Name: 미세주입에 의한 스트 롱실로이드 종에서 형질전환 및 녹아웃 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-07T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: 배우세요 Strongyloides stercoralis와 S. ratti 기생선충에서 미세주입을 이용한 형질전환 및 녹아웃 생성 방법입니다. 이 기술은 유전자 기능 연구와 기생 메커니즘 규명에 필수적입니다.

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pPV540과 pPV402는 펜실베니아 대학의 제임스 록 박사의 친절한 선물이었다. 원고에 대한 유용한 의견을 주신 Astra Bryant에게 감사드립니다. 이 연구는 Burroughs-Wellcome Fund Investigators가 Pathogenesis of Disease Award, Howard Hughes Medical Institute Faculty Scholar Award 및 National Institutes of Health R01 DC017959 (E.A.H.)의 자금을 지원했습니다.

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</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

이 미세주입 프로토콜 은 S. stercoralis 및 S. ratti에 트랜스제네시스 및 CRISPR/Cas9 매개 돌연변이유발을 위한 작제물을 도입하는 방법을 상세 히 기술한다. S. stercoralis 및 S. ratti 둘 다에 대해, 주사 후 생존 및 형질감염 또는 돌연변이 유발의 속도는 미세 조정될 수 있는 몇 가지 변수의 적용을 받는다.
성공적인 전이형성을 위한 첫 번째 중요한 고려 사항은 플라스미드 전이유전자가 어떻게 구축되는지입니다. 이전의 연구들은 스트롱실로이드에서 외인성 전이유전자의 발현이 스트롱실로이드 5' 프로모터 및 3' UTR 요소 3,13,19의 사용을 필요로 한다는 것을 발견했다. <e...

