 분할을 촉진하기 위해 세제 및 투석 조건을 결정하기 위해 보다 광범위한 경험적 조사가 필요합니다. 지질 단층은 극지 지질 헤드 그룹이 수성 상에서 수분을 유지하고 비 극성, 아실 체인, 꼬리 분할을 공기로 분할하여 표면 장력을 깨고 수면을 평평하게 하는 공기-물 인터페이스에서 형성됩니다. 헤드 그룹의 충전 된 자연 또는 독특한 화학 적 moieties는 용액의 단백질에 대한 친화력을 제공하여 2D 어레이 형성에 대한 결합을 촉진합니다. 2D 어레이를 가진 새로 형성된 단층은 결정 배열을 들어 올리고 지원하는 데 사용되는 탄소 코팅 구리 그리드에서 전자 현미경(EM)으로 쉽게 이송될 수 있다. 이 작품에서, 우리는 극저온 전자 현미경 (극저온-EM) 화상 진찰을 위한 지질 단층 방법론을 기술합니다.

EM 그리드에 증착된 지질 단층은 염색없이 전송 전자 현미경(TEM)으로 시각화될 수 있다. 단층의 존재는 빔 경로에 시편이 없는 영역과 의대조 차이로 인식될 수 있다. 지질 단층 커버리지가 있는 영역은 비어 있는 구멍을 통해 전자 빔이 산란되지 않고 더 밝은조명(도 3)을나타내기 때문에 커버리지가 없는 영역보다 국부적 대비가 낮습니다.
2D 단층 결정화의 조건을 검사하려면 네거티브 얼룩 EM 또는 극저온-EM 이미징을 사용하여 시편의 이미지를 조사합니다. 단층이 구멍을 덮는지 여부는 스테이지가 기울어질 때 더 강한 가장자리 대비로 관찰될 수 있습니다. 결정이 형성되면 이미지 전원 스펙트럼 또는 주기각표가 포리에 또는 회절 반점을 표시합니다. 작은 크기(&lt; 200nm)의 크리스탈과 임의로 지향되는 결정은 전력 스펙트럼에서 고강도 링을 나타낼 수 있다. 결정이 재배되지 않으면 파워 스펙트럼에 Fourier 반점이 표시되지 ...

지질 단층은 수십 년 동안 구조 연구를 위한 2차원(2D) 단백질 결정을 형성하는 기초로 사용되어 왔습니다. 그들은 공기 물 인터페이스에서 안정적이며 전자 이미징을위한 얇은 지지 재료로 작용할 수 있습니다. 여기에서 우리는 생물학 연구를 위한 지질 단층을 준비하는 에 입증된 단계를 제시합니다.

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...

수년에 걸쳐 지질 단층은 용해성 단백질뿐만 아니라 말초 막 단백질의 2D 결정화를 촉진하기 위한 지지 층으로 사용되어 왔습니다. 이 방법은 또한 2D 결정화에 적용될 수 있습니다, 몇몇 일체형 막 단백질로. 그러나 지질 단층으로 분할을 촉진하기 위해 세제 및 투석 조건을 결정하기 위해 보다 광범위한 경험적 조사가 필요합니다.지질 단층은 공기 물 인터페이스에서 형성되어 지질의 극지 헤드 그룹이 수성 상에서 수분을 유지합니다. 그리고 지질 분할의 비 극성 아실 꼬리는 공기 물 인터페이스에, 이는 표면 장력을 깨고 물 표면을 평평하게. 전하 자연 지질 헤드 그룹의 독특한 화학 적 moieties 용액단백질에 대 한 친화성을 제공 합니다.바인딩을 촉진하고 원칙적으로 2D 어레이 형성을 촉진합니다. 지질 단층상상에 형성된 모든 2D 결정은 지질 층의 결정 배열을 들어 올리고 지원하는 데 사용되는 탄소 코팅 된 EM 그리드에서 전자 현미경으로 쉽게 전달 될 수 있습니다. 우리는 극저온 전자 현미경 현미경 화상 진찰을 위한 지질 단층 방법론, 이 원고에서 기술했습니다.지질 단층 준비. 지질 재고 제제는 9:1 부피클로로포, 메탄올에 ml 지질 혼합물 당 0.01 mg을 준비한다. 클로로폼 8.91 ml와 메탄올 0.99 ml, 0.1 ml 의 지질 용액 10 ml를 사용 하 여.테플론 플레이트 준비. 메탄올 욕조에서 테플론 접시를 5분간 초음파 처리합니다. 뜨거운 물로 15분간 씻은 다음 증류수로 헹구습니다.테플론 플레이트를 건조한 상태에서 30분 간 건조시키고 사용할 때까지 진공 상태로 유지합니다. 버퍼 저장소에 지질 단층의 형성. 예상 작동 시간은 1시간 반이 소요됩니다.페트리 접시에 1형 필터 용지를 놓고 필터 용지 위에 테플론 블록을 정렬합니다. 60 마이크로리터의 완충제로 테플론 플레이트의 우물을 채웁니다. 조심스럽게 드롭에 의해 버퍼 표면 드롭의 상단에 액체 혼합물을 추가합니다.해밀턴 주사기를 사용하여 드롭당 마이크로리터 1개를 사용하는 것이 이상적입니다. 필터 용지에 증류수로 적시고 페트리 접시에 습도를 유지합니다. 60분 동안 실온에서 배양하면 클로로폼이 증발해야 하며 완충제 표면에 지질의 단층이 형성되어야 한다.지질 단층상에 EM 그리드를 적용합니다. 예상 작동 시간 1 시간 반. 탄소 코팅 된 EM 그리드를 각 버퍼 저장소의 표면에 빛을 방출하지 않고 부드럽게 놓습니다.조심스럽게 측면 주입에 단백질을 주입, 하나의 마이크로 몰러 주위에 잘에 최종 단백질 농도를 사용. 실온에서 60분 동안 배양하세요. 테플론 블록의 표면 위에 그리드를 올리기 위해 약 20~30마이크로리터의 완충제를 사이트 사출 포트에 부드럽게 주입한다.이렇게 하면 핀셋한 쌍으로 그리드를 선택하고 물방울에서 수직으로 들어 올릴 수 있습니다. 대표적인 결과. EM 그리드에 증착된 지질 단층은 대조적 인 염색없이 전송 전자 현미경으로 시각화 될 수 있습니다.단층의 존재는 해당 빔 경로에 있는 시편이 없는 영역과 대조차이로 인식될 수 있다. 지질 단층 범위가 있는 지역은 엄호가 없는 그들 보다는 더 낮은 대비가 있습니다. 빈 구멍을 통해 전자 빔이 흩어져 있지 않으므로 더 밝은 조명을 보여줍니다.결론적으로, 지질 단층 방법은 단순성 때문에 단백질 구조를 공부할 수 있는 기회를 제공합니다. 2D 결정화 과정을 용이하게 하기 위한 대안적 접근법을 제공할 수 있다.

