Name: 지방 조직에서 중간엽 줄기세포를 얻는 기술 및 장기 냉동 보존에서 기질 혈관 분획 특성 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-30T16:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: 배우세요 지방 조직에서 중간엽 줄기세포를 분리하고 장기 냉동 보존 후 생존율을 유지하는 향상된 방법을. 이 기술은 세포 치료 및 재생 의학 연구에 활용됩니다.

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참여에 자원한 환자들과 상파울루 병원의 의료 및 간호 직원들에게 감사드립니다. 이 연구는 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)와 Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)의 지원을 받았습니다.

본 연구는 UNIFESP 윤리위원회 (프로토콜 번호 : 0029/2015 CAAE : 40846215.0.0000.5505)의 승인을 받았으며, 헬싱키 선언 (2004)에 따라 환자로부터 서면 동의를받은 후 수행되었습니다. 본 연구의 샘플은 33-50 세 (평균 연령 41.5)이고 평균 초기 체질량 지수 (BMI)가 24.54 (22.32-26.77 사이) (표 1)의 9 명의 여성 환자로 구성되어 있으며, 상파울루 연방 대학교 (UNIFESP)의 성형 외과 부서에서 임신 후 피부 과잉으로 미적 복부 성형술을받은 사람, 브라질. 비뚤림을 줄이기 위해 환자는 성별, 연령 및 BMI를 고려한 동종 그룹으로 선택되었습니다. 이 연구 중에 사용 및/또는 분석된 데이터 세트는 합리적인 요청에 따라 교신 저자로부터 구할 수 있습니다.
1. 지방 흡인물 수집
참고: 이 단계는 수술 센터에서 수행해야 합니다.
<ol><li>피부 준비 및 무균을 위해 4 % 클로르헥시딘 글루코 네이트 ( 재료 표 참조)를 사용하십시오.<ol><li>2mm 피하 피부 절개 (진피하와 동맥 경화증 사이)를 수행하십시오. 26mm 3G 3구멍 및 3mm 구경의 Klein 캐뉼러와 주사기를 삽입하여 하부 영역의 식염수(1:1,000,000)에 희석한 총 부피의 아드레날린 용액(1mg/mL)( 재료 표 참조) 500mL를 주입합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>60mL 주사기를 26mm 3G 3구멍 및 3mm 구경 지방 흡입 캐뉼러에 연결하고 피부 절개 부위를 통해 삽입하고 플런저를 잠가 진공을 만듭니다.<ol><li>진공이 생성되면 지방 흡인물이 60mL 주사기에 남아 있도록 밀고 당기는 움직임을 만듭니다.</li>
	</ol></li>
	<li>밸브가 있는 멸균 커넥터를 사용하여 수집된 100mL의 리포아피네이트를 150mL 폴리염화비닐 전사 백으로 옮깁니다( 재료 표 참조).<ol><li>이송 백을 실온(~25°C)의 폴리스티렌 상자에 포장하고 즉시 실험실로 가져갑니다. 조직 처리를 시작하는 데 30 분 이상 걸리지 마십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 지방 흡인물의 가공
알림: 이 단계는 실험실에서 수행해야 합니다.
<ol><li>먼저, 가방의 무게를 측정하고, 디지털 비접촉 적외선 임상 온도계로 온도를 측정하고, 기름기 층(기포)의 침전 및 관심 세포를 포함하는 조직 분리를 위해 백을 층류 챔버 내부에 5분 동안 그대로 두십시오.<ol><li>일련의 조직 세척을 수행하십시오. 첫 번째 세척: DPBS 100mL에 칼슘(1x)을 트랜스퍼 백에 주입하고 손으로 섞습니다.</li>
		<li>5 분 동안 그대로 두어 침전되는 대부분의 기본 액체를 제거하십시오.</li>
		<li>백 어댑터에 부착된 60mL 주사기로 기본 액체를 폐기합니다. 이 과정은 두 번 반복해야합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>백에 분해액 100mL(무칼슘 DPBS 93mL + 염화칼슘 60μL(1g/L) + 0.075% 멸균 콜라게나제 7mL, 재료 표 참조)를 넣고 37°C에서 30분 동안 천천히 교반합니다.</li>
	<li>백의 모든 내용물을 50mL의 원뿔형 튜브 4개로 옮기고 22°C에서 400 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다.<ol><li>상청액을 제거하고 버리고 20% FBS(소 태아 혈청)가 보충된 Dulbecco의 변형된 Eagle's 배지(DMEM) 저혈당 5mL를 세포 펠릿에 추가합니다(그림 1).</li>
	</ol></li>
</ol>3. SVF 세포의 계수
