Name: Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins(본질적으로 무질서한 단백질의 자기 연관성을 검출하고 특성화하기 위한 상자성 이완 향상) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: 배우세요 상자성 이완 향상 NMR 분광법을 사용하여 본질적으로 무질서한 단백질의 약하고 일시적인 상호작용을 검출하고 특성화하는 방법을. 이 기술은 원자 해상도로 동적 상태를 식별하고 정량화하여 생물학적 과정을 이해하는 데 도움을 줍니다.

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유용한 토론과 기술 지원을 해주신 Jinfa Ying 박사와 Kristin Cano에게 감사드립니다. DSL은 St. Baldrick's Scholar이며 St. Baldrick's Foundation(634706)의 지원을 인정합니다. 이 작업은 Welch Foundation(AQ-2001-20190330)에서 DSL로, Max and Minnie Tomerlin Voelcker Fund(DSL에 대한 Voelcker Foundation Young Investigator Grant), DSL에 대한 UTHSA 스타트업 펀드, CNJ에 대한 Greehey Graduate Fellowship in Children's Health에서 부분적으로 지원되었습니다. 이 작업은 샌안토니오에 있는 텍사스 대학교 보건 과학 센터의 기관 연구 핵심의 일부인 구조 생물학 핵심 시설에서 수행된 연구를 기반으로 하며, 연구 담당 부사장실과 Mays Cancer Center 약물 발견 및 구조 생물학 공유 리소스(NIH P30 CA054174).

모든 저자는 원고를 읽고 승인했습니다. 이해 상충은 선언되지 않습니다.

PRE를 사용하여 본질적으로 무질서한 단백질과 다양한 결합 파트너 사이에 낮은 집단에 존재하는 일시적인 상호 작용을 특성화하는 방법이 제시되었습니다. 제시된 예에서, 단백질은 자가 회합이며, 따라서 PRE는 분자간 및 분자내 상호작용의 조합으로부터 발생할 수 있다. 이 방법은 두 개의 서로 다른 단백질 간의 상호 작용을 특성화할 수 있는 이종 샘플로 쉽게 확장됩니다. 단백질의 상이한 영역이 어떻게 상호작용하는지에 대한 상보적인 정보는 단백질 내의 상이한 위치에 스핀 라벨을 배치함으로써 이용 가능하다. 추가적으로, NMR 활성(15N)과 NMR 비활성(14N) 종 사이의 스핀 라벨을 교대함으로써, 관찰된 PRE의 분자내 및 분자간 소스가 서로 분화되어 만남 복합체에 대한 정보를 제공할 수 있습니다. 여기에 요약된 실험은 복잡한 상호작용이 마이크로초 단위의 시간 척도에서 발생하더라도 이를 보고할 수 있다(13).
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내인성 장애(ID)는 안정적인 2차 또는 3차 구조로 자발적으로 접히지 않고 생물학적으로 활성인 단백질(IDP) 또는 단백질 내 영역(IDR)을 설명합니다. 일반적으로 IDP/IDR의 기능은 생리학적 조건에서 생체 분자와의 특이적이면서도 가역적인 상호작용을 촉진하는 것이다1. 따라서, 국내실향민 및 IDR은 다중단백질 복합체의 모집, 조직 및 안정화, 예를 들어, 스플라이소좀2의 조립 및 활성, DNA 손상부위에서의 성분의 모집 및 조직화3, 전사 복합체4 또는 염색질 리모델러BAF5의 모집의 조직 및 안정화를 포함하는 다양한 세포 기능에 관여한다. 또한 IDP는 서로 다른 결합 파트너에 대한 난잡함으로 인해 세포 단백질 네트워크를 통한 정보 전달을 매개할 수 있는 신호 연결 고리에서 발견됩니다6. 최근 연구에서는 IDR 영역이 액체-액체 상 분리 과정을 통해 생체 분자 응축수를 자가 결합하는 경향이 있음이 밝혀졌다7. ID를 포함하는 전술한 기능들 중 많은 것들은 또한 응축수 형성(condensate formation)8의 어떤 측면을 포함하는 것으로 생각된다. 생체 분자 복합체 조립, 안정화, 스캐폴딩 및 신호 전달에 대한 ID의 중요성에도 불구하고, IDP 및 IDR은 일반적으로 X선 결정학 또는 극저온 전자 현미경을 사용한 구조 조사에 적합하지 않기 때문에 특정 상호 작용의 원자 세부 사항을 식별하기 어렵습니다.
