Name: 입체 택시 바이러스 주입 및 생체 내 심부 뇌를위한 그라디언트 인덱스 렌즈 이식 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: 배우세요 생체 내 칼슘 이미징을 위한 바이러스 주입 및 GRIN 렌즈 이식 수술법을 자유롭게 움직이는 생쥐에서 뇌 신경회로 동역학을 연구하는 이 방법은 뇌 질환 모델 연구에 활용됩니다.

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<ol><li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling.</a> Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).</li>
<li>Brini, M., Cali, T., Ottolini, D., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+calcium+signaling%3A+function+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Neuronal calcium signaling: function and dysfunction.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (15), 2787-2814 (2014).</li>
<li>Chen, T. W., Li, N., Daie, K., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Map+of+Anticipatory+Activity+in+Mouse+Motor+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Map of Anticipatory Activity in Mouse Motor Cortex.</a> Neuron. 94 (4), 866-879 (2017).</li>
<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li>
<li>Komiyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning-related+fine-scale+specificity+imaged+in+motor+cortex+circuits+of+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Learning-related fine-scale specificity imaged in motor cortex circuits of behaving mice.</a> Nature. 464 (7292), 1182-1186 (2010).</li>
<li>Peters, A. J., Lee, J., Hedrick, N. G., O'Neil, K., Komiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reorganization+of+corticospinal+output+during+motor+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Reorganization of corticospinal output during motor learning.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1133-1141 (2017).</li>
<li>Barbera, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+compact+neural+clusters+in+the+dorsal+striatum+encode+locomotion+relevant+information%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Spatially compact neural clusters in the dorsal striatum encode locomotion relevant information.</a> Neuron. 92 (1), 202-213 (2016).</li>
<li>Cai, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shared+neural+ensemble+links+distinct+contextual+memories+encoded+close+in+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time.</a> Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).</li>
<li>de Groot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NINscope%2C+a+versatile+miniscope+for+multi-region+circuit+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations.</a> Elife. 9, 49987(2020).</li>
<li>Ghosh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+integration+of+a+fluorescence+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Miniaturized integration of a fluorescence microscope.</a> Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).</li>
<li>Jacob, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+compact+head-mounted+endoscope+for+in+vivo+calcium+imaging+in+freely+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A compact head-mounted endoscope for in vivo calcium imaging in freely behaving mice.</a> Current Protocols in Neuroscience. 84 (1), 51(2018).</li>
<li>Liang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+and+Dynamic+ON+and+OFF+neural+ensembles+in+the+prefrontal+cortex+code+social+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Distinct and Dynamic ON and OFF neural ensembles in the prefrontal cortex code social exploration.</a> Neuron. 100 (3), 700-714 (2018).</li>
<li>Liberti, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unstable+neurons+underlie+a+stable+learned+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Unstable neurons underlie a stable learned behavior.</a> Nature Neuroscience. 19 (12), 1665-1671 (2016).</li>
<li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+indicators+for+Ca2%2B+based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).</li>
<li>Bassett, J. J., Monteith, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+calcium+indicators+as+probes+to+assess+the+role+of+calcium+channels+in+disease+and+for+high-throughput+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded calcium indicators as probes to assess the role of calcium channels in disease and for high-throughput drug discovery.</a> Advances in Pharmacology. 79, 141-171 (2017).</li>
<li>Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+indicators+of+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded indicators of neuronal activity.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).</li>
<li>Tian, L., Akerboom, J., Schreiter, E. R., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+activity+imaging+with+genetically+encoded+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Neural activity imaging with genetically encoded calcium indicators.</a> Progress in Brain Research. 196, 79-94 (2012).</li>
<li>Moore, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradient-index+optics%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Optics%22%5BJournal%5D)">Gradient-index optics: A review.</a> Applied Optics. 19 (7), 1035-1038 (1980).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniscope+GRIN+Lens+System+for+Calcium+Imaging+of+Neuronal+Activity+from+Deep+Brain+Structures+in+Behaving+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Miniscope GRIN Lens System for Calcium Imaging of Neuronal Activity from Deep Brain Structures in Behaving Animals.</a> Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56(2019).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-step+GRIN+lens+coating+for+in+vivo+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Bulletin%22%5BJournal%5D)">A two-step GRIN lens coating for in vivo brain imaging.</a> Neuroscience Bulletin. 35 (3), 419-424 (2019).</li>
<li>Liang, B., Zhang, L., Moffitt, C., Li, Y., Lin, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open-source+automated+surgical+instrument+for+microendoscope+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">An open-source automated surgical instrument for microendoscope implantation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 311, 83-88 (2019).</li>
<li>Giovannucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaImAn+an+open+source+tool+for+scalable+calcium+imaging+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis.</a> Elife. 8, 38173(2019).</li>
<li>Barbera, G., Liang, B., Zhang, L., Li, Y., Lin, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+wireless+miniScope+for+deep+brain+imaging+in+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A wireless miniScope for deep brain imaging in freely moving mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 323, 56-60 (2019).</li>
<li>Shuman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breakdown+of+spatial+coding+and+interneuron+synchronization+in+epileptic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice.</a> Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).</li>
<li>Werner, C. T., Williams, C. J., Fermelia, M. R., Lin, D. T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circuit+mechanisms+of+neurodegenerative+diseases%3A+A+new+frontier+with+miniature+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Circuit mechanisms of neurodegenerative diseases: A new frontier with miniature fluorescence microscopy.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 1174(2019).</li>
<li>Brault, V., Besson, V., Magnol, L., Duchon, A., Herault, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre%2FloxP-mediated+chromosome+engineering+of+the+mouse+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Experimental+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Cre/loxP-mediated chromosome engineering of the mouse genome.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. (178), 29-48 (2007).</li>
<li>McLellan, M. A., Rosenthal, N. A., Pinto, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre-loxP-mediated+recombination%3A+General+principles+and+experimental+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Mouse+Biology%22%5BJournal%5D)">Cre-loxP-mediated recombination: General principles and experimental considerations.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 7 (1), 1-12 (2017).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이익을보고하지 않습니다.

