Name: 뮤린 망막에서 AAV 변환 효율의 정량화를위한 디지털 물방울 PCR 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: 배우세요 뮤린 망막에서 디지털 물방울 PCR을 이용한 AAV 변환 효율 정량화 방법입니다. 이 프로토콜은 소규모 AAV 생산, 유리체내 주사, 망막 이미징, 게놈 DNA 분리를 포함하며 유전자 치료 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리는 Oezkan 켈레스, 조세핀 Jüttner, 교수 보톤드 로스카, 분자 및 임상 안과 바젤, AAV 생산에 대한 그들의 도움과 지원을위한 복잡한 바이러스 플랫폼에 감사드립니다. 우리는 또한 교수 장 베넷, 의학의 페렐만 학교, AAV8 / BP2 균주에 대한 펜실베니아 대학에게 감사드립니다. 동물 작업은 Gebze 기술 대학 동물 시설에서 수행됩니다. 이를 위해, 우리는 기술 지원과 축산에 대한 지원을 위해 라일라 디크메타스와 교수 Uygar Halis Tazebay 교수에게 감사드립니다. 우리는 또한 원고에 대한 그녀의 의견에 대한 박사 Fatma 오즈데미르에게 감사드립니다. 이 작품은 TUBITAK, 교부금 번호 118C226 및 121N275, 사반치 대학 통합 보조금에 의해 지원됩니다.

