Name: 세포외 플럭스 분석기를 사용한 마우스 조혈 줄기 및 원시 전구 세포의 세포 생체 에너지 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: 배우세요 세포외 플럭스 분석기를 사용한 마우스 조혈 줄기 및 원시 전구 세포의 실시간 세포 생체 에너지 평가 방법입니다. 이 고감도 고처리량 기술로 당분해 및 미토콘드리아 기능을 정량화하여 줄기세포 다능성 유지에 필수적인 대사 경로를 규명할 수 있습니다.

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롬바르드 실험실에서의 작업은 NIH (NIGMS R01GM101171, NIEHS R21ES032305), DoD (CA190267, CA170628, NF170044 및 ME200030) 및 Glenn Foundation for Medical Research의 지원을 받습니다. Li 실험실에서의 작업은 NIH (NHLBI 5R01HL150707)에 의해 지원됩니다.

모든 척추동물 실험은 미시간 대학교 동물 사용 및 관리 위원회의 규정에 따라 승인되고 수행되었습니다.
1. 분석 전날 (총 시간 : ~ 10 분)
<ol><li>센서 카트리지의 수화 (스텝 타임: ~10분)<ol>
<li>세포외 플럭스 분석 키트를 열고 센서 카트리지 및 유틸리티 플레이트 어셈블리를 분리합니다. 다음날 사용할 수 있도록 적재 가이드 플랫을 저장하십시오.</li>
		<li>센서 카트리지(뚜껑이 있는 상단 녹색 부분)를 유틸리티 플레이트(하부 96웰 마이크로플레이트)에서 수동으로 분리하고 유틸리티 플레이트 옆에 거꾸로 놓습니다.</li>
		<li>다중 채널 피펫을 사용하여, 유틸리티 플레이트의 각 웰을 플럭스 분석 키트에 포함된 200μL의 캘리브란트로 채운다.</li>
		<li>센서 카트리지를 유틸리티 플레이트에 다시 올려 놓고 센서를 캘리브란트에 완전히 잠기십시오.</li>
		<li>조립된 센서 카트리지 및 유틸리티 플레이트를 교정제와 함께 비CO2 37°C 인큐베이터에 하룻밤 동안 놓는다. 캘리브란트의 증발을 방지하려면 인큐베이터가 제대로 가습되었는지 확인하십시오. 비CO2 37°C 인큐베이션을 위해 규칙적인 오븐 인큐베이터를 사용하는 경우, 물을 함유하는 개방된 비커를 인큐베이터 내부에 배치하여 가습시킨다. 이용 가능한 경우, 모든 비CO2 37°C 인큐베이션을 위해 XF 준비 스테이션을 사용한다. 참고: 대안적으로, 센서 카트리지는 비CO2 37°C 인큐베이터에서 웰 당200 μL의 멸균 초순수로 밤새 수화될 수 있다. 분석 당일에 주입 포트를 로딩하기 최소 45-60분 전에 37°C의 예열 교정제의 웰 당 200 μL로 물을 교체한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 분석의 날 (총 시간 : ~ 9 시간 30 분)
참고: 위에 표시된 총 시간에는 2.5단계 또는 2.6단계 외에 2.1-2.4단계의 누적 기간이 포함됩니다.
<ol><li>세포 접착제 코팅 마이크로플레이트의 제조 (단계 시간: ∼1 h 30 분) 주: 생물 안전 캐비닛의 모든 단계를 수행하십시오.<ol>
<li>96웰 세포 배양 마이크로플레이트당 2.5 mL의 세포 접착제 용액(22.4 μg/mL, 표 참조)을 준비하여 세포 접착제 56 μg을 적절한 부피의 필터-멸균된 0.1 M 중탄산나트륨(pH 8.0)에 용해시키고 즉시 사용된 세포 접착제 스톡의 부피의 절반에 1N 수산화나트륨을 첨가한다. 소용돌이 또는 피펫을 위아래로 섞어서 혼합하십시오.</li>
		<li>96-웰 세포 배양 마이크로플레이트(플럭스 분석 키트와 함께 포함됨)를 열고 제조된 세포 접착 용액 25 μL를 각 웰의 바닥에 분주한다. 마이크로플레이트를 뚜껑으로 덮고 후드 내부의 실온에서 30분 동안 인큐베이션한다.</li>
		<li>배양 후, 다채널 피펫 또는 흡인물을 이용하여 과량의 세포 접착 용액을 제거하고 버리고, 200 μL의 멸균 초순수로 각 웰을 두 번 세척한다. 뚜껑을 제거한 상태에서 플레이트를 후드 내부에서 30-45 분 동안 공기 건조시킵니다. 참고: 세포-접착제-코팅된 세포 배양 마이크로플레이트는 4°C에서 최대 일주일 동안 저장될 수 있다. 4°C에 보관된 예비코팅된 마이크로플레이트는 세포를 시딩하기 전에 후드 내부의 실온으로 가온되도록 허용되어야 한다.</li>
	</ol></li>
	<li>분석 매질의 제조 (단계 시간: ∼30 분)<ol>
<li>당분해 스트레스 시험 분석 배지의 제조<ol>
<li>100 mL의 기본 배지 ( 물질 표 참조)를 1 mL의 200 mM L-글루타민으로 보충하십시오. 참고: 분석 배지 내의 최종 L-글루타민 농도는 2mM이다.</li>
			<li>L-글루타민이 보충된 배지를 수조에서 37°C로 따뜻하게 한다.</li>
			<li>따뜻한 배지의 pH를 1 N NaOH로 7.4로 조정한다.</li>
			<li>필터-멸균된 배지를 0.2 μm 필터로 세척하고 사용할 준비가 될 때까지 37°C에서 보관한다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>미토콘드리아 스트레스 시험 분석 배지의 제조<ol>
<li>기본 배지 100 mL를 0.45 g의 포도당, 1 mL의 200 mM L-글루타민 및 100 mM 나트륨 피루베이트 1 mL로 보충하십시오. 참고: 최종 분석 배지는 25 mM 글루코스, 2 mM L-글루타민 및 1 mM 소듐 피루베이트를 함유한다.</li>
			<li>따뜻한 글루코스, L-글루타민, 및 소듐 피루베이트-보충된 배지를 수조에서 37°C로 한다.</li>
			<li>따뜻한 배지의 pH를 1 N NaOH로 7.4로 조정한다.</li>
			<li>멸균 배지를 0.2 μm 필터로 필터-멸균하고 사용 준비가 될 때까지 37°C에서 유지한다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>수확 마우스 계보 음성 HSPC (단계 시간 : ~ 3 시간)<ol>
<li>행크의 균형 잡힌 소금 용액에 4% 소 태아 혈청을 보충하여 분석 완충액을 준비합니다. 5x 스톡을 멸균 증류수로 희석하여 1x 농축 완충액을 준비합니다. 사용할 때까지 두 버퍼를 얼음 위에 보관하십시오.</li>
		<li>CO2를 사용하여 마우스를 인도적으로 안락사시킨 다음 자궁 경부 탈구하고 가위로 뒷다리를 제거하십시오. 조심스럽게 뼈에서 모든 조직을 제거하고 가위를 사용하여 대퇴골과 경골의 양쪽에서 끝을 자릅니다. 분석 버퍼를 사용하여 대퇴골과 경골에서 골수 세포를 플러시하십시오. 플러싱된 세포를 멸균된 70 μm 필터에 통과시키고, 여액을 200 × g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하고, 상층액을 폐기한다.</li>