신경 과학의 핵심 질문은 신경 역학과 회로가 정보를 인코딩하고 저장하는 방법과 뇌 질환에서 어떻게 변경되는지 이해하는 것입니다. 생체 내 현미경Ca2+ 이미징 시스템을 사용하여 국소 미세회로 내의 수백 개의 뉴런으로부터의 개별 신경 활동을 자유롭게 행동하는 동물로부터 동시에 모니터링할 수 있습니다. 여기에서, 바이러스 주입 및 GRIN 렌즈 이식을 위한 상세한 수술 프로토콜이 맞춤형 미니스코프 기록 시스템을 통해 생체 내 심부 뇌Ca2+ 이미징을 위한 설치류를 제조하기 위해 기술된다. 표 1은 당사의 미니스코프 시스템을 상업적으로 이용 가능하고 맞춤 제작된 다른 미니 스코프 시스템(7,8,9,10,11,13,25,26)과 비교한 결과를 보여줍니다. 본 수술 프로토콜을 사용하는 GRIN 렌즈 이식은 심부 뇌 생체 내 칼슘 이미징을위한 상업적 또는 맞춤형 단일 광자 및 이광자 이미징 시스템과 호환된다는 점은 주목할 가치가 있습니다.
바이러스 주입에서 생체 내 칼슘 이미징의 축소경 데이터 수집에 이르기까지 전체 실험 절차를 완료하는 데 최소 2 개월이 걸립니다. 복잡하고 노동 집약적 인 과정입니다. 실험의 궁극적 인 성공은 GECI의 적절한 선택, 표적 뇌 영역에 바이러스의 정확한 주입, 원하는 신경 집단에서의 충분한 바이러스 발현, 원하는 위치에 정확하게 GRIN 렌즈 이식, 수술로부터의 적절한 회복, 수술 후 심각한 염증이 발생하는지 여부 및 동물의 행동이 수술에 의해 심각하게 영향을 받는지 여부 등 여러 요인에 달려 있습니다. 등등.
두 가지 중요한 단계는 바이러스의 입체 택시 주입과 GRIN 렌즈 이식을 포함합니다. 실증적 목적을 위해, mPFC 내의 피라미드성 뉴런을 선택적으로 표지하는 CaMKII 프로모터의 제어 하에 GCaMP6f를 코딩하는 아데노-연관 바이러스 (AAV1)와 함께 마우스 mPFC에서 입체택시 미세주입을 수행하였다. GCaMP6f는 71ms15의 절반 붕괴 시간을 가진 가장 빠르고 민감한 칼슘 지표 중 하나이기 때문에 선택되었습니다. 또한, GCaMP6f의 AAV 바이러스 발현은 오래 지속되며(즉, 수개월), 신경퇴행성 질환27의 마우스 모델에서 종단 연구를 위해 장기간에 걸쳐 반복적인 생체내 Ca2+ 이미징을 수행하는 데 이상적이다. 현재의 수술 프로토콜은 임의의 다른 뇌 영역에서 상이한 세포 집단을 표적화하기 위해 적응될 수 있다. 다양한 사용 가능한 바이러스 도구를 사용하면 원하는 나이에 원하는 뇌 영역에서 특정 신경 집단을 선택적으로 표지 할 수 있습니다. 또한, 연구자들은 Cre-LoxP 재조합 시스템과 다양한 이용 가능한 트랜스제닉 마우스 모델을 활용하여 유전자 변형을 수행하고 행동 및 신경 회로 결과28,29를 연구 할 수 있습니다.
제시된 프로토콜의 한 가지 독특한 특징은 GRIN 렌즈 (직경 1mm) 이식 전에 자동화된 층별 뇌 조직 흡인이 수행되었다는 것입니다. 이것은 진공 시스템에 연결된 27G 바늘을 통해 달성되며, 맞춤형 로봇 암 및 소프트웨어(23)에 의해 제어된다. 우리의 경험에 기초하여, 이 방법은 GRIN 렌즈가 접촉하기 위한 균일한 표면을 생성하고, 수동 조직 흡인(23)보다 이웃 조직에 더 적은 손상을 야기한다. 이러한 이유로, 이 절차는 비교적 넓은 직경(예를 들어, 1mm)을 갖는 GRIN 렌즈에 명백한 이점을 제공한다. 그러나 조직 흡인은 더 작은 직경 (0.5mm 또는 0.25mm)의 GRIN 렌즈를 이식하는 데 필요하지 않을 수 있습니다. 대신에, 30 G 바늘(21)로 만들어진 선행 트랙을 따라 직접 심어질 수 있다.
위에서 설명한 두 가지 중요한 단계 외에도 성공적인 작동을 위해 많은 다른 요소를주의 깊게 고려해야합니다. (1) 뇌에 접촉하는 모든 기구는 감염을 예방하기 위해 멸균되어야 한다. (2) 모든 수술 단계는 추가 염증 및 과도한 흉터 조직 형성을 방지하기 위해 뇌 손상을 최소화하기 위해 수행되어야합니다. (3) 수술 초기에 주어지고 수술 중에 유지되는 마취 용량, 특히 복강내 투여된 마취 용량은 신중하게 고려될 필요가 있다. 마취 용량은 다른 마우스 균주에 따라 변형될 수 있으며, 일부는 더 민감할 수 있다. (4) 수술 중 마우스의 상태를 지속적으로 모니터링해야합니다. 마지막으로, (5) 마우스는 수술 후 많은 합병증이 발생할 수 있으므로 수술 후 정기적으로 모니터링해야합니다.
GRIN 렌즈 이식 단계 동안 뇌 조직의 덩어리가 일방적으로 제거되었지만, 우리는 명백한 행동 결핍 7,12을 관찰하지 못했습니다. 미니 스코프의 무게는 약 2 그램이며 케이블은 가볍게 만들고 마우스가 쉽게 운반 할 수 있도록 맞춤 설계되었습니다. 미니스코프와 케이블은 생체 내 이미징 전에 동물에게만 부착되고 이미징 후 분리됩니다. 전체 이미징 프로세스는 일반적으로 30 분을 넘지 않습니다. 따라서 이러한 계측기는 마우스가 자유롭게 작동하는 것을 방지하지 못합니다. 미니 스코프 설치 및 제거 단계는 동물 억제를 목적으로 이소플루란으로 간단한 마취 (2 분 미만)가 필요합니다. 우리는 전형적으로 마우스가 생체내 영상화를 수행하기 전에 30분 동안 이소플루란의 짧은 노출로부터 회복되게 한다. 우리는 마우스 건강과 마우스 사회적 행동에 어떤 영향도 느끼지 않고 몇 주 동안 일주일에 한 번 미니 스코프 생체 내 칼슘 이미징을 수행했습니다12.
현재 미니스코프 기록 시스템의 주요 한계 중 하나는 데이터 수집을 위해 현미경을 케이블에 연결해야한다는 것입니다. 케이블이 있으면 마우스 작업 성능이 제한되고 한 번에 한 마리의 동물이 기록되는 것이 제한됩니다. 최근에는 무선 미니스코프가 개발되었습니다25,26. 이것은 작업 성능을 넓히고 그룹의 여러 동물로부터 동시에 생체 내 이미징을 가능하게합니다. 또한, 이중 컬러 미니스코프와 결합된 분광적으로 분리가능한 파장을 가진 더 민감한 GECI를 개발하면 신경 과학 연구에 더 흥미로운 가능성을 제공할 것입니다.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63049">Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging</a>. The Discussion&#160;was&#160;updated.
The following paragraph was added to the end of the Discussion:
Although a chunk of brain tissue is removed unilaterally during the GRIN lens implantation step, we did not observe any obvious behavior deficits7,12. The weight of the miniscope is around 2 grams and the cable is custom-designed to make it light and to ensure that the mouse can easily carry it. The miniscope and cable are only attached to the animal prior to in vivo imaging and detached after imaging. The entire imaging process usually takes no longer than 30 minutes. Therefore, these instrumentations do not prevent the mouse from freely behaving. The miniscope installation and deinstallation steps need a brief anesthesia (less than 2 minutes) with isoflurane for the purpose of animal restraining. We typically let the mouse recover from the brief exposure of isoflurane for 30 minutes before performing in vivo imaging. We have performed miniscope in vivo calcium imaging once per week for a few weeks without noticing any impact on mouse health and mouse social behavior12.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63049">Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging</a>. The Discussion&#160;was&#160;updated.