<ol><li>증류수에 0.05%의 트리판 블루 10μL의 신선한 용액을 10μL의 세포 현탁액과 5분 동안 혼합합니다.</li>
	<li>20x 배율로 도립 광학 현미경 (재료 표 참조)을 사용하여 Neubauer 세포 계수 챔버(32)에서 생존 가능한 세포를 계수합니다.</li>
	<li>세포 펠릿을 냉동 보호 배지(FBS 5mL + 디메틸설폭사이드 10% - DMSO)에 1 x 106 cells /mL의 농도로 재현탁합니다.</li>
	<li>이 혼합물 1mL를 냉동 바이알에 넣습니다. 냉각 속도가 (1 °C/min에서 -80 °C)인 냉동 용기( 재료 표 참조)를 사용하십시오.<ol><li>-80 °C에서 1 년 동안 보관하십시오.</li>
		<li>이 시간 후에, 액체 질소 증기상 (-165 °C)에 침지 된 표준 카세트 박스에 저장한다.</li>
	</ol></li>
</ol>4. 세포의 해동 과정
<ol><li>액체 질소에서 바이알을 제거하고 즉시 37°C 수조에 1분 동안 두십시오.</li>
	<li>SVF 세포를 4°C에서 예열된 DMEM(20% FBS가 보충된 저혈당)이 있는 원뿔형 튜브에 37°C로 놓습니다.</li>
	<li>22°C에서 400 x g 로 5분간 원심분리합니다.</li>
	<li>상청액을 제거하고 DMEM(저혈당) + 10% FBS 1mL를 추가합니다. 아래 단계에 따라 면역 표현형을 수행하십시오.</li>
</ol>5. 유세포 분석 기술 (면역 표현형 다중 표지)
<ol><li>1mL의 세포 펠릿(1,000 cells/μL 농도)을 5개의 세포분석 튜브(각각 200μL)에 넣습니다.</li>
	<li>22°C에서 400 x g 에서 5분 동안 원심분리하고, 피펫으로 상청액을 버린다.</li>
	<li>300μL의 인산염 완충 식염수(PBS)(10x)를 추가하고 22°C에서 400x g 로 원심분리한 후 피펫으로 상청액을 버립니다.</li>
	<li>다음과 같이 상이한 마커 조합을위한 5 개의 튜브를 준비하십시오 : 5 μL의 CD11B / 5 μL의 CD19 / 20 μL의 CD45; 5 μL의 CD73/20 μL의 CD90/5 μL의 CD105/20 μL의 CD45; 20 μL의 CD34 / 5 μL의 HLA-DR / 20 μL의 CD45; 세포 생존율 분석-5 μL의 형광 반응성 염료. ( 재료 표 참조) 및 염색되지 않은 세포 및 음성 대조군으로서 PBS를 갖는 튜브를 포함한다. 와류에서 균질화하고 4 ° C에서 30 분 동안 배양합니다.<ol><li>22°C에서 400 x g 에서 5분 동안 원심분리하고, 피펫으로 상층액을 버리고, 500μL의 PBS(10x)를 첨가하고, 세포 분류를 진행한다. 참고: 유세포분석기에서 4가지 색상과 5가지 파라미터의 항체 세트당 5,000개의 이벤트를 획득하고 CellQuest 소프트웨어로 분석합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>6. 통로 1 (P1)의 파종
<ol><li>75 cm 2 배양 플라스크에2 x 105 세포를 시드합니다.</li>
	<li>DMEM 저혈당 12mL + FBS 20% + 항생제/항진균제 10%(mL당 페니실린 10,000단위, 스트렙토마이신 10mg 및 암포테리신 B 25μg, 0.1μm)를 추가합니다.</li>
	<li>세포가 80%-90% 합류 사이에 도달하면 2mL의 0.25% EDTA-트립신으로 부착 세포의 트립신화를 3분 동안 수행합니다.</li>
	<li>셀을 다시 계산합니다(3단계에서 언급한 대로).</li>
	<li>면역 표현형을 다시 수행하십시오 (5 단계에서 언급 한 바와 같이).</li>
</ol>7. 통계 분석
<ol><li>Spearman의 Rho 계산기33 을 사용하여 아래에 언급된 대로 P < 0.05를 갖는 다음 변수 간의 연관성 강도를 측정합니다.<ol><li>SVF 세포 수율과 SVF가 첫 번째 계대 (P1)에서 80 % -90 % 합류 (P1까지의 일수)까지 배양에 머무르는 일수를 선택하십시오.</li>
		<li>P1로 이동하기 전과 후의 SVF 셀룰러 수율을 선택합니다.</li>
		<li>P1로 가기 전에 P1까지의 일과 세포 수율을 고려하십시오.</li>
		<li>확인 된 ADSC의 평균 백분율로 SVF 세포 수율을 선택하십시오.</li>
		<li>P1로 이동하기 전에 확인 된 ADSC의 백분율과 세포 수율을 계산하십시오.</li>
		<li>BMI 및 SVF 세포 수율을 결정합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>8. 분화 분석
<ol><li>분화 키트 프로토콜에 따라 분화 분석을 수행합니다( 재료 표 참조). 그림 4 는 사례 1의 결과를 보여 줍니다.</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