		<li>세포 펠릿을 500 μL의 ACK 완충액 (150 mMNH4Cl, 10 mMKHCO3, 0.1 mM EDTA, pH 7.2)에 재현탁시켜 적혈구를 용해시킨다. 얼음 상에서 1분 동안 용해시킨 후, 1 mL의 분석 완충액을 첨가하고, 4°C에서 5분 동안 200 × g 에서 원심분리하여 샘플을 세척한다. 상층액을 버리십시오.</li>
		<li>세척 후, 샘플을 CD2 (1:200 희석), CD3 (1:200 희석), CD5 (1:200 희석), CD8 (1:200 희석), Ter-119 (1:200 희석), B220 (1:200 희석), 및 Gr-1 (1:800 희석)에 대해 지시된 비오티닐화 항체의 칵테일과 함께 500 μL의 총 부피의 분석 완충액에서 얼음 상에서 45분 동안 인큐베이션한다.</li>
		<li>위와 같이 원심분리로 1 mL의 분석 완충액으로 샘플을 세척한다.</li>
		<li>위와 같이 원심분리로 1 mL의 1x 농축 완충액으로 샘플을 세척한다.</li>
		<li>샘플을 20 μL의 스트렙타비딘 나노비드 및 100 μL의 1x 농축 완충액과 함께 15분 동안 얼음 상에서 인큐베이션한다.</li>
		<li>위와 같이 원심분리로 1 mL의 1x 농축 완충액으로 샘플을 세척한다.</li>
		<li>샘플을 2.5 mL의 1x 농축 완충액에 재현탁시킨다. 5 분 동안 분리 자석에 놓습니다. 상청액을 15 mL 원뿔형 튜브에 별도로 수집하십시오.</li>
		<li>자석으로 분리된 샘플을 추가로 2.5 mL의 1x 농축 완충액에 재현탁시키고, 이를 다시 분리자석 상에 5분 동안 놓는다. 상청액을 수집하고 단계 2.3.9에서 15 mL 원뿔형 튜브에서 이전 수집에 결합한다. 참고: 상청액은 혈통-음성 세포 분획을 함유한다.</li>
		<li>음으로 선택된 세포를 함유하는 15 mL 원뿔형 튜브를 4°C에서 200 × g 에서 5분 동안 원심분리한다.</li>
		<li>세포 펠릿을 1mL의 분석 완충액에 재현탁하고 트립판 블루를 사용하여 수동으로 또는 Countess 3과 같은 자동화된 세포 카운터를 통해 세포 수를 계수합니다. 참고 : 위에서 설명한 접근법에 따라 ~ 6 × 106 혈통 음성 HSPC는 단일 마우스의 뒷다리에서 쉽게 정제되어야합니다. 분석 완충액, 1x 농축 완충액 및 혈통특이적 항체 칵테일과 같은 시약이 실험 전날 제조되는 경우, 4마리의 마우스로부터 HSPC를 풍부하게 하는 데 약 2.5-3시간이 소요된다. 이 숫자를 초과하는 각 마우스에 대해 추가로 10 분이 걸릴 것입니다.</li>
	</ol></li>
	<li>세포 접착제 코팅 마이크로플레이트에 세포 시딩 (단계 시간: ~1 h)<ol>
<li>세포를 단계 2.3.12에서 200 × g 에서 실온에서 5분 동안 원심분리한다.</li>
		<li>상청액을 제거하고 세포 펠릿을 적절한 분석 배지(글리코분해 스트레스 시험 배지 또는 미토콘드리아 스트레스 시험 배지)에 재현탁시켰다. 실온에서 5분 동안 200 × g 에서 원심분리한다.</li>
		<li>2.4.2단계를 반복합니다. 상청액을 제거하고 세포를 적절한 가온된 분석 배지에 재현탁시켜 50 μL 당 2.5 × 105 세포 또는 5 × 10mL 당 6 세포의 농도로 재현탁시킨다.</li>
		<li>50 μL의 세포 현탁액을 상온 세포-접착제가 코팅된 96-웰 세포 배양 마이크로플레이트의 각 웰의 측면을 따라 피펫한다. 50 μL의 분석 배지를 코너 배경 측정 웰에 피펫한다. 일관성을 보장하기 위해 셀 도금을 위해 다중 채널 피펫을 사용하십시오.</li>
		<li>코팅되지 않은 96-웰 세포 배양 마이크로플레이트의 웰 당 50 μL의 물을 첨가하여 원심분리 밸런스 플레이트를 생성한다.</li>
		<li>플레이트 내의 세포를 200 × g 에서 실온에서 1분 동안 원심분리한다. 브레이크를 적용하지 마십시오. 플레이트를CO2가 아닌 37 °C 인큐베이터로 25-30분 동안 옮겨 세포가 완전히 부착되었는지 확인한다. 현미경으로 세포가 마이크로플레이트 표면에 안정적으로 부착되어 있는지 육안으로 확인한다. 참고 : 단일 마우스의 뒷다리에서 ~ 6 개×6 개의 혈통 음성 HSPC를 수확 할 수 있으므로 4 마리의 마우스 (~ 2.4 × 107 개 세포)에서 분리 된 HSPC가 생체 외 다중 개입을 병렬로 스크리닝하는 것이 목표라면 전체 96 웰 플레이트를 채우기 위해 필요합니다. 그러나 유전자 변형 또는 개입이 생체 내에서 HSPC의 대사 매개 변수에 미치는 영향을 조사하는 것이 목적이라면 여러 쌍의 대조군 및 테스트 마우스에서 분리 된 HSPC를 단일 플레이트를 사용하여 여러 기술 복제본에서 병렬로 분석 할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>세포외 플럭스 분석기를 이용한 당분해 스트레스 테스트 수행(스텝 타임: ∼3시간 30분)<ol><li>화합물을 주입하는 센서 카트리지 로딩<ol>
<li>100 mM 글루코스, 20 μM 올리고마이신 및 500 mM 2-DG 용액을 예열된 당분해 스트레스 시험 분석 배지 (pH 7.4)에서 준비한다. 참고 : 모든 주입 화합물 용액은 10x 농도로 만들어집니다. 최종 웰 농도는 글루코스의 경우 10mM, 올리고마이신의 경우 2μM, 2-DG의 경우 50mM이다( 표 1 참조).</li>
			<li>수화된 센서 카트리지를 단계 1.1.5로부터 비CO2 37°C 인큐베이터로부터 제거한다. 센서 카트리지를 교정기에서 들어올려 교정기가 있는 동일한 유틸리티 플레이트로 교체하여 유틸리티 플레이트의 교정기에서 기포를 제거합니다.</li>
			<li>A/D 로딩 가이드를 센서 카트리지 상단에 플랫(세포외 플럭스 분석 키트에 포함)에 놓고 문자 'A'가 왼쪽 위 모서리에 위치하도록 방향을 지정하여 포트 A만 로드할 수 있도록 합니다. 다채널 피펫을 사용하여, 포트 A에 20 μL의 100 mM 글루코스 용액을 분주한다.</li>
			<li>A/D 로딩 가이드 플랫을 B/C 로딩 가이드 플랫으로 교체하고, 문자 'B'가 왼쪽 상단 모서리에 위치하도록 방향을 지정하여 포트 B만 적재할 수 있도록 합니다. 다채널 피펫을 사용하여, 22 μL의 20 μM 올리고마이신 용액을 포트 B에 분주한다.</li>
			<li>B/C 로딩 가이드 플랫의 방향을 재조정하여 포트 C를 로딩하기 위한 왼쪽 상단 모서리에 문자 'C'를 찾습니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 포트 C에 500mM 2-DG 솔루션 25μL를 분배합니다.</li>