스트롱실로이드 스테로이드는 더 널리 알려진 갈고리벌레 및 회충 Ascaris lumbricoides1에 비해 중요한 인간 병원체로서 오랫동안 간과되어 왔다. 웜 부담에 대한 이전의 연구는 종종 S. stercoralis 2에 대한 일반적인 진단 방법의 민감도가 낮기 때문에 S. stercoralis의 유병률을 심각하게 과소 평가했습니다. 최근 몇 년 동안, 개선 된 진단 도구에 기초한 역학 연구는 S. stercoralis 감염의 진정한 유병률이 이전에보고 된 것보다 훨씬 높다고 추정했다(전 세계적으로 약 610 만 명).
밀접한 관련이 있는 쥐 기생충과 일반적인 실험실 모델 S. ratti를 포함한 S. stercoralis 및 다른 Strongyloides 종은 모두 기생 및 자유 생활 (환경) 세대 3으로 구성되어 있기 때문에 실험 게놈 연구에 유리한 비정상적인 수명주기를 가지고 있습니다 (그림 1). 특히, S. stercoralis와 S. ratti 모두 단일 자유 생활 세대를 통해 순환 할 수 있습니다. 자유 생활 세대는 자유롭게 사는 성인 남성과 여성으로 발전하는 기생 후 애벌레로 구성됩니다. 자유롭게 사는 성인의 모든 자손은 감염성 애벌레로 발전하며, 이는 수명주기를 계속하기 위해 숙주를 감염시켜야합니다. 또한,이 환경 또는 자유 생활 세대는 실험실에서 실험적으로 조작 될 수 있습니다. 자유 생활 Strongyloides 성인과 C. elegans 성인은 유사한 형태를 공유하기 때문에 원래 C. elegans를 위해 개발 된 성선 내 미세 주사와 같은 기술은 자유 생활 성인 Strongyloides 4,5와 함께 사용하도록 적용 할 수 있습니다. DNA는 일반적으로 자유 생활 성인 여성에게 도입되지만, 스트롱 틸로이드의 남성과 여성 모두 미세 주입 될 수 있습니다6. 따라서, 기능적 게놈 도구는 스트롱실로이드의 생물학의 많은 측면을 심문하기 위해 이용가능하다. 다른 기생 선충류는 자유 생존 세대가 부족하고, 결과적으로 기능적 게놈 기술에 쉽게 적응할 수 없다3.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63023/63023fig01.jpg"> 그림 1: 스트롱실로이드 스테로이드 수명주기. S. stercoralis 기생 암컷은 포유류 숙주 (인간, 비 인간 영장류, 개)의 소장에 서식합니다. 기생 여성은 분파 발생에 의해 번식하고 소장 내에 알을 낳습니다. 알은 숙주 안에있는 동안 부화하여 기생 후 애벌레로 변한 다음 대변이있는 환경으로 전달됩니다. 기생 후 애벌레가 수컷 인 경우, 그들은 자유롭게 사는 성인 남성으로 발전합니다. 기생 후 유충이 암컷 인 경우, 자유 생활 성인 암컷 (간접 발달) 또는 3 단계 감염성 유충 (iL3s; 직접 발달)으로 발전 할 수 있습니다. 자유롭게 사는 남성과 여성은 성적으로 번식하여 iL3가되도록 제한받는 자손을 만듭니다. 특정 조건 하에서, S. stercoralis는 또한 대변의 환경으로 통과하기보다는 기생 후 유충 중 일부가 숙주 장 내부에 남아있는 자동 감염을 겪을 수 있습니다. 이 유충은 숙주 내부에서자가 감염 유충 (L3a)으로 발전하여 장 벽을 관통하고 신체를 통해 이동하며 결국 장으로 돌아와 생식 성인이 될 수 있습니다. S. ratti의 수명주기는 S. ratti가 쥐를 감염시키고 자동 감염주기가 없다는 점을 제외하고는 유사합니다. 환경 생성은 유전 연구에 Strongyloides 종을 사용하는 열쇠입니다. 자유 생존 성인 여성 (P0)은 미세 주입 될 수있다; 모두 iL3s가 될 그들의 자손은 잠재적 인F1 트랜스제닉입니다. 이 그림은 Castelletto et al.에서 수정되었습니다. 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63023/63023fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
S. stercoralis는 숙주 침범 및 숙주 면역 조절을 포함한 다른 위장 인간 기생 선충류와 생물학의 많은 측면을 공유합니다. 예를 들어, Necator 및 Ancylostoma 속의 인간 기생 갈고리 벌레는 또한 피부 침투에 의해 감염되고, 신체를 통해 유사하게 탐색하며, 궁극적으로 소장7에서 기생 성인으로 거주합니다. 따라서 많은 위장 선충류는 일반적인 감각 행동과 면역 회피 기술을 사용할 가능성이 큽니다. 결과적으로, Strongyloides 에서 수집 된 지식은 유전적으로 덜 다루기 쉬운 다른 선충류의 발견을 보완하고 이러한 복잡하고 중요한 기생충에 대한보다 완전한 이해로 이어질 것입니다.
이 미세 주입 프로토콜은 트랜스제닉 및 돌연변이 자손을 만들기 위해 Strongyloides 자유 생활 성인 여성에게 DNA를 도입하는 방법을 설명합니다. 미세주사를 위한 성인 웜의 발달 시기 및 형질전환 자손의 수집을 포함하는 균주 유지 요건이 설명된다. 프로토콜 및 완전한 미세 주입 기술의 시연과 함께 트랜스제닉 자손을 배양하고 스크리닝하기위한 프로토콜이 포함되어 있으며 필요한 모든 장비 및 소모품 목록이 포함되어 있습니다.