Erratum: Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

세포내Ca2+ 신호전달은 세포 성장, 증식, 분화, 이동, 유전자 전사, 분비 및 아폽토시스1의 필수 조절자이다. 뉴런에서Ca2+ 신호전달은 시공간적 패턴이 막 흥분성, 신경전달물질 방출, 시냅스 가소성2와 같은 중요한 기능과 관련이 있기 때문에 정밀하게 제어된다.
생체 내 칼슘 이미징은 정상적인 동물 행동에 대한 원소의 신경 회로 표현을 해독하고, 뇌 장애의 동물 모델에서 비정상적인 신경 활동을 식별하고, 이러한 변경된 회로를 정상화 할 수있는 잠재적 인 치료 목표를 밝히는 데 활용할 수있는 강력한 기술입니다. 두 가지 일반적인 생체 내 칼슘 이미징 시스템은 이광자 레이저 스캐닝 형광 현미경 3,4,5,6 및 헤드 장착형 소형 현미경 내시경 (miniscope) 7,8,9,10,11,12,13 입니다. . 기존의 이광자 현미경은 더 나은 해상도, 낮은 노이즈 및 낮은 광표백과 같은 명령 이점을 제공합니다. 그러나, 실험 동물은 3,4,5,6 수행 될 수있는 행동 연구를 제한하여 머리를 고정시켜야합니다. 대조적으로, 헤드 마운트 미니 스코프 시스템은 작고 휴대가 가능하여 자유롭게 행동하는 동물 7,8,9,10,11,12,13을 사용하여 다양한 행동 테스트를 연구 할 수 있습니다.
두 가지 주요 Ca2+ 지표, 화학 지표5,14 및 유전자 인코딩 칼슘 지표 (GECIs)15,16이 있습니다. Ca2+ 이미징은 표적 회로에서 뉴런의 특정 표지를 허용하는 바이러스 벡터와 함께 전달되는 매우 민감한 GECI를 사용하여 촉진되었습니다. 감도, 수명 및 세포 하부 구획을 라벨링하는 능력을 향상시키기위한 지속적인 노력으로 GECI는 다양한 생체 내 칼슘 이미징 연구 17,18,19에 이상적입니다.
이미징 중 뇌 조직에서 빛의 산란은 이광자 현미경을 사용하더라도 광학 침투를 심층적으로 제한합니다. 그러나 그라디언트 인덱스 (GRIN) 렌즈는 GRIN 렌즈가 생물학적 조직에 직접 매립되어 심부 뇌 영역의 이미지를 현미경 목표로 전달할 수 있기 때문에 이러한 문제를 극복합니다. 광학적으로 균질한 재료로 만들어진 종래의 렌즈와는 달리, 초점을 맞추고 이미지를 생성하기 위해 복잡한 형상의 표면을 필요로 하며, GRIN 렌즈 성능은 평면 표면(20)으로 초점을 달성하는 렌즈 재료 내의 점진적인 굴절률 변화에 기초한다. GRIN 렌즈는 직경 0.2mm까지 제작할 수 있습니다. 따라서 소형화된 GRIN 렌즈는 너무 많은 손상을 일으키지 않고 심뇌에 이식할 수 있습니다.
이 기사에서는 심뇌 in vivo 칼슘 이미징에 대한 완전한 수술 프로토콜이 제시됩니다. 시연을 위해, 우리는 마우스 뇌의 내측 전두엽 피질 (mPFC)을 목표로하는 뇌 수술과 국립 약물 남용 연구소 (NIDA / IRP)7,12의 린 박사 그룹이 개발 한 맞춤형 미니 스코프 시스템을 통한 생체 내 칼슘 이미징 기록에 대해 설명합니다. 실험 절차에는 두 가지 주요 뇌 수술이 포함됩니다. 첫 번째 수술은 GCaMP6f (GECI)를 발현하는 바이러스 벡터를 mPFC에 입체 적으로 주입하는 것입니다. 두 번째 수술은 GRIN 렌즈를 동일한 뇌 영역에 이식하는 것입니다. 이러한 뇌 수술에서 회복 된 후, 후속 절차는 치과 시멘트를 사용하여 마우스 두개골에 미니 스코프 홀더 (베이스)를 부착하는 것입니다. 생체 내 Ca2+ 이미징은 미니스코프를 베이스에 장착한 후 언제든지 수행할 수 있습니다. 바이러스 주입 및 GRIN 렌즈 이식을 위한 수술 프로토콜은 심뇌 생체 내 칼슘 이미징을 위한 상업적 또는 맞춤형 단일 광자 및 이광자 이미징 시스템과 호환됩니다.