			<li>적재 가이드 플랫을 제거하고 버립니다. 참고: 배경 웰을 포함한 모든 96개 웰의 각 포트 시리즈는 주입 화합물의 동일한 부피로 완전히 로드되는 것이 중요합니다.</li>
		</ol></li>
		<li>템플릿 작성, 교정 및 측정<ol>
<li>컨트롤러에서 글리코분해 스트레스 테스트를 위한 템플릿을 만들거나 로드합니다. 주사 전략, 치료 조건 및 세포 유형에 대한 세부 정보를 입력하고 생성 그룹을 누릅니다. 플레이트 맵 으로 이동하여 분석할 각 그룹에 웰을 할당합니다. 배경 측정을 위해 4개의 모서리 웰을 할당합니다.</li>
			<li>프로토콜에서 초기화 단계에서 교정 및 평형화가 확인되었는지 확인합니다.</li>
			<li>각 주사 후의 기준선 측정 및 측정(글루코스, 올리고마이신 및 2-DG)의 경우, 측정 주기 수를 3으로 설정하고 믹스-대기 - 측정 시간을 3분 - 0분 - 3분으로 설정한다(표 2 참조). </li>
			<li>컴파운드가 로딩되고 수화된 센서 카트리지에서 뚜껑을 분리하고 유틸리티 플레이트의 교정기에 잠겨 있습니다. 세포외 플럭스 분석기의 작업 트레이에 놓고 실행을 시작하십시오. 참고: 첫 번째 단계는 교정이며, 보통 ~20분이 소요됩니다.</li>
			<li>세포를 포함하는 마이크로플레이트를 단계 2.4.6으로부터 37°C 인큐베이터로부터 비CO2 꺼내어 25-30분 동안 인큐베이션이 끝난 후 한다. 세포를 교란시키지 않고, 웰 당 130 μL의 미리 가온된 당분해 스트레스 시험 검정 배지 (pH 7.4)를 천천히 첨가하여 각 웰에서 배지 부피를 180 μL로 구성하고, 플레이트를 추가의 15-20분 동안 비CO2 37°C 인큐베이터로 복귀시킨다. 참고: 원심분리 후 45-60분의 총 배양 시간이 바람직하다.</li>
			<li>교정이 끝난 후, 유틸리티 플레이트를 세포를 포함하는 분석 마이크로플레이트(뚜껑 없이)로 교체한다. 로드 세포 플레이트를 눌러 측정을 시작하고, 분석 완료를 위해 ~1.5시간이 소요됩니다.</li>
			<li>측정이 끝난 후, 세포를 함유하는 분석 마이크로플레이트를 수집하고 세포를 교란시키지 않고 분석 배지를 제거한다. 세포를 분산시키지 않고 250 μL의 1x 포스페이트 완충 식염수로 1회 부드럽게 세척한다.</li>
			<li>10 μL의 RIPA 용해 완충액 (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1% NP-40, 0.5% Na 데옥시콜레이트, 0.1% 소듐 도데실설페이트, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM NaF)을 첨가하고, 1x 프로테아제 억제제 칵테일로 보충하여, 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 진탕기 상에서 10분 동안 교반시킨다. 전체 플레이트를 -80°C에서 동결시킨다.</li>
			<li>플레이트를 해동하고, 제조자의 지시에 따라 데이터 정규화를 위한 단백질 측정 분석을 수행한다.</li>
			<li>데이터를 검색하고 분석합니다. Wave 데스크탑 소프트웨어를 사용하여 데이터 파일을 엽니다. 정규화 를 클릭하고 각 웰에 대한 정규화 값을 붙여 넣습니다. 적용 을 클릭하여 데이터를 정규화하십시오. 내보내기 를 클릭하고 당분해 스트레스 테스트 보고서 생성기를 선택하여 분석된 데이터를 보고서 생성기로 내보냅니다. 또는 데이터를 외부 응용 프로그램으로 내보냅니다. 참고: 대안적으로, 각 웰의 총 핵 DNA 함량은 데이터를 정규화하는데 사용될 수 있다. 핵산에 결합하는 CyQuant와 같은 형광 염료를 사용하여 웰 당 총 핵 DNA 함량을 평가할 수 있습니다.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>세포외 플럭스 분석기를 이용한 미토콘드리아 스트레스 테스트 수행(스텝 타임: ∼3시간 30분)<ol>
<li>화합물을 주입하는 센서 카트리지 로딩<ol>
<li>20 μM 올리고마이신, 20 μM FCCP, 및 5 μM 로테논 + 5 μM 안티마이신 A 용액을 예열 미토콘드리아 스트레스 시험 배지 (pH 7.4)에서 제조하였다. 참고 : 모든 주입 화합물 용액은 10x 농도로 만들어집니다. 최종 웰 농도는 올리고마이신에 대해 2 μM, FCCP에 대해 2 μM, 로테논 및 안티마이신 A에 대해 각각 0.5 μM이다( 표 3 참조).</li>
			<li>수화된 센서 카트리지를 단계 1.1.5로부터 37°C 인큐베이터로부터 분리하고, 단계 2.5.1.2에서 앞서 설명된 바와 같이 기포를 제거한다.</li>
			<li>단계 2.5.1.3 내지 2.5.1.6에 이어서, 포트 A에 20 μL의 20 μL의 올리고마이신을, 22 μL의 20 μM FCCP를 포트 B에 분주하고, 25 μL의 5 μM 로테논 및 5 μM 안티마이신 A의 혼합물을 포트 C에 분주한다. 참고: 배경 웰을 포함한 모든 96개 웰의 각 포트 시리즈가 동일한 양의 주입 화합물로 완전히 로드되는 것이 중요합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>템플릿 작성, 교정 및 측정<ol>
<li>컨트롤러에서 미토콘드리아 스트레스 테스트를 위한 템플릿을 만들거나 로드합니다. 주사 전략, 치료 조건 및 세포 유형에 대한 세부 정보를 입력하고 생성 그룹을 누릅니다. 플레이트 맵 으로 이동하여 분석할 각 그룹에 웰을 할당합니다. 배경 측정을 위해 4개의 모서리 웰을 할당합니다.</li>
			<li>프로토콜에서 초기화 단계에서 교정 및 평형화가 확인되었는지 확인합니다.</li>
			<li>각 주사 후 기준선 측정 및 측정치(올리고마이신, FCCP, 및 로테논+안티마이신 A)의 경우, 측정 주기 수를 3으로 설정하고 믹스-대기 - 측정 시간을 3분 - 0분 - 3분으로 설정한다(표 4 참조).</li>
			<li>2.5.2.4단계에서와 같이 교정을 수행하기 위해 실행을 시작합니다.</li>
			<li>단계 2.5.2.5에서와 마찬가지로 예열된 미토콘드리아 스트레스 시험 검정 배지 (pH 7.4) 당 130 μL를 첨가한다.</li>
			<li>측정을 시작하십시오. 2.5.2.6 ~ 2.5.2.10 단계와 같이 데이터를 검색하고 분석합니다. 분석된 데이터를 미토콘드리아 스트레스 테스트 보고서 생성기 또는 외부 애플리케이션으로 내보냅니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