sample-preparation-using-lipid-monolayer-method-for-electron

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

본는 lipidic mesophases 수동으로 막 단백질의 결정화 실험을 설정 캐퍼리 막 구조 및 기능 생물학 그룹의 구현 절차를 설명합니다.

Lipidic Mesophases를 사용하여 구조 결정을위한 막 단백질 Crystallizing

주문한 막 단백질 배열의 형성을위한 2 차원 (2D) 결정화 실험을 평가하는 것은 전자 crystallography에 매우 중요하고 어려운 작업입니다. 90kDa - 여기에 대한 심사와 15의 범위에서 주로 작은 막 단백질의 2D 결정을 식별하는 우리의 접근 방식을 설명합니다.

전자 Crystallography에 의해 구조 생물학 연구에 대한 작은 막 단백질의 2 차원 결정화 평가판을 평가

프로토콜은 LCP 결정화 시련과 수확 결정을 설정, LCP - FRAP 미리 결정화 assays과 초기 조건을 찾는 lipidic 입방 단계 (LCP)에서 단백질의 reconstitution부터 막 단백질의 회절 품질 결정을 얻기 위해 필수적인 단계를 설명 .

Lipidic Mesophases의 막 단백질의 결정화

β-barrel 외막 단백질(OMP)은 그람 음성 박테리아, 미토콘드리아 및 엽록체의 외막 내에서 많은 기능을 수행합니다. 여기에서 우리는 X선 결정학 또는 NMR 분광법에 의한 구조 결정을 위해 충분한 양의 β배럴 OMP를 생산하기 위한 프로토콜을 제시하여 구조 연구에서 알려진 병목 현상을 완화하기를 희망합니다.

β-배럴 외부 막 단백질의 구조 결정을 향해 - 구축해에서 결정에

X선 자유전자 레이저 및 싱크로트론 소스에서 연속 결정학을 위한 지질 입방상의 막 단백질 미세결정의 준비 및 전달 절차를 설명합니다. 이러한 프로토콜은 또한 용해성 단백질 미세결정의 통합 및 전달에 적용할 수 있으며, 이로 인해 액체 주입에 비해 샘플 소비를 크게 줄일 수 있습니다.

준비 및 직렬 펨토초 결정학에 대한 지질 큐빅 단계에서 단백질 미세 배달

데이터의 신호 대 잡음 비율은 마이크로 결정에서 X 선 회절 측정을 수행하는 데 가장 중요한 고려 사항 중 하나입니다. VMXm 빔라인은 이러한 실험을 위한 저소음 환경과 마이크로빔을 제공합니다. 여기서는 VMXm 및 기타 마이크로포커스 대식분자 결정학 빔라인에 대한 미세 결정의 장착 및 냉각을 위한 샘플 준비 방법을 설명합니다.

VMXm 빔라인의 미세 결정을 위한 샘플 준비 파이프라인

이 논문은 지질 막의 중성자 스핀 에코 (NSE) 연구에서 샘플 준비, 데이터 감소 및 데이터 분석을위한 프로토콜을 설명합니다. 지질의 현명한 중테리움 라벨링은 중요한 생물학적 과정이 발생하는 중전 길이와 시간 척도에 대한 다양한 막 역학에 접근할 수 있게 합니다.

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분자 상호 작용 연구를 위한 세포 모방 지원 및 중단된 지질 이중층 모델의 조립

필 블롯 기술은 다층 및 농축된 생물학적 샘플을 단일 레이어로 분리하여 두께를 줄이고 샘플 농도를 높이며 이미지 처리를 용이하게 하는 Cryo-EM 그리드 준비 방법입니다.

필 블롯 기법: 다층 또는 농축된 생물학적 시료에서 단층을 분리하는 Cryo-EM 시료 전처리 방법

streptavidin 친화성 그리드를 제작하기 위한 단계별 프로토콜은 초저온 전자 현미경에 의한 까다로운 고분자 샘플의 구조 연구에 사용할 수 있도록 제공됩니다.

극저온 전자 현미경 시료 전처리를 위한 Streptavidin-Affinity Grid 제작

학습하세요 지질 단층을 이용한 단백질 2D 결정화 방법을 통해 막 단백질과 가용성 단백질의 구조를 연구하는 기법을 배우세요. 이 방법은 전자 현미경 영상 분석에 안정적인 플랫폼을 제공합니다.

전자 결정학 연구를 위한 지질 단층 방법을 이용한 샘플 준비

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