핵 자기 공명(NMR)은 단단하거나 균질한 구조 앙상블의 존재에 의존하지 않고 개별 핵의 즉각적인 국소 환경에 대해 보고하기 때문에 ID를 조사하는 데 이상적인 기술입니다. 주어진 분자 내 핵의 공명 주파수(resonant frequency) 또는 화학적 이동(chemical shift)은 국소 전자 분포에 의해 유도된 약한 자기장의 영향을 받으며, 이는 다시 결합 길이, 각도, 다른 핵의 근접성, 결합 파트너와의 상호작용 및 기타 요인에 따라 달라진다9. 따라서 각 핵은 지역 화학 환경의 변화에 민감한 고유한 부위별 구조 프로브 역할을 합니다. 이러한 장점에도 불구하고 NMR은 벌크 기술이며 관찰된 화학적 이동은 특정 핵에 의해 샘플링된 모든 환경의 평균입니다. 이 문제에 설명된 다양한 NMR 기술은 평균 화학적 이동10,11에 포함된 고에너지, 저인구 생체 분자 형태에 대한 구조적, 동적 및 운동학적 정보를 복구하기 위해 개발되었습니다. 비록 일시적인 인구가 채워져 있기는 하지만, 이들 상태의 식별과 정량화는 기능적 메커니즘의 세부사항을 결정하는 데 중요하다12. 예를 들어, IDP 및 IDR의 경우, 구조적 앙상블은 생리학적 결합 파트너와의 만남 복합체의 형성을 위해 생산적인 샘플 형태를 우선적으로 샘플링하도록 편향될 수 있습니다. 이러한 상태의 검출과 잔류물 특이적 분자 간 및 분자 내 상호 작용 및 역학의 식별은 단백질 기능 및 복합체 형성의 기본 구조적 메커니즘을 결정하는 데 중요합니다.
IDP/IDR 매개 생체 분자 복합체의 형성에 중요한 일시적이고 인구가 적은 상태를 조사하기 위해 상자성 이완 향상(PRE) NMR을 사용하기 위한 프로토콜이 설명되어 있습니다13. 이 접근법은 α-시누클레인 14,15 또는 FUS 16의 자가 결합으로부터 아밀로이드 원섬유의 조립을 촉진하는 것과 같은 일시적인 단백질-단백질 상호작용을 연구하고 신호 전달 단백질17 사이의 특정 단백질-단백질 상호작용을 특성화하는 데 유용합니다. 자기 연관 IDP의 예가 제시되며, 특정 분자 간 및 분자 내 상호 작용이 우선적으로 압축된 상태와 자기 결합을 유도하는 부위별 상호 작용을 초래합니다.