모든 실험 프로토콜은 사반치 대학 윤리위원회에 의해 받아들여졌으며 연구에 동물을 사용하기위한 '비전 및 안과 연구 협회'의 성명에 따라 실험을 수행했습니다.
1. 소규모 AAV 생산12
<ol><li>문화 HEK293T 세포는 DMEM/10% FBS의 완전한 10mL에서 15cm 플레이트를 사용하여 70-80% 수렴성까지.</li>
	<li>도우미 플라스미드(pHGT1-Adeno1), 캡시드 플라스미드 7μg, AAV2-CBA-tdTomato-WPRE 벡터 7μg, 5mL의 PEI 용액 136μL(1 mg/mL)로 트랜스펙션 혼합물을 준비합니다.</li>
	<li>5mL 준비된 형질혼합물을 배양 배지 10mL를 함유한 세포 배양접시에 넣고 37°C에서 48-60h의 전감염된 세포를 배양한다.</li>
	<li>48-60 h에서 미디어를 수집하고 37 °C에서 30 분 동안 250 U / mL의 최종 농도에서 DNase I로 소화하십시오.</li>
	<li>소화된 매체를 4000 x g,4°C에서 30분 동안 원심분리한 다음 0.22 μm 주사기 필터로 100kDa의 미리 습식 재생셀룰로오스 멤브레인에 걸레로 넣습니다.</li>
	<li>원심분리기는 4000 x g,4°C에서 재생된 셀룰로오스 멤브레인을 30분 동안 제거하고 미디어를 폐기한다.</li>
	<li>PBS로 재생된 셀룰로오스 멤브레인을 세척 및 원심분리하여 4000 x g에서3회, 4°C에서 30분 동안 0.001% 플루론 F-68을 함유한다. 각 단계에서 PBS를 폐기합니다.</li>
	<li>재생된 셀룰로오스 멤브레인의 상부에서 농축 된 AAV를 수집하고 추가 용도로 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>DNase I (0.2U/μl)로 갓 만든 AAV의 5 μL을 37 °C에서 15 분 동안 소화하십시오. 이것은 DNase I를 비활성화하고 바이러스 성 capsids를 저하 둘 다에 대한 95 °C 인큐베이션에서 10 분 뒤에.</li>
	<li>0.05% 플루론 F-68을 사용하여 소화된 AAV에서 10배 의 직렬 희석을 준비합니다. 적정(표 1)에대한 AAV2-ITR 및 WPRE 프라이머를 사용합니다. 티터는 희석 계수와 함께 dd-PCR 결과를 곱하여 계산했습니다. 결과는 게놈 카피/mL(GC/mL)으로 변환되었다. 참고: 소규모 AAV 생산을 위한 AAV 농도는 약 1 x 1012 GC/mL일 것으로 예상됩니다. 이 프로토콜은 AAV213과같은 미디어로 AAV를 효율적으로 방출하지 않는 AAV 균주에는 적용되지 않습니다.</li>
</ol>2. AAV의 인트라비티리얼 주입
<ol><li>
장비 준비
	<ol>
<li>시작하기 전에 36 G 무딘 바늘로 10 μL 현미경 을 준비하십시오. 5회 70%의 EtOH, ddH2O에서 5회, 그리고 PBS로 5번 을 기록했다.</li>
		<li>각 주사에 대한 현미경 주사에 AAV의 적절한 금액을로드합니다.</li>
		<li>수술 바늘 (봉합사, 실크, 6/0), 테이프, 집게 및 가위를 준비합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
인트라비티리얼 주입
	<ol>
<li>1방울의 열대지방과 2.5% 페닐레프린 염산염(예: 마이드프린)을 발라 마취 전에 눈방울을 함유하여 동공을 증식합니다.</li>
		<li>이소플루란5%(1 L/분)를 가진 마우스를 마취하고 시술 도중 1.5% 이소플루란 (1 L/min)으로 계속합니다. 작은 이소플루란 챔버는 첫 번째 유도에 사용됩니다.</li>
		<li>오른쪽 반사, 철수 반사 및 꼬리 핀치 응답의 손실에 의해 마취의 깊이를 확인합니다.</li>
		<li>주입 시술 전에 각 눈에 0.3%의 토브라마이신과 0.1% 덱사메타손 멸균 안과 용액을 적용하십시오. 안약의 적용은 건조를 방지하고 항염증 및 항균 효과를 발휘합니다.</li>
		<li>수술 후크를 사용하여 눈꺼풀 상부를 안정화시하십시오. 눈의 등대 부분을 노출시키기 위해 약간 뒤로 당깁니다. 후크를 벤치에 테이프로 테이프로 고정합니다.</li>
		<li>해부 현미경하에서 눈의 경각증을 노출하기 위해 곡선홍채 가위로 결막(1mm미만 2)제거합니다. 신선하고 멸균된 인슐린 주사기(30G)를 사용하여 clera를 뚫습니다.</li>
		<li>미세 조작기를 사용하여 동일한 구멍을 통해 현미경의 바늘을 삽입합니다. 바늘 끝을 렌즈 뒤에 안구 중간에 놓습니다.</li>
		<li>AAV2/BP2 및 AAV2/PHP의 1 μL을 주입합니다. 1.63 x 1012 GC/mL 및 1.7 x 1012 GC/mL 농도를 갖는 S 벡터는 눈의 유리체속으로 천천히 들어간다. 사출 볼륨 제어는 수동으로 수행됩니다. 바늘을 1 분 동안 제자리에 두고 천천히 바늘을 철회하십시오.</li>
		<li>눈꺼풀을 풀어 서 서 항 염증 및 항균 국 소 젤 치료를 적용 하 여 0.3% 토브라마이신과 0.1% 덱사메타손 안구에. 외형(밝은 눈, 손질된 외투, 구칭), 동작(활동, 고정화, 자기 절단), 체중 0~3의 관점에서 점수시트에 따라 다음 날에 마우스를 모니터링하고 평가한다. 각 조건은 0-3의 점수를 가지며 총 점수는 3 이상이며 종료 기준입니다.</li>
		<li>복구 후 동물을 케이지에 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 형광 및 기금 이미징
<ol><li>마우스를 변형시키고 각 눈에 0.5% 열대지방과 2.5%의 페닐프린 염산염을 배치하여 동공을 팽창시다.</li>
	<li>이소플루란과 위의 절차로 동물을 마취시화합니다. 발을 꼬집어 마취의 깊이를 신중하게 평가합니다.</li>
	<li>이미징 단계에 마우스를 놓고 fundus 카메라를 통해 확인하여 적절한 팽창을 확인합니다. 마취 하에서 탈수로부터 눈을 보호하고 이미징을위한 커플링 젤로 사용하기 위해 눈 표면에 국소 젤 (0.2 % 카보머 980)을 적용하십시오.</li>
	<li>이미징 스테이지를 조작하여 목표의 코피스와 정렬합니다. 필요에 따라 스테이지를 조정하여 마우스 눈을 중심으로 합니다. 눈이 중심이 되면 눈과 접촉할 때까지 천천히 목표를 이동합니다.</li>
	<li>두 눈에 fundus 및 형광 이미징을 수행하여 인트라비티리얼 주사 후 1주 및 2주에 tdTomato 발현을 추적한다(그림3B)14. 기자 표현의 비교를 위해 동일한 설정에서 fundus 및 형광 이미지를 가져 가라.</li>
</ol>4. 망막 고립
<ol><li>2주 시점에서 망막 수집을 위한 CO2 흡입에 의한 fundus 및 형광 화상 진찰 후에 동물을 안락사시합니다.</li>
	<li>13.5cm 스플리터 집게의 도움으로 안구를 앞으로 이동합니다.</li>
	<li>집게로 부드러운 압력을 가하여 남은 유리체와 함께 렌즈를 제거합니다.</li>
	<li>정밀 곡선 집게로 안구의 연결을 시신경과 잘라내고 동일한 곡선 포셉으로 망막을 부드럽게 짜냅니다.</li>
	<li>해부된 망막을 미세 원심 분리 튜브로 옮기.</li>
	<li>액체 질소에 튜브를 배치하여 망막을 스냅합니다.</li>
</ol>5. 조직 유전체 DNA 격리
<ol><li>상용화된 Proteinase K 소화 기반 조직 게놈 DNA 키트로 게놈 DNA를 분리한다.</li>
	<li>55°C에서 망막, 30분 동안 200 x g의 다이제스트 망막이 이미 키트에 공급되고 있습니다.</li>
	<li>RNase 인큐베이션 단계를 수행하고, 세척 버퍼 I 및 II로 단계를 세척하고, 제조업체의 프로토콜에 따라 마지막으로 용출 단계를 수행합니다.</li>
	<li>마지막 세척 후 추가 스핀 스텝을 추가하여 잔류 에탄올을 제거합니다.</li>
	<li>유전체 DNA의 농도를 측정하고 샘플을 -20°C에서 저장합니다.</li>
</ol>6. 바이러스 게놈의 정량화를 위한 마우스 망막 견본의 물방울 디지털 PCR 분석
<ol><li>주입된 망막에서 유전체 DN을 0.05% 플루론 F-68 용액으로 희석하여 각 시료에 대해 1 ng/μL의 최종 농도에 도달합니다.</li>
	<li>각 프라이머에 대해 125nM의 최종 농도를 가진 표적 특정 프라이머를 사용하여 WPRE 및 18S에 대해 별도의 반응을 수행한다.</li>
	<li>게놈 DNA 1ng, 125 nM 프라이머 및 2배 회피녹색 슈퍼믹스를 포함한 PCR 반응 믹스의 20 μL에서 액적 생성을 수행합니다.</li>
	<li>물방울 생성을 위해 카트리지의 중간 부분에 샘플 믹스를 로드합니다.</li>
	<li>카트리지에 샘플 로딩이 완료된 후, 카트리지의 아래쪽 행에 액적 생성 오일의 70 μL을 추가합니다.</li>
	<li>개스킷을 카트리지 위에 올려 놓고 물방울 발생기에 넣습니다. 개스킷과 카트리지 사이에 간격이 없는지 확인합니다.</li>
	<li>상단에서 잘 생성되는 약 40 μL의 물방울을 부드럽게 가져 가십시오. 세미 스커트 96웰 PCR 반응 플레이트에 액적 용액을 추가합니다.</li>
	<li>알루미늄 밀봉 호일을 사용하여 PCR 플레이트 실러로 PCR 플레이트를 밀봉하십시오.</li>
	<li>PCR 플레이트를 96웰의 열 밀봉 열 사이클러에 넣습니다. PCR 프로토콜을 사용; 95°C 5분, 30초 동안 95°C40사이클, 1분 동안 60°C, 5분 동안 4°C, 5분 동안 90°C, 4°C의 무한홀드. 각 사이클에 2°C/s 경사로 속도를 적용하여 소적이 사이클링 중 각 단계에 대해 올바른 온도에 도달할 수 있도록 합니다.</li>
	<li>DD-PCR 소프트웨어를 사용하여 액적 을 정량화하기 위해 PCR 플레이트를 방울 판독기에 배치합니다. 템플릿은 회피에 대한 특정 설정을 사용하여 설정됩니다.</li>
	<li>형광 강도 대 액적 수에 대한 각 표본과 함께 1 차원 플롯 그래프를 사용하여 데이터를 분석합니다. 임계값은 임계값 위의 액수가 양수로 할당되고 아래 액수가 음수로 할당되도록 정렬됩니다. 이어서 푸아송 알고리즘을 적용하여 사본/μL 단위로 표적 DNA의 시작 농도를 결정한다. WPRE 대 18S의 비율은 AAV 트랜스듀션 효율을 측정하기 위해 계산됩니다.</li>
</ol>