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저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

이 방법 논문은 Seahorse 세포외 플럭스 분석기를 사용하는 마우스 HSPCs에서 세포 생물에너지학(당분해 및 OxPHOS)의 평가를 위한 최적화된 프로토콜을 기술한다. 이 장치는 각각 글리코 분해 및 미토콘드리아 호흡의 메트릭 인 살아있는 세포의 ECAR 및 OCR을 동시에 측정하는 강력한 도구입니다. 따라서, 세포 생물에너지를 실시간으로 평가하는데 사용될 수 있다. 또한, 96웰 마이크로플레이트 기반 플랫폼은 고감도로 고처리량 정량화를 제공하므로 2개의 샘플만 동시에 분석할 수 있는 다른 고해상도 호흡계인 Oroboros O2k 또는 클래식 Clark 전극(20)과 비교하여 단일 플레이트를 사용하여 여러 샘플을 동시에 분석할 수 있습니다.
세포외 플럭스 분석기는 세포가 단층으로 존재해야 하기 때문에 부착성 세포 유형의 분석에 주로 사용되어 왔으며, 현탁액에서 성장한 세포를 분석하는 것이 더 어려워졌습니다. 더욱이, 포트로부터의 약...

조혈은 고도로 전문화 된 기능을 가진 다양한 유형의 성숙한 혈액 세포가 HSC1에서 형성되는 과정입니다. HSC는 자기 갱신 및 다양한 다능성 및 혈통 특이적 선조 집단으로 분화 할 수 있습니다. 이 선조는 궁극적으로 림프구, 골수성, 에리스로이드 및 거핵구 혈통의 세포를 생산합니다. 자기 재생 능력을 유지하기 위해 HSC는 크게 정지 상태로 유지되며 다른 조직 줄기 세포와 마찬가지로 ATP 생산 2,3을 위해 미토콘드리아 OxPHOS보다는 당분해에 의존하는 것으로 여겨집니다. 세포 주기로의 진입은 향상된 호흡 및 OxPHOS로 이어지고, 그 결과 HSC 유지 및 기능3에 해로운 반응성 산소 종(ROS)의 수준이 상승한다. 따라서 반복되는 세포 분열은 HSC의 자기 재생 능력을 감소시키고 궁극적으로 고갈로 이어질 수 있습니다.
성인 조혈에서 HSC는 주로 비대칭 세포 분열을 겪으며, 그 동안 딸 세포 중 하나가 HSC 잠재력을 유지하고 글리콜 대사에 계속 의존합니다. 다른 딸 세포는 자기 재생 능력을 잃지만 증식하고 결국 분화 된 기능적 조혈 세포를 일으키는 원시적 인 전구 세포가됩니다4. HSC가 하류 선조를 생산하기 위해 분화 할 때, HSC 가 비활성 미토콘드리아 질량을 가지고 있다는 관찰에 의해 제안 된 바와 같이이 급속한 전이를 지원하는 데 필요한 에너지와 빌딩 블록을 공급하기 위해 글리코 분해에서 미토콘드리아 대사로의 전환이 발생하는 것으로 생각됩니다 5 . 대조적으로, 미토콘드리아 활성(연결된 ROS 수준으로 나타냄)은 HSC 9,10,11에서보다 혈통-헌신적 선조에서 훨씬 더 높다. 따라서 조혈의 초기 단계에서 발생하는 대사 변화는 HSC 운명을 조절하는 데 미토콘드리아의 직접적이고 중요한 역할을 제안합니다.
노화, 암, 당뇨병 및 비만과 같은 다양한 스트레스 조건 하에서 존재하는 기능 장애 미토콘드리아는 HSC 자기 재생 능력을 방해하여 과도한 양의 ROS를 생산하고 ATP 생산을 저해하거나 다른 대사 과정을 변경함으로써 HSC / 선조 분화의 불균형을 유발할 수 있습니다9,12,13 . HSC / 선조 분화에서 대사 항상성의 교란은 조혈에 상당한 영향을 미칠 수 있으며, 잠재적으로 혈액 학적 이상13의 발달에 기여할 수 있습니다. HSC 줄기 및 분화에 대한 글리코 분해 및 미토콘드리아 OxPHOS의 중요한 영향을 감안할 때, 정상 및 스트레스 조건 하에서 대사 매개 변수를 모두 조사하는 것이 중요합니다. HSCs 및 전구 세포의 글리콜 및 미토콘드리아 기능에 대한 귀중한 통찰력은 각각 세포 당분해 및 미토콘드리아 호흡의 지표 인 ECAR 및 OCR을 평가함으로써 얻을 수 있습니다.
Seahorse 세포외 플럭스 분석기는 살아있는 세포에서 ECAR 및 OCR을 동시에 측정하기 위해 웰 당 두 개의 프로브가 장착 된 강력한 장치이므로 다양한 기질 또는 억제제에 반응하여 실시간으로 세포 생물 에너지를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 분석기와 함께 사용되는 분석 카트리지에는 분석 중에 자동 주입을 위해 최대 네 개의 약물을 보유하는 주입 포트가 포함되어 있습니다. 전형적인 당분해 스트레스 시험의 반응식은 도 1A에 도시되어 있다. 상기 분석은 세포의 ECAR의 측정으로 시작하여, 글루타민을 함유하지만 글루코스 또는 피루베이트는 함유하지 않는 당분해 스트레스 시험 배지에서 배양한다. 이것은 세포의 비 글리콜 성 활성으로 인해 발생하는 산성화를 나타내며 비 글리콜 성 산성화로보고됩니다. 이것은 포화 농도에서 포도당의 주입으로 이어진다. 당분해를 통해 세포 내의 포도당은 피루베이트로 전환되며, 이는 세포질에서 추가로 대사되어 젖산을 생산하거나 미토콘드리아에서CO2 및 물을 생산합니다.
포도당을 젖산으로 전환시키는 것은 순 생산과 양성자의 세포외 배지로의 후속 방출을 유발하여 ECAR14,15,16의 급속한 증가를 초래합니다. ECAR의 이러한 글루코스-자극된 변화는 기저 조건하에서 글리코분해로서 보고된다. 두 번째 주사는 미토콘드리아 ATP 생산을 억제하는 올리고마이신 (ATP 합성 효소의 억제제, 일명 복합체 V17)으로 구성됩니다. 올리고마이신 매개 OxPHOS 억제 동안, 세포는 그들의 에너지 요구를 충족시키기 위해 당분해를 최대로 상향조절한다. 이것은 ECAR의 추가 증가를 일으켜 세포의 최대 글리콜 용량을 드러냅니다. 최대 글리콜 용량과 기저 글리코 분해 사이의 차이는 글리콜 보유량이라고합니다. 마지막으로, 2-DG가 주입되어 ECAR이 크게 떨어지며 일반적으로 비 글리콜 성 산성화 수준에 가깝습니다. 2-DG는 헥소키나제에 경쟁적으로 결합하는 글루코스 유사체로, 글리코분해억제(18)를 초래한다. 따라서, ECAR의 2-DG-유도된 감소는 글루코스 및 올리고마이신 주사 후에 관찰된 ECAR의 공급원이 실제로 당분해임을 추가로 확인시켜준다.
도 1B는 전형적인 미토콘드리아 스트레스 테스트에 대한 개략도를 표시한다. 상기 분석은 세포의 기준선 OCR 측정으로 시작하여, 글루코스, 글루타민 및 피루베이트를 함유하는 미토콘드리아 스트레스 시험 배지에서 인큐베이션한다. 기초 OCR 측정 후, 올리고마이신이 이 분석법에 주입되어 복합체 V를 억제하여 전자 수송 사슬(ETC)17을 통한 전자 흐름을 감소시킨다. 결과적으로, OCR은 올리고마이신 주사에 반응하여 감소되고, OCR의 이러한 감소는 미토콘드리아 ATP 생산과 관련이 있다. 두 번째 주사는 카르보닐 시아나이드-4 (트리플루오로메톡시) 페닐히드라존(FCCP), 프로토노포어 및 미토콘드리아 OxPHOS17의 언커플러로 구성된다. FCCP는 미토콘드리아 내막을 가로지르는 양성자의 흐름을 허용함으로써 미토콘드리아 양성자 구배를 붕괴시킨다. FCCP 주입으로 인해 ETC를 통한 전자 흐름이 억제되고 복합 IV는 최대 수준에서 산소를 소비합니다. 최대 OCR과 기저 OCR의 차이는 예비 호흡 용량이라고하며, 이는 스트레스 조건 하에서 증가 된 에너지 수요에 대응하는 세포의 능력을 측정합니다. 마지막으로, 두 개의 ETC 억제제 (로테논, 콤플렉스 I 억제제 및 안티마이신 A, 콤플렉스 III 억제제17)의 혼합물이 주입되어 전자 흐름을 완전히 차단하고 OCR은 낮은 수준으로 감소합니다. 로테논 및 안티마이신 A 주사 후 측정된 OCR은 세포 내부의 다른 과정에 의해 구동되는 비미토콘드리아 OCR에 상응한다. 비 미토콘드리아 OCR은 기저 호흡, 양성자 누출 및 최대 호흡의 계산을 가능하게합니다.
기저 호흡은 기준선 OCR과 비미토콘드리아 OCR 사이의 차이를 나타낸다. 양성자 누출은 올리고마이신 주사 후 OCR과 비미토콘드리아 OCR의 차이를 의미한다. 최대 호흡은 FCCP 주사 후 OCR과 비미토콘드리아 OCR 사이의 차이를 나타낸다. 커플링 효율은 기초 호흡률에 대한 ATP 생산 속도의 백분율로서 계산된다. 