PRE는 등방성 g-텐서가 있는 상자성 중심에 대한 핵의 자기 쌍극자 상호 작용에서 발생하며, 일반적으로 질산화물 그룹 또는 상자성 금속 원자18에 짝을 이루지 않은 전자의 형태로 공급됩니다(그림 1). 이방성 g-텐서를 가진 원자도 PRE 효과를 생성하지만, 이러한 시스템의 분석은 의사 접촉 이동(PCS) 또는 잔류 쌍극자 결합(RDC)에 의해 기여되는 교란 효과로 인해 더 어렵습니다13,19. 핵과 상자성 중심 사이의 상호 작용 강도는 둘 사이의 <r-6> 거리에 따라 달라집니다. 이 상호 작용은 핵 이완 속도를 증가시켜 장거리 상호 작용 (~ 10-35 Å)에서도 검출 가능한 선이 넓어지게하는데, 이는 짝을 이루지 않은 전자의 자기 모멘트가 매우 강하기 때문입니다20,21. PRE로 과도 상태를 감지하는 것은 다음 두 가지 조건이 충족되는 경우 가능합니다. (1) 일시적인 상호 작용은 NMR 시간 척도에서 빠른 교환에 있습니다(관찰된 화학적 이동은 교환 상태의 모집단 가중 평균임). (2) 상자성 중심 거리까지의 핵은 주요 상태(11)에서보다 일시적으로 채워진 상태에서 더 짧다. 횡방향 PRE는 Γ2로 표시되며, 실용적인 목적을 위해 상자성 중심과 반자성 대조군을 포함하는 샘플 사이의 1H횡방향 이완 속도의 차이로부터 계산됩니다. 빠르고 느린 교환 체제에서 PRE 이론 및 관련 의사 접촉 교대에 대한 심층적 인 치료를 위해 독자는 Clore와 동료13,22의 포괄적 인 검토를 참조합니다. 여기서, 1HN-Γ 2 가 빠른 교환 체제에있는 상황 만 고려되며, 여기서 PRE의 r-6- 의존성으로 인해 관찰 된 이완 속도는 상자성 중심이 핵에 접근하는 거리와 그 형태에서 소비하는 시간과 관련이 있습니다. 따라서 근접 접근을 포함하지 않는 과도 형태는 작은 PRE를 생성하는 반면, 근접 상호 작용은 수명이 짧더라도 더 큰 PRE를 생성합니다.
IDP의 경우 PRE는 단일 분자 내(분자 내)와 개별 분자 간(분자 간)에서 발생하는 상호 작용을 측정하고 구별하는 데 사용됩니다. 가시적(예: 15N-표지) 또는 가시적(예: 14N-자연적 존재비) NMR 단백질에 상자성 중심을 부착하여 PRE의 소스(분자간 또는 분자내)를 결정할 수 있습니다(그림 2). 시스테인 잔기를 도입하는 부위-지시적 돌연변이유발은 단백질23에 상자성 중심(스핀-라벨)을 부착하는 편리한 접근법이다. 금속 킬레이트화(EDTA 기반) 및 자유 라디칼(니트록시드 기반)을 포함하여 스핀 라벨로 사용하기 위해 여러 유형의 분자가 제안되었습니다.24. 다양한 산화질소 스핀 표지가 설명되었으며 메탄티오술포네이트, 말레이미드 및 요오도아세트아미드25,26과 같은 다양한 시스테인 반응성 화학 물질과 함께 사용할 수 있습니다(그림 1). 태그 또는 링커의 고유한 유연성은 특정 분석에 문제가 될 수 있으며, 이러한 상황에서는 부피가 큰 화학 그룹을 추가하거나 태그를 단백질에 고정하기 위해 두 번째 링커를 사용하는 것과 같이 태그의 움직임을 제한하기 위한 다양한 전략이 제안되었습니다(27). 28. 추가로, 상업적으로 이용가능한 태그는 부분입체이성질체 단백질을 함유할 수 있지만, 일반적으로 이것은 관찰된 PRE29에 기여하지 않을 것이다. 말레이미드 화학을 통해 유리 시스테인에 부착된 3-말레이미도-PROXYL의 사용은 쉽게 구할 수 있고 비용 효율적이며 비가역적이며 환원제인 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)이 라벨링 반응 전반에 걸쳐 용액에서 유지될 수 있기 때문에 설명됩니다. 3-Maleimido-PROXYL은 등방성 g-텐서를 갖기 때문에, PCS 또는 RDC가 유도되지 않으며, 상자성 및 반자성 샘플(13) 모두에 대해 동일한 화학적 이동 할당이 사용될 수 있다.
