지방 조직에서 중간엽 줄기세포를 얻는 기술 및 장기 냉동 보존에서 기질 혈관 분획 특성 분석
2021년 12월 30일
본 프로토콜은 ADSC 단리를 위한 개선된 방법론을 기술하여 문헌에 비해 시간 이득과 함께 엄청난 세포 수율을 초래한다. 이 연구는 또한 장기 동결보존 후 비교적 많은 수의 생존 가능한 세포를 얻기 위한 간단한 방법을 제공합니다.
여기에서 우리는 만능 중간엽 세포의 주입과 같은 치료 단계의 사용을 위해 양호하고 생존 가능한 세포를 얻고 보존하기 위한 프로토콜을 시연했습니다. 이것의 주요 이점은이 기술을 사용하여 수집 된 조직으로부터 세포의 분리 단계에서 얻은 시간 대비 생존 가능한 세포 부피를 얻을 수 있다는 것입니다. 이 기술은 이형 의학 및 세포 요법이 적용되는 모든 질병 또는 상태로 확장 될 수 있습니다.
이 방법은 장기 세포 배양이 장려 될 수있는 약물 검사와 같은 영역에서 세포 게놈 안정성 검사에도 적용될 수 있습니다. 살아있는 세포를 조작 할 때마다 침착하고 자신감을 가지십시오. 패혈증에 극도의 주의를 기울이고 역경을 관찰하고 올바른 결정을 내리기 위해 과학자의 눈으로 끊임없이 경계하십시오.
가방의 무게를 측정하고 디지털 비접촉 적외선 임상 온도계로 온도를 측정하는 것으로 시작하십시오. 층류 챔버 내부에 5 분 동안 백을 두어 기름기 층을 침전시키고 세포가 들어있는 조직을 분리합니다. 칼슘이 든 DPBS 100ml를 이송 백에 넣고 손으로 섞습니다.
5 분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 백 어댑터에 부착 된 60 밀리리터 주사기를 사용하여 침전되는 대부분의 기본 액체를 버립니다. 이 과정을 두 번 반복하십시오.
소화 용액 100 밀리리터를 백에 넣고 천천히 저어 주면서 섭씨 37도에서 30 분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 가방의 모든 내용물을 4 개의 50 밀리리터 원추형 튜브로 옮기고 섭씨 22도에서 10 분 동안 400G에서 원심 분리합니다. 상청액을 버리고 20% 태아 소 혈청이 보충된 DMEM 저혈당 5밀리리터를 세포 펠릿에 추가합니다.
증류수에 0.05 % 10 마이크로 리터의 트리판 블루의 신선한 용액을 10 마이크로 리터의 세포 현탁액과 5 분 동안 혼합합니다. 20X 배율의 도립 광학 현미경을 사용하고 Neubauer 세포 계수 챔버에서 생존 가능한 세포를 계수합니다. 세포 펠릿을 밀리리터당 100만 세포 농도의 냉동 보호 배지에 현탁합니다.
그런 다음이 혼합물 1 밀리리터를 냉동 바이알에 넣으십시오. 분당 섭씨 1 도의 냉각 속도로 냉동 용기를 사용하고 섭씨 80도에서 1 년 동안 보관하십시오. 1 년 후 액체 질소 증기상에 담근 표준 카세트 상자에 보관하십시오.
9 명의 환자로부터의 절차의 다른 단계의 데이터가이 표에 제시되어있다. 초기 세포 수율에 따라, 각 샘플에 대한 세포의 가변 부피가 결정되었다. 세포 수율이 높은 샘플 1 밀리리터, 중간 세포 수율을 가진 샘플의 경우 1.1 밀리리터, 세포 수율이 낮은 샘플 당 2 밀리리터.
통과 전의 세포 수율은 트립신화 전에 동일한 합류가 관찰된 경우에도 광범위하게 다양했습니다. 따라서 여기서 세포는 층으로 성장했을 수 있습니다. 대표 이미지는 광학 현미경에서 분리 후 첫 번째 통로에서 플라스틱 부착 중간엽 ADSC를 보여줍니다.
세포는 플라스틱 및 섬유 아세포와 같은 형태에 대한 접착력을 보여줍니다. 트리판 블루 분석에서 Neubauer 챔버에서 계수된 생존 세포가 여기에 표시됩니다. 6 명의 환자로부터의 유세포 분석 데이터가이 표에 제시되어있다.
이들 CD45 음성 세포로부터, 줄기 세포 마커의 상이한 조합을 갖는 ADSC의 백분율이 결정되었다. 대표적인 이미지는 8개월간의 냉동 보존 후 사례 9의 SVF에서 줄기 세포 관련 마커에 대해 양성인 세포의 하위 집단을 보여줍니다. 여기서, R1은 순방향 산란 대 측면 산점도에서 분석된 전체 세포 영역이다.
R2는 CD45 음성 영역이다. CD73, CD90 및 CD105 인구는 이 지역에서 양성입니다. 연골 세포, 골 세포 및 지방 세포에서의 ADSC 분화가 여기에 표시됩니다.
이 절차를 시도하는 동안 천천히, 가급적이면 손으로 저어주고 섭씨 37도에서 30분 동안 방치하여 유착과 물집을 관찰하는 것을 잊지 마십시오. 작업실 온도를 섭씨 25도 정도로 유지하고 훨씬 더 큰 온도에서 열 충격을 피하십시오. 여기에 표시된 기술은 만능 중간엽 세포를 다른 조직에서 성공적으로 분리하는 데 사용할 수 있습니다.
