Name: 박테리아 스크리닝, 선택 및 격리를 위한 광분해성 하이드로겔 인터페이스 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: 배우세요 광분해성 하이드로겔을 이용한 박테리아 세포의 신속한 격리 및 스크리닝 방법을. 이 기술은 복잡한 미생물 군집에서 특정 세포를 선택적으로 추출하여 유전체 분석을 가능하게 합니다.

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이 연구는 NSF 커리어 어워드 #1944791 의해 지원되었습니다.

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RRH와 AJV는 이 기술에 대한 특허를 출원했습니다. 나머지 저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

이 원고는 박테리아 스크리닝 및 격리를 위해 광분해성 하이드로겔의 사용을 보여줍니다. 재료와 접근 방식은 높은 처리량 배양, 성장 미디어 및 성장 조건을 제어하며 간단하고 비용 효율적인 방식으로 깨끗하고 정확한 세포 추출을 가능하게 합니다. 추출은 패턴 조명 도구와 결합된 형광 현미경만 필요하며 여러 세포 표적을 격리하기 위해 순차적으로 수행할 수 있습니다. 각 추출은 수행하는 데 5-10 분이 걸리며 단일 하이드로겔에서 최대 30 개의 표적 식민지가 제거되었습니다. 이 접근법의 주요 장점은 벌크 하이드로겔과 마이크로웰 어레이 모두에서 스크리닝하여 입증된 바와 같이 다양한 분석 형식에 대한 적응성입니다. 두 형식의 분리 과정은 배양 및 현미경 관찰 후 하류 유전자 형에 대한 고유 한 성장 거동을 표시하는 박테리아를 분리하는 데 성공적으로 사용되어 왔으며 세포 유전자형을 표현형에 연결하는 중요한 기능입니다. 현재까지 이러한 인터페이스에서 추출된 박테리아의 게놈 특성화에는 16S 앰플리코 시퀀싱이 포함되어 있으며, 응급 성장거동을생성하는 환경 미생물군유전체에서 박테리아의 다종 수집을 식별하고, 전체 게놈 시퀀싱을 통해 돌연변이 라이브러리19내에 존재하는 세포에서 희귀 한 성장 프로파일을 유발하는 유전 적 돌연변이를 성공적으로 식별합니다.
세포 스크리닝 및 격리를 위해 대량 하이드로겔을 사용하는 것은 가장 간단하고 간단한 형식입니다. 대량 광분해성 하이드로겔은 투명 유리 커버립위에 전구체를 혼합한 후 표준 직립 또는 반전형 형광 현미경으로 이미지된 3D 세포 배양 매트릭스에서 세포를 캡슐화한 후 빠르게 형성(25분) 형성된다. 따라서, 이 방법은 미량 제조 자원이나 전문 지식이 없는 일반적인 미생물학 실험실에 번역될 가능성이 있다. 이 형식의 단점은 세포가 3차원 하이드로겔 전체에 걸쳐 무작위로 지향된다는 것입니다. 따라서 세포는 배율 목표와 함께 이미징할 때 초점 평면에서 나타날 수 있으며 세포 식민지가 서로 너무 가깝게 향하거나 식민지의 수직 오버레이가 있는 경우 추출이 어려울 수 있습니다. 설명된 대로 얇은 하이드로겔(<13 μm)을 증착하는 것은 이 단점을 완화하는 데 매우 중요합니다. 깨진 크로스 라이트패턴(도 4B)에노출되는 것이 바람직하며, 이러한 패턴은 UV 광에 노출이 최소화되고 도금을 통해 쉽게 회수할 수 있는 하이드로겔이 없는 세포로 인해 바람직하다.
대조적으로, 마이크로웰 어레이 포맷은 박테리아 세포가 작은 배양 또는 공동 배양 사이트로 봉사하는 이산 마이크로웰로 분할되기 때문에 보다 잘 제어된 인터페이스를제공한다(17,18,26). 마이크로웰 치수, 피치 및 밀도는 표준 포토리소그래피 기술을 사용하여 정밀하게 제작됩니다. 대량 하이드로겔에 비해, 박테리아는 하이드로겔 전체에 무작위로 분산되지 않고 미리 정의된 위치에만 존재하기 때문에 특이성이 높고 교차 오염 가능성이 낮은 마이크로웰 어레이에서 추출될 수 있습니다. 종자용에서 박테리아 세포의 농도 및 비율은 또한 이전보고(26)에서특징화된 종자 과정을 통해 마이크로웰 접종의 양과 조성을 제어하기 위해 다양할 수 있으며, 이는 사용자가 화면의 실험 설계에 유연성을 부여한다. 마이크로웰 어레이 형식으로 선별의 주요 단점은 미세 제조에 필요한 추가 시간과 전문 지식입니다. 마이크로웰의 제조비용은 자재 비용과 클린룸 비용을 포함하는 어레이당 ~$10의 비용으로 추정되었습니다. 또한, 마이크로웰 어레이는 전통적으로 실리콘으로 만들어지며, 기판이 투명하지 않으므로 이미징 문제를 일으킬 수 있습니다. 더욱이, 실리콘 표면으로부터 산란하는 광의 양이 많으며 마이크로웰 내의 이미징을 제한할 수 있으며 패턴 조명 도구(도8A,B에서볼 수 있음)로부터 UV 광으로 하이드로겔 노출 시 패턴 분해능을 감소시킬 수 있다. 유사한 마이크로웰은 이러한 유형의 제한 사항을 해결하기 위해 투명 석영 기판에서제조되었습니다(27). 그러나,이 제조는 상당히 더 어렵다. 우물의 둘레를 비추는 링 패턴에 노출되면 UV 노출을 최소화하면서 우물에서 자유 세포를 방출하는 것이 바람직하다.
어느 형식에서 발생하는 가장 일반적인 문제는 하이드로겔 부종으로 인해 배양 중에 기본 기판에서 하이드로겔을 분리하는 것입니다. 이것이 대량 하이드로겔에 대한 문제인 경우, 염기 유리 커버슬립의 표면을 가로지르는 화학물질(MTPS) 부착층에서 티올 군의 존재, 밀도 및 균일성을 적절한 표면 특성화 기술(XPS, ATR-FTIR, AFM 등)을 이용하여 검증되어야 한다. 비효율적인 표면 기능화로 인해 표면 티올 그룹의 밀도가 낮기 때문에 기판과 하이드로겔 간의 약한 상호 작용으로 이어질 수 있다. 낮은 수준의 표면 티올화가 발생하면 MTPS 솔루션의 안정성을 확인해야 합니다. MTPS 처리 전에 깨끗한 표면을 보장하기 위하여 유리 슬라이드의 초기 청소에서 주의해야 하고, MTPS 표면 반응 도중 무수성 톨루엔의 사용을 보장하기 위하여 주의해야 합니다 (프로토콜 섹션 4). 마이크로웰 어레이의 경우, 표면은 티오레이트되지 않으며, 하이드로겔은 대신 하이드로겔과 우물의 부분 충전을 통해 부착되며, 이는 하이드로겔을 실리콘기판(17)에고정시한다. 하이드로겔 분리가 이 시스템에서 문제가 되는 경우, 더 많은 마이크로웰 또는 다른 마이크로스케일 특징을 어레이에 새겨 더 강한 부착을 촉진하기 위해 기판에 하이드로겔을 더 고정시킬 수 있다.
어느 형식의 기술의 제한은 박테리아가 있는 하이드로겔의 제한된 안정성이다. A. tumefaciens와같은 일부 박테리아는 실험 시간을 제한하는 5-7 일17,19의과정을 통해 하이드로겔을 저하시킬 수 있다는 점에 주목되었습니다. 세균성 분해 의 기계장치에 대한 현재의 조사가 진행중입니다. 다른시스템에서언급된 바와 같이, 디아크릴레이트 단량체로부터 존재하는 에스테르 단은 박테리아 매개 가수분해 및/또는 효소 분해의 대상이 된다는 가설이다. 보다 안정적인 하이드로겔 화학을 개발하면 박테리아가 하이드로겔에 남아 있을 수 있는 시간이 연장되고 성장 속도가 느린 미생물로 화면을 확장할 것입니다. 두 번째 제한은 두 가지 형식 모두에서 세포 회수 및 추출이 열린 환경에서 발생하여 외부 오염에 취약할 수 있는 비교적 높은 추출 량(30-100 μL)이 발생한다는 것입니다. 따라서 추출 용액 볼륨을 최소화하면서 대상 식민지로부터 충분한 세포가 존재하도록 주의를 기울여야 합니다. 도금 및 회수 또는 DNA 물질의 추출을 위해 충분한 세포를 얻으려면 벌크 하이드로겔에서 세포가 적어도 10 μm의 식민지 직경에 도달할 만큼 충분히 배양되어야 한다는 것이 관찰되었습니다. 세포 추출에 필요한 부피를 낮추기 위해, 마이크로리터 주사기 및 튜브(도 2)를 사용하는 것이 파이펫팅보다 더 효율적이라는 것을 관찰하였다. 튜브를 통해 분리를 릴리스 지점에서 보다 정확하게 그려서 용액 량이 줄어들고 오염 가능성을 낮출 수 있었습니다.
향후 작업은 이러한 하이드로겔의 기계적 특징이 다양한분자량(28)의적절한 PEG 기반 단조량 전구체 의 선택에 의해 잘 제어되고 기계적 상호 작용이 박테리아행동(29)에서중요한 역할을 하기 때문에 하이드로겔 기계적 특성이 세포 성장에 미치는 영향을 이해하는 것을 포함한다. 하이드로겔 소재를 다양한 시스템 및 장치에 쉽게 통합할 수 있기 때문에, 이 물질을 미세유체 시스템에 통합하는 데에도 중점을 둔다. 이렇게 하면 현재 오픈 컬렉션 형식에 필요한 기존의 30-100 μL 볼륨과 비교하여 펨톨리터에서 피콜리터 볼륨까지 추출 용액이 줄어듭니다. 용액 량이 작으면 잠재적오염을 크게 줄이고 단일 셀 격리 및 특성화로 접근 방식을 이동합니다.