<ol><li>Herrmann, A. K., Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+dissection+of+AAV-host+interactions%3A+The+fast+and+the+curious%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput dissection of AAV-host interactions: The fast and the curious.</a> Journal of Molecular Biology. 430 (17), 2626-2640 (2018).</li>
<li>Pillay, S., Carette, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+determinants+of+adeno-associated+viral+vector+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Virology%22%5BJournal%5D)">Host determinants of adeno-associated viral vector entry.</a> Current Opinion in Virology. 24, 124-131 (2017).</li>
<li>Castle, M. J., Turunen, H. T., Vandenberghe, L. H., Wolfe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+AAV+tropism+in+the+nervous+system+with+natural+and+engineered+capsids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Controlling AAV tropism in the nervous system with natural and engineered capsids.</a> Methods in Molecular Biology. 1382, 133-149 (2016).</li>
<li>Agbandje-McKenna, M., Kleinschmidt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+capsid+structure+and+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">AAV capsid structure and cell interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 807, 47-92 (2011).</li>
<li>Han, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+tropism+and+transduction+of+adeno-associated+virus+varies+by+serotype+and+route+of+delivery+%28intravitreal%2C+subretinal%2C+or+suprachoroidal%29+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Retinal tropism and transduction of adeno-associated virus varies by serotype and route of delivery (intravitreal, subretinal, or suprachoroidal) in rats.</a> Human Gene Therapy. 31 (23-24), 1288-1299 (2020).</li>
<li>Muraine, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+efficiency+of+adeno-associated+virus+serotypes+after+local+injection+in+mouse+and+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Transduction efficiency of adeno-associated virus serotypes after local injection in mouse and human skeletal muscle.</a> Human Gene Therapy. 31 (3-4), 233-240 (2020).</li>
<li>Cronin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transduction+and+optogenetic+stimulation+of+retinal+bipolar+cells+by+a+synthetic+adeno-associated+virus+capsid+and+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Efficient transduction and optogenetic stimulation of retinal bipolar cells by a synthetic adeno-associated virus capsid and promoter.</a> EMBO Molecular Medicine. 6 (9), 1175-1190 (2014).</li>
<li>Higashimoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+woodchuck+hepatitis+virus+post-transcriptional+regulatory+element+reduces+readthrough+transcription+from+retroviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">The woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element reduces readthrough transcription from retroviral vectors.</a> Gene Therapy. 14 (17), 1298-1304 (2007).</li>
<li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+droplet+digital+polymerase+chain+reaction+format+for+DNA+copy+number+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+in+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification.</a> Annals in Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).</li>
<li>Albayrak, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+quantification+of+proteins+and+mrna+in+single+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Digital quantification of proteins and mrna in single mammalian cells.</a> Molecular Cell. 61 (6), 914-924 (2016).</li>
<li>Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+determination+of+single-stranded+and+self-complementary+adeno-associated+viral+vector+genome+titers+by+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR.</a> Hum Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).</li>
<li>Juttner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+neuronal+and+glial+cell+types+with+synthetic+promoter+AAVs+in+mice%2C+non-human+primates+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Targeting neuronal and glial cell types with synthetic promoter AAVs in mice, non-human primates and humans.</a> Nature Neuroscience. 22 (8), 1345-1356 (2019).</li>
<li>Vandenberghe, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+serotype-dependent+release+of+functional+vector+into+the+culture+medium+during+adeno-associated+virus+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing.</a> Human Gene Therapy. 21 (10), 1251-1257 (2010).</li>
<li>Barben, M., Schori, C., Samardzija, M., Grimm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Hif1a+rescues+cone+degeneration+and+prevents+subretinal+neovascularization+in+a+model+of+chronic+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Targeting Hif1a rescues cone degeneration and prevents subretinal neovascularization in a model of chronic hypoxia.</a> Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 12(2018).</li>
<li>Chan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+AAVs+for+efficient+noninvasive+gene+delivery+to+the+central+and+peripheral+nervous+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1172-1179 (2017).</li>
<li>Guiet, R., Burri, O., Seitz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+source+tools+for+biological+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Open source tools for biological image analysis.</a> Methods Molecular Biology. 2040, 23-37 (2019).</li>
<li>Parks, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variant+ribosomal+RNA+alleles+are+conserved+and+exhibit+tissue-specific+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Variant ribosomal RNA alleles are conserved and exhibit tissue-specific expression.</a> Science Advances. 4 (2), (2018).</li>
<li>Aurnhammer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+real-time+PCR+for+the+detection+and+quantification+of+adeno-associated+virus+serotype+2-derived+inverted+terminal+repeat+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences.</a> Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2012).</li>
<li>Maclachlan, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+safety+evaluation+of+AAV2-sFLT01-+a+gene+therapy+for+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Preclinical safety evaluation of AAV2-sFLT01- a gene therapy for age-related macular degeneration.</a> Molecular Therapy. 19 (2), 326-334 (2011).</li>
<li>Stieger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+intact+rAAV+particles+up+to+6+years+after+successful+gene+transfer+in+the+retina+of+dogs+and+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Detection of intact rAAV particles up to 6 years after successful gene transfer in the retina of dogs and primates.</a> Molecular Therapy. 17 (3), 516-523 (2009).</li>
<li>Gyorgy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allele-specific+gene+editing+prevents+deafness+in+a+model+of+dominant+progressive+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Allele-specific gene editing prevents deafness in a model of dominant progressive hearing loss.</a> Nature Medicine. 25 (7), 1123-1130 (2019).</li>
<li>Cox, D. B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+editing+with+CRISPR-Cas13%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA editing with CRISPR-Cas13.</a> Science. 358 (6366), 1019-1027 (2017).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