이 방법 논문은 Seahorse XFe96 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 계보 음성 HSPC에서 ECAR 및 OCR을 측정하기 위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 마우스 혈통 음성 HSPC를 분리하는 접근법을 설명하고, 세포외 플럭스 분석에 사용되는 다양한 약물의 세포 시딩 밀도 및 농도의 최적화를 설명하고, 약물 치료 전략을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>0.2 &무; m 필터</td><td>Corning</td><td>430626</td> 분석 매체 100mM 피루브산 나트륨을 <td>여과-멸균하는 데 사용됨</td></tr><tr><td></td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td>미토콘드리아 스트레스 테스트 분석 매체의 구성 요소</td></tr><tr><td>15mL 원뿔형 팔콘 튜브</td><td>Corning</td><td>352096</td><td>HSPC 수확 및 분석 약물 용액 준비 중에 사용</td></tr><tr><td>200mM L-글루타민</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>해당과정 스트레스 테스트 및 미토콘드리아 스트레스 테스트의 구성 요소 분석 매체</td></tr><tr><td>2-Deoxy-D-glucose (2-DG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8375</td><td>해당과정 스트레스 테스트 중 3차 약물 주입</td></tr><tr><td>5x 농축 완충액(MojoSort)</td><td>Biolegend</td><td>480017</td><td>HSPC 수확 중 세척에 사용</td></tr><tr><td>염화암모늄(NH4Cl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A661-3</td><td>ACK 용해 구성 요소 완충액</td></tr><tr><td>Antimycin A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td>미토콘드리아 스트레스 테스트 중 3차 약물 주입</td></tr><tr><td>Bio-Rad DC 단백질 분석 키트</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0112</td><td>제조업체의 지침에 따라 사용</td></tr><tr><td>카르보닐 시안화물-4(트리플루오로메톡시) 페닐히드라존(FCCP)</td><td>시그마-알드리치</td><td>C2920</td><td>미토콘드리아 스트레스 테스트 중 2차 약물 주입</td></tr><tr><td>Cell-Tak</td><td>Corning</td><td>354240</td><td>셀 접착제. 세포 마이크로 플레이트 백</td></tr>작 <tr><td>3 자동 세포 계수기</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>세포 계수</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>O2793-500</td><td>ACK 용해 완충액 및 RIPA 용해 완충액의 구성 요소</td></tr><tr><td>Falcon 70 &mu 코팅에 사용됩니다. m 필터</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td>HSPC 수확 중 세포 여과기로 사용</td></tr><tr><td>Gibco Fetal bovine serum(FBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>26400044</td><td>HSPC 수확 중 분석 완충액을 준비하는 데 사용</td></tr><tr><td>Gibco HBSS</td><td>Fisher Scientific</td><td>14175095</td><td>HSPC 수확 중 분석 완충액을 준비하는 데 사용</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td>미토콘드리아 스트레스 테스트 분석 배지 및 해당과정 스트레스 테스트의 첫 번째 주입</td></tr><tr><td>올리고마이신</td><td>시그마-알드리치</td><td>O4876</td><td>해당과정 스트레스 테스트 중 2차 약물 주입 및 미토콘드리아 스트레스 테스트 중 1차 약물 주입</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-049</td><td>단백질 정량화를 위한 분석 후 세포를 세척하는 데 사용</td></tr><tr><td>중탄산칼륨(KHCO3)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P235-500</td><td>ACK 용해 완충액</td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail(PIC)</td>의 구성 요소<td>Roche</td><td>11836170001</td><td>정제로 공급됩니다. 1정을 10mL의 RIPA 완충액에 용해시켜 1x PIC를 만들었습니다.</td></tr><tr><td>Rat biotin antimouse-B220, 클론 ID: RA3-6B2</td><td>Biolegend</td><td>103203</td><td>HSPCs 수확 중 계통 고갈에 사용됨</td></tr><tr><td>Rat biotin antimouse-CD2, 클론 ID: RM2-5</td><td>Biolegend</td><td>100103</td><td>HSPCs 수확 중 혈통 고갈에 사용됨</td></tr><tr><td>Rat biotin antimouse-CD3, 클론 ID: 17A2</td><td>Biolegend</td><td>100243</td><td>HSPCs 수확 중 혈통 고갈에 사용됨</td></tr><tr><td>Rat biotin antimouse-CD5, Clone ID: 53-7.3</td><td>Biolegend</td><td>100603</td><td>HSPCs harvest rat</td></tr><tr><td>biotin antimouse-CD8, Clone ID: 53-6.7</td><td>Biolegend</td><td>100703</td><td>HSPCs harvest while lineage depleation during HSPCs harvest Rat</td></tr><tr><td>biotin antimouse-Gr-1, Clone ID: RB6-8C5</td><td>Biolegend</td><td>108403</td><td>HSPCs harvest during lineage depleation during HSPCs Rat</td></tr><tr><td>biotin antimouse-Ter-119, Clone ID: TER-119</td><td>Biolegend</td><td>116203</td><td>HSPC 수확 중 혈통 고갈에 사용</td></tr>: <tr><td>Rotenone</td><td>, Sigma-Aldrich,</td><td>R8875</td>, <td>미토콘드리아 스트레스 테스트 중 3차 약물 주입</td></tr>, <tr><td>Seahorse XFe96, 세포외 플럭스 분석기</td>, <td>Seahorse Biosciences, 이제 Agilent</td><td></td>, <td>ECAR 및 OCR 실시간 측정용.</td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>마이크로플레이트 코팅용 셀 접착 용액을 만드는 데 사용</td></tr><tr><td>염화나트륨(NaCl)</td><td>Fisher</td><td>BP358</td><td>RIPA 용해 완충액의 구성 요소</td></tr><tr><td>데옥시콜산나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>D6750</td><td>RIPA 용해 완충액의 구성</td></tr><tr><td>요소 불화나트륨(NaF)</td><td>시그마-알드리치</td><td>S7920</td><td>RIPA 용해 완충액의 구성 요소</td></tr><tr><td>수산화 나트륨 (NaOH)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td>는 <td>1 N 용액을 준비했습니다. pH 정규화에 사용</td></tr><tr><td>Streptavidin Nanobeads (MojoSort)</td> <td>Biolegend</td><td>480015</td><td>HSPCs 수확 중 혈통 고갈에 사용</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher</td><td>BP153</td><td>RIPA 용해 완충액의 구성 요소</td></tr><tr><td>XF 염기 배지</td><td>Agilent</td><td>102353-100</td><td>염기 배지 해당작용 스트레스 테스트 및 미토콘드리아 스트레스 테스트 분석 매체</td></tr><tr><td>XF 준비 스테이션</td><td>Seahorse 비</td> CO에 사용되는 생명 과학<td></td><td>2 37 &deg; C incubations</td></tr><tr><td>XFe96 extracellular FluxPak</td><td>Agilent</td><td>102416-100 또는 102601-100</td><td>유틸리티 플레이트가 있는 어세이 카트리지, 어세이 카트리지에 약물 로딩을 위한 로딩 가이드 플랫, XF 캘리브란트 용액 및 XF 세포 배양 마이크로플레이트가 포함되어</td></tr></tbody></table> 있습니다.