절연 수율 세포 치료에 자주 요구되는 동결 보존 과정은 때로는 50 % 이상의 상당한 세포 손실을 초래한다는 것이 잘 알려져 있습니다.29,30,35. 따라서, 고립 된 상태에서 높은 초기 세포 수율을 얻기위한 기술적 개선이 기본이다. 지방 흡인물의 수집 방법과 세포의 분리 방법은 세포의 장기 배양 및 조작을 고려하면서 더 많은 수의 세포를 보존하고 높은 생존력을 유지하며 초기 물질에서 최대 세포 수를 추출하는 데 중점을 두어야합니다. 따라서 세포 요법이 환자에게 효과적이고 안전할 가능성이 높기 때문에 세포를 세포자멸사, 노화 또는 유전적 불안정성으로부터 멀리하기 위해 직선 배양 유지가 필요합니다.
우리가 아는 한, 지방 흡인물에서 유래 한 중간 엽 줄기 세포의 분리를 위해이 단...

인간 중간엽 줄기세포는 기초 및 응용 연구 모두에서 유리합니다. 이 성체 세포 유형의 사용은 배아 또는 다른 세포의 사용과 비교하여 윤리적 문제를 능가하며, 신생물 영역, 퇴행성 질환 치료 및 재건 수술 영역의 치료 응용 분야와 같은자가 조직 재생 공학 및 세포 치료1에서 가장 유망한 연구 분야중 하나입니다 2,3,4, 5. 지방 조직의 기질 혈관 세포 분획에 중간엽 다능성 및 만능 줄기 세포의 풍부한 공급원이 있다고 이전에 보고되었습니다 6,7. 이러한 ADSC는 최소 침습적 절차5,8에서 높은 수율로 생체 외 확장 능력을 가진 상당한 수의 세포를 쉽게 얻을 수 있기 때문에 세포 치료 및 이식/주입에 사용하기에 훌륭한 후보로 간주됩니다.
또한 지방 조직은 다른 두 가지 공급원(골수 및 탯줄 조직)보다 중간엽 줄기 세포를 제공할 수 있는 더 큰 능력을 제공한다는 것이 입증되었습니다9. ADSC는 면역원성이 낮고 숙주 조직에 통합되고 주변 조직과 상호 작용하는 능력이 높을 뿐만 아니라4,10, 적절한 배양 조건11,12,13 및 췌장, 간세포와 같은 세포로의 연골성, 골인성 및 근원성 분화에 대한 보고와 함께 세포주로의 분화 다분화능을 가지고 있습니다. 및 신경성 세포14,15,16.
과학계는 중간엽 줄기세포의 면역 조절 효과가 분화 특성보다 세포 치료17,18,19에 더 관련성이 높은 작용 메커니즘이라는 데 동의합니다. ADSC 사용의 가장 중요한 장점 중 하나는이 자가 주입 또는 이식의 가능성으로 여러 질병에 대한 대체 치료법이됩니다. 재생 의학의 경우 ADSC는 이미 간 손상, 심장 근육 재건, 신경 조직 재생, 골격근 기능 개선, 뼈 재생, 암 치료 및 당뇨병 치료20,21의 경우에 사용되었습니다.