이 프로토콜에서, 우리는 다른 capsid 단백질을 가진 2개의 AAV 벡터를 생성하고 그에 따라 그(것)들을 titered. 이 프로토콜의 가장 중요한 단계 중 하나는 변환12,13후에 감지 가능한 리포터 발현을 산출하는 충분한 양의 AAV를 생성하는 것입니다.
AAV의 Titering 또한 intravitreal 주사에 대 한 AAV의 복용량을 조정 하는 중요 한 요소. 이러한 중요한 기준이 달성되면 dd-PCR 방법론을 통해 AAV의 변환 효율성을 정량화할 수 있습니다.
많은 실험실은 AAV 티터링에 대한 정량적 PCR(qPCR) 방법을 사용하고 있다. qPCR 기반 절대 정량화 방법은 표적DNA(18)의공지된 양을 희석하는 표준 곡선을 필요로 한다. 그러나, dd-PCR은 표적...

Adeno 관련 바이러스 (AAV)는 지금 일반적으로 망막 유전자 치료 연구의 각종을 위해 이용됩니다. AAV는 면역genicity및 적은 게놈 통합을 가진 유전자 전달의 안전하고 효율적인 방법을 제공합니다. 표적 세포로의 AAV 진입은 세포 표면1,2에수용체 및 공동 수용체의 결합을 요구하는 내분비증을 통해 발생합니다. 따라서, 상이한 세포 유형에 대한 AAV의 변환 효율은 주로 캡시드 및 숙주 세포 수용체와의 상호 작용에 달려 있다. AAV는 혈청형을 가지고 있으며 각 혈청형은 뚜렷한 세포/조직 트로피즘과 전관 효율을 가질 수 있습니다. 또한 바이러스 캡시드의 화학적 변형, 하이브리드 캡시드 생산, 펩타이드 삽입, 캡시드 셔플, 지향진화, 합리적 돌연변이발생3의화학적 변형에 의해 생성된 인공 AAV 혈청형 및 변이체도 있다. 아미노산 서열 또는 캡시드 구조의 사소한 변화조차도 숙주 세포 인자와의 상호작용에 영향을 미칠 수 있으며 다른 트로피4를 초래할 수 있다. 캡시드 변이체 외에도, AAV 생산의 사출 경로 및 배치 간 변화와 같은 다른 요인은 신경 망막에서 AAV의 변환 효율에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, 다른 변종에 대한 변환 속도의 비교를위한 신뢰할 수있는 방법이 필요합니다.
AAV 트랜스듀션 효율을 결정하는 대부분의 방법은 리포터 유전자 발현에 의존한다. 이들은 리포터 유전자생성물의형광 화상 진찰, 면역히스토케, 서양 얼룩, 또는 화학적 분석을포함5,6,7. 그러나, AAV의 크기 제약으로 인해, 트랜스듀션 효율을 모니터링하기 위해 기자 유전자를 포함하는 것이 항상 가능하지는 않다. mRNA 안정기 서열로서 하이브리드 CMV 증강제/닭 베타-액틴 또는 우드척 형 간염 조절 원소(WPRE)와 같은 강력한 프로모터를 사용하면 크기 문제를 더욱 복잡하게 만든다8. 따라서 보다 직접적인 방법론으로 주입된 AAV의 트랜스듀션 속도를 정의하는 것도 도움이 될 것이다.
디지털 물방울 PCR (dd-PCR)은 미세한 양의 샘플에서 표적 DNA를 정량화하는 강력한 기술입니다. dd-PCR 기술은 오일 방울에 의한 표적 DNA 및 PCR 반응 혼합물의 캡슐화에 의존한다. 각 dd-PCR 반응에는 수천 개의 물방울이 포함되어 있습니다. 각 액적은 독립적인 PCR 반응9로처리되고 분석된다. 물방울의 분석은 푸아송 알고리즘을 사용하여 모든 샘플에서 표적 DNA 분자의 절대 복사 수를 계산할 수 있습니다. AAV의 트랜스듀션 효율은 뉴런 망막에서 AAV 게놈의 카피 수와 상관관계가 있기 때문에 DD-PCR 방법을 사용하여 AAV 게놈을 정량화했습니다.
여기서, 우리는 망막 게놈 DNA6,10로부터AAV 벡터의 트랜스듀션 효율을 계산하기 위해 dd-PCR 방법론을 설명한다. 먼저, tdTomato 리포터를 표현하는 AAV는 소규모 프로토콜을 사용하여 생성되었고, dd-PCR방법(11)에의해 적발되었다. 둘째, AAV는 신경 망막에 주입되었습니다. 트랜스듀션 효율을 입증하기 위해, 우리는 먼저 형광 현미경 검사법과 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 tdTomato 발현을 정량화했습니다. 이것은 dd-PCR를 사용하여 주입된 망막에 있는 AAV 게놈의 정량화를 위한 게놈 DNA의 격리에 선행되었습니다. dd-PCR에 의해 정량화된 변환된 AAV 게놈과 tdTomato 발현 수준을 비교한 결과 dd-PCR 방법은 AAV 벡터의 트랜스듀션 효율을 정확하게 정량화한 것으로 나타났다. 당사의 프로토콜은 AAV 변환 효율성을 정량화하기 위해 dd-PCR 기반 방법론에 대한 자세한 설명을 보여 주어. 이 프로토콜에서, 우리는 또한 단순히 게놈 DNA 격리 및 dd-PCR 결과 후에 희석 인자를 사용하여 인트라비티리얼 주사 후에 유도되는 AAV 게놈의 절대 수를 보여줍니다. 전반적으로, 이 프로토콜은 망막에서 AAV 벡터의 트랜스듀션 효율성을 정량화하기 위한 기자 표현의 대안이 될 강력한 방법을 제공한다.