<table><tbody><tr><td>0.6mm 및 1.2mm 드릴 버</td><td>KF 기술</td><td>8000037800</td><td>개두술</td></tr><tr><td>용 27-G 및 30-G 바늘</td><td>BD PrecisionGlide 바늘</td><td>REF 305109 및 REF305106</td><td>두 수술 용</td></tr><tr><td>45 각도 겸자</td><td>Fine Science 도구</td><td>11251-35</td><td>수술</td></tr><tr><td>용 7.5 % 포비돈 - 요오드 용액 (Betadine)</td> <td>Purdue Products LP</td><td>NDC 67618-151-17</td><td>표면 소독제</td></tr><tr><td>아세톤</td><td>시그마 알드리치</td><td>179124-1L</td><td>그린 렌즈 클리너</td></tr><tr><td>아가로 로즈</td><td>시그마 알드리치</td><td>A9539-25G</td><td>그린 렌즈 이식</td></tr><tr><td>용 항생제 연고</td><td>HeliDerm 기술</td><td>81073087</td><td>바이러스 주입</td></tr><tr><td>용 항염증제 (이부프로펜)</td><td>Johnson & Johnson Consumer Inc</td><td>30043308</td><td>수술 후 진통제 역할을 합니다</td></tr><tr><td>AutoStereota</td><td>NIDA/IRP</td><td>github.com/liang-bo/autostereota</td><td>GRIN 렌즈 이식</td></tr><tr><td>행위 기록 소프트웨어(Point Grey FlyCap2)</td><td>Point Grey</td><td>Point Grey Research Blackfly BFLY-PGE-12A2C</td><td>동작 기록용</td></tr><tr><td>황동 육각 너트</td><td>McMASTER-CARR</td><td>92736A112</td><td>GRIN 렌즈 이식용</td></tr><tr><td>GRIN 렌즈 이식 용</td> <td>Buprenorphine</td><td>Par Pharmaceuticals</td><td>NDC 4202317905</td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>시그마</td><td>10043-52-4</td><td>aCSF</td></tr><tr><td>정류자</td><td>NIDA / IRP</td><td>이미지</td><td>수집 시스템의 맞춤형 구성 요소</td></tr><tr><td>압축 산소 및 이산화 산소 탱크</td><td>Rocky Mountain Air Solutions</td><td>BI-OX-CD5C-K</td><td>GRIN 렌즈 준비 이식</td></tr><tr><td>압축 산소 탱크</td><td>Rocky Mountain Air Solutions</td><td>OX-M-K</td><td>바이러스 주입용</td></tr><tr><td>무선 마이크로드릴</td><td>KF 기술</td><td>8000037800</td><td>개두술</td></tr><tr><td>Cyanoacrylate</td><td>Henkel Coorporation</td><td># 1811182</td><td>GRIN 렌즈 이식용</td></tr><tr><td>데이터 수집 컨트롤러</td><td>NIDA/IRP</td><td>이미지</td><td>획득의 맞춤형 구성 요소 체계</td></tr><tr><td>자료 전송 케이블</td><td>NIDA/IRP</td><td>이미지 취득 체계의</td><td>주문 설계</td></tr><tr><td>되는 분대 치과 시멘트 세트</td><td>C& ; B Metabond 및 Catalyst</td><td>A00253revA306 및 A00168revB306</td><td>GRIN 렌즈 이식</td></tr><tr><td>치과 시멘트 세트</td><td>Duralay</td><td>2249D</td><td>GRIN 렌즈 이식</td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>VETone</td><td>NDC 1398503702</td><td>GRIN 렌즈 이식</td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Sigma</td><td>50-99-7</td><td>준비 aCSF</td></tr><tr><td>다이어트 젤</td><td>Clear H20</td><td>72-06-5022</td><td>다이어트 보충제 마우스</td></tr><tr><td>GRIN 렌즈</td>용 <td>GRINTECH</td><td>NEM-100-25-10-860-S</td><td>GRIN 렌즈 이식용</td></tr><tr><td>가열 패드</td><td>Physitemp Instruments LLC.</td><td>#10023</td><td>수술 중 마우스 몸을 따뜻하게 유지하기 위해</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>VETone</td><td>V1 502017</td><td>마취</td></tr><tr><td>케타민</td><td>VETone</td><td>V1 501072</td><td>GRIN 렌즈 이식용</td></tr><tr><td>리도카인</td><td>WEST-WARD</td><td>NDC 0143-9575-01</td><td>국소 마취</td></tr><tr><td>염화마그네슘 육수화물</td><td>Sigma</td><td>7791-18-6</td><td>aCSF</td></tr><tr><td>마이크로리터 제조용 주사기 (Hamilton)</td><td>Hamilton</td><td>7653-01</td><td>바이러스 주입</td></tr><tr><td>용 MicroSyringe Pump Controller</td><td>World Precision Instrument</td><td>#178647</td><td>바이러스 주입 용</td></tr><tr><td>미니 스코프</td><td>NIDA / IRP</td><td>이미징 용</td>맞춤 <td>설계</td></tr><tr><td>Miniscope base</td><td>Protolabs</td><td>맞춤 설계</td><td>베이스 Miniscope</td></tr><tr><td>홀딩 암</td><td>NIDA/IRP</td><td>맞춤 설계</td><td>기본</td></tr><tr><td>미니스코프 보호 캡</td> 장착용 <td>Protolabs</td> 맞춤형 <td>설계</td><td>미니스코프 보호용</td></tr><tr><td>전동 컨트롤러</td><td>Thorlabs</td><td>KMTS50E</td><td>베이스 NeuView</td></tr><tr><td></td><td>장착용 NIDA/IRP</td><td>https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0</td><td>생체 내 이미징</td></tr>용 <tr><td>안과 연고</td><td>Puralube Vet 연고</td><td>NDC 17033-211-38</td><td>안과</td></tr><tr><td>PCR 튜브</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0622</td><td>GRIN 렌즈 이식</td></tr><tr><td>용 핀치 클램프</td><td>세계 정밀 기기</td><td>14040</td><td>튜브 폴리</td></tr><tr><td>테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 테이프</td><td>클램핑 용 TegaSeal PTFE 테이프</td><td>AA-58092</td><td>미니 스코프를 베이스에 고정</td></tr> 용 <tr><td>염화칼</td>륨 <td>시그마</td><td>7447-40-7</td><td>준비를 위해 CSF</td></tr><tr><td>로봇 팔</td><td>NIDA/IRP</td><td>맞춤형 GRIN</td><td>렌즈 이식용</td></tr><tr><td>식염수</td><td>Hospira</td><td>RL 7302</td><td>두 수술 모두</td></tr><tr><td>세트 나사</td><td>DECORAH LLC.</td><td>3BT-P9005-00-0025</td><td>미니스코프 베이스에 있는 황동 육각 너트를 나사로 고정하는 용도</td></tr><tr><td>&nbsp; 실리콘 고무 튜브, 0.062"ID, 1/8" OD</td><td>McMaster</td><td>2124T3</td><td>aCSF</td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td> 관개용 <td>시그마</td><td>144-55-8</td><td>aCSF</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>준비용 시그마</td><td>7647-14-5</td><td>aCSF</td></tr><tr><td>인산나트륨 단일염기성</td><td>준비용 시그마</td><td>7558-80-7</td><td>aCSF</td></tr><tr><td>입체성 스테이지</td> 준비용 <td>KOPF</td><td>모델 962 듀얼 초정밀 소형 동물 입체택시</td><td>두 수술 모두</td></tr><tr><td>멸균 면봉</td><td>Puritan REF</td><td>806-WC</td><td>두 수술용</td></tr><tr><td>수술 도구</td><td>Fine Science 도구</td><td>11251-35</td><td>수술용</td></tr><tr><td>봉합</td>사 <td>Sofsilk</td><td>REF SS683</td><td>바이러스 주입용</td></tr><tr><td>&nbsp; 주사기 필터(0.22 &마이크로; m)</td><td>Millex</td><td>SLGVR33RS</td><td>GRIN 렌즈 이식 중 aCSF 필터링용</td></tr><tr><td>바이러스 현탁액(AAV1-CamKII-GCamp6f)</td><td>Addgene</td><td>100834-AAV1</td><td>바이러스 주입</td></tr><tr><td></td><td></td>용 <td>역가: 2.8 X 10^13 GC/ml</td><td></td></tr><tr><td>자일라진</td><td>VETone</td><td>V1 510650</td><td>GRIN 렌즈 이식용</td></tr></tbody></table>