현재까지 ADSC의 잠재력 평가를 위해 등록 된 임상 시험은 263 건이며 미국 국립 보건원22 웹 사이트에 나와 있습니다. 지방 조직을 수확하기위한 다른 프로토콜이 확립되었지만, 임상 사용을 위해 ADSC를 분리하는 표준화 된 방법에 대한 문헌에는 합의가 없다23,24. 수술 중 및 수술 후의 지방 흡인 처리 방법은 세포 생존율, 최종 세포 수율25 및 ADSC 집단20의 품질에 직접적인 영향을 미칠 수 있습니다. 외과적 전처리와 관련하여, 어떤 외과적 전처리 기술이 분리 후 더 많은 수의 생존 세포를 생성하는지 또는 지방 조직에 주입된 마취액이 세포 수율 및 그 기능에 영향을 미치는지 여부는 잘 확립되어 있지 않다26. 유사하게, 지방 세포를 얻기 위한 기술 사이의 차이는 생존 가능한 ADSC(20)의 수의70%만큼 감소를 초래할 수 있다. 문헌에 따르면, 초음파를 포함하여 높은 생존력을 갖는 세포 집단을 얻기위한 기계적 처리는 지방 조직(20)을 분해 할 수 있기 때문에 피해야한다. 그러나 주사기를 사용한 수동 지방 흡인 방법은 덜 해롭기 때문에 세포 파괴가 적으며 격렬한 지방 흡입술은 최고의 품질을 가진 상당한 수의 세포를 생성합니다26.
이 기술은 지방 흡입 부위에 주입되는 리도카인과 에피네프린이 함유 된 식염수를 사용합니다. 주입 된 용액 3mL 부피마다 1mL가 흡인됩니다. 이 연구에서는 아드레날린과 식염수 1mL를 주입 할 때마다 0.2mL의 지방 조직을 흡인하는 습식 지방 흡입 기술을 수행했습니다. 소화 효소, 특히 콜라게나 제의 사용은 ADSC를 분리하는 과정에서 일반적입니다.
실험실에서 첫 번째 분리 단계 후 최종 펠릿을 기질 혈관 분획(SVF)이라고 합니다. 그것은 내피 전구체 세포, 내피 세포, 대식세포, 평활근 세포, 림프구, 혈관주위세포, 예비지방세포 및 ADSC를 포함하는, 부착이 가능한 상이한 세포 유형(27)을 함유한다. 시험관 내 배양에서 최종 분리가 완료되면 플라스틱에 부착되지 않은 세포는 배지 교환에서 제거됩니다. 8주간의 팽창, 배지 변화, 및 계대 배양 후, ADSC는 플라스크(20) 내의 대부분의 세포 집단을 나타낸다. 가능한 미래 치료를 위해 분리 된 지방 유래 줄기 세포를 사용하는 가장 중요한 이점 중 하나는 동결 보존의 가능성입니다. 냉동 보존 된 지방 흡인물은 6 주간의 냉동28 후에도 SVF 세포의 잠재적 공급원이며, 2 년의 냉동 보존29 후에도 생물학적 활성이 있으며, 배양30에서 성장하고 분화 할 수있는 완전한 능력을 가지고 있음이 입증되었습니다. 그러나, 해동 과정 동안, 상당한 비율의 세포가 보통 손실된다(31). 따라서 지방 흡인 제거 과정과 다음과 같은 세포 분리 방법은 최고의 세포 수율을 보장해야합니다.
이 연구는 ADSC를 수집하고 분리하는 더 빠른 방법론을 설명하여 세포 치료제의 효율성을 높이기 위해 높은 세포 수율과 생존력을 보여줍니다. 또한, 장기 SVF 동결 보존 후이 개선 된 기술의 효과가 평가되었습니다.