<table><tbody><tr><td>96-웰 세미 스커트 ddPCR 플레이트</td><td>BioRad</td><td>12001925</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>아미콘 필터</td><td>Millipore UFC910096</td><td></td><td>AAV</td></tr><tr><td>C1000 TOUCH 96 DEEP WELLS</td><td>BioRad</td><td>1851197</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>C57BL/6JRj 마우스 균주</td><td>Janvier</td><td>C57BL/6JRj</td><td>마우스</td></tr><tr><td>DG8 개스킷</td><td>BioRad</td><td>1863009</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>DG8 카트리지</td><td>BioRad</td><td>1864008</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>BE12-604Q</td><td>AAV</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>PAN BIOTECH</td><td>L 1825</td><td>AAV</td></tr><tr><td>액적 생성 오일 eva green</td><td>BioRad</td><td>1864006</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>액적 리더 오일</td><td>BioRad</td><td>1863004</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>FBS</td><td>팬 BIOTECH</td><td>p30-3306</td><td>PX1용 AAV</td></tr><tr><td>호일 씰 PCR 플레이트 실러</td><td>BioRad</td><td>1814040</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>인슐린 주사기</td><td>BD 의료</td><td>320933</td><td>유리체 내 주사</td></tr><tr><td>이소플루란</td><td>ADEKA ILAC SANAYI VE TICARET</td><td></td> N01AB06 <td>마취</td></tr>제 <tr><td>마이크로인젝터 MM33</td><td>World Precision Instruments</td><td>82-42-101-0000</td><td>유리체 내 주사</td></tr><tr><td>Micron IV</td><td>Phoenix Research Labs</td><td>Micron IV</td><td>3-CCD 컬러 카메라, 프레임 그래버 및 기성 소프트웨어를 기반으로 하는 현미경 시스템을 통해 연구원들은 마우스 망막을 이미지화할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Mydfrin(%2.5 페닐에프린 염산염)</td><td>Alcon</td><td>S01FB01</td><td>동공 확장</td></tr><tr><td>Nanofil Syringe 10 &mu; l</td><td>World Precision Instruments</td><td>NANOFIL</td><td>유리체 내 주</td></tr><tr><td>사 바늘 RN G36, 25mm, PST 2</td><td>World Precision Instruments</td><td>NF36BL-2</td><td>유리체 내 주사</td></tr><tr><td>PEI-MAX</td><td>Polyscience</td><td>24765-1</td><td>AAV</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>PAN BIOTECH</td><td>P06-07100</td><td>AAV</td></tr><tr><td>플라스미드 pHGT1-Adeno1</td><td>플라스미드Factory</td><td>PF1236</td><td>AAV</td></tr><tr><td>Pluronic F-68</td><td>Gibco</td><td>24040032</td><td>AAV</td></tr><tr><td>PX1 PCR 플레이트 실러 시스템</td><td>BioRad</td><td>1814000</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td><td>BioRad</td><td>1864034</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>QX200 액적 리더/QX200 액적 발생기</td><td>BioRad</td><td>1864001</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>스플리터 겸자 WATCHER MAKER - 길이 = 13.5 CM</td><td>엔도스톨 메디컬</td><td>EJN-160-0155</td><td>망막 분리</td></tr><tr><td>멸균 주사기 필터</td><td>AISIMO</td><td>ASF33PS22S</td><td>AAV</td></tr><tr><td>조직 게놈 DNA 키트</td><td>EcoSpin</td><td>E1070</td><td>gDNA 분리</td></tr><tr><td>Tobradex (0.3% 토브라마이신 / 0.1% 덱사메타손)</td><td>Alcon</td><td>S01CA01</td><td>항염증/항생제</td></tr><tr><td>Tropamid (% 0.5 트로피카미드)</td><td>Bilim Ilac Sanayi ve Ticaret AS.</td><td>S01FA06</td><td>동공 확장</td></tr><tr><td>Turbonuclease</td><td>Accelagen</td><td>N0103L</td><td>AAV</td></tr><tr><td>Viscotears (carbomer 2 mg/g)</td><td>Bausch+Lomb</td><td>S01XA20</td><td>윤활제 점안액</td></tr></tbody></table>

뮤린 망막에서 aav 변환 효율의 정량화를위한 디지털 물방울 pcr 방법

Digital Droplet PCR Method for the Quantification of AAV Transduction Efficiency in Murine Retina