세포외 플럭스 분석기를 사용한 마우스 조혈 줄기 및 원시 전구 세포의 세포 생체 에너지 평가

Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer

정상 상태에서 조혈 줄기 세포 (HSCs)는 크게 정지 상태로 유지되며 에너지 요구를 충족시키기 위해 주로 당분해에 의존하는 것으로 여겨집니다. 그러나 감염이나 혈액 손실과 같은 스트레스 조건 하에서, HSC는 증식 성이되어 하류 전구 세포를 빠르게 생산하여 차례로 분화되어 궁극적으로 성숙한 혈액 세포를 생산합니다. 이 전이 및 분화 과정 동안 HSC는 정지에서 빠져 나와 글리코 분해에서 산화 인산화 (OxPHOS)로 대사 전환을 빠르게 겪습니다. 노화, 암, 당뇨병 및 비만과 같은 다양한 스트레스 상태는 미토콘드리아 기능에 부정적인 영향을 미칠 수 있으므로 조혈 중 HSC 및 선조의 대사 재 프로그래밍 및 분화를 변화시킬 수 있습니다. 정상 및 스트레스 조건 하에서 HSC와 선조의 글리콜 및 미토콘드리아 기능에 대한 귀중한 통찰력은 각각 세포 당 분해 및 미토콘드리아 호흡의 지표 인 세포 외 산성화 속도 (ECAR) 및 산소 소비율 (OCR)의 평가를 통해 얻을 수 있습니다. 
여기서, 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 조혈 줄기 및 원시전구 세포(HSPCs)를 모두 포함하는 마우스 골수 유래 혈통-음성 세포 집단에서 ECAR 및 OCR을 측정하기 위한 상세한 프로토콜이 제공된다. 이 프로토콜은 마우스 골수로부터 혈통 음성 세포를 분리하는 접근법을 설명하고, 세포 시딩 밀도 및 2-데옥시-D-글루코오스(2-DG, 당분해를 억제하는 글루코스 유사체) 및 이러한 분석에 사용되는 다양한 OxPHOS 표적 약물(올리고마이신, FCCP, 로테논 및 안티마이신 A)의 농도 최적화를 설명하고, 약물 치료 전략을 설명합니다. 당분해, 글리콜 용량 및 글리콜 보유량과 같은 글리콜 플럭스의 주요 파라미터, 및 OxPHOS 파라미터, 예컨대 기저 호흡, 최대 호흡, 양성자 누출, ATP 생산, 예비 호흡 용량 및 커플링 효율은 이들 분석에서 측정될 수 있다. 이 프로토콜은 비부착성 HSPC에 대한 ECAR 및 OCR 측정을 허용하며 모든 유형의 현탁액 셀에 대한 분석 조건을 최적화하도록 일반화할 수 있습니다.

이 프로토콜을 사용하여, 다양한 OxPHOS 표적 약물의 세포 수 및 농도(세포외 플럭스 분석에 사용됨)를 최적화하여 24주령의 암컷 C57BL/6 마우스로부터 분리된 HSPC의 ECAR 및 OCR을 측정하였다. 먼저, 세포 수 및 올리고마이신 농도를 최적화하기 위해 당분해 스트레스 시험을 수행하였다. 웰당 5 내지 104 내지 2.5 × 10,5 범위의 다양한 수의 HSPCs가 이 검정× 사용되었다. 도 2A 및 도 2C에 나타난 바와 같이, 비글리콜성 산성화 속도는 세포 수가 5 내지 10 내지 4에서 2.5 × 10 5로 증가×면서 상승하지만, 2 내지 10 5 내지 5 × 10 5내지 2.5 사이×만 최소한으로증가한다. 예상대로, 10 mM 글루코스의 주사는 모든 세포 수에서 당분해를 자극하며, EC...

여기에 제시된 방법은 HSPC의 세포외 산성화 속도 (ECAR) 및 산소 소비 속도 (OCR)를 실시간으로 측정하기 위해 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 비 부착성 마우스 조혈 줄기 및 원시 전구 세포 (HSPCs)에서 세포 생물 에너지를 평가하기위한 최적화 된 프로토콜을 요약합니다.

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their ...