<table><tbody><tr><td>1.8mL cryovials</td><td>Nunc Thermo Fisher Scientific</td><td>340711</td><td></td></tr><tr><td>150mL 폴리염화비닐 전사 백</td><td>JP FARMA</td><td>80146150059</td><td></td></tr><tr><td>2% Alizarin Red S 용액, pH 4.2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5533</td><td></td></tr><tr><td>아드레날린(1mg/mL)</td><td>Hipolabor</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue 용액</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1,01,647</td><td></td></tr><tr><td>항생제 - 항진균제 100x</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSBD CellQues Pro 분석을 사용한 칼리버 유세포 분석기</td><td>BD BioSciences</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘 10 %</td> <td>Merck</td><td>102379</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhexidine gluconate 4</td> <td>% VIC PHARMA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase, Type I, 분말</td><td>Gibco</td><td>17018029</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium)</td>칼슘<td></td>, 마그네슘 없음<td>11966025</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)</td><td></td>칼슘이 함유된 <td>DPBS A1285801</td><td></td>Gibco</tr><tr><td>(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)</td><td>Gibco</td><td>A1285601</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Gibco</td><td>10500056</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드 4%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1,00,496</td><td></td></tr><tr><td>도립광 현미경</td><td>Nikon Eclipse TS100</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>라이브 및 데드 셀 분석</td><td>Thermofisher</td><td>01-3333-41 |01-3333-42</td><td></td></tr><tr><td>단클론 항체: CD105</td><td>BD BioSciences</td><td>745927</td><td></td></tr><tr><td>단클론 항체: CD11B</td><td>BD BioSciences</td><td>746004</td><td></td></tr><tr><td>단클론 항체: CD19</td><td>BD BioSciences</td><td>745907</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal 항체: CD34</td><td>BD BioSciences</td><td>747822</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal 항체: CD45</td><td>DAKO</td><td>M0701</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal 항체: CD73</td><td>BD BioSciences</td><td>746000</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal 항체: CD90</td><td>BD BioSciences</td><td>553011</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal 항체: HLA-DR</td><td>BD BioSciences</td><td>340827</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty 냉동 용기</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>PBS (인산염 완충 식염수) 1x pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>&nbsp; </td><td></td>10010023</tr><tr><td>StemPro 지방형성 분화 키트</td><td>Gibco</td><td>A1007001</td><td></td></tr><tr><td>StemPro 연골형성 분화 키트</td><td>Gibco</td><td>A1007101</td><td></td></tr><tr><td>StemPro 골형성 분화 키트</td><td>Gibco</td><td>A1007201</td><td></td></tr><tr><td>바늘 주입 부위가 있는 하나의 스파이크가 있는 멸균 커넥터</td><td>Origen Biomedical Connector, USA</td><td>NA</td><td>코드 마크: IBS</td></tr><tr><td>트리판 블루 용액 0.4%</td><td>시그마 알드리치</td><td>93595</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA 0.25% 1x, 페놀 레드</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

지방 조직에서 중간엽 줄기세포를 얻는 기술 및 장기 냉동 보존에서 기질 혈관 분획 특성 분석

Technique for Obtaining Mesenchymal Stem Cell from Adipose Tissue and Stromal Vascular Fraction Characterization in Long-Term Cryopreservation

지방 조직에서 유래한 인간 중간엽 줄기세포는 적절한 특징을 보여주고 재생 임상 적용을 위한 접근 가능한 공급원이 됨에 따라 점점 더 매력적이 되고 있습니다. 지방 유래 줄기 세포를 얻기 위해 다른 프로토콜이 사용되었습니다. 이 기사에서는 더 많은 양의 ADSC를 얻기 위해 개선된 시간 절약 프로토콜의 여러 단계를 설명하고 배양 확장을 위한 생존 가능한 세포를 얻기 위해 ADSC를 냉동 보존 및 해동하는 방법을 보여줍니다. 26cm 3 구멍 및 3mm 구경 주사기 지방 흡입술을 사용하여 선택적 복부 성형술을받은 9 명의 환자의 복부에서 100 밀리리터의 지방 흡인물을 수집했습니다. 줄기 세포 분리는 칼슘이 보충 된 Dulbecco의 인산염 완충 식염수 (DPBS) 용액과 콜라게나 제를 사용하여 일련의 세척으로 수행되었습니다. 기질 혈관 분획 (SVF) 세포를 냉동 보존하고 면역 표현형으로 생존력을 확인했습니다. SVF 세포 수율은 15.7 x 105 세포 / mL, 6.1-26.2 세포 / mL 범위였습니다. 부착 SVF 세포는 평균 7.5 (±4.5) 일 후에 합류에 도달했으며 평균 세포 수율은 12.3 (± 5.7) x 105 세포 / mL입니다. 8 개월, 1 년 및 2 년 후 해동 된 SVF의 생존력은 23.06 % -72.34 % 사이였으며 평균 47.7 % (±24.64)로 2 년 동결 사례와 관련하여 가장 낮은 생존력을 보였다. 칼슘이 보충 된 DPBS 용액과 콜라게나제 소화 시간이 짧은 지방 침전을위한 가방 휴식 시간을 사용하면 줄기 세포의 최종 세포 수율이 증가했습니다. 생존 가능한 줄기 세포의 높은 수율을 얻기위한 상세한 절차는 이전 연구의 기술보다 시간과 세포 수율과 관련하여 더 효율적이었습니다. 장기간의 동결 보존 후에도 SVF에서 생존 가능한 ADSC 세포가 발견되었습니다.