많은 망막 세포 생물학 실험실은 지금 일상적으로 유전자 편집 및 규제 응용을 위해 Adeno 관련 바이러스 (AAV)를 이용합니다. AAV 트랜스듀션의 효율성은 일반적으로 중요하며, 이는 전반적인 실험 결과에 영향을 미칩니다. 트랜스듀션 효율을 위한 주요 결정요인 중 하나는 AAV 벡터의 혈청형 또는 변형이다. 현재, 다양한 인공 AAV 혈청형 및 변이체는 세포 표면 수용체를 호스트하기 위해 상이한 친화력으로 사용할 수 있다. 망막 유전자 치료를 위해, 이것은 다른 망막 세포 모형을 위한 transction 효율성의 다양한 정도에서 초래합니다. 또한, 사출 경로 및 AAV 생산의 품질은 또한 망막 AAV 변환 효율성에 영향을 미칠 수 있다. 따라서 다양한 변형, 배치 및 방법론의 효율성을 비교하는 것이 필수적입니다. 디지털 물방울 PCR(dd-PCR) 방법은 핵산을 고정밀으로 정량화하고 표준이나 기준 없이 주어진 표적의 절대 정량화를 수행할 수 있게 한다. dd-PCR을 사용하면 주입된 망막 내에서 AAV 게놈 카피 번호를 절대적인 정량화하여 AAV의 트랜스듀션 효율성을 평가하는 것도 가능하다. 여기서, 우리는 dd-PCR를 사용하여 망막 세포에서 AAV의 변환 속도를 정량화하는 간단한 방법을 제공합니다. 사소한 수정으로, 이 방법론은 또한 미토콘드리아 DNA의 복사 수 정량화뿐만 아니라 여러 망막 질환 및 유전자 치료 응용 프로그램에 중요한 기본 편집의 효율성을 평가하기위한 기초가 될 수 있습니다.

소규모 AAV 생산은 인트라비리얼주사(도 1)에대한 벡터를 제공하는 빠르고 효율적인 방법입니다. 소규모 AAV 생산은 일반적으로 망막에서 리포터 발현을 감지하기에 충분한 1 x10 12 GC/ml 범위 내에서 티터를 제공한다(도2). dd-PCR을 사용하여 AAV를 사용하면 일관된 결과가 생성됩니다. ITR2 및 WPRE 특이적 프라이머는 정기적으로 사용되고 각 표적 분자의 시작 농도는 푸아송 분포로 모델링하여 dd-PCR 소프트웨어로 계산되었다. 계산은 희석 인자의 곱셈에 의해 마무리되고 mL 당 게놈 사본으로 변환되었습니다. 이 프로토콜을 위해 생성된 AAV에는 각각 AAV2/BP2 및 AAV2/PHP.S7,15용1.63 x10 12 GC/mL 및 1.7x10 12 GC/ml의...

이 프로토콜은 작은 규모의 AAV 생산, 인트라비탈 주사, 망막 이미징 및 망막 게놈 DNA 격리와 함께 디지털 액적 PCR (dd-PCR)을 사용하여 마우스 망막에서 AAV 변환 효율을 정량화하는 방법을 제시합니다.

뮤린 망막에서 AAV 변환 효율의 정량화를위한 디지털 물방울 PCR 방법

Many retinal cell biology laboratories now routinely use Adeno-associated viruses (AAVs) for gene editing and regulatory applications. The efficiency of ...