입체 택시 바이러스 주입 및 생체 내 심부 뇌를위한 그라디언트 인덱스 렌즈 이식

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

소형 형광 현미경 (miniscope)은 자유롭게 행동하는 동물의 생체 내 칼슘 이미징을위한 강력한 도구입니다. 그것은 기존의 다중 광자 칼슘 이미징 시스템에 비해 몇 가지 장점을 제공합니다 : (1) 컴팩트; (2) 경량; (3) 저렴한; (4) 자유롭게 행동하는 동물로부터 녹음 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 맞춤형 미니스코프 기록 시스템을 사용하여 심부 뇌 생체 내 칼슘 이미징을위한 뇌 수술을 설명합니다. 상기 준비 절차는 (1) 뉴런의 특정 하위군을 유전적으로 암호화된 칼슘 센서로 표지하기 위해 마우스 뇌의 원하는 뇌 영역에 바이러스를 입체화학적으로 주입하는 단계를 포함하는 세 단계로 구성된다; (2) 심부 뇌 영역에서 미니스코프 시스템으로 칼슘 이미지를 중계 할 수있는 그라디언트 인덱스 (GRIN) 렌즈의 이식; (3) 미니 스코프를 마우스 두개골 위에 부착하여 나중에 미니 스코프를 부착 할 수 있습니다. 생체 내 칼슘 이미징을 수행하기 위해 미니스코프를 홀더에 고정하고 신경 칼슘 이미지를 동시 행동 기록과 함께 수집합니다. 본 수술 프로토콜은 심뇌 생체 내 칼슘 이미징을 위한 임의의 상업적 또는 맞춤형 단일 광자 및 이광자 이미징 시스템과 호환된다.

도 1은 바이러스 주입, GRIN 렌즈 이식, 마우스 두개골에 대한 미니스코프 베이스의 부착, 및 미니스코프를 통한 생체내 칼슘 이미징을 포함하는 개략적인 실험 절차를 보여준다. 전체 절차는 ~ 2 개월이 걸립니다. 도 2는 생체내 칼슘 이미징을 위한 미니스코프 프로토콜에 설명된 주요 구성요소들을 도시한다. 그림 3은 GRIN 렌즈 이식 중 AutoStereota 소프트웨어의 인터페이스를 표시합니다. 그림 4는 생체 내 칼슘 이미징 동안 NeuView 및 행동 기록 소프트웨어의 인터페이스를 표시합니다.
생체 내 칼슘 이미징의 결과는 바이러스 주입과 GRIN 렌즈 이식 수술의 성공에 달려 있습니다. 도 5는 생체내 칼슘 이미징 기록으로부터의 다양한 결과(즉, 성공적이지 못함, 최적이 아닌 및 양호함)를 보여준다. 실패한 경우, 칼슘 이미지는 어둡거나 밝게 보일 수 있지만 일반적으로 활성 뉴런이 없거나 거의 나타나지 않습니다. 우리는 일반적으로 다섯 개 미만의 활성 뉴런이있는 경우 생체 내 칼슘 기록 실험을 추구하지 않습니다. 좋은 생체 내 칼슘 이미징은 일반적으로 수백 개의 활성 뉴런을 나타냅니다. 기록에 백 개 미만의 활성 뉴런이 포함되어 있다면, 우리는 그것을 차선책으로 간주합니다.
차선책과 양호한 기록 에서 생체 내 칼슘 이미징 실험이 추구되었고, 후속 데이터 분석이 수행되었다. 무비 1은 마우스 mPFC로부터의 대표적인 생체내 칼슘 이미징 기록을 나타낸다. 행동 비디오 및 칼슘 이미징 데이터는 일반적으로 별도로 처리됩니다. 마우스 동작 비디오는 수동으로 점수를 매길 수 있습니다. 칼슘 이미징 파일은 CaIman 칼슘 이미지 프로세싱 툴박스(24)를 사용하여 처리된다. 도 6은 양호한 생체내 칼슘 영상 기록으로부터의 대표적인 세포 맵 및 몇몇 칼슘 트레이스를 도시한다.
생체 내 칼슘 이미징을 완료 한 후, 마지막 단계는 바이러스 주입 및 GRIN 렌즈 이식이 원하는 뇌 영역에서 발생했는지 여부를 확인하는 것입니다. 이러한 목적을 위해, 마우스를 포스페이트 완충 식염수 (PBS)로 관류시키고, 이어서 4% 파라포름알데히드 (PFA)로 관류시켰다. 마우스 뇌를 수확하고, 12시간 동안 4% PFA에 후고정시키고, 4°C에서 PBS에 저장하였다. 이어서, 마우스 뇌를 비브라톰으로 50 μm 두께의 슬라이스로 절편화하였다. 뇌 절편을 DAPI로 염색하고 현미경 (프로토콜에 기술되지 않음)12 하에서 관찰하였다. 도 7은 실험 마우스로부터의 브레그마 전방 ∼1.94 mm 마우스 뇌 슬라이스로서, GRIN 렌즈가 이식된 위치를 추적하여 나타낸 것이다. GRIN 렌즈 트랙 아래 및 주위의 녹색 형광 영역은 mPFC 영역에서 GCaMP6f의 발현을 나타낸다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig01.jpg"> 도 1: 실험 절차의 개략적인 개요 . (A) mPFC에 바이러스의 입체형 주사. (b) mPFC에 GRIN 렌즈 이식. (C) 마우스 두개골에 미니스코프 베이스를 부착. (D) 미니스코프 장착 및 생체 내 칼슘 이미징. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig02.jpg"> 그림 2: 생체 내 칼슘 영상 화에 필요한 주요 구성 요소. (A) 직경 1mm, 길이 4.38mm의 GRIN 렌즈. (B) 뇌 조직 흡인에 사용되는 27G의 수동으로 연마된 무딘 엔드 바늘. (c) 바늘 홀더에 결합된 로봇 암. (D) 마우스 두개골에 미니스코프 베이스가 부착될 때까지 노출된 GRIN 렌즈를 보호하기 위해 PCR 튜브로부터 맞춤형 캡. (E) 육각 너트가 있는 미니스코프 홀더(베이스). (F) 스레드 부분이 PTFE 테이프로 감싸인 미니 스코프. (G) 잠금 나사로 베이스에 고정된 미니스코프. (H) 미니 스코프 지주 암. (I) XYZ 위치에서 미니 스코프의 움직임을 용이하게하는 데 사용되는 맞춤형 3D 전동 컨트롤러. (J) 마우스가 생체내 칼슘 이미징을 수행하지 않는 동안 노출된 GRIN 렌즈를 보호하기 위해 베이스에 고정된 보호 캡. (K) 케이블에 연결된 미니스코프. (L) 생체내 Ca2+ 이미징을 위한 데이터 수집 시스템. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig03.jpg"> 그림 3: 층별 뇌 조직 흡인 중 AutoStereota 소프트웨어의 인터페이스. (A) 2.17.1~2.17.3단계에 해당하는 인터페이스. (b) 단계 2.17.4 내지 2.17.6에 대응하는 인터페이스. (c) 단계 2.17.7 내지 2.17.9에 대응하는 인터페이스. (d) 단계 2.17.10 내지 2.17.12에 대응하는 인터페이스. 빨간색 상자는 입력 값을 강조 표시합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig04.jpg"> 그림 4: 생체 내 칼슘 이미징 중 NeuView 소프트웨어 및 행동 기록 소프트웨어의 인터페이스. (A) NeuView의 인터페이스. (B,C) 행동 기록 소프트웨어의 인터페이스. 빨간색 상자는 클릭해야 하는 단추를 강조 표시합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig05.jpg"> 그림 5: 최대 프로젝션 형광 세포는 가능한 결과의 범위를 보여주기 위해 매핑됩니다 . (A,B) 후속 데이터 분석에 허용되지 않는 생체 내 칼슘 이미징에 실패함. (A) 어둡고 5 개 미만의 활성 뉴런을 포함합니다. (B)는 밝지만 활동적인 뉴런이 없다. (c) 일부 활성 뉴런을 포함하는 차선의 생체내 칼슘 영상으로부터의 세포 맵. (d) 수백 개의 활성 뉴런을 포함하는 양호한 생체내 칼슘 영상으로부터의 세포 지도. 스케일 바: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig06.jpg"> 도 6: 성공적인 생체내 칼슘 영상화로부터의 대표적인 세포 맵 및 칼슘 과도기. 왼쪽 패널은 개방 필드 시험 동안 mPFC에 기록된 생체내 칼슘 이미징으로부터의 최대 프로젝션 형광 세포 맵이다. 녹음은 5 분 동안 지속됩니다. 오른쪽 패널은 15 관심 영역 (색상 일치)의 칼슘 과도 상태를 보여줍니다. 스케일 바: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig07.jpg"> 도 7: 실험 마우스의 사후 평가. 실험 마우스의 mPFC에서의 GCaMP6f 발현 및 GRIN 렌즈 이식에 대한 사후 평가. 직사각형 영역은 GRIN 렌즈 이식을 위한 경로를 나타낸다. GRIN 렌즈 이식 영역 아래의 녹색 영역은 GCaMP6f가 발현되었음을 확인하고 GRIN 렌즈가 원하는 뇌 영역에 정확하게 이식되었음을 확인합니다. Cg, 신구레이트 피질; PrL, 전변연계 피질; IL, 적외선 피질. 스케일 바: 400 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 1: NIDA에서 맞춤 제작한 미니스코프 시스템과 다른 미니스코프 시스템의 비교 7,8,9,10,11,13,25,26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049_Table%201_1.xlsx" target="_blank">이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
무비 1: 오픈 필드 테스트 동안 마우스 mPFC로부터의 생체내 칼슘 이미징 기록. 데모를 위해 이 동영상은 1분 녹화만 표시합니다. 원래 녹화 프레임 속도는 10 프레임 / 초입니다. 비디오는 원래 녹화보다 6 배 빠릅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/movie.mp4" target="_blank">이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Miniscope in vivo 칼슘 이미징은 자유롭게 행동하는 마우스에서 신경 역학과 미세 회로를 연구하는 강력한 기술입니다. 이 프로토콜은 미니 스코프를 사용하여 좋은 생체 내 칼슘 이미징을 달성하기 위해 뇌 수술을 수행하는 것을 설명합니다.