<table><tbody><tr><td>(&빼기;)-니코틴, &ge; 99%(GC), 액체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3876-5ML</td><td>니코틴 마비 웜</td></tr><tr><td>3" 철 C-클램프, 3" x 2"(용량 x 깊이)</td><td>VWR</td><td>470121-790</td><td>벤치 탑 설정을 위한 C-클램프</td></tr> 슬라이드<tr>용<td>Agarose LE</td><td>Phoenix</td><td>RBA-500</td><td>아가로스</td></tr><tr><td>뼈 숯, 4lb 통, 10 x 28 메쉬</td><td>Ebonex</td><td>n/a</td><td>숯 배양용</td></tr><tr><td>뼈 숯, 과립, 10 x 28 메쉬</td><td>Reade</td><td>bonechar10x28</td><td>배설물 배양용 숯(위의 대안)</td></tr><tr><td>굵은 미세 조작기</td><td>Narishige</td><td>MMN-1</td><td>거친 미세 조작기</td></tr><tr><td>Corning Costar Spin-X 원심분리기 튜브 필터</td><td>Fisher</td><td>07-200-385</td><td>마이크로 필터 컬럼</td></tr><tr><td>커버 유리, 48 x 60mm, No. 1 두께</td><td>Brain Research Lab</td><td>4860-1</td><td>커버슬립 (48 x 60mm)</td></tr><tr><td>깊은 페트리 접시, 6개의 통풍구가 있는 무거운 버전, 직경 100mm</td><td>VWR</td><td>82050-918</td><td>10cm 페트리 접시(배설물 배양용)</td></tr><tr><td>Eisco 레토르트 베이스(막대 포함</td>) <td>Fisher</td><td>12-000-101</td><td>Baermann 장치용 스탠드</td></tr><tr><td>Eppendorf FemtoJet 마이크로인젝터 마이크로로더 팁</td><td>VWR</td><td>89009-310</td><td>마이크로주입 바늘 주입</td></tr>용 <tr><td>Fisherbrand 흡수성 언더패드</td><td>Fisher</td><td>14-206-62</td><td>벤치 용지(준비용)</td></tr><tr><td>Fisherbrand 주철 링</td><td>Fisher</td><td>14-050CQ</td><td>Baermann O-링</td></tr><tr><td>Fisherbrand 삼각 폴리프로필렌 비커</td><td>Fisher</td><td>14-955-111F</td><td>플라스틱 비커(혼합용)</td></tr><tr><td>Fisherbrand 삼각 폴리프로필렌 비커</td><td>Fisher</td><td>14-955-111F</td><td>플라스틱 비커(캐치 버킷/물 양동이용)</td></tr><tr><td>Fisherbrand 삼각 폴리프로필렌 비커</td><td>Fisher</td><td>14-955-111F</td><td>플라스틱 비커(x2)(홀더 제작용)</td></tr><tr><td>주사기에 담긴 고릴라 에폭시</td><td>McMaster-Carr</td><td>7541A51</td><td>접착제(튜브 부착용)</td></tr><tr><td>할로카본 오일 700</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8898-50ML</td><td>할로카본 오일</td></tr><tr><td>식품 및 음료용 고온 실리콘 고무 튜브, 1/2" ID, 5/8" OD</td><td>McMaster-Carr</td><td>3038K24</td><td>튜빙 (깔때기 용)</td></tr> <tr><td>KIMAX 깔때기, 긴 줄기, 60도; 앵글, 킴블 체이스</td><td>VWR</td><td>89001-414</td><td>Baermann 깔때기</td></tr><tr><td>Kimberly-Clark Professional Kimtech Science 벤치탑 프로텍터</td><td>Fisher</td><td>15-235-101</td><td>벤치 페이퍼(준비용)</td></tr><tr><td>형광이 있는 Leica 실체 현미경</td><td>Leica</td><td>M165 FC</td><td>GFP 형질 전환 웜 식별 및 분류용 실체 현미경</td></tr><tr><td>microINJECTOR 황동 스트레이트 암 니들 홀더</td><td>Tritech</td><td>MINJ-4</td><td>마이크로 주입 바늘 홀더</td></tr><tr><td>microINJECTOR 시스템</td><td>Tritech</td><td>MINJ-1</td><td>마이크로 주입 시스템</td></tr><tr><td>몽골 게르빌스</td><td>Charles River Laboratories</td><td>213-몽골 게</td>르<td>빌 저빌스 S. stercoralis, 수컷 4-6주</td></tr><tr><td>Nasco Whirl-Pak 닫기 쉬운 가방, 18oz</td><td>VWR</td><td>11216-776</td><td>Whirl-Pak 샘플 가방</td></tr><tr><td>나일론 얇은 명주 그물(메쉬)</td><td>Jo-Ann