이 비디오에서는 매우 민감하고 대상 DNA의 절대 적인 정량화를 수행하는 디지털 물방울 PCR 방법을 사용하여 마우스 망막에서 AAV 변환을 정량화하는 방법을 보여줍니다. 우리는 우리가 CRISPR 기반 구조같이 기자 유전자를 사용하는 것을 허용하지 않는 큰 AVV 구조물을 위해 주로 이 방법을 개발했습니다. 이 방법을 사용하면 망막에서 AAV의 변환 속도를 정량화할 수 있습니다.이 방법은 디지털 물방울 PCR의 감도 및 절대 정량화에 의존하며 곧바로 결과를 산출합니다. 이 비디오에서는 매우 민감하고 대상 DNA의 절대 적인 정량화를 수행하는 디지털 물방울 PCR 방법을 사용하여 마우스 망막에서 AAV 변환을 정량화하는 방법을 보여줍니다. 우리는 우리가 CRISPR 기반 구조같이 기자 유전자를 사용하는 것을 허용하지 않는 큰 지역 구조물을 위해 주로 이 방법을 개발했습니다.이 방법을 사용하면 망막에서 AAV의 변환 속도를 정량화할 수 있습니다. 이 방법은 두 방울 PCR의 감도 및 절대 정량화에 의존하며 곧바로 결과를 산출합니다. 디지털 물방울 PCR 방법론의 효율성 때문에 여러 실험실은 이미 정량적 실시간 PCR에서 디지털 물방울 PCR 또는 AAV 티팅으로 전환됩니다.이 방법은 또한 망막에서 미토콘드리아 DNA 정량화에 대한 기초를 제공할 뿐만 아니라 마우스 망막에서 유전자 치료를 위한 CRISPR 기반 돌연변이 교정의 효율을 확인할 수 있다. 5밀리리터 수요에 AAV 도우미 플라스미드, AAV 캡시드 플라스미드, AAV 벡터 및 PI 용액으로 트랜스페션 혼합물을 준비합니다. 5 밀리리터를 제조한 트랜스페션 혼합물을 배양 매체에 추가합니다.섭씨 37도에서 감염된 세포를 배양합니다. 48~60시간 후 의 미디어를 수집합니다. DNA로 미디어를 37도에서 30분 동안 밀리리터당 250유닛, 30분간 원심분리기로 30분간 소화합니다.PBS를 통해 재생된 셀룰로오스 멤브레인을 미리 습식합니다. 0.22 마이크로미터 주사기 필터로 미디어를 100킬로 달톤에 대한 미리 습식 재생셀룰로오스 멤브레인에 넣습니다. 30분 동안 섭씨 4, 000 G에서 재생된 셀룰로오스 멤브레인을 원심분리하고 미디어를 폐기합니다.PBS로 재생된 셀룰로오스 멤브레인을 세척하고 원심분리하여 30분 동안 섭씨 4000G에서 0.001%의 플루론 F68을 3회 세척한다. 재생된 셀룰로오스 멤브레인의 상부에서 농축 된 AAV를 수집하고 추가 사용을 위해 할당하십시오. 여기서 우리는 작은 규모의 AAV 생산을 만드는 방법을 보여 주었다.이 프로토콜을 검사한 후 망막에서 기자 의표정을 보기에 충분한 AvV를 만들 수 있어야 합니다. 또한 디지털 PCR의 프로토콜을 따라 생산 된 AAV를 titer할 수 있습니다. 마취 전에 안약이 함유된 0.5%의 열대아미드와 2.5%의 페닐레프린 염산염1방울을 적용하여 동공을 증식합니다.이소플루란으로 마우스를 마취시키고 반사 신경을 확인합니다. 주입 시술 전에 각 눈에 0.3%의 토브라마이신과 0.1%덱사메타손 멸균 안과 용액 안과 액액을 적용합니다. 수술 후크를 사용하여 눈꺼풀 상부를 안정화시하십시오.눈의 등대 부분을 노출시키기 위해 약간 뒤로 당깁니다. 후크를 밴드에 테이프로 테이프로 고정합니다. 눈의 clera를 노출하기 위해 곡선 홍채 가위로 결막을 제거합니다.신선하고 멸균된 30G 인슐린 주사기를 사용하여 clera를 뚫습니다. 마이크로 조작기로 동일한 펑크를 통해 마이크로 주사기의 바늘을 삽입합니다. 바늘 끝을 렌즈 뒤에 두는 눈컵 중간에 놓습니다.AAV 용액 1리터를 눈의 유리체에 천천히 주입합니다. 바늘을 1분 동안 제자리에 두고 천천히 바늘을 철회하십시오. 안구컵에 0.3%토브라마이신과 0.1%의 덱사메타손이 함유된 항염증제 및 항균 국소 젤 트리트먼트를 적용하십시오.0.5%의 트로피아미드를 한 방울 떨어뜨리면 됩니다. 그리고 마취 전에 안약이 함유된 2.5%의 페닐레프린 염산염으로 동공을 팽창시. 카르바미드를 그램 국소 젤당 2밀리그램을 눈 표면에 바이런을 발라주세요.마우스 눈을 중심으로 필요에 따라 마우스 스탠드를 조정합니다. TdTomato 발현을 1주일 및 2주 후에 는 두 눈에 fundus 및 형광 이미징을 수행합니다. 절차 전에 이산화탄소 흡입을 사용하여 동물을 안락사시하십시오.13.5센티미터 스플리터 포셉의 도움으로 눈공을 앞으로 이동합니다. 렌즈를 남은 유리체와 함께 제거합니다. 정밀 곡선 포셉으로 안구의 연결을 시신경과 잘라내고 동일한 곡선 포셉으로 망막을 부드럽게 짜냅니다.유전체 DNA를 상용화된 단백질아제 K 다이제스트 필름 기반 조직 게놈 DNA 키트로 분리한다. 단백질Ase K.Lyse 망막으로 30 분 동안 섭씨 55도 200 G에서 망막을 소화하고 제조업체의 프로토콜을 따릅니다. 이러한 프로토콜에서, 우리는 망막과 게놈 DNA 격리뿐만 아니라 intravitreal 주입 fundus 꽃집 화상 진찰을 보여주었습니다.이들은 망막에 대 한 매우 중요 한 절차, 그리고이 프로토콜을 따라, 생산 된 AAV를 주입 하 고 그들의 식 프로필을 후속 수 있어야 합니다. 그리고 망막 게놈 DNA에서 AAV 게놈을 정량화하여 그 변환 효율을 국자. 여기에서 망막 세포에서 트랜스듀스하는 AAV 게놈의 절대적인 정량화를 할 수 있는 디지털 물방울 PCR의 기본 적용을 볼 수 있습니다.각 샘플에 대해 마이크로리터 당 1 나노그램의 최종 농도에 도달하기 위해 0.05%의 플루론 F 68 용액으로 주입된 망막으로부터 게놈 DNA를 희석시합니다. 나노그램 게놈 DNA 125 나노몰라 프라이머와 2X 상록 슈퍼 믹스를 포함한 20마이크로리터 PCR 반응 믹스에서 액적 생성을 수행한다. 물방울 생성을 위해 카트리지의 중간 부분에 샘플 믹스를 로드합니다.그 후 70개의 마이크로리터 액적 생성 오일을 카트리지의 맨 아래 줄에 넣습니다. 개스킷을 카트리지 위에 놓습니다. 개스킷과 카트리지 사이에 간격이 없는지 확인합니다.그런 다음 액적 생성기에 넣습니다. 상단 종에서 생성되는 약 40 마이크로 리터의 물방울을 부드럽게 가져 가라. 세미 스커트 96-Well PCR 반응 플레이트에 액적 용액을 추가합니다.알루미늄 밀봉 호일을 사용하여 PCR 플레이트 실러로 PCR 플레이트를 밀봉하십시오. PCR 플레이트를 96-Well 열 밀봉 열 사이클러에 넣습니다. 문서에 표시된 ddPCR 프로토콜을 사용합니다.데이터를 분석하기 위해 PCR 플레이트를 액적 판독기에 배치합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 기본적인 디지털 PCR 기술을 수행할 수 있어야 합니다. 또한 디지털 PCR 기술에 이상적인 소량의 재료로 가전 된 세포를 사용할 수 있습니다.그러나 대상 DNA 양을 디지털 방울 PCR의 한계를 초과하지 않도록 신중하게 조정해야 합니다. 실험 절차에 대한 흐름 차트는 다음과 같습니다. 우리는 AAV 티터링 다음에 작은 규모의 AAV 생산을 수행했습니다.그런 다음 우리는 인트라비티리얼 주사를 수행했습니다. 그 후, 우리는 fundus 형광 화상 진찰에 의해 형광 강도를 정량화했습니다. 그런 다음 마우스 망막을 분리하고 ddPCR에 대한 망막에서 게놈 DNA를 추출했습니다.Titering AAV는 AAV 변환을 올바르게 정량화할 수 있어야 합니다. ddPCR은 타겟 AAV 제놈을 희석한 액적생성에 따라 달라집니다. 대표적인 ddPCR 결과는 AVV 게놈에 대한 양수 및 음수 액적을 나타낸다.임계값보다 양수 및 음수는 아래입니다. 희석 인자를 곱한 후, AAV의 티터는 밀리리터 당 게놈 사본에서 10에서 12로 나타났습니다. AAV 대납 효율을 올바르게 정량화하기 위해 여러 망막이 주입되었습니다.주입된 동물을 이미지화하고, 형광평균 강도가 계산되었다. 2주 시점에서 망막은 고립되었습니다. 및 ddPCR은 WPRE 및 18 S 프라이머를 사용하여 수행되었다.AAV 주입망막의 형광 강도는 방법론의 힘을 보여주는 AAV 게놈 계산과 상관관계가 있었다. 여기에서, 우리는 몇몇 기술을 보여주었습니다, 소규모 AAV 준비 intravitreal 주입을 포함하여.