상기 1HNT2는 8 내지 12개의 시점으로 구성된 완전한 진화 시리즈를 수집하는 것만큼 정확한 것으로 이전에 밝혀진 2개의 시점 전략(Ta, Tb)을 사용하여 측정된다(30). 제 1 시점 (Ta)은 실제적으로 0에 가깝게 설정되고, 제 2 시점의 최적 길이는 주어진 샘플에 대해 예상되는 가장 큰 PRE의 크기에 의존하며, 다음으로부터 추정될 수 있다: Tb~1.15/(R2,dia+Γ2) 여기서 R2,dia는 반자성 샘플(13)의 R2를 나타낸다. 가장 큰 PRE의 크기가 알려지지 않은 경우, Tb를 단백질의 1H T2의 ~1배로 설정하는 것은 양호한 초기 추정치이며, 신호 대 잡음을 개선하기 위해 T2를 조정함으로써 추가로 최적화된다. 이 2점 측정 전략은 PRE를 측정하는 데 필요한 실험 시간을 크게 단축하고, 특히 분자 간의 비특이적 접촉의 영향을 최소화하기 위해 상대적으로 희석된 샘플이 사용되기 때문에 더 많은 신호 평균화를 위한 시간을 허용합니다. HSQC 기반 펄스 시퀀스는 1H, N-T2를 측정하는 데 사용되며 다른 곳에서도30에 자세히 설명되어 있습니다. 감도 향상을 위해 순방향 및 후방 INEPT 전송의 하드 펄스를 성형 펄스로 대체할 수 있습니다. 대안적으로, 시퀀스는 TROSY-기반 판독(31)으로 쉽게 변환된다. IDP는 일반적으로 유사한 크기의 구형 단백질보다 훨씬 더 긴 횡방향 이완 속도를 가지므로 (내재적 장애로 인해) 더 좁은 선폭을 초래하기 때문에 간접 차원에서 긴 획득 시간을 사용하여 스펙트럼 분해능을 개선하고 IDP에 내재된 화학적 이동 분산 제한을 완화할 수 있습니다.
PRE는 단백질-단백질 및 단백질-핵산 상호작용, 특히 일시적이거나 인구가 적은 상호작용을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 단백질 정제, 부위 지정 스핀 라벨링, 펄스 프로그램 설정 및 보정, NMR 데이터 처리 및 해석을 위한 단계를 포함하여 PRE 측정에 적합한 NMR 샘플을 준비하기 위한 자세한 프로토콜이 제공됩니다. 데이터 품질 및 실험 결과에 영향을 미칠 수 있는 중요한 실험 고려 사항(샘플 농도, 스핀 라벨 선택, 상자성 성분 제거)이 전체적으로 언급됩니다.

<table><tbody><tr><td>0.45 & 마이크로; m 및 0.22 &마이크로; m 주사기 필터</td>: <td>Millipore Sigma</td><td>SLHVM33RS SLGVR33RS</td><td>필터 용해물, 첫 번째 정제 단계 전, 그리고 크기 배제 크로마토그래피 전.</td></tr><tr>박테리아 변형을 위한 <td>100mm 페트리 접시</td><td>Fisher</td><td>FB0875713</td><td>한천 플레이트.</td></tr><tr><td>14N 염화암모늄</td><td>Sigma Aldrich</td><td>576794</td><td>M9 매체에서 15N을 사용하면 NMR 가시 단백질이 생성되고 14N은 NMR 보이지 않는 단백질</td></tr><tr><td>을 생성합니다15N 염화암모늄</td><td>Sigma Aldrich</td><td>299251</td><td>M9 배지에서 15N을 사용하면 NMR 가시 단백질이 생성되고, 14N은 NMR 보이지 않는 단백질을 생성함</td></tr><tr><td>3 L Fernbach 배플 플라스크</td><td>Corning</td><td>431523</td><td>세균 발현 배양</td></tr><tr><td>3-Maleimido-Proxyl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>253375</td><td>Nitroxide 스핀 라벨</td></tr><tr><td>50mL 원추형 원심분리기 튜브</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-432-22</td><td>용액/단백질 저장</td></tr><tr><td>Amicon 원심 필터</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC900308</td><td>단백질 농도</td></tr><tr><td>Ampicillan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5354</td><td>선택적 마커를 위한 항생제, 정확한 선택은 발현에 따라 다릅니다 플라스미드</td></tr><tr><td>구성 분석 저울</td><td>Oahus</td><td>30061978</td><td>Explorer Pro, 시약 계량용</td></tr><tr><td>Ascorbic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>AX1775</td><td>니트록사이드 스핀 라벨</td></tr><tr><td>감소, 오토클레이브</td><td></td><td></td><td>, 