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages ...

Miniscope in vivo 칼슘 이미징은 연구자들이 자유롭게 행동하는 동물의 깊은 뇌 구조에서 수백 개의 뉴런에서 공간적으로나 시간적으로 조정 된 활동을 조사 할 수있게 해줍니다. Miniscope in vivo 칼슘 이미징은 세포 유형에 특정적, 대규모, 종방향 인 기록을 수행 할 수있는 능력을 포함하여 많은 이점을 제공합니다. 바이러스 주입 및 GRIN 렌즈 이식을 위한 당사의 수술 프로토콜은 심부 뇌 내 칼슘 이미징을 위한 상업적 또는 맞춤형 단일 광자 및 두 개의 광자 이미징 시스템과 호환됩니다.절차를 시연하는 것은 내 실험실의 대학원생 인 Rashmi Thapa가 될 것입니다. 마취 된 마우스의 면도 된 수술 부위를 소독 한 후 메스를 사용하여 중간 선을 따라 피부를 통해 두 센티미터 절개하여 두개골의 람다와 브레그마를 노출시킵니다. 브레그마에서 전방 1.94 밀리미터와 내측 측면 0.5 밀리미터의 위치에 0.5 밀리미터 치과 드릴 버를 배치 한 후, 두개골을 통해 드릴링을 시작하십시오.다음으로, 마이크로 펌프의 제어판을 사용하여 마이크로리터 주사기에 바이러스를 로딩하고 초당 50 나노리터의 유속으로 800 나노리터의 기포를 인출한 다음 800 나노리터의 바이러스를 인출한다. 바늘을 뇌 조직으로 천천히 움직여 등쪽 복부 1.75 밀리미터의 목표 Z 좌표로 이동 한 다음 등쪽 복부 1.65 밀리미터의 Z 좌표까지 약간 움직입니다. 제어판에서 실행 버튼을 눌러 바이러스를 주입하기 전에 분당 50 나노 리터의 유속으로 500 나노 리터의 바이러스를 주입하도록 마이크로 펌프를 설정하십시오.주사가 끝나면 피부 가장자리를 정렬하고 조심스럽게 4-0 봉합사로 절개를 닫으십시오. 감염을 예방하기 위해 꿰매어 진 부위에 항생제 연고를 바르십시오. 그라디언트 인덱스 또는 GRIN 렌즈를 이식하려면 미세한 가위를 사용하여 눈 사이의 앞쪽에서 람다 뒤의 뒤쪽까지 1.5 센티미터 높이와 1.5 센티미터 베이스의 피부의 삼각형 영역을 소비하십시오.두개골을 철저히 청소하고 말린 후 시아 노 아크릴레이트를 피부 가장자리에 바르고 피부를 두개골에 부착하십시오. 시아노아크릴레이트가 건조될 때 5분 후, 브레그마로부터 0.8 밀리미터의 전방 후부 1.94 밀리미터, 내측 측방 0.8 밀리미터의 위치에 직경 1.2 밀리미터의 치과용 드릴 버를 위치시킨다. 두개골을 뚫고 30 게이지 바늘 팁을 사용하여 경막을 제거했습니다.45도 각진 날카로운 포셉으로 뼈 조각의 모든 조각을 청소하십시오. 다음으로, 수동으로 연마 된 27 게이지의 무딘 끝 바늘을 10도 각도로 기울어 진 로봇 팔에 연결된 바늘 홀더에 부착하고 바늘 홀더의 다른 쪽 끝을 집 진공 시스템에 연결하십시오. 브레그마 버튼을 클릭하여 브레그마의 Z 좌표를 0으로 설정하기 전에 브레그마를 만지기 위해 바늘 끝을 찾으십시오.입력 X 값을 0.8로 설정하고, Y 값을 1.94로 입력하고, Z 값을 1.0으로 입력 한 다음 찾기 버튼을 클릭하여 바늘을 두개골의 뚫린 구멍 상단으로 이동하십시오. 바늘 끝을 뚫은 구멍에 중앙에 놓고 Z 위치 제로로 가져옵니다. 진공을 켜고 구부러진 팁이있는 30 게이지 바늘에 연결된 중력 제어 튜브 시스템을 통해 인공 뇌척수액 또는 ACSF로 노출 된 뇌 영역을 헹구기 시작하십시오.ACSF는 0.2 미크론 필터를 통해 여과되는 동안 95 % 산소와 5 % 이산화탄소의 가스 혼합물로 지속적으로 버블링됩니다. AutoStereota 소프트웨어를 사용하면 뇌 조직의 흡인이 네 라운드로 완료됩니다. 포부의 첫 번째 라운드의 경우 Z 값이 0으로 표시되는지 확인하십시오.그런 다음 zStep 세션에서 첫 번째 행과 두 번째 행을 클릭하고 확인하십시오. 첫 번째 행의 값을 0.2와 1로 설정합니다. 두 번째 행의 값을 0.15와 4로 설정합니다.모드 세션에서 바늘 크기를 27 게이지와 1.2로 설정하십시오. 딤지 0.9를 설정합니다. 다른 모든 값은 기본값입니다.포부를 시작하려면 NotSet, KeepZero 및 시작 버튼을 순차적으로 클릭하십시오. 흡인의 첫 번째 라운드는 깊이가 0.8 밀리미터이고 직경이 1 밀리미터 인 기둥 포켓을 생성합니다. 포부의 세 번째 라운드에서 zStep 세션의 첫 번째 행을 클릭하여 확인하고 첫 번째 행의 값을 1.8 및 1로 설정합니다.모드 세션에서 바늘 크기 27 게이지와 2.2를 설정하십시오. 다른 값을 이전 라운드와 동일하게 유지하여 포부를 시작하십시오. 포부의 세 번째 라운드 후, 기둥 주머니의 깊이는 1.8 밀리미터입니다.