복잡하고 이기종 환경에서 독특한 행동을 가진 세포의 격리는 생물학1에서유전 정보를 얻기위한 기본이다. 미생물학에서는 관찰 후 희귀하거나 독특한 미생물의 선택과 격리가 게놈 정보와 관찰 가능한 현상 정보 사이의 연결을 필요로하는 많은 응용 분야에서 중요해집니다. 이러한 응용 분야에는 돌연변이 라이브러리2에서페노전형 희귀 균주를 선택하고, 복잡한 미생물 커뮤니티3,4에서키스톤 미생물을 선택하고, 동종 포집단으로부터 희귀하지만 중요한 박테리아를 선택하는 것이 포함된다. 박테리아 집단으로부터 생존 가능하지만 비과성 세포(VBNC)의 격리는 VBNC 표현형을 가진 세포가 종종 1:102 에서 1:105 비55의박테리아 집단에 숨겨져 있는 후자의 중요한예입니다. 박테리아 격리에 있는 광범위 한 어려움으로 인해, 많은 페노 전형적으로 희귀 한 미생물에 대 한 알 수 없는 남아. 이러한 제한은 먼저 혼합물에서 표적 세포 또는 세포를 식별한 다음 다운스트림 분자 분석7을위해 이를 검색및 격리하는 세포 격리 기술의 필요성을 강조한다.
세포 격리의 가장 일반적으로 확립된 방법 중 일부는 유혈 세포 측정 및 형광 활성 세포 분류(FACS)8,면역자기 분리9,10및 미세유체(11)를포함한다. 이러한 격리 메서드는 값이 높지만 사용을 제한하는 단점도 있습니다. 예를 들어, FACS는 후속 게놈 분석3에 대한 단일 세포 수준에서 일상적인 미생물 격리를 제공할 수 있지만, 종종 다운스트림 오염문제(11)뿐만아니라 가용성 및 비용에 의해 제한됩니다. 미세유체 유체 계세포측정과 같은 미세유체 기반 접근법은 많은 관심을 얻었으며, 이는 종래의 유동 세포측정에 비해 필요한 샘플부피(12)의현저한 감소를 허용한다. 그러나, 미세유체 장치에서 개별 또는 작은 셀 수집의 분리 및 회수는 일반적으로 보다 복잡한 설정 및 장치설계(13)를요구하는 어려운 문제이다. 많은 미세 유체 기반 접근법은 기능성 화면을 수행할 때 관찰된 독특한 종의 수를 제한하는장치(14)에서입력및 관찰되기 전에 유전적으로 세포를 특성화한다. 이러한 한계를 감안할 때, 많은 실험실에서 광범위하게 사용하기 위해서는 세포 선별 및 격리에 실용적인 방법과 재료의 추가 혁신이 필요합니다.
이 논문은 박테리아 스크리닝 및 격리를 위한 새로운 재료 기반 접근법을 제시합니다. 이 방법은 세포 캡슐화, 배양, 미세 관찰, 고유한 표현형을 가진 표적 박테리아의 온디맨드 방출 및 회복을 위해 광분해성 하이드로겔을 사용합니다. 하이드로겔은 10nm 메쉬 크기를 포함하도록 설계되었으며, 각 크로스링크에는 o-니트로벤질그룹(15)이포함되어 있습니다. 이 물질은 관찰을 위해 세포를 캡슐화하거나 트랩하는 동시에 배양을 위해 세포에서 영양분과 폐기물을 확산시킬 수 있게 합니다. 직립 현미경을 통해 패턴365 nm UV 광원에 물질을 노출하면 o-니트로벤질 그룹 16,17의광분열을 통해 하이드로겔의 국소 분해를 가능하게 한다. 분해는 유전체학 및 잠재적으로 프로테오믹 및 전사 분석을 포함하여 다운스트림 분석을 위한 회복을 위한 세포의 선택적 방출을 유발합니다. 실험 적인 설치 및 프로토콜은 상대적으로 간단, 저렴 한, 그리고 미생물학 실험실에 번역. 하이드로겔 형성, 수직 밝은 필드 및 형광 현미경을 가진 포획 된 세포의 관찰, 검색을위한 패턴 UV 광원으로 관심있는 세포의 조명을 통해 세포 캡슐화만 필요합니다.
이 재료 기반 검진 방식의 주요 장점은 다양한 스크리닝 형식에 대한 적응성입니다. 가장 기본적인 형식으로, 재료는 대량 하이드로겔에 이질 세포 수집을 캡슐화하여 스크리닝에 사용할 수 있습니다. 세포는 원하는 표현형에 대해 관찰되고, 유전체 특성화를 위해 개별 적인 관심 세포가 제거된다. 보다 정교한 형식으로 재료는 랩 온-칩 장치에 통합되어 장치의 원하는 영역에서 정확한 셀 방출 및 검색을 제공할 수 있습니다. 두 형식 모두 여기에 설명되어 있으며, 둘 다 최근 새로운 미생물 스크리닝 및 선택 응용 프로그램17,18,19를가능하게 했다. 이 방법은 모델 그람 음성유기체(대장균, 아그로박테리움 tumefaciens)및 모델 그람 양성유기체(바실러스 서브틸리스)로여기에서 입증되며, 다양한 다른 박테리아로 쉽게 확장되었다.