Fabrics</td><td>zprd_14061949a</td><td>Baermann 홀더용 나일론 메쉬</td></tr><tr><td>플래티넘 와이어, 36 게이지, 인치당</td><td>Thomas Scientific</td><td>1233S72</td><td>플래티넘/이리듐 와이어 웜 픽용</td></tr><tr><td>청교도 혀 압착기, 152mm(L) x 17.5mm(W)</td><td>VWR</td><td>62505-007</td><td>나무 막대기(샘플 혼합용)</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td>QIAGEN Miniprep Kit</td></tr><tr><td>Rats-Long Evans</td><td>Envigo</td><td>140 HsdBlu:LE Long Evans</td><td>쥐 S. ratti, 암컷 4-6</td></tr>주 <tr><td>유지 관리 Rats-Sprague Dawley</td><td>Envigo</td><td>002 Hsd:Sprague Dawley SD</td><td>쥐 S. ratti, 암컷 4-6주 유지 관리</td></tr> 정말 <tr><td>유용한 상자 뚜껑이 있는 반투명 보관 상자, 1.6L 용량, 7-5/8" x 5-5/16" x 4-5/16"</td> <td>Office Depot</td><td>452369</td><td>가습실</td></tr><tr><td>용 플라스틱 상자셰퍼드 테크보드, 8 x 16.5인치</td><td>Newco</td><td>999589</td><td>테크보드</td></tr><tr><td>스테인리스 스틸 레이즈드 와이어 바닥</td><td>Ancare</td><td>R20SSRWF</td><td>와이어 케이지 바닥</td></tr><tr><td>StalkMarket 퇴비화 가능한 수저 스푼, 6", 흰색, Office</td><td>Depot</td><td>9587303</td><td>스푼</td>1,000개 팩</tr><tr><td>Stender 접시, 스태킹 유형, 37 x 25mm</td><td>캐롤라이나(과학)</td><td>741012</td><td>시계 안경(소, 원형)</td></tr><tr><td>실체현미경</td><td>Motic</td><td>K-400 LED</td><td>해부 준비 스코프</td></tr><tr><td>보관 토트, 색상 클리어/화이트, 외부 높이 4-7/8인치, 외부 길이 13-5/8인치, 가</td><td>습 챔버용</td>Sterilite <td>Grainger</td><td>53GN16</td> 플라스틱 상자</tr><tr><td>Sutter P-30 마이크로피펫 풀러 Sutter P-30</td><td></td><td>/P</td><td>바늘 풀러와 백금/이리듐 필라멘트</td></tr><tr><td>시러큐스 시계 안경</td><td>Fisher</td><td>S34826</td><td>시계 안경 (대, 원형)</td></tr> <tr><td>Thermo Scientific Castaloy 고정 각도 클램프</td><td>Fisher</td><td>05-769-2Q</td><td>깔때기 클램프 (2x)</td></tr> <tr><td>3 축 행잉 조이스틱 오일 하이드로 릭 마이크로 매니퓰레이터</td><td>Narishige</td><td>MM0-4</td><td>미세 미세 매니퓰레이터</td></tr><tr><td>United Mohr 핀치 콕 클램프</td><td>Fisher</td><td>S99422</td><td>핀치 클램프 (2x)</td></tr> <tr><td>통풍이 잘되는 날카로운 가장자리의 페트리 접시 (직경 60mm)</td> <td>Tritech Research</td><td>T3308P</td><td>6cm 페트리 접시 (소규모 분변 숯 배양 용)</td></tr> <tr><td>VWR 경량 티슈 와이퍼</td><td>VWR</td><td>82003-820</td><td>라이닝 Baermann 홀더</td></tr><tr><td>시계 유리, 사각형, 1-5/8 인치</td><td>캐롤라이나 (과학)</td> <td>742300</td><td>시계 안경 (소, 사각형)</td></tr><tr><td>Whatman 품질 등급 일반 원, 1 학년, 직경 5.5 cm</td><td>피셔</td><td>09-805B</td><td>여과지 (6cm 페트리 용) 그릇)</td></tr><tr><td>Whatman 품질 등급 일반 원, 1 등급, 직경 9cm</td><td>Fisher</td><td>09-805D</td><td>여과지 (10cm 페트리 접시 용)</td></tr><tr><td>World Precision Instrument 붕규산 유리 모세관, 1.2mm x 4 in</td><td>Fisher</td><td>50-821-813</td><td>유리 모세관 마이크로 주입 바늘</td></tr><tr><td>X-Acto 나이프, No. 1 나이프 No. 11 블레이드 Office</td><td>Depot</td><td>238816</td><td>X-Acto 나이프 웜 픽을 담을 블레이드가없는 나이프</td></tr><tr><td>Zeiss AxioObserver A1</td><td>Zeiss</td><td>해당 없음</td><td>도립 현미경</td></tr></tbody></table>