digital-droplet-pcr-method-for-quantification-aav-transduction

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

망막 질환의 동물 모델에서 혈액-망막 장벽 투과성과 내부 제한 막 무결성을 조사하기 위해 여러 아데노 관련 바이러스(AAV) 변종을 망막 뉴런과 신경교세포를 라벨링하는 도구로 사용했습니다. 그런 다음 바이러스 매개 리포터 유전자 발현을 망막 장벽 투과성의 지표로 사용합니다.

도구로 아데노 관련 바이러스를 사용하여 질병 망막 장벽을 연구하는

이 원고 내용을 adeno 관련 바이러스 (AAV) titers 및 어셈블리 활성화의 역할을 연구의 응용의 정량에 대 한 간단한 점 오 점 분석 결과 단백질 (AAPs), 모든 AAV에 구조 비 바이러스 성 단백질의 새로운 클래스 serotypes capsids 동족과 분리 AAV serotypes에서 파생 된의 어셈블리를 홍보에.

AAV 적정 및 Adeno 관련 바이러스 어셈블리 활성화의 기능 평가 대 한 그것의 사용에 대 한 양적 점 오 점 분석 결과 단백질

생체 내 이미징은 건강 및 질병 생물학 연구를위한 강력한 도구입니다. 이 프로토콜은 표준 2 광자 현미경으로 마우스 망막의 경공 영상을 설명합니다. 또한 망막의 여러 세포 코호트를 형광으로 표지하는 다양한 생체 내 이미징 방법을 보여줍니다.

경동공 이광자 마우스 망막의 생체 내 이미징

여기에서, 우리는 시간 경과 공초점 현미경에 의해 산후 마우스 망막 외식편에서 신경돌기 형태 형성을 조사하는 방법을 제시한다. 우리는 Cre 의존성 방식으로 막 표적화된 형광 단백질을 발현하는 재조합 아데노-관련 바이러스 벡터를 사용하는 망막 세포 유형의 희소 표지 및 획득 및 이들의 미세 공정에 대한 접근법을 기술한다.

유전자 표적화된 망막 세포 집단의 희소 아데노-연관 바이러스 표지를 이용한 뉴런 수목화의 타임랩스 이미징

포괄적인 실험실 프로토콜 및 분석 워크플로우는 AAV6에 대한 중화 요소를 감지하기 위해 신속하고 비용 효율적이며 간단한 색채 세포 기반 분석법을 위해 설명됩니다.

색색세포 기반 분석법을 사용하여 AAV에 대한 항체 중화를 검출하는 단계별 방법

여기에서 우리는 유전자 치료 벡터의 임상 개발을 지원하기 위해 액적 디지털 중합효소 연쇄 반응에 의한 인간 눈물에서 아데노 관련 바이러스 벡터의 규정 준수 검출에 대한 우수 실험실 관행의 개발 및 검증을 위한 프로토콜을 제시합니다.

눈물의 바이오셰딩 연구에서 아데노 관련 바이러스 벡터의 검출을 위한 검증 가능한 액적 디지털 중합효소 연쇄 반응 분석

여기에서는 성체 마우스에서 아데노 관련 바이러스(AAV)를 체계적으로 투여하기 위해 마우스 측면 꼬리 정맥 주입에 최적화된 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 또한 AAV transduction을 평가하기 위해 일반적으로 사용되는 분석 프로토콜에 대해 설명합니다.

성체 마우스에서 측면 꼬리 정맥 주입을 통한 아데노 관련 바이러스의 일관된 전달

아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터 게놈 복제의 정확한 정량화는 매우 중요하지만 표준화된 프로토콜은 아직 확립되지 않았습니다. 이 프로토콜은 바이러스 게놈 역가를 신뢰성 있게 정량화하기 위해 정제된 AAV 샘플을 준비하고 디지털 액적 중합효소 연쇄 반응(dd_PCR)을 수행하기 위한 검증된 방법을 설명합니다.

Digital Droplet Polymerase Chain Reaction에 의한 정제된 벡터 샘플의 Adeno-Associated Viral Genomes 정량화

망막하 주사는 광수용체 및 RPE 질환에 대한 치료제의 전임상 개발에 없어서는 안 될 기술입니다. 우리는 수술 중 성공률을 향상시키고 망막 손상을 최소화하는 마우스에서 최적화된 경공막 망막하 주사 기술을 설명합니다.

마우스에서 최적화된 최소 침습 경공막 망막하 주사 기술

이득 또는 기능 연구의 손실 중 하나를 수행하기위한 목적으로 murine 망막 세포에 플라스미드 DNA의 결합을위한...

개발 마우스 망막의 생체내 Electroporation에

배우세요 뮤린 망막에서 디지털 물방울 PCR을 이용한 AAV 변환 효율 정량화 방법입니다. 이 프로토콜은 소규모 AAV 생산, 유리체내 주사, 망막 이미징, 게놈 DNA 분리를 포함하며 유전자 치료 연구에 활용됩니다.

뮤린 망막에서 AAV 변환 효율의 정량화를위한 디지털 물방울 PCR 방법

더 많은 동영상 탐색