<table><tbody><tr><td>(3-메르캅토프로필)트리에톡시실란</td><td>시그마-알드리치</td><td>175617-25G</td><td>> 95%</td></tr><tr><td>알코녹스 세제 분말</td><td>알코녹</td>스 <td>1104</td><td></td></tr><tr><td>황산암모늄</td><td>피셔 케미컬</td><td>A702-500</td><td>인증 ACS 과립</td></tr><tr><td>오토클레이브 SK300C</td><td>야마토 사이언티픽</td><td>18016</td><td></td></tr><tr><td>바실러스 서브틸리스 1A1135</td><td>바실러스 유전자 재고 센터</td><td>1A1135</td><td></td></tr><tr><td>명시야 정립 현미경</td><td>Olympus Corporation</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘, 무수</td><td>Fisher Chemical</td><td>C614-500</td><td>데시케이터 펠릿, 4-20 메쉬</td></tr><tr><td>원심분리기 5702</td><td>Eppendorf</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>구연산 일수화물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1909-500G</td><td>ACS 시약, > 99.0%</td></tr><tr><td>D-포도당( 포도당)</td><td>VWR Amresco 생명 과학</td><td>0188-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Dneasy 혈액 & 조직 키트</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td>DNA 정제 키트</td></tr><tr><td>DOWSIL 184 실리콘 엘라스토머 베이스</td><td>Dow Silicones Corporation</td><td></td><td>저장 온도: -30-60 &deg; C</td></tr><tr><td>DOWSIL 184 실리콘 엘라스토머 경화제</td><td>Dow Silicones Corporation</td><td></td><td>보관 온도: < 32 C</td></tr><tr><td>EPOCH2 마이크로플레이트 분광 광도계</td><td>BioTek Instruments</td><td>EPOCH2</td><td></td></tr><tr><td>대장균 ATCC 25922</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R19020</td><td></td></tr><tr><td>에탄올, 무수</td><td>Fisher Chemical</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 현미경 커버 유리</td><td>Fisher Scientific</td><td>12540A</td><td></td></tr><tr><td>Fisherfinest 프리미엄 현미경 슬라이드 플레인</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-4</td><td></td></tr><tr><td>과산화수소 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763-500ML</td><td>억제제 함유, H2O</td></tr><tr><td>Incu-Shaker Mini</td><td>Benchmark</td><td>E5-0014-01</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>190764</td><td></td></tr><tr><td>황산 마그네슘, 7 수화물</td><td>Macron 정밀 화학</td><td>6066-04</td><td>Avantor Performance Materials, Inc.</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>시그마-알드리치</td><td>179337-4L</td><td>ACS 시약, > 99.8%</td></tr><tr><td>NanoDrop One 분광 광도계</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-ONEC-W</td><td></td></tr><tr><td>질소, 압축</td><td>Matheson</td><td>UN1066</td><td></td></tr><tr><td>산소 플라즈마 세척기</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001-HP</td><td></td></tr><tr><td>펜타에리트리톨 테트라(메르캅토에틸) 폴리옥시에틸렌(4 arm-PEG)</td><td>NOF America Corporation</td><td>PTE-100SH</td><td>Sunbright-PTE-100SH</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS), 10X</td><td>VWR Amresco Life Science</td><td>K813-500ML</td><td>15 &도 사이에 저장; C&ndash; 30 > C</td></tr><tr><td>폴리디메틸 실록산(PDMS) Slygard 184</td><td>다우코닝</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>Polygon400</td><td>Mightex</td><td>DSI-D-000</td><td></td></tr><tr><td>프리미엄 현미경 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-4</td><td>25 x 75 x 1mm</td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>시그마 생명과학</td><td>S5886-500G</td><td>세포 배양에 적합한 생물 시약</td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>S8045-500G</td><td>BioXtra, > 98%, 펠릿(무수)</td></tr><tr><td>인산나트륨 일염기성 이수화물</td><td>시그마-알드리치</td><td>71505-250G</td><td>BioUltra, 분자생물학용, > 99.0% (T)</td></tr><tr><td>스테인리스강 두께 게이지</td><td>정밀 브랜드 제품</td><td>77739</td><td></td></tr><tr><td>황산</td><td>시그마-알드리치</td><td>320501-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>톨루엔, 무수, 99.8%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>244511-1L</td><td>무수, > 99.8%</td></tr><tr><td>Trichloro(1H,1H,2H,2H perfluorooctyl) 실란(TPS), 97%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>448931-10G</td><td></td></tr><tr><td>트립틱 콩 육수</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22092-500G</td><td>미생물학용</td></tr><tr><td>Super Nuova 디지털 핫 플레이트 교반기</td><td>Thermo Scientific</td><td>S131825</td><td></td></tr><tr><td>초음파 초음파 발생기</td><td>Fischer Scientific</td><td>FS-110H</td><td></td></tr></tbody></table>