미세주입에 의한 스트 롱실로이드 종에서 형질전환 및 녹아웃 생성

Generating Transgenics and Knockouts in Strongyloides Species by Microinjection

Strongyloides 속은 Strongyloides stercoralis 및 Strongyloides ratti를 포함하여 다양한 숙주 범위를 가진 여러 종의 피부 침투 선충류로 구성됩니다. S. stercoralis는 약 610 만 명의 사람들을 감염시키는 인간 기생충, 피부 침투 선충류이며, 쥐 기생충 S. ratti는 S. stercoralis와 밀접한 관련이 있으며 종종 S. stercoralis의 실험실 모델로 사용됩니다. S. stercoralis 및 S. ratti 둘 다 성선 내 미세주사의 외인성 핵산 전달 기술을 통해 트랜스제닉 및 녹아웃의 생성에 쉽게 적응할 수 있으며, 따라서 아직이 기술에 적용 가능하지 않은 다른 기생충에 대한 모델 시스템으로 부상했습니다.
기생충 Strongyloides 성인은 숙주의 소장에 서식하며 대변을 통해 자손을 환경으로 방출합니다. 일단 환경에 들어가면, 애벌레는 배설물에 살고 새로운 숙주를 찾아 침략해야하는 자손을 생산하는 자유 생활 성인으로 발전합니다. 이러한 환경 생성은 Strongyloides 종에 고유하며 C. elegans를 위해 개발 된 기술이 성선 내 미세 주사를 포함하여 이러한 기생충 선충류와 함께 사용하도록 적응 될 수있는 모델 자유 살아있는 선충류 Caenorhabditis elegans 와 형태학적으로 충분히 유사합니다 . 성선 내 미세주사를 사용하여, 매우 다양한 전이유전자가 스트롱실로이드에 도입될 수 있다. CRISPR / Cas9 성분은 또한 돌연변이 Strongyloides 애벌레를 만들기 위해 미세 주입 될 수 있습니다. 여기에서, 자유 생존 성인의 제조, 주사 절차 및 트랜스제닉 자손의 선택을 포함하는 스트롱실로이드 로의 성선 내 미세주사의 기술이 기재되어 있다. CRISPR/Cas9 돌연변이유발을 사용하여 만든 형질전환 스트롱실로이드 유충의 이미지가 포함되어 있습니다. 이 논문의 목적은 다른 연구자들이 미세 주입을 사용하여 트랜스제닉 및 돌연변이 스트롱 틸로이드를 만들 수있게하는 것입니다.

실험이 성공하면,F1 유충은 관심있는 전이유전자 및/또는 돌연변이 표현형을 발현할 것이다(그림 4). 그러나 형질전환 속도는 매우 가변적이며 구성물, 웜의 건강, 주사 후 배양 조건 및 실험자의 기술에 따라 다릅니다. 일반적으로, 성공적인 실험은 주입된 암컷 당 &gt;15 F1 유충을 산출하고 형광 마커에 대해 &gt;3%의 형질전환 속도를 산출할 것이다. 살아있는 자손의 총 수가 평균 10 마리 미만의 애벌레 / 암컷이라면, 그 구조는 독성이 있고 변형 된 유충은 생존하지 못할 수 있습니다. 형광 유충이 아닌 많은 수의 형광 알을 발견하는 것은 주사 혼합이 유독 할 수 있다는 또 다른 표시입니다. 이 기술을 처음 학습할 때는 체벽 근육(13)에서 강력한 표현을 유도하는 act-2::mRFPmars와 같이 잘 표현되는 구조를 사용하는 것이 좋습니다(<strong class="x...

기생 선충류 Strongyloides stercoralis 및 Strongyloides ratti 에 대한 기능적 게놈 툴킷에는 트랜스제네시스, CRISPR/Cas9 매개 돌연변이유발 및 RNAi가 포함됩니다. 이 프로토콜은 성선 내 미세주사를 사용하여 전이유전자 및 CRISPR 성분을 S. stercoralis 및 S. ratti에 도입하는 방법을 입증할 것이다.

The genus Strongyloides consists of multiple species of skin-penetrating nematodes with different host ranges, including Strongyloides stercoralis and ...