유리 제품 및 배양 배지 살균</td></tr>, <tr><td>염화칼슘</td>, <td>시그마 Aldrich</td><td>C4901</td>, <td>M9 배지 구성 요소</td></tr>, <tr><td>원심분리기 병</td><td>Thermo Fisher</td><td>010-1459</td><td>재조합 단백질 발현 후 E. coli 세포 수확</td></tr>, <tr><td>원심분리기, 수동 크랭크</td>, <td>Thomas Scientific</td><td>0241C68</td><td>NMR 튜브를 수용할 수 있는 15mL 버킷이 있는 Boekel 수동 구동 저속 원심분리기</td></tr><tr><td>Chelex 100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7901</td><td>버퍼 용액에서 오염 상자성 화합물 제거</td></tr><tr><td>NMR, 데이터 처리 및 분석 소프트웨어 패키지와 호환되는 컴퓨터 워크스테이션</td><td></td><td></td><td></td>, Linux 또는 Mac OS, NMRPipe 및 Sparky</tr><tr><td>중수소 산화물</td>, <td>Sigma Aldrich</td><td>151882</td><td>NMR 잠금 신호에 필요</td></tr><tr><td>포도당</td><td>시그마 Aldrich</td><td>D9434</td><td>M9 매체 구성</td></tr><tr><td>요소 이염기성 인산나트륨</td><td>시그마 Aldrich</td><td>S5136</td><td>M9 미디어 구성</td></tr><tr><td>요소 Ellman의 시약(5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid)</td><td>Thermo Fisher</td><td>22582</td><td>유리 시스티엔 잔기의 정량화</td></tr><tr><td>고속 원심분리 튜브</td><td>Thermo Fisher</td><td>3114-0050</td><td>세균성 용해물을 제거하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>고자기장 NMR 기기 (600 - 800 MHz)</td><td>Bruker</td><td></td><td>멀티채널 극저온 프로브 및 온도 제어</td></tr><tr><td>IMAC 컬럼 장착, HisTrap FF</td><td>Cytvia</td><td>17528601</td><td>미처리 박테리아 용해물</td></tr><tr><td>이소프로필 B-D-티오갈락토시드(IPTG)</td>의 초기 분획<td>Sigma Aldrich</td><td>I6758</td> lac operator LB 한천 Thermo<td>의 제어 하에 있는 유전자에 대한 단백질 발현 유도</td></tr><tr><td></td><td> Fisher</td><td>22700025</td><td>항목은 관심 단백질을 발현하기 위해 대장균을 변형시키는 데 사용되며, 이러한 항목 중 하나를 유사한 제품으로 대체하는 것이 허용됩니다.</td></tr><tr><td>LB 브로스</td>, <td>Thermo Fisher</td><td>12780052</td><td></td></tr><tr><td>저압 크로마토그래피 시스템</td>, <td>Bio-Rad</td><td>7318300</td>, <td>BioRad, BioLogic은 IMAC 컬럼</td></tr>, <tr><td>황산마그네슘</td>, <td>Sigma, Aldrich</td>, <td>M7506</td>, <td>M9 매체 구성 요소</td></tr>, <tr><td>중압 크로마토그래피 시스템</td>, <td>Bio-Rad</td><td>7880007</td><td>다중 파장 검출기, pH 및 전도도 모니터, 자동 분획 수집기</td></tr><tr><td>MEM 비타민 용액</td>이 장착된 BioRad NGC <td>Sigma Aldrich</td><td>M6895</td><td>M9 매체 구성 요소</td></tr><tr><td>Microfluidizer</td><td>Avestin</td><td>EmulsiFlex-C3</td><td>빠르고 효율적인 박테리아 세포 용해</td></tr><tr><td>제공 Micropipettes</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>적절하게 맞는 일회용 팁이 있는 보정된 마이크로피펫터 세트(예: Eppendorf와 같은 여러 제조업체에서 사용 가능)</td></tr><tr><td>일염기성 인산칼륨</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1551139</td><td>M9 매체 구성 요소</td></tr><tr><td>NMR 