박테리아 스크리닝, 선택 및 격리를 위한 광분해성 하이드로겔 인터페이스

Photodegradable Hydrogel Interfaces for Bacteria Screening, Selection, and Isolation

생물학자들은 오랫동안 표현형과 유전자형 사이의 관계를 이해하려고 노력해 왔습니다. 이 연결을 더 잘 이해하기 위해, 다운스트림 유전 분석을 위한 고순도에서 세포 격리와 현미경 세포 검열을 결합하는 실용적인 기술을 개발하는 것이 중요합니다. 여기서, 이질적인 세포 집단으로부터 독특한 성장 표현형을 가진 박테리아의 스크리닝 및 절연을 위한 광분해성 폴리(ethylene glycol) 하이드로겔의 사용이 설명된다. 이 방법은 하이드로겔로 세포를 캡슐화하거나 포획한 다음 배양, 현미경 스크리닝, 하이드로겔 분해 및 선택된 세포의 방출을 위한 고해상도 라이트 패터닝 도구를 사용하여 검색용 솔루션으로 사용합니다. 다른 빛 패턴을 적용하면 추출 된 세포의 형태에 대한 제어를 할 수 있으며, 링이나 십자가와 같은 패턴은 분리에 대한 DNA 손상을 완화하기 위해 최소한의 직접 UV 광 노출로 세포를 검색하는 데 사용할 수 있습니다. 더욱이, 라이트 패터닝 툴은 다양한 분해 및 세포 방출 속도를 달성하기 위해 조절 가능한 광 용량을 제공합니다. 고해상도로 분해할 수 있으므로 미크로네 규모의 공간 정밀도로 세포 검색을 가능하게 합니다. 여기서, 이 물질의 사용은 대량 하이드로겔과 마이크로 패브릭 실험실 온 칩 장치에서 박테리아를 선별하고 회수하는 것이 입증된다. 이 방법은 저렴하고 간단하며 돌연변이 라이브러리에서 희귀 한 성장 프로파일을 가진 세균 균주의 격리 및 게놈 특성에 대한 응급 표현형을 가진 세균 성 동종의 격리를 포함하여 미생물학의 일반적이고 새로운 응용 분야에 사용할 수 있습니다.