미세 주입을 사용하여 DNA 구축물을 Strongyloides에 전달하면 녹아웃 및 트랜스제닉을 생성 할 수 있습니다.이 웜이 어떻게 발달하고, 환경을 탐색하고, 숙주를 기생시키는 지 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 지금까지, 이것은 이러한 기생충에서 녹아웃 및 트랜스제닉을 생성하는 유일한 성공적인 기술입니다. 미세주입 하루 전, 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 커버 슬립에 아가로스 용액 180 마이크로리터를 넣은 다음, 즉시 두 번째 커버 슬립을 위에 떨어뜨려 아가로스를 얇은 패드로 평평하게 만듭니다.5 ~ 10 초 후, 두 개를 밀어 상단 덮개 슬립을 제거하고 한천 패드가 어느 슬라이드에 있는지 확인한 다음 위로 향하게하십시오. 그런 다음 깨진 커버 슬립에서 작은 유리 파편을 선택하고 집게를 사용하여 패드의 상단 가장자리 근처의 한천으로 부드럽게 누릅니다. 미세 주입 당일, Baermann 홀더를 줄 지어 놓으십시오.이 체는 두 개의 플라스틱 링으로 만든 체로 나일론 튜일 그물망 두 층이 세 개의 겹치는 실험실 조직 조각으로 그 사이에 고정되어 있습니다.그런 다음 배설물 - 숯 혼합물을 Baermann 홀더에 첨가하십시오. 다음으로 깔때기에 분변 - 숯 혼합물이있는 Baermann 홀더를 놓고 분변 - 숯 혼합물 주위에 조직 조각을 접은 다음 분변 숯의 대부분을 잠수하기에 충분한 물을 첨가하십시오. 그런 다음 깔때기를 15 센티미터 플라스틱 페트리 접시 뚜껑으로 올려 냄새를 억제하고 필요에 따라 깔때기에 라벨을 붙입니다.한 두 시간 후, 깔때기 바닥의 고무 튜브 아래에 50 밀리리터 원심 분리 튜브를 잡고 조심스럽게 하단의 클램프를 열어 웜이 들어있는 30 ~ 40 밀리리터의 물을 50 밀리리터 튜브에 분배하십시오. 그러면. 웜이 들어있는 Baermann 물 15 밀리리터를 15 밀리리터 원심 분리 튜브로 옮깁니다. 튜브를 돌리고 상청액을 최대 13 밀리리터까지 제거한 다음 요오드가 함유 된 액체 폐기물 용기에 버려 웜을 죽입니다.모든 웜을 수집 한 후 튜브 바닥에있는 웜 펠렛을 검사하십시오. 웜이 보이지 않으면 한 두 시간 동안 기다린 다음 Baermann 장치에서 더 많은 웜을 수집하십시오. E.coli HB101의 잔디밭이있는 6 센티미터 2 % 선충류 성장 배지 플레이트에 가능한 한 적은 물에 웜을 옮기고이 플레이트를 미세 주입을위한 소스 플레이트로 사용하십시오.해부 현미경 아래, 표준 백금 웜 픽을 사용하여 마이크로 주입 패드 커버 슬립의 유리 파편을 할로 카본 오일로 덮으십시오. 그런 다음 미세 주입 패드 커버 슬립을 미세 주입 범위에 놓고 오일로 덮인 유리 파편을 찾습니다. 가장자리가 바늘의 방향에 수직이 되도록 유리 파편을 정렬하여 바늘을 부러 뜨리는 데 사용되는 표면 역할을합니다.다음으로, 해부 현미경을 사용하여 바늘에 테이퍼 샤프트에 기포 나 이물질이 없는지 확인한 다음 바늘을 가압 홀더에 1 ~ 1.5 센티미터 고정하십시오. 바늘의 끝을 눈으로 볼 수 있는 현미경의 중앙에 놓고 저배율 하에서 바늘의 끝을 유리 파편의 측면에 수직인 시야각에 위치시킵니다. 그런 다음 더 높은 배율로 전환하고 바늘 끝을 유리의 가장자리에 맞 춥니 다. 가까이에서 만지지는 않습니다.다음으로, 바늘의 팁을 부수고 액체 흐름을 허용하려면 가스로부터 지속적인 압력을 가하면서 유리 조각의 측면에있는 바늘을 부드럽게 누릅니다. 액체가 흐르기 시작하면 팁의 모양을 확인하고 쉽게 흐르는 액체로 날카로운지 확인하십시오. 