조혈 동안, 조혈 줄기 세포는 글리코 분해에서 산화 인산화로 대사 전환을 겪습니다. 이 프로토콜은 마우스 조혈 줄기 및 전구 세포의 글리콜 및 미토콘드리아 기능을 평가하는데 사용될 수 있다. 이 방법은 실시간으로 세포 생물 에너지를 평가하는 데 사용할 수 있습니다.96웰 마이크로플레이트 기반 플랫폼은 고감도로 높은 처리량 정량화를 제공하므로 단일 플레이트를 사용하여 여러 샘플을 동시에 분석할 수 있습니다. 이 기술은 다양한 조건에서 HSC 대사에 대한 화학 물질 또는 유전자 조작의 영향을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. HSC 다능성을 유지하는 대사 경로를 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다.현재의 연구는 주로 마우스 조혈 줄기 및 전구 세포에 초점을 맞추고 있지만, 프로토콜 및이 접근법은 모든 유형의 현탁액 세포에 대한 분석 조건을 최적화하기 위해 쉽게 적응 될 수 있습니다. 분석 하루 전, 세포외 플럭스 분석 키트를 열어 센서 카트리지 및 유틸리티 플레이트 어셈블리를 제거합니다. 다음날 사용할 수 있도록 로딩 가이드 플랫을 저장하십시오.이제 센서 카트리지를 유틸리티 플레이트에서 수동으로 분리하고 유틸리티 플레이트 옆에 거꾸로 놓습니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 플럭스 분석 키트에 포함된 200마이크로리터의 교정제로 유틸리티 플레이트의 각 웰을 채운 다음 센서 카트리지를 다시 유틸리티 플레이트에 올려 놓고 캘리브란트의 센서를 완전히 잠급니다. 그런 다음 교정제로 유틸리티 플레이트를 인큐베이션하고 원고에 언급 된 가습 조건에 따라 밤새 섭씨 37도의 비 이산화탄소 인큐베이터에서 센서 카트리지를 조립하십시오.분석의 날에 텍스트 원고에 기재된 바와 같이 96-웰 세포 배양 마이크로플레이트 당 2.5 밀리리터의 세포 접착 용액을 준비한다. 플럭스 분석 키트에 포함된 96-웰 세포 배양 마이크로플레이트를 열고 준비된 세포 접착 용액 25 마이크로리터를 각 웰의 바닥에 분주한다. 마이크로플레이트를 뚜껑으로 덮고 후드 내부의 실온에서 30분 동안 인큐베이션한다.배양 후, 다채널 피펫 또는 흡인기기를 사용하여 과량의 세포 접착 용액을 제거하고 버리고 200 마이크로리터의 멸균 초순수로 각 웰을 두 번 세척한다. 후드 내부의 뚜껑없이 플레이트를 30 ~ 45 분 동안 공기로 건조시킵니다. 제조된 마우스 계보 음성 HSPCs를 실온에서 5분 동안 200배 G에서 원심분리한다.상청액을 폐기한 후, 세포 펠릿을 적절한 분석 배지에 재현탁시키고, 세포 현탁액을 다시 원심분리한다. 이 과정을 한 번 더 반복하고, 세포를 적절한 가온된 분석 배지에서 50 마이크로리터 당 250, 000 세포 또는 밀리리터 당 오백만 세포의 농도로 재현탁시킨다. 다채널 피펫을 사용하여 세포 접착제가 코팅된 96-웰 세포 배양 마이크로플레이트의 각 웰의 측면을 따라 50 마이크로리터의 세포 현탁액을 첨가한 다음, 50 마이크로리터의 분석 배지를 코너 배경 측정 웰에 첨가한다.코팅되지 않은 96-웰 세포 배양 마이크로플레이트의 웰 당 50 마이크로리터의 물을 첨가하여 원심분리 밸런스 플레이트를 생성한다. 세포를 실온에서 1분 동안 200배 G에서 원심분리한다. 플레이트를 세포 부착을 위해 섭씨 37도의 이산화탄소 인큐베이터에서 25 내지 30분 동안 인큐베이션한다.30분 후, 현미경으로 세포가 마이크로플레이트 표면에 안정적으로 부착되어 있는지 육안으로 확인한다. 텍스트 원고에 언급된 바와 같이 미리 가온된 당분해 스트레스 시험 분석 배지에서 필요한 모든 용액을 준비함으로써 시작하고 수화된 센서 카트리지를 인큐베이터로부터 제거한다. 센서 카트리지를 교정기에서 들어올려 동일한 유틸리티 플레이트에 있는 교정기로 교체하여 기포를 제거합니다.80개의 로딩 가이드를 센서 카트리지 상단에 평평하게 놓고 문자 A가 왼쪽 위 모서리에 위치하도록 방향을 지정합니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 포트 A에 20 마이크로 리터의 100 밀리몰 포도당 용액을 분배하십시오.80 로딩 가이드 플랫을 BC 로딩 가이드 플랫으로 교체하고 문자 B를 왼쪽 상단 모서리에 맞 춥니 다. 22 마이크로리터의 20 마이크로몰 올리고마이신 용액을 포트 B.Reorient BC 로딩 가이드 플랫에 재배치하여 로딩 포트 C의 왼쪽 상단 모서리에 글자 C를 찾고 포트 C에 500 밀리몰 2-데옥시-d-글루코스 용액 25 마이크로리터를 분배한 다음 로딩 가이드 플랫을 제거하고 버립니다.이제 컨트롤러에서 글리코 분해 스트레스 테스트를위한 템플릿을 만들거나 로드하십시오. 주사 전략, 치료 조건 및 세포 유형에 대한 세부 정보를 입력하고 그룹 생성을 누릅니다. 플레이트 맵으로 이동하여 분석할 각 그룹에 웰을 할당합니다.프로토콜에서 초기화 단계에서 교정 및 평형화가 검사되었는지 확인하십시오. 각 주입 후 기준선 측정 및 측정의 경우 측정 주기 수를 세 개로 설정하고 혼합, 대기, 측정 시간을 세 분, 0분, 세 분으로 설정합니다. 소프트웨어에서 실행 시작을 클릭합니다.적재되고 수화된 센서 카트리지에서 뚜껑을 꺼내 세포외 플럭스 분석기의 작업 트레이에 놓습니다. 교정 실행을 시작합니다. 시딩된 세포를 포함하는 마이크로플레이트를 인큐베이터로부터 꺼내십시오.세포를 교란시키지 않고, 웰 당 130 마이크로리터의 미리 가온된 글리코분해 스트레스 시험 분석 배지를 천천히 첨가하여 각 웰의 배지 부피를 180 마이크로리터로 구성하고, 플레이트를 추가로 15 내지 20분 동안 인큐베이터로 복귀시킨다. 소프트웨어에서 트레이 열기를 클릭하여 Seahorse의 열 트레이를 엽니 다. 교정이 끝난 후 유틸리티 플레이트를 세포가 포함된 이 분석 마이크로플레이트로 교체하고 로드 셀 플레이트를 눌러 측정을 시작합니다.측정이 끝난 후, 세포를 방해하지 않고 플레이트로부터 분석 배지를 제거하고, 세포를 분해하지 않고 250 마이크로리터의 인산염 완충 식염수로 부드럽게 세척한다. 이제 1X 프로테아제 억제제 칵테일로 보충 된 10 마이크로 리터의 방사성 면역 침전 용해 완충액을 각 웰에 첨가하고 플레이트를 진탕기에서 10 분 동안 교반하십시오. 전체 접시를 영하 80도에서 얼립니다.플레이트를 해동하고 제조업체의 지시에 따라 데이터 정규화를 위한 단백질 측정 분석을 수행합니다. Wave 데스크탑 소프트웨어를 사용하여 데이터 파일을 열어 데이터를 검색하고 분석합니다. 정규화를 클릭하고 각 웰의 정규화 값을 붙여 넣은 다음 적용을 클릭하여 데이터를 정규화하십시오.내보내기를 클릭하고 당분해 스트레스 테스트 보고서 생성기를 선택하여 분석된 데이터를 보고서 생성기로 내보냅니다. 비글리콜성 산성화율은 세포 수가 50, 000에서 250, 000으로 증가하면서 상승하지만, 200, 000에서 250, 000 사이에서만 최소한으로 증가한다. 10 밀리몰 글루코스의 주입은 웰 당 250, 000 세포에서 관찰되는 ECAR의 최대 증가와 함께 모든 세포 수에서 당분해를 자극합니다.그러나, 올리고마이신의 두 마이크로몰의 주입은 ECAR을 더 증가시키지 않는다. 동일한 글리코분해 스트레스 테스트 세트에서 얻어진 OCR 데이터는 복합 5 억제로 인한 올리고마이신 주사 후 유의한 감소를 보여준다. 글리코분해 스트레스 테스트 파라미터를 계산하고, 추가 연구를 위해 올리고마이신의 두 마이크로몰에서 웰당 250, 000개의 세포를 선택하였다.미토콘드리아 스트레스 테스트는 두 마이크로몰 올리고마이신 주사가 콤플렉스 5의 억제를 통해 OCR의 현저한 감소를 야기한다는 것을 보여주었다. FCCP는 두 마이크로몰에서 관찰되는 최대 증가로 용량 의존적 방식으로 HSPCs의 OCR을 자극한다. 0.5 마이크로몰 로테논과 0.5 마이크로몰 안티마이신 A 주사의 혼합물은 OCR을 비미토콘드리아 산소 소비에 상응하는 최소 수준으로 감소시킨다.미토콘드리아 스트레스 테스트 파라미터를 계산하고 추가 연구를 위해 FCCP의 두 마이크로몰을 선택하였다. 이 기술의 높은 처리량 특성을 감안할 때, 여기에 기술된 프로토콜은 조혈 줄기 세포, 조혈 전구 인자 및 악성 조혈 세포에서 많은 수의 생물에너지 조절제를 스크리닝하도록 쉽게 적응될 수 있다. 해마 분석은 다양한 기질 및 억제제의 존재하에 다양한 맥락에서 신진 대사를 측정하기 위해 문헌에서 널리 사용됩니다.