열망의 마지막 라운드는 주머니 바닥에 축적 된 혈액을 청소하는 것입니다. zStep 세션에서 첫 번째 행의 값을 1.6 및 1로 설정하고 포부를 시작하기 전에 모드 세션에서 바늘 크기 27게이지 및 2.2 및 Dims 0.6을 설정합니다. 주머니에 혈액이 없으면 진공을 멈추고 ACSF의 관개를 중단하고 바늘을 Z 좌표에서 2 밀리미터, 중앙으로 0.5 밀리미터 앞쪽으로 가져 오십시오.멸균 1mm GRIN 렌즈를 뇌 조직 주머니에 넣으십시오. 다음으로, 녹은 아가로스를 주걱으로 GRIN 렌즈와 뇌 조직 사이의 틈새에 적용하십시오. 아가로스가 겔을 형성한 후, 마이크로 블레이드를 이용하여 과량의 아가로스를 제거한다.치과용 시멘트 분말과 촉매액을 미리 냉각된 혼합에 잘 섞어 두개골에 자기경화 접착수지 시멘트층을 도포하고, 먼저 GRIN 렌즈를 둘러싸고 노출된 두개골 전체를 덮는다. 깨끗한 플라스틱 우물에서 치과 시멘트 분말과 검은 숯을 액체와 혼합하여 치과 시멘트의 첫 번째 층 위에 혼합물의 얇은 층을 적용하십시오. 다섯 분 동안 굳어지게하십시오.Miniscope를 케이블에 연결하고 사용자 지정 개발된 소프트웨어 NuView를 켭니다. NuView에서 하드웨어를 클릭하고 LED1을 확인한 다음 스트림 단추를 클릭하여 라이브 이미지를 봅니다. 라이브 스트리밍을 중지하려면 중지 버튼을 클릭하십시오.다음으로, 미니스코프를 맞춤형 미니스코프 홀딩 암에 고정시킵니다. 전동 컨트롤러의 도움으로 노출 된 GRIN 렌즈 바로 위에 Miniscope를 배치하여 렌즈 표면과 평행하게 만듭니다. 미니스코프를 GRIN 렌즈쪽으로 천천히 내리고 최적의 초점 평면이 발견 될 때까지 Z 위치를 조정하십시오.Miniscope의 위치를 변경하지 않고 Miniscope 베이스 주위에 치과 시멘트의 첫 번째 층을 적용하십시오. 시멘트가 경화 된 후 Miniscope가 마우스 머리에 스스로 설 수 있도록 지주 팔을 부드럽게 제거하십시오. 바닥 주위에 치과 시멘트의 두 번째 층을 적용하여 모든 틈새를 채우고 틈새에서 LED 조명이 누출되지 않도록하십시오.치과 시멘트가 굳어지게하십시오. 마우스를 이소플루란으로 잠깐 마취시킨 후, 보호 캡을 제거하기 전에 작은 스크루 드라이버로 베이스의 잠금 나사를 풀고 아세톤에 담근 면봉으로 GRIN 렌즈 표면을 청소합니다. Miniscope를 케이블에 연결하고 NuView 소프트웨어를 시작하여 무딘 포셉을 사용하여 약간 조이거나 느슨하게 하여 베이스를 기준으로 미니스코프의 위치를 조정하여 최적의 초점면을 식별하기 시작합니다.최상의 초점면이 결정되면 케이블을 분리하고 마우스를 홈 케이지에 다시 넣기 전에 잠금 나사를 조이십시오. 행동 카메라 소프트웨어를 켜서 라이브 스트림 기능을 통해 마우스 동작 경기장을 봅니다. 상단 카메라의 초점을 수동으로 조정합니다.스트로브 트리거를 선택하고 트리거 활성화/비활성화를 선택한 다음 레코드 버튼을 클릭합니다. 그런 다음 찾아보기를 사용하여 동작 기록이 저장될 위치를 선택합니다. 원하는 이미지 형식을 선택합니다.마우스를 경기장 가까이로 가져와 Miniscope를 데이터 수집 시스템에 연결된 케이블에 연결합니다. 그런 다음 마우스를 경기장 중앙에 놓습니다. 비헤이비어 카메라 소프트웨어에서 녹화 시작을 클릭합니다.NuView에서 LED1을 확인하고 캡처를 클릭 한 다음 버튼을 트리거하여 녹음을 시작하십시오. 이를 통해 칼슘 이미징과 마우스 행동을 동시에 기록 할 수 있습니다. 히트 중지 3, 000 프레임 후 파일을 저장합니다.녹음이 완료되면 마우스를 이소플루란으로 간단히 마취시키고 미니스코프를 바닥에서 분리한 다음 보호 캡을 베이스 위에 올려 놓고 마우스를 홈 케이지에 다시 넣습니다. 차선책의 생체 내 칼슘 영상의 세포 맵에는 일부 활성 뉴런이 포함되었지만 성공적인 이미징에는 집중 영역에 수백 개의 활성 뉴런이 포함되었습니다. 실패한 생체내 칼슘 영상화의 전형적인 예에서, 영역은 어둡고 다섯 개 미만의 활성 뉴런을 포함하거나, 영역은 밝았지만 활성 뉴런이 없는 것으로 관찰되었다.대표적인 분석에서, 연속적인 생체내 칼슘 이미징 기록으로부터의 최대 프로젝션 형광 세포 맵 및 칼슘 과도기가 도시된다. 실험 마우스의 내측 PFC에서의 GCaMP6f 발현 및 GRIN 렌즈 이식에 대한 사후 평가는 GCaMP6f가 발현되고 GRIN 렌즈가 원하는 뇌 영역에 정확하게 이식되었음을 나타냈다. 좋은 칼슘 이미징을 얻으려면 GRIN 렌즈를 이식하기 전에 출혈이 완전히 멈추고 현장에 혈전이 없는지 확인해야합니다.이 기술은 다른 인간 뇌 장애의 마우스 모델에서 신경 회로 변화를 연구하고 약물 후보가 변경된 회로를 정상화 할 수 있는지 테스트하는 데 사용될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