나이, 체중, 키 및 BMI를 포함하여 연구 된 9 명의 개인의 특성은 표 1에 나와 있습니다.
초기에 제시된 세포 수율에 따라, 배양물에 접종된 세포 부피는 75cm2 배양 플라스크의 용량에 가능한 한 근접한 것으로 계산되었다. 각 경우에 시딩된 샘플 부피는 표 2에 설명되어 있습니다. 그런 다음 초기 세포 수율에 따라 각 샘플에 대한 다양한 세포 부피를 결정했습니다 : 세포 수율이 높은 샘플의 경우 1mL, 중간 세포 수율을 갖는 샘플의 경우 1.1mL, 세포 수율이 낮은 샘플의 경우 2mL를 사용하여 사례간에 더 유사한 세포 파종을 수행합니다. 배양이 약 80%-90% 합류에 도달했을 때(도 2A)(약 7.5 ± 4.5일), 부착성 세포의 트립신화를 수행하였다(표 2 및 도 2B).<strong class="xf...

본 프로토콜은 ADSC 단리를 위한 개선된 방법론을 기술하여 문헌에 비해 시간 이득과 함께 엄청난 세포 수율을 초래한다. 이 연구는 또한 장기 동결보존 후 비교적 많은 수의 생존 가능한 세포를 얻기 위한 간단한 방법을 제공합니다.

Human mesenchymal stem cells derived from adipose tissue have become increasingly attractive as they show appropriate features and are an accessible ...