피펫</td><td>Sigma Aldrich</td><td>255688</td><td>NMR 튜브에서 샘플 제거</td></tr><tr><td>NMR 샘플 튜브</td><td>NewEra</td><td>NE-SL5</td><td>고자기장 NMR 분광계</td></tr><tr><td>에 적합분취용 원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>Avanti J-HC Harvest</td><td>E. coli cells after recombinant protein expression Round</td></tr><tr><td>bottom polystyrene centrifuge tubes</td><td>Corning</td><td>352057</td><td>Clear bacterial lysate</td></tr><tr><td>Shaking incubator</td><td>Eppendorf</td><td>S44I200005</td><td>E. coli starter and expression cultures의 온도 조절 성장 Sodium</td></tr><tr><td>chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5886</td><td>M9 매체 구성</td></tr><tr><td>요소 초음파 처리 수조 및 진공 소스</td><td>Thomas Scientific</td><td></td><td>버퍼 용액을 탈기하는 데 사용</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Thermo Fisher</td><td>FB505110</td><td>박테리아 세포 용해 또는 전단 박테리아 DNA</td></tr><tr><td>분광 광도계</td>에 사용 <td>Implen</td><td>OD600 Dilu 광도계</td><td>E.coli 단백질 발현 배양의 성장 모니터링</td></tr><tr><td>Superdex 200 16/600 크기 추출 colum</td><td>Cytvia</td><td>28989333</td><td>최종 단백질 정제 단계</td></tr><tr><td>Topspin 소프트웨어, 버전 3.2 이상</td><td>Bruker</td><td></td><td>NMR 기기용 운영 소프트웨어</td></tr><tr><td>형질전환 유능 대장균 세포</td><td>Thermo Fisher</td><td>C600003</td><td>One Shot BL21 Star(DE3) 화학적으로 유능한 대장균, 다른 균주는 호환 가능할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td><td>ThermoFisher</td><td>20490</td><td>일부 sulfhydryl-반응성 접합체와 호환되는 환원제</td></tr><tr><td>UV-Vis 분광 광도계</td><td>Implen</td><td>NP80</td><td>단백질 농도를 측정합니다.</td></tr><tr><td>수조, 온도 제어</td><td>ThermoFisher</td><td>FSGPD25</td><td>박테리아 형질전환의 열 충격 단계용</td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y1625</td><td>필요한 경우 M9 매체 보충용</td></tr></tbody></table>

paramagnetic relaxation enhancement for detecting and characterizing self-associations of intrinsically disordered proteins(본질적으로 무질서한 단백질의 자기 연관성을 검출하고 특성화하기 위한 상자성 이완 향상)

Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins

본질적으로 무질서한 단백질과 단백질 내의 본질적으로 무질서한 영역은 인간 프로테옴의 크고 기능적으로 중요한 부분을 구성합니다. 이러한 서열의 매우 유연한 특성으로 인해 다양한 생체 분자 파트너와 약하고 장거리이며 일시적인 상호 작용을 형성할 수 있습니다. 구체적이지만 친화도가 낮은 상호 작용은 무차별 결합을 촉진하고 본질적으로 무질서한 단일 세그먼트가 다수의 표적 부위와 상호 작용할 수 있도록 합니다. 이러한 상호 작용의 일시적인 특성으로 인해 단백질에 의존하여 하나의 우세한 형태를 형성하는 구조 생물학 방법으로 특성화하기 어려울 수 있습니다. 상자성 이완 강화 NMR은 약하고 일시적인 상호 작용의 구조적 토대를 식별하고 정의하는 데 유용한 도구입니다. 본질적으로 무질서한 단백질과 단백질, 핵산 또는 기타 생체 분자 파트너 사이에 형성되는 저인구 만남 복합체를 특성화하기 위해 상자성 이완 향상을 사용하기 위한 자세한 프로토콜이 설명됩니다.