세포 방출을 위한 통제된 하이드로겔 분해를 유발하는 UV 빛의 능력을 조사하기 위하여는, 하이드로겔은 박테리아가 존재하지 않는 thiolated 커버립위에 먼저 캡슐화되었습니다. 각 하이드로겔은 서로 다른 강도와 노출 시간에 빛의 세 복제 원 패턴에 노출되었다. 백분율 겔 분해는 각 광 강도에서 UV 광 노출 후 계산되었고, 노출 시간은 형광 이미징19,24에대한 형광-5-maelimide 염료와 펜던트 티올 그룹을 결합하여 정량화되었다. 이 두 매개 변수가 하이드로겔 저하에 미치는 영향을 보여주는 대표적인 예가 도 3에표시됩니다. 패턴 조명 도구에서 제공하는 패턴 조명은 소수의 셀만 방출할 수 있는 해상도로 하이드로겔 분해의 공간-시간적 제어를 제공합니다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig03.jpg"> 그림 3: 하이드로겔 분해제어. UV 광 용량 및 그로 인한 하이드로겔 분해 속도는 패턴 조명 도구를 통해 튜닝할 수 있습니다. (개시) 패턴 하이드로겔 분해를 위해 두 가지 다른 광 강도가 선택되었습니다. 365nm UV 광 노출 후, 하이드로겔은 형광 이미징을 위해 형광-5-말리미드로 표지되었습니다. 파타히 외19 저작권 2020 미국 화학 협회의 허가하에 전재 (적응) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
세포 추출을 위해, 상이한 광 패턴은 세포 방출을 조사하기 위해사용되었다(도 4). 여기서, Agrobacterium 박테리아 세포는 티오레이트 유리 커버립을 통해 대량 하이드로겔로 캡슐화된 다음 마이크로 스케일 콜로니로 배양되었습니다. 하이드로겔은 밝은 시야 현미경 검사에서 검사되었고, 표적 마이크로콜로니는 다양한 자외선 패턴에 노출되었다. 상이한 노출 패턴이 방출된 세포의 형태에 영향을 미치는 것으로 관찰되었다. 이는 다양한 응용 분야에 잠재적으로 유용합니다. 예를 들어, 표적 식민지 주변에 링 패턴을 노출하면 전체 콜로니가 여전히 보호 PEG 하이드로겔에 캡슐화되어 있으며 직접 UV 광노출(도 4A)이없으면 세포를 보존하고 쉽게 다운스트림 정화를 제공할 수 있습니다. 대조적으로, 식민지의 일부 또는 전부를 UV 광에 노출시킴으로써, 세포는 집계된 세포클러스터(도 4B)또는 자유, 개별 세포(도4C)로추출될 수 있다.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig04.jpg"> 도 4: 추출된 세포의 형태에 대한 제어. (A)전체 세포 식민지를 방출하기 위해 링 패턴을 사용하여 PEG 매트릭스에서 보호된다. (B)골재로 세포 방출을 위한 깨진 크로스 패턴의 사용. (C)개별 세포를 방출하기 위해 교차 패턴을 사용합니다. [19] [1] [1][1] <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
캡슐화 프로토콜에서 중요한 것은 셀 파종 밀도와 하이드로겔의 두께모두이며, 이러한 파라미터 는 관찰을 위해 하이드로겔에 통합된 세포의 수에 영향을 미칠 수 있다. 이를 입증하기 위해, A. tumefaciens 세포 샘플은 얇은 스페이서(12.7 μm) 또는 두꺼운 스페이서(40 μm)를 사용하여 두 개의 서로 다른 두께의 하이드로겔로 캡슐화되었고, 확립된 프로토콜에 따라 이미지화되었다. 얇은 하이드로겔은 하이드로겔 전체에 걸쳐 90개의 콜로니/mm2의 마이크로콜로니 밀도를 초래하여 최소한의 식민지 중복이 관찰되었다(그림5A). 대조적으로, 하이드로겔 두께가 12.7 μm보다 커서 수직방향(도 5B)에서겹치는 콜로니의 형성이 발생하여 여러 식민지의 추출이 발생할 수 있다. 중첩된 콜로니는 빛 패턴의 2차원 특성으로 인해 추출 하는 동안 교차 오염을 일으킬 수 있습니다. 예를 들어, 상부 식민지는 표적으로 삼을 수 있으며, 기본 식민지도 그것으로 추출된다(도5C). 따라서 하이드로겔 제제에는 12.7 μm 스페이서를 사용하는 것이 좋습니다.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig05.jpg"> 그림 5: 하이드로겔 두께는 추출 순도에 영향을 미칩니다. (A)하이드로겔 형성을 위해 두께가 12.7 μm인 스페이서를 활용하여 콜로니가 10배 초점 평면 내에 형성된다. (B)12.7 μm보다 두께가 큰 스페이서가 사용되는 경우 콜로니의 오버레이는 10배배율로 관찰될 수 있다. (C)교차 오염은 세포 방출 시 콜로니의 오버레이로 발생할 수 있다: (i) 고리 패턴은 표적 세포 식민지를 방출하는 데 사용되며, (ii) 표적 세포 식민지는 하이드로겔로부터 분리되고, (iii) 두 번째, 기본 식민지는 표적 식민지 아래의 빛 노출 중에 관찰된다. 이 식민지는 또한 제거되어 교차 오염이 발생합니다. 파타히 외19 저작권 2020 미국 화학 협회의 허가하에 전재 (적응) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
UV 광이 있는 박테리아에 대한 잠재적 손상을 감안할 때, 세포 생존가능성에 대한 다양한 자외선 마이크로패턴의 효과는 모델, 그람 양성균(B. subtilis)및 모델, 그람 음성 박테리아(대장균)를 사용하여 더욱 연구되었다. 각각은 대량 하이드로겔 내에서 캡슐화되었고 표준 프로토콜에 따라 마이크로 스케일 콜로니로 배양되어 하이드로겔과의 호환성을 확인했습니다. 동등한 크기의 표적 마이크로콜로니(26± μm 직경)는 일정한 광량(168mJ/mm2)에노출되었고, 전체 마이크로콜로니를 UV 광에 노출시키는 원 패턴의 형태로 또는 하이드로겔 모서리만 저하시키는 교차 패턴으로 세포에 대한 광 노출을 최소화하였다. 세포는 각 식민지에서 회수된 CFU/mL을 정량화하기 위해 회수및 도금되었다. 세포 회수 수준에 큰 차이가 발견되지않았다(도 6A). 추출된 세포의 순도를 더욱 조사하기 위해, DNA는 대장균 샘플에서 추출되고 UV-Vis 분광계를 사용하여 분석하였다. 두 패턴 모두, DNA 품질 수준은 1.8과 2.0(도6B)사이의 A260/A280 범위 내에 속하며, 이는 유전체 염 시퀀싱25에이상적인 범위에 있다. 이것은 기술된 조건하에서 방출을 위해 사용된 UV 패턴이 대량 하이드로겔에서 또는 추출 후에 게놈 DNA 질에 회수된 실행 가능한 세포의 양에 최소한의 효력이 있다는 것을 보여줍니다.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig06.jpg"> 그림 6: 대량 하이드로겔에서 방출되는 박테리아의 세포 생존 가능성 및 DNA 품질에 대한 상이한 빛 노출 패턴의 영향. (A)교차 패턴 및 원 패턴을 사용하여 추출 후 대장균과 B. 서브틸리스 모두에 대한 세포 회수 수준. 이 실험을 위해, 각 식민지에서 방출된 세포의 수가 동등하도록 동일한 직경(26 μm ± 1 μm)을 가진 구형 식민지로부터 추출하였다. 그런 다음 추출된 솔루션을 도금하여 각 패턴에서 획득한 CFU/mL을 계산했습니다. 통계 분석은 대장균과 B. 서브틸리스 모두에 대한 교차 및 원 패턴에서 얻은 CFU/mL(P-값 &gt; 0.05, n= 6 모두 균주에 대해 유의한 차이를 보였다). (B)교차 및 원 패턴을 사용하여 격리된 대장균 세포에 대한 DNA 품질의 분광측정량. 여기서, 통계 분석은 사용되는 패턴에 대한 DNA 품질에 유의한 차이를 나타내지 않았다(P-값 &gt; 0.05, n = 6)(C)교차 및 원 패턴에 노출된 동일한 직경의 콜로니의 브라이트필드 영상. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