여기에서 우리는 만능 중간엽 세포의 주입과 같은 치료 단계의 사용을 위해 양호하고 생존 가능한 세포를 얻고 보존하기 위한 프로토콜을 시연했습니다. 이것의 주요 이점은이 기술을 사용하여 수집 된 조직으로부터 세포의 분리 단계에서 얻은 시간 대비 생존 가능한 세포 부피를 얻을 수 있다는 것입니다. 이 기술은 이형 의학 및 세포 요법이 적용되는 모든 질병 또는 상태로 확장 될 수 있습니다.이 방법은 장기 세포 배양이 장려 될 수있는 약물 검사와 같은 영역에서 세포 게놈 안정성 검사에도 적용될 수 있습니다. 살아있는 세포를 조작 할 때마다 침착하고 자신감을 가지십시오. 패혈증에 극도의 주의를 기울이고 역경을 관찰하고 올바른 결정을 내리기 위해 과학자의 눈으로 끊임없이 경계하십시오.가방의 무게를 측정하고 디지털 비접촉 적외선 임상 온도계로 온도를 측정하는 것으로 시작하십시오. 층류 챔버 내부에 5 분 동안 백을 두어 기름기 층을 침전시키고 세포가 들어있는 조직을 분리합니다. 칼슘이 든 DPBS 100ml를 이송 백에 넣고 손으로 섞습니다.5 분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 백 어댑터에 부착 된 60 밀리리터 주사기를 사용하여 침전되는 대부분의 기본 액체를 버립니다. 이 과정을 두 번 반복하십시오.소화 용액 100 밀리리터를 백에 넣고 천천히 저어 주면서 섭씨 37도에서 30 분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 가방의 모든 내용물을 4 개의 50 밀리리터 원추형 튜브로 옮기고 섭씨 22도에서 10 분 동안 400G에서 원심 분리합니다. 상청액을 버리고 20% 태아 소 혈청이 보충된 DMEM 저혈당 5밀리리터를 세포 펠릿에 추가합니다.증류수에 0.05 % 10 마이크로 리터의 트리판 블루의 신선한 용액을 10 마이크로 리터의 세포 현탁액과 5 분 동안 혼합합니다. 20X 배율의 도립 광학 현미경을 사용하고 Neubauer 세포 계수 챔버에서 생존 가능한 세포를 계수합니다. 세포 펠릿을 밀리리터당 100만 세포 농도의 냉동 보호 배지에 현탁합니다.그런 다음이 혼합물 1 밀리리터를 냉동 바이알에 넣으십시오. 분당 섭씨 1 도의 냉각 속도로 냉동 용기를 사용하고 섭씨 80도에서 1 년 동안 보관하십시오. 1 년 후 액체 질소 증기상에 담근 표준 카세트 상자에 보관하십시오.9 명의 환자로부터의 절차의 다른 단계의 데이터가이 표에 제시되어있다. 초기 세포 수율에 따라, 각 샘플에 대한 세포의 가변 부피가 결정되었다. 세포 수율이 높은 샘플 1 밀리리터, 중간 세포 수율을 가진 샘플의 경우 1.1 밀리리터, 세포 수율이 낮은 샘플 당 2 밀리리터.통과 전의 세포 수율은 트립신화 전에 동일한 합류가 관찰된 경우에도 광범위하게 다양했습니다. 따라서 여기서 세포는 층으로 성장했을 수 있습니다. 대표 이미지는 광학 현미경에서 분리 후 첫 번째 통로에서 플라스틱 부착 중간엽 ADSC를 보여줍니다.세포는 플라스틱 및 섬유 아세포와 같은 형태에 대한 접착력을 보여줍니다. 트리판 블루 분석에서 Neubauer 챔버에서 계수된 생존 세포가 여기에 표시됩니다. 6 명의 환자로부터의 유세포 분석 데이터가이 표에 제시되어있다.이들 CD45 음성 세포로부터, 줄기 세포 마커의 상이한 조합을 갖는 ADSC의 백분율이 결정되었다. 대표적인 이미지는 8개월간의 냉동 보존 후 사례 9의 SVF에서 줄기 세포 관련 마커에 대해 양성인 세포의 하위 집단을 보여줍니다. 여기서, R1은 순방향 산란 대 측면 산점도에서 분석된 전체 세포 영역이다.R2는 CD45 음성 영역이다. CD73, CD90 및 CD105 인구는 이 지역에서 양성입니다. 연골 세포, 골 세포 및 지방 세포에서의 ADSC 분화가 여기에 표시됩니다.이 절차를 시도하는 동안 천천히, 가급적이면 손으로 저어주고 섭씨 37도에서 30분 동안 방치하여 유착과 물집을 관찰하는 것을 잊지 마십시오. 작업실 온도를 섭씨 25도 정도로 유지하고 훨씬 더 큰 온도에서 열 충격을 피하십시오. 여기에 표시된 기술은 만능 중간엽 세포를 다른 조직에서 성공적으로 분리하는 데 사용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 프로토콜은의 고립을 설명 지방 - 파생 lipoaspirate과 골격 재생을 평가하는 4mm 중요한 크기 calvarial 결함의 생성의 stromal 세포를.

Lipoaspirate에서 수확 지방 - 파생 Stromal 셀을 사용하여 임계 크기 Calvarial 결함 모델의 수리

이 비디오는 쥐 대동맥 주위 지방 조직에서 형광 표지된 신경능선 유래 지방 유래 줄기세포(ADSC)를 분리 및 배양하는 기술을 보여줍니다. 분리 후 NCADSC를 검출하고 형광 활성화 세포 분류를 사용하여 분류한 후 플레이트에서 배양하여 세포 증식을 촉진합니다.