액체가 바늘에서 잘 흐르면 미세 주입 슬라이드를 해부 범위로 옮기고 웜을 배치하기 위해 한천 패드에 하나 ~ 두 마이크로 리터의 할로 카본 오일을 추가하십시오.20 ~ 30 명의 젊은 성인 스트롱 틸로이드를 박테리아가없는 2 % 선충류 성장 배지 플레이트에 적어도 5 분 동안 옮겨 과도한 표면 박테리아를 제거하고 미세 주입을위한 단일 웜을 선택하십시오. 주입하는 동안 필요에 따라 플레이트에 더 많은 웜을 추가하십시오. 웜 픽에 소량의 할로 카본 오일을 사용하여 박테리아가없는 접시에서 생식선에 하나 ~ 네 개의 알을 가진 Strongyloides 젊은 성인 여성을 선택하고 웜을 한천 패드의 작은 기름 방울로 옮깁니다.웜 픽을 사용하여 웜이 감겨지지 않도록 부드럽게 배치하고 생식선이 보이고 접근하기 쉽습니다. 그런 다음 미세 주입 현미경 시야에 웜을 배치하여 생식선이 바늘과 같은면에 있는지 확인하고 바늘이 약간의 각도로 생식선에 닿을 수 있도록 배치하십시오. 다음으로, 바늘의 끝을 동일한 초점면의 웜 옆으로 가져 오십시오.그런 다음 웜의 중간 근처의 생식선 팔을 겨냥하여 미세 인젝터를 사용하여 바늘을 생식선에 부드럽게 삽입하십시오. 즉시 바늘에 압력을 가하여 전체 생식선 팔을 DNA 용액으로 부드럽게 채 웁니다. 충분한 유체가 주입 된 후 바늘을 제거하고 상처가 닫히는 것을 관찰하십시오.생식선의 다른 팔이 보이면 절차를 반복하십시오. 주사가 완료되면 한천 패드에 바늘 끝으로 압력을 가하여 바늘이 막히지 않았는지 신속하게 확인한 다음 주입 된 웜으로 슬라이드를 해부 현미경으로 옮깁니다. 주입 된 웜을 복구하려면 먼저 웜에 웜 완충 식염수 몇 방울을 떨어 뜨려 한천 패드에서 떼어냅니다.그런 다음 웜 픽에 소량의 박테리아를 모으고 부착 박테리아로 웜을 만져서 액체에서 제거하십시오. 웜을 복구 플레이트로 부드럽게 옮깁니다. 행동 실험을 위해, 20 내지 30마리의 유충을 두꺼운 HB101 박테리아 잔디밭이 있는 2%선충 성장 배지 플레이트로 옮기고, 형광 해부 현미경 하에서 관심있는 전이유전자를 발현하는 유충을 확인한다.그런 다음 웜 픽을 사용하여 형질전환 유충을 선택하고 웜 완충 식염수가있는 작은 시계 유리에 놓습니다. 현미경 검사의 경우, 면도날을 사용하여 10 센티미터 화학주성 플레이트의 플라스틱 바닥에 그리드를 채점하여 플레이트에서 웜의 위치를 쉽게 추적하십시오. 다음으로, 웜 버퍼링 식염수에 세 마이크로 리터의 유충을 그리드의 사각형에 넣고 필요한만큼 많은 사각형을 채 웁니다.그런 다음 웜 방울에 물에 1 % 니코틴 15 ~ 20 마이크로 리터 방울을 넣으십시오. 네 분 후, 웜이 마비되면 형광 해부 현미경을 사용하여 웜을 스크리닝합니다. 불완전하고 완전한 act-2 mRFPmars 발현 패턴을 갖는 트랜스제닉 스트롱실로이드 스테로이드 유충이 여기에 제시되어 있다.체벽 근육에서의 패치 발현은 전이유전자가 게놈에 통합되지 않을 때 더 흔하다. 대조적으로, 체벽 근육 전체에 걸친 일관된 발현은 종종 전이유전자가 게놈 내로 통합되었다는 것을 나타낸다. 핵심 단계는 DNA가 생식선에 주입되고 발달하는 알에 통합 될 수 있도록 생식선과 동일한 초점 평면에 바늘을 배치하는 것입니다.이 기술의 개발은 기생충 선충류의 유전자 기능을 연구 할 수있게 해주었고, 기생충과 숙주 - 기생충 상호 작용의 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 제공하고 있습니다.

generating-transgenics-knockouts-strongyloides-species

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

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미세주입에 의한 스트 롱실로이드 종에서 형질전환 및 녹아웃 생성

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