마이크로웰 어레이는 대량 하이드로겔에 비해 더 많은 제어된 스크리닝 기능을 제공하는 대체 랩 온 어칩 스크리닝 인터페이스를 제공합니다. 예를 들어, 마이크로웰 어레이는 비수화의 세포 수를 조절할 수 있는 이산 배양 부위로 박테리아의 파종을 가능하게 한다. 깊이와 직경과 같은 마이크로웰의 기하학적 특징은 표준 미세 제조 방법을 통해 제어됩니다. 이러한 이점으로, 마이크로웰은 공간감금(26)하에서박테리아 성장을 연구하는 데 유용했으며, 가장 최근에는마이크로스케일(18)에함께 국한될 때 다른 세균종 간의 공생 및 적대적 상호 작용의 발견에 유용하게 사용되어 왔다. 16S 앰플리턴 염기서열분석과 같은 유전체 분석을 위한 우물에서 의세포 추출은 이러한 응용 분야에 매우 중요합니다. 동일한 하이드로겔 소재를 사용하여 UV 광은 원 또는 링 패턴으로 관심 있는 셀을 잘 함유하고 있는 셀위에 노출될 수있다. 후자는 세포의 직접적인 조사를 방지하기 위해 마이크로웰 경계에서만 하이드로겔 분해를 보장합니다. 이를 입증하기 위해, mCherry를 발현하는 A. tumefaciens 세포는 우물로 씨를 뿌린 후, 하이드로겔은 마이크로웰 어레이에 부착하였다. 세포는 배양된 다음 원 또는 링 패턴으로 조사되었습니다. 그 때 막은 형광염-5-말리미드 염료로 염색되었다. 2색 형광 이미지는 우물 내의 막과 세포가 모두 조사패턴(17)에대해 제거된다는 것을 밝혔다. 벌크 하이드로겔 포맷과 달리, 여기서 세포 추출은 셀클러스터(18)의형태로만 관찰되었다.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig07.jpg"> 그림 7: 마이크로웰 어레이로부터세포 격리에 대한 가벼운 패턴의 영향을 보여주는 대표적인 공초점 현미경 영상. (A)파종 후 세균(적색)을 함유한 40μm의 직경을 가진 마이크로웰. (B)원과 링 패턴(파란색)을 이용한 광 노출. (C)적색형 감소는 세포가 조사된 우물에서 추출된다는 것을 보여준다. (D)조사 후 멤브레인과 박테리아의 2색 형광 이미지로, 대상 우물에서 하이드로겔(green)과 박테리아(red)를 모두 제거했음을 나타낸다. (E)Z-스택, 대상 우물의 2색 형광 이미지. 빨간색선(D)은(E)로이미지된 xz 평면을 나타내고 녹색 선(E)은(D)에서이미지된 xy 평면을 나타낸다. 이미지(C-E)의샘플은 방출된 셀의 제거를 위해 세척한 다음 고정 및 이미지화하였다. 스케일 바 = 40 μm. 반 데르 Vlies 외17의허가하에 전재 (적응) . 저작권 2019 미국 화학 소성. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
이러한 포맷에서 추출 후 박테리아 세포 생존력 및 DNA 품질을 정량화하기 위해 B. 서브틸리스 및 대장균 세포는 원 및 링 패턴을 사용하여 마이크로웰 어레이로부터 종자, 배양 및 방출되었다(도8A,B). 방출된 세포는 ATGN 천 판상에서 도금되었고, 추출된 세포의 DNA 품질은 정량화되었다. 각 추출 중에 일관된 수의 세포가 존재하도록 하기 위해 유사한 형광 성 강도(~6000 A.U.)를 가진 마이크로웰은 이와 유사한 수의 세포가 방출을 목표로 삼았습니다. 원 패턴을 사용하여 추출된 실행 가능한 세포의 수는 어느박테리아(도 8C)에대한 링 패턴을 사용하여 추출된 실행 가능한 세포의 수와 크게 다르지 않았다. 또한, DNA 품질 수준은 어느박테리아(도 8D)에대해 원과 링 패턴 사이에 크게 다르지 않았다. 따라서, 벌크 하이드로겔의 연구 결과와 유사하게, 여기에 지정된 강도 와 기간에 UV 광을 적용하는 것은 마이크로웰 어레이에서 추출된 세포의 생존가능성 과 DNA 품질에 무시할 수 있는 영향을 미쳤다. 이 사실 인정은 실행 가능한 박테리아 세포가 다운스트림 분석을 위한 최소한의 손상으로 마이크로웰에서 선택적으로 검색될 수 있다는 것을 보여줍니다.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig08.jpg"> 그림 8: 마이크로웰 어레이에서 방출되는 박테리아의 세포 생존력 과 DNA 품질에 대한 다양한 광 노출 패턴의 영향. (A,B) 대장균과 B. 서브틸리스모두의 경우, 10 μm 마이크로웰에서 세포 추출에 원 패턴과 링 패턴이 사용되었습니다. 직경 10μm의 원형 패턴과 10 μm의 내지름과 20 μm의 외경을 가진 링 패턴이 세포 추출을 위한 실험에서 사용되었다. 동일한 직경을 가진 마이크로웰은 각 마이크로웰에서 방출된 세포의 수가 동일하도록 하기 위하여 이용되었습니다. (C)추출된 솔루션은 각 노출 패턴에서 획득한 CFU/mL을 계산하기 위해 도금되었다. 통계 분석은 대장균과 B. 서브틸리스 모두에 대해 원 및 링 패턴으로부터 얻은 CFU/mL에 유의한 차이를 나타내지 않았다(P-값 &gt; 0.05, n = 6 모두 균주에 대해). (D)분광측법은 원및 링 패턴을 사용하여 대장균과 B. 서브틸리스 세포의 DNA 품질을 측정하는 데 사용되었습니다. 여기서, 통계 분석은 사용된 패턴에 대한 DNA 품질에 유의한 차이를 나타내지 않았다(P-값 &gt; 0.05, n =6 모두 균주에 대해). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig08large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보조 도1: 마이크로웰 어레이의 설계 및 제작. (A)실리콘 웨이퍼에서 마이크로웰 어레이를 제조하기 위해 표준 미세 제조 기술이 적용되었다. (B)각 기판은 20 μm 깊이와 30 μm 피치와 10μm 직경 우물의 7 x 7 배열로 구성되었다. (C)각 어레이는 225마이크로웰로 구성되었다. 이 그림은 Barua 외18에서수정되었습니다. 저작권 2021 프론티어 미디어. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