쥐 대동맥 지방 조직에서 지방 유래 줄기 세포 분리

2001 년, UCLA의 연구자들은 성체 줄기 세포의 인구의 분리는 지방 조직에서 지방 유래 줄기 세포 나부터 ASC라고 기술. 이 문서는 콜라게나 제를 사용 설명서, 소화 효소의 프로토콜을 사용 lipoaspirates에서부터 ASC의 분리를 설명.

인간 Lipoaspirates에서 지방 유래 줄기 세포를 수동으로 분리

이 프로토콜은 배식물 방법을 사용하여 복부 성형술 및 지방 흡입구 샘플로부터 중간엽 줄기 세포를 분리하는 효소 없는 방법을 제공한다. 가혹한 효소 또는 원심 분리 단계의 부재는 시험관 내 연구에 사용되거나 클리닉으로 다시 전송될 수 있는 임상적으로 관련된 줄기 세포를 제공합니다.

인간 지방분지 유래 중간엽 줄기 세포의 분리 및 확장을 위한 효소 없는 방법

여기서, 우리는 폐쇄된 시스템 장치를 사용하여 인간 지방 조직 효소-무마이크로 단편화를 제시한다. 이 새로운 방법은 생체 내 이식, 시험관 내 배양, 및 추가적인 세포 격리 및 특성화에 적합한 지방 조직의 서브 밀리미터 클러스터의 획득을 허용한다.

세포 표현형 및 분비 특성화를 위한 인간 지방 조직 미세 단편화

이 프로토콜은 유세포 분석을 위한 여러 막 결합 마커의 염색을 통해 지방 세포에서 고품질 RNA를 얻는 방법론과 SVF-대식세포의 표현형을 포함하여 단일 공정에서 인간 내장 지방에서 생존 가능한 지방 세포 및 기질 혈관 분획-SVF 세포를 분리하기 위한 효율적인 콜라겐분해효소 분해 방법을 제공합니다.

RNA 분석 및 대식세포 표현형에 적합한 인간 내장 지방 조직에서 생존 가능한 지방 세포 및 기질 혈관 분획 분리

세포 치료제 준비/조작 단계에 도입된 이종(화학적 또는 동물 유래) 제품은 숙주 환자에서 면역 반응성 및 병원성 전파의 위험 증가와 관련이 있습니다. 여기서, 인간 지방유래 줄기세포의 분리 및 시험관내 확장을 위한 완전한 이종발생학적 무함유 방법이 기재되어 있다.

인간 지방 유래 줄기 세포의 분리 및 배양 (Isolation and culture of human adipose-derived stem cells with an innovative Xenogeneic-free method for human therapy)

이 프로토콜은 Sprague Dawley 쥐에서 지방 조직 유래 중간엽 줄기 세포(MSC)를 분리하고 식별하는 방법론을 설명합니다.

Sprague Dawley 쥐의 지방 조직에서 유래한 중간엽 줄기 세포의 분리 및 식별

지방 조직은 중간엽 줄기 세포의 훌륭한 공급원입니다. 여기에서는 스위스 생쥐 부고환 지방 조직에서 지방 조직 유래 줄기 세포(ADSC)의 단계별 추출, 배양 및 특성 분석을 제공합니다.

Isolation, In Vitro Expansion, and Characterization of Mesenchymal Stem Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissue(마우스 부고환 지방 조직에서 중간엽 줄기 세포의 분리, 체외 확장 및 특성 분석)

이 프로토콜은 인간 지방 유래 중간엽 줄기 세포(ADSC) 배양 및 상층액 수집부터 초원심분리를 사용한 세포외 소포체(EV) 추출에 이르기까지 모든 절차를 설명합니다.

Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells의 세포외 소포체의 정제 및 특성 분석

여기서는 처리 시간이 &gt;90% 감소하고, 세포 생존율이 높으며, 광범위한 호환성을 특징으로 지방유래 줄기세포와 지방세포를 효율적으로 분리하는 표준 방법을 제시합니다.

돼지 지방 조직에서 지방 유래 줄기세포와 지방세포의 효율적인 분리

배우세요 지방 조직에서 중간엽 줄기세포를 분리하고 장기 냉동 보존 후 생존율을 유지하는 향상된 방법을. 이 기술은 세포 치료 및 재생 의학 연구에 활용됩니다.

지방 조직에서 중간엽 줄기세포를 얻는 기술 및 장기 냉동 보존에서 기질 혈관 분획 특성 분석

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