assessment-cellular-bioenergetics-mouse-hematopoietic-stem-primitive

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 프로토콜은 세포외 플럭스 분석을 통해 1차 백혈병 세포의 세포외 산성화율(ECAR) 및 산소 소비율(OCR)을 측정하기 위한 생화학적 접근 방식을 제공합니다. 이러한 세포의 대사 프로파일에 대한 평가는 세포의 요구를 특성화하는 데 도움이 되어 맞춤형 치료로 이어집니다.

Extracellular Flux Assay: 세포의 대사 프로파일을 측정하는 방법

이 동영상은 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 활성화된 인간 NK 세포의 에너지 대사를 분석하는 방법을 보여줍니다. 전자 전달 사슬 복합체의 다양한 억제제는 산소 소비율 또는 OCR을 통해 측정되는 ATP 합성에 영향을 미치며 세포 대사 및 생체 에너지학에 대한 통찰력을 제공합니다.

세포외 플럭스 분석기를 사용한 인간 NK 세포의 에너지 대사 실시간 모니터링

대사 재프로그래밍은 M1 및 M2 대식세포 분극의 특성이자 전제 조건입니다. 이 원고는 마우스 골수 유래 대식세포에서 해당작용 및 미토콘드리아 기능의 기본 매개변수를 측정하기 위한 분석을 설명합니다. 이 도구는 특정 요인이 대식세포의 대사와 표현형에 어떤 영향을 미치는지 조사하는 데 적용할 수 있습니다.

실시간 세포 외 유출 분석을 사용하여 편광 M1과 M2 골수 유래 대 식세포의 대사 특성

이 프로토콜에는 분리 하 고 마우스 기본 신장 관 세포 이후에 하위 신장 생물학 기능 비보 전, 미토 콘 드리 아 생체를 포함 하 여 평가 양식 수 있는 특성화 하는 비용 효율적인 접근 방식을 제공 합니다.

마우스 기본 신장 관 상피 세포의 고립, 특성, 및 높은 처리량 세포 외 유출 분석

여기 선물이 leukemic 세포 백혈병 환자 골 수에서 격리 및 그들의 대사 상태 분석을 위한 프로토콜. 기본 백혈병 세포의 신진 대사 프로필의 평가 1 차 셀의 수요 특성을 더 나은 하는 데 도움이 수 그리고 더 맞춤된 의학까지 이어질 수 있습니다.

기본 백혈병 세포의 신진 대사 프로필의 평가

이 기술은 산소 소비와 세포 외 산성화 속도 explanted 마우스 망막 조직 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 실시간으로 녹음을 설명 합니다.

Explanted 망막 조직 세포 외 유출 분석을 사용 하 여 신진 대사 에너지의 측정

이 프로토콜의 목표는 어떻게 다양 한 요인에에서 산소 소비를 변경할 수 있습니다 검사 마우스 신생아 cardiomyocytes 모델 시스템으로 사용 하는 방법을 보여 줍니다.

세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 기본 교양된 마우스 신생아 Cardiomyocytes에 산소 소비 속도 분석

조혈 줄기 전구 세포 (HSPC) 혈액 형성 동안 그들의 신진 대사 가소성으로 인해 분화 상태로 정지 상태에서 전환. 여기에서는 HSPC의 미토콘드리아 호흡 및 당화 분석을 측정하기 위한 최적화된 방법을 제시합니다.

조혈 줄기 선조 세포 대사 분석

실시간 세포 대사 플럭스 분석은 pH 및 산소 센서를 사용하여 미토콘드리아 및 글리콜 아데노신 삼인산염 생산에 해당하는 산소 소모율 및 세포외 산성화 속도를 측정합니다. 원고는 조골 세포의 에너지 상태와 세포 생물 에너지 상태의 특성화 및 해석을 이해하는 방법을 설명합니다.

실시간 세포 대사 플럭스 분석기를 사용하여 조골세포 생물에너지 모니터링

대사 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 마우스와 인간 호중구 및 HL60 세포의 미토콘드리아 호흡을 측정하는 단계적 프로토콜을 설명합니다.

호중구의 미토콘드리아 생물에너지 프로파일의 실시간 측정

여기에서는 골수, 비장 및 경색된 심장에서 대식세포를 추출하고 이후에 살아있는 세포의 대사 플럭스를 평가하는 방법을 자세히 설명합니다.

비장 및 심장 대식세포와 골수 단핵구의 생체 외 대사 플럭스 분석

배우세요 세포외 플럭스 분석기를 사용한 마우스 조혈 줄기 및 원시 전구 세포의 실시간 세포 생체 에너지 평가 방법입니다. 이 고감도 고처리량 기술로 당분해 및 미토콘드리아 기능을 정량화하여 줄기세포 다능성 유지에 필수적인 대사 경로를 규명할 수 있습니다.

세포외 플럭스 분석기를 사용한 마우스 조혈 줄기 및 원시 전구 세포의 세포 생체 에너지 평가

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