고해상도 광 패터링 도구를 이용하여 세균 세포를 분리하기 위해 광분해성 하이드로겔을 사용하는 것이 보고된다. 프로세스의 필수 실험 절차, 결과 및 이점을 검토합니다. 이 방법은 이질적인 지역 사회 또는 인구에서 희귀하거나 독특한 기능을 보여주는 표적 박테리아의 신속하고 저렴한 격리를 가능하게합니다.

Biologists have long attempted to understand the relationship between phenotype and genotype. To better understand this connection, it is crucial to ...

이 프로토콜은 유전체 특성화를 위한 스크리닝 인터페이스에서 세포를 빠르게 격리하도록 설계되었으며, 이 기능은 거시적으로 관찰 가능한 셀 피처를 게놈 정보와 결합할 수 있기 때문에 중요합니다. 스크리닝 인터페이스에서 표적화된 세균 세포는 이 기술을 사용하여 작동적으로 간단한 방식으로 높은 공간 위치로 격리될 수 있다. 하이드로겔은 다른 스크리닝 인터페이스에서 구현될 수 있다.하이드로겔 물질은 미세 유체 장치에서 세포의 온디맨드 검색을 위해 미세 유체 채널에 쉽게 통합될 수 있습니다. 먼저 교차 연결 버퍼를 원하는 셀 밀도로 접종합니다. 0.5 밀리리터 마이크로센심분리기 튜브에 하이드로겔 전구체 용액을 12.5 마이크로리터의 교차 연결 버퍼와 PEG ONB 디아크릴레이트 용액의 5.6 마이크로리터를 추가하여 준비한다.그리고 마지막으로, 혼합물에 팔뚝 PEG 티올 용액의 6.9 마이크로 리터를 추가합니다. 하이드로겔 전구체 용액의 셀 캡슐화의 경우, 깨끗한 페트리 접시에 티오레이드 베이스 커버립을 놓고 커버슬립의 두 반대쪽에 두 개의 스페이서를 배치합니다. 스페이서를 페트리 접시에 테이핑하여 베이스 커버슬립의 스페이서를 수정합니다.비반응성 역류 유리 슬라이드에 전구체 용액의 원하는 부피를 추가한 후, 슬라이드를 베이스 커버슬립에 놓고 25분 동안 실온에서 하이드로겔 형성을 완료할 수 있도록 한다. 겔화가 완료되면, 부드럽게 퍼플루오로알키드 유리 슬라이드를 제거합니다. 항생제로 보충 된 ATGN 미디어를 포함하는 60 by 15 밀리미터 페트리 접시에 기판을 놓습니다.종자 700 마이크로리터는 마이크로웰 어레이 기판에 대해 0.1의 OD 600을 가진 세균세포 현탁액을 제거하고 pH 8의 인산염 완충식식염염의 12.5 마이크로리터를 사용하여 이전에 입증된 바와 같이 하이드로겔 전구체 용액을 만든다. 비반응성 역류 유리 슬라이드에 전구체 용액의 파이펫 12.5 마이크로리터와 세포로 접종된 마이크로웰 어레이 기판의 두 개의 반대쪽에 38 마이크로미터 강철 스페이서 2개를 배치한다. 그런 다음 전구체 용액 액을 가진 역류 유리 슬라이드를 반전시키고 마이크로웰 기판 의 중간에 액적을 놓습니다.하이드로겔이 실온에서 25분의 배양 후 형성되면, 마이크로웰 기판에서 유리 슬라이드를 부드럽게 제거하고 항생제로 보충된 ATGN 매체를 함유한 페트리 접시에 기판을 놓는다. 샘플을 PDMS 홀더에 넣고 시료 탈수를 방지하고 방출된 셀에 대한 반송파 솔루션을 제공하기 위해 정의된 미디어를 샘플 위에 추가합니다. 교정 거울을 위치에 가져온 후 현미경 초점을 조정하여 하이드로겔 또는 마이크로웰 어레이 내의 콜로니의 선명한 이미지를 얻고 콜로니 또는 관심 있는 우물을 식별하도록 검사합니다.여기서, 카메라 뷰가 샘플 내부의 콜로니를 보여주면서 조명 패턴을 설계하여 셀 추출을 위한 상이한 패턴을 테스트하고 정의된 패턴을 저장합니다. 그런 다음 세션 제어 섹션을 선택하고 패턴 조명 도구 제품 이름으로 제목의 탭 아래에 저장된 시퀀스를 추가합니다. 원하는 노출 위치를 보고 조정할 수 있는 패턴을 자극하는 옵션을 선택합니다.다음으로, 광 강도를 60%로 조정하고 노출 시간을 LED 제어 탭 에서 40초로 조정하고 노출 프로세스를 시작합니다. 하이드로겔 분해를 실시간으로 모니터링하고 브라이트필드 모드를 사용하여 셀 방출을 보장합니다. 방출된 세포를 수집하기 위하여는, 현미경 필터를 브라이트필드에서 TRITC로 변경하여 육안으로 시료의 노출된 영역을 시각화합니다.노출 된 영역이 있으면, 조사 된 지점에 튜브의 끝을 배치 한 다음 현미경 필터를 브라이트 필드로 다시 변경하여 실시간으로 세포 검색을 모니터링합니다. 튜브의 다른 쪽 끝에 부착 된 주사기를 사용하여 방출 된 세포를 포함하는 용액 200 마이크로 리터를 조심스럽게 철회하고 DNA 분석 또는 도금을 위한 1.5 mm 원심 분리 튜브로 용액을 전송하십시오. 다른 UV 광 마이크로 패턴은 방출 된 세포의 형태에 영향을 미치는 벌크 하이드로 겔에서 세포 추출에 사용되었다.링 패턴의 UV 노출은 보호 PEG 하이드로겔에 캡슐화된 전체 식민지의 방출을 초래했습니다. 대조적으로, 식민지의 일부 또는 전부를 UV 광에 노출시킴으로써, 세포는 집계된 세포 클러스터또는 자유로운 개별 세포로 추출될 수 있었습니다. 하이드로겔의 세포 시싱 밀도 및 두께는 세포 캡슐화에 중요합니다.얇은 하이드로겔은 최소한의 식민지 중복으로 마이크로 콜로니를 초래했으며, 두께가 증가한 하이드로겔은 겹치는 식민지를 초래하여 여러 식민지를 추출할 수 있습니다. 중첩된 콜로니는 빛 패턴의 2차원 특성으로 인해 추출 하는 동안 교차 오염을 일으킬 수 있습니다. 상부 식민지가 표적으로 삼았을 때, 기본 식민지도 그것으로 추출되었습니다.세포 생존가능성에 대한 다양한 자외선 마이크로 패턴의 효과도 평가되었다. 마이크로 콜로니가 원형 또는 교차 패턴에서 UV 광의 통제 된 복용량에 노출되었을 때, 세포 복구 및 DNA 순도는 영향을받지 않았다. 세포는 이 접근법을 사용하여 마이크로웰 어레이로부터 성공적으로 회수되었으며, 이는 대표적인 공초점 현미경 이미지에서 분명하게 드러났으며, 원형 및 링 패턴에서 조사할 때 세포는 각각의 패턴으로 제거되었다.마이크로웰 어레이에서 추출한 후 세포 생존가능성과 DNA 양을 평가했습니다. 노출 패턴은 실행 가능한 세포 수도 또는 DNA 질에 영향을 미치지 않으며, 실행 가능한 박테리아 세포가 최소한의 손상으로 마이크로웰에서 선택적으로 검색될 수 있고, 그들의 DNA는 다운스트림 게놈 분석을 위한 고순도에서 격리될 수 있었다는 것을 표시합니다. 항상 수압겔이 퍼플루오로알키드 커버슬립을 제거하기 전에 형성되었는지 확인하십시오.하이드로겔 증착을 위해 스페이서를 배치하고 세포 추출을 위해 튜브를 사용하는 데는 정밀도와 주의가 필요합니다.

photodegradable-hydrogel-interfaces-for-bacteria-screening-selection

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 프로토콜은 상피 세포와 세균의 동시와 언어 문화 microfluidic 공동 문화 모델을 설명합니다. 이 모델은 putative probiotic 박테리아 변종의 효과를 pathogenesis에 다른 수용성 분자 신호의 역할을 조사뿐만 아니라 화면을 사용할 수 있습니다.