분자 내 1HN-Γ 2 PRE는 RNA 결합 단백질 EWSR142의 저복잡성 도메인에서 유래된 자가 회합, 본질적으로 무질서한 단편(잔기 171-264)에 기록되었습니다(그림 3). 스핀-라벨 부착 지점에 근접한 순차적 근접 잔기(예를 들어, 도 3의 잔기 178 또는 260)는 상당히 넓어질 것으로 예상되며, 스펙트럼에서 검출가능하지 않다. 부착 지점으로부터 순차적으로 이격된 잔류물은 아직 향상된 Γ2를 나타내어 스핀 라벨에 공간적으로 가까웠다(10-35 Å). EWSR1 171-264의 경우, PRE 효과의 원인을 귀속시키는 것은 잔기 간 및 잔기 내 접촉의 조합에서 발생할 수 있고 핵에서 상자성 중심까지의 거리, 해당 형태의 집단 및 전자와 핵 스핀을 연결하는 벡터의...

본질적으로 무질서한 단백질에서 약하고 일시적인 분자 간 및 분자 내 상호 작용을 감지하기 위한 상자성 이완 강화 NMR 분광법의 적용을 위한 프로토콜이 제시됩니다.

Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins(본질적으로 무질서한 단백질의 자기 연관성을 검출하고 특성화하기 위한 상자성 이완 향상)

Intrinsically disordered proteins and intrinsically disordered regions within proteins make up a large and functionally significant part of the human ...

상자성 이완 강화 기술은 분자간 거리를 특성화 및 측정하고 일시적 및/또는 인구가 적은 생체 분자 상호작용을 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 여기에서 우리는 단백질 응축 이전의 상호 작용을 포착하기 위해 이 기술을 적용했습니다. PRE의 감도는 다른 NMR 기술로는 보이지 않고 접근할 수 없는 동적 상태의 원자 분해능 식별, 검출 및 정량화를 가능하게 합니다.이 프로토콜의 주요 단계에는 비접합 니트록사이드 스핀 라벨을 제거하고 스펙트럼을 주의 깊게 분석하여 피크 높이를 정확하게 측정하는 것이 포함됩니다. 또한 NMR 실험 설정 및 펄스 보정 중에 주의해야 합니다. 먼저, 관심 있는 15N 동위원소 표지 단백질의 20배 몰 초과량으로 원액에서 3-maleimido-PROXYL을 추가합니다.실온 또는 섭씨 4도에서 빛과 산소로부터 보호하고 부드럽게 흔들거나 너트로 밤새 배양하십시오. 다음날, 단백질 샘플의 광범위한 투석 또는 겔 여과를 사용하여 비특이적 용매 PRE를 방지하기 위해 반응하지 않은 자유 스핀 표지를 제거합니다. 그런 다음 Ellman의 시약을 사용하여 용액의 유리 설프하이드릴기를 정량화합니다.마이크로플레이트 리더를 사용하여 흡광도를 측정하고 표준 곡선을 구성합니다. 분자내 PRE를 측정하기 위해, NMR에 적합한 완충액에서 15N 동위원소 농축 스핀 표지 단백질을 최소 100마이크로몰 이상 300마이크로몰 이하의 농도로 준비한다. 그런 다음 긴 줄기 유리 피펫 또는 마이크로 피펫을 사용하여 NMR 샘플을 하이 필드 자석에