네크로 텍스의 microcircuits의 네트워크 역학을 이해하기 위해서는 동시에 뉴런의 다수의 활동을 기록하는 것이 필수적입니다. - 생체내에서 두 광자 칼슘 이미징 하나는 단일 셀 해상도 고밀도의 연결 인구의 활동을 기록하는 수있는 유일한 방법입니다.

레이어의 VIVO에서 2 광자 칼슘 이미징 마우스의 2 / 3

이 문서에서는, 우리는 50 μm의 루멘과 유리 모세관 바늘을하는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 크게, 뇌 손상을 감소 약물의 수동적 확산을 최소화하고 쥐 두뇌에 정확한 타겟팅을 수 있습니다.

마약, 바이러스성 벡터, 또는 세포 이식 전달 Microinjections 깊은 뇌 구조의 타겟팅

출처: Lee, H. et. al., Successful In vivo Calcium Imaging with a Head-Mount Miniaturized Microscope in the Amygdala of Freely Vihaving Mouse(자유롭게 행동하는 마우스의 편도체에서 헤드 마운트 소형 현미경을 사용한 성공적인 생체 내 칼슘 이미징). J. Vis. Exp. (2020)이 비디오는 구배 굴절률 또는 GRIN 렌즈와 소형 현미경을 사용하여 마우스의 생체 내 칼슘 이미징을 보여줍니다. 이 설정은 마찰이 없는 이동식 케이지 시스템 내에서 머리를 고정하여 뉴런을 자극하고 칼슘 이온 유입을 유발합니다. GRIN 렌즈는 뇌의 칼슘 신호를 포착하여 신경 활동을 실시간으로 시각화할 수 있습니다.

자유롭게 움직이는 마우스의 실시간 미세내시경 칼슘 이미징

출처: Thapa, R., et. al., 심부 뇌를 위한 입체성 바이러스 주입 및 그라디언트 인덱스 렌즈 이식 생체 내 칼슘 이미징.  J. Vis. Exp. (2021)이 비디오는 형질주입된 쥐의 미니스코프를 사용하여 뉴런 활동과 행동을 연관시키는 실시간 칼슘 이미징을 보여줍니다.

Miniscope를 사용한 쥐 내측 전전두엽 피질의 실시간 칼슘 이미징

여기에서 우리는 가상 현실 환경에서 동작하는 동안 마우스 피질의 두 광자 영상에 포함 된 실험 절차에 대해 설명합니다.

가상 현실 환경을 탐색 마우스의 두 광자 칼슘 이미징

생체 내 미세 엔도스코픽 칼슘 이미징은 자유롭게 행동하는 동물의 신경 활동을 실시간으로 모니터링 할 수있는 귀중한 도구입니다. 그러나, 편도체에 이 기술을 적용하는 것은 어려웠습니다. 이 프로토콜은 마우스에 있는 소형화된 현미경으로 편도체 세포를 성공적으로 표적으로 하기 위한 유용한 지침을 제공하는 것을 목표로 합니다.

자유롭게 행동하는 마우스의 편도체에 있는 머리 산 소형 현미경을 가진 성공적인 생체 내 칼슘 화상 진찰

우리는 복부 측에서 성인 마우스의 뇌간을 노출하는 프로토콜을 제시합니다. 소형 현미경을 가진 그라데이션 굴절 지수 렌즈를 사용하여, 칼슘 화상 진찰은 생체 내의 열등한 올리브 신경 소마타의 활동을 검사하기 위하여 이용될 수 있습니다.

생체 내 마우스 열등올리브의 칼슘 이미징

경화 중 치과용 시멘트의 수축은 베이스 플레이트를 대체합니다. 이 프로토콜은 베이스 플레이트를 시멘트로 만들 공간을 남기는 치과용 시멘트의 초기 기초를 만들어 문제를 최소화합니다. 몇 주 후, 베이스 플레이트는 새 시멘트를 거의 사용하지 않고 이 비계의 위치에 접합될 수 있으므로 수축을 줄일 수 있습니다.

마우스의 칼슘 과도 연구를 위해 대물 렌즈가 사전 고정된 베이스플레이팅과 미니스코프 사용

해마의 치상이랑(dentate gyrus)은 학습과 기억에서 필수적이고 뚜렷한 기능을 수행합니다. 이 프로토콜은 자유롭게 움직이는 마우스의 치상이랑에 있는 과립 세포의 생체 내 칼슘 이미징을 위한 일련의 강력하고 효율적인 절차를 설명합니다.

In Vivo: Calcium Imaging of Granule cells in the dentate gyrus of hippocampus in mice(생쥐의 해마 치열계에 있는 과립 세포의 In vivo 칼슘 이미징) 

이 프로토콜은 사회적 상태 조작(사회적 고립 및 사회적 재결합) 중 마우스의 소형화된 현미경(미니스코프)을 이용한 시상하부 신경세포의 생체 내 칼슘 이미징을 상세히 다룹니다. 이 방법은 사회적 욕구와 사회적 포만을 나타내는 시상하부 활동을 단일 뉴런 해상도로 영상화할 수 있게 하여 사회적 항상성의 기전적 연구를 가능하게 합니다.

생체 내 쥐의 사회적 행동 이해를 위한 시상하부 내 소형 현미경으로 칼슘 영상 촬영

배우세요 생체 내 칼슘 이미징을 위한 바이러스 주입 및 GRIN 렌즈 이식 수술법을 자유롭게 움직이는 생쥐에서 뇌 신경회로 동역학을 연구하는 이 방법은 뇌 질환 모델 연구에 활용됩니다.

입체 택시 바이러스 주입 및 생체 내 심부 뇌를위한 그라디언트 인덱스 렌즈 이식

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