Microfluidic 가용성식이 중재 신호의 상호 작용을 조사하는 상피 세포 박테리아의 공동 문화

온 - 칩 photopolymerization 기술을 사용하여 폴리머 microarray의 형성에 대한 설명입니다. 원자 힘 현미경, 물 접촉 각도 측정, X-선 광전자 분광법 및 비행 차 이온 질량 분광법과 세포 부착 분석 시간을 사용하여 높은 처리량 표면 특성도 설명되어 있습니다.

Biomaterials 높은 처리량 발견을위한 폴리머 Microarrays

합성 오페론 인코딩 모두 분비 장치와 curli 섬유의 구조 단량체의 디자인이 설명되어 있습니다. 이 amyloids와 자기편 고분자의 과잉은의 준수 측정 게인을 할 수...

단일 합성 Curli 오페론을 생성하여 공학 점착성의 박테리아를

출처: Fattahi, N., et al. 박테리아 스크리닝, 선택 및 분리를 위한 광분해성 하이드로겔 인터페이스. J. Vis. 경험. (2021년)이 비디오는 실리콘 마이크로웰 어레이 내에서 박테리아 콜로니를 분리하기 위해 광분해성 하이드로겔을 사용하는 방법을 보여줍니다. 박테리아 세포는 먼저 마이크로웰에 로드되고 가교 하이드로겔에 캡슐화되고 별개의 콜로니로 배양됩니다. 자외선에 노출되면 하이드로겔의 표적 분해를 통해 개별 콜로니를 선택적으로 추출할 수 있습니다.

마이크로웰 어레이에서 박테리아 콜로니의 광분해성 하이드로겔 기반 분리

출처: Fattahi, N., et al. 박테리아 스크리닝, 선택 및 분리를 위한 광분해성 하이드로겔 인터페이스. J. Vis. 경험. (2021).이 비디오는 UV 광선을 사용하여 광분해성 하이드로겔에서 박테리아 콜로니를 추출하는 방법을 보여줍니다. 특정 콜로니가 선택되고 패턴화된 빛 노출이 국부적인 하이드로겔 분해를 시작하도록 설계되었습니다. 빛의 강도와 지속 시간을 조정한 후 UV 광선이 적용되어 콜로니가 방출됩니다. 그런 다음 콜로니는 튜브를 통해 흡인되고 다운스트림 분석을 위해 튜브로 옮겨집니다.

Light-patterned Hydrogel Degradation을 사용한 표적 박테리아 콜로니 분리

출처: Venkateswaran, S., et al. 의료 기기용 박테리아 퇴치제 폴리머의 고처리량 식별. J. Vis. 경험. (2016년)이 비디오는 혼합 박테리아 배양에 노출된 마이크로어레이 슬라이드를 사용하여 박테리아 퇴치성 폴리머를 식별하는 고처리량 방법을 보여줍니다. 박테리아 결합은 DAPI 형광에 의해 평가되며, 여기서 감소된 신호는 표면 부착이 최소화된 폴리머를 나타냅니다.

마이크로어레이 스크리닝을 통한 박테리아 퇴치성 폴리머의 고처리량 식별

출처: Yarringto, K. D., et al. 단일 세포 종간 박테리아 상호 작용의 동역학적 시각화. J. Vis. 경험. (2020년)이 비디오는 살아있는 세포 이미징을 위해 아가로스 패드 아래에서 운동성 및 비운동성 박테리아를 사용하여 공동 배양 시스템을 준비하는 방법을 보여줍니다. 운동성 박테리아가 어떻게 화학적 유인제를 감지하고 비운동성 콜로니에 침입하여 박테리아 상호 작용을 드러내는지 보여줍니다.

단일 세포 박테리아 상호 작용의 시각화

의료 기기에서 박테리아 표면 결합을 감소시키는 폴리머를 식별하기 위한 고처리량 마이크로어레이 방법에 대해 설명합니다.

의료 기기에 대한 박테리아의 높은 처리량 식별 구충제 폴리머

이 살아있는 세균성 세포 화상 진찰 프로토콜은 시간이 지남에 따라 단세포 수준에서 다중 세균성 종 사이 상호 작용의 시각화를 허용합니다. 시간 경과 화상 진찰은 개별 세포 운동성 및 생존성을 포함하여 다종 세균성 지역 사회에서 종 간 상호 작용을 심문하기 위하여 단배문화 또는 공동 문화에서 각 세균성 종의 관찰을 허용합니다.

단세포 종 간 세균성 상호 작용의 운동 시각화

이 프로토콜은 기존의 액체 배양 또는 페트리 접시보다 자연 서식지에 더 가까운 복잡한 3D 다공성 하이드로겔 매트릭스에서 박테리아 군집의 운동성과 성장을 연구하기 위한 박테리아 군집의 3차원(3D) 프린팅 절차를 설명합니다.

복잡한 3D 다공성 매체의 운동성과 성장을 연구하기 위한 3D 프린팅 박테리아

이 프로토콜은 산업 미생물을 위한 표준 고처리량 스크리닝 워크플로우를 제공합니다. 이 과정은 ARTP 돌연변이 유발을 통해 돌연변이 라이브러리를 구축하고, 자동화된 마이크로플루이딕스를 이용한 양성 액상 스크리닝을 수행하며, 이후 결과를 검증하는 과정을 포함합니다. 이 워크플로우의 신뢰성은 고수율 B. coagulans 균주를 스크리닝하여 검증되었습니다.

자동 액상 마이크로플루이딕 플랫폼을 이용한 L-락산을 과생산하는 바실루스 응고 체 돌연변이체의 고처리량 스크리닝

배우세요 광분해성 하이드로겔을 이용한 박테리아 세포의 신속한 격리 및 스크리닝 방법을. 이 기술은 복잡한 미생물 군집에서 특정 세포를 선택적으로 추출하여 유전체 분석을 가능하게 합니다.

박테리아 스크리닝, 선택 및 격리를 위한 광분해성 하이드로겔 인터페이스

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