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개요
본 프로토콜은 기존 문헌과 비교하여 세포 수율을 높이고 소요 시간을 단축한 지방 유래 줄기세포(ADSCs) 분리를 위한 개선된 방법론을 설명합니다. 또한, 장기 동결 보존 후 상당수의 생존 세포를 확보하는 방법도 상세히 다룹니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 세포 생물학
- 줄기세포 연구
- 치료적 응용
배경
- ADSC는 재생 의학 분야에서 가치가 높습니다.
- 분리 기술은 세포 생존율과 수율에 영향을 미칠 수 있습니다.
- 장기 동결 보존은 세포 저장에 있어 매우 중요합니다.
- 세포 치료 응용을 위해서는 고품질의 세포 집단이 필요합니다.
연구 목적
- ADSC의 분리 과정을 강화하기 위함입니다.
- 동결 보존 후 세포의 생존율을 높이기 위함입니다.
- 치료적 응용을 위한 신뢰할 수 있는 방법을 제공하기 위함입니다.
사용된 방법
- 수집된 조직으로부터 ADSC 분리.
- 동결 보존 후 세포 생존력 평가.
- 치료적 상황에서 해당 방법의 적용.
- 배양 중 세포 유전체 안정성 모니터링.
주요 결과
- 생존 세포 수율의 유의미한 증가.
- 세포 분리에 소요되는 시간 단축.
- 세포 생존력의 성공적인 장기 보존.
- 다양한 치료 분야에서의 잠재적 응용 가능성.
결론
- 개선된 프로토콜은 ADSC 분리에 효과적입니다.
- 장기 냉동 보존을 통해 세포 생존율을 유지할 수 있습니다.
- 이 방법은 세포 치료의 발전을 뒷받침합니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 개요
지방 유래 중간엽 줄기세포(ADSCs)의 효율적인 분리와 장기 동결 보존은 세포 기반 연구 및 전임상 개발의 확장성과 신뢰성에 직접적인 영향을 미칩니다. 본 프로토콜은 더 높은 생존 세포 수율과 장기 보관 후의 견고한 생존율을 가능하게 하여, 중개 연구 워크플로우와 바이오 제약 파이프라인의 연속성을 지원합니다. 잘 특성화된 ADSCs에 대한 안정적인 접근은 초기 발견 및 하위 치료 모델링의 예측 신뢰도를 뒷받침합니다.
바이오 제약 R&D에서의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 가설 기반의 경로 조사를 위해 생존 가능한 ADSC의 안정적인 소싱을 가능하게 합니다.
- 일관되고 고품질의 세포군을 제공함으로써 생물학적 리스크 감소를 지원합니다.
- 재현 가능한 세포 증식 및 분화를 통해 기능적 타겟 검증을 용이하게 합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 어세이의 재현성과 확장성을 위해 표준화된 냉동 보존 ADSC를 제공합니다.
- 해동 후 세포 생존율을 유지함으로써 정량적 결과의 신뢰도를 향상시킵니다.
- 화합물 스크리닝 및 평가를 위해 검증된 생물학적 시스템의 준비를 가능하게 합니다.
중개 및 전임상 연구
- 장기 보관 후에도 다능성 ADSC에 대한 접근성을 보장함으로써 질환 관련 모델링을 지원합니다.
- 세포 수집부터 전임상 검증 단계까지의 중개 연구 연속성을 유지합니다.
- 세포 투입 품질을 표준화하여 전임상 연구에서의 생물학적 변동성 위험을 줄입니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
본 프로토콜은 초기 발견부터 전임상 연구까지의 과정을 통합하여, 타겟 검증, 어세이 개발 및 중개 연구를 위한 일관된 ADSC 공급을 가능하게 합니다.
- 발견 생물학: 신뢰할 수 있는 ADSC 세포군을 통해 가설 검증 및 경로 규명을 지원합니다.
- 스크리닝: 동결 보존 후 재현 가능하고 정량적인 세포 기반 분석 입력물을 제공합니다.
- 분석: 배치 간 세포 품질의 벤치마크를 위한 생존율 및 면역 표현형 데이터 분석을 제공합니다.
- 중개 연구: 질환 모델링 및 바이오마커 연구를 위한 세포 특성의 연속성을 보장합니다.
- 기업 내 재사용: 여러 R&D 프로그램을 위해 재사용 가능한 동결 보존 ADSC 리소스를 구축합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 세포 기반 연구에서 예측 신뢰도를 높이고 기전적 모호성을 줄입니다.
- 운용적 가치: 세포 분리 및 보관을 표준화하여 재현성과 확장성을 향상시킵니다.
- 전략적 가치: 일관된 세포 품질과 생존율을 보장함으로써 더 나은 go/no-go 결정이 가능해집니다.
- 포트폴리오 영향: 세포 기반 치료제 프로그램의 리스크 조정 우선순위 선정 및 진전을 지원합니다.
실행 시 고려 사항
- 최적의 결과를 얻으려면 무균 조작 기술 및 세포 취급에 관한 전문 지식이 필요합니다.
- 프로그램 냉동 장치 및 액체 질소 저장 시설을 이용할 수 있어야 합니다.
- 세포 수 측정 및 생존율 평가 프로토콜에 대한 팀 간 표준화가 요구됩니다.
- 다양한 조직 기원이나 모델 시스템에 따라 조정이 필요할 수 있습니다.
- 장기 동결 보존 시 생존율이 감소하므로, 장기 저장 시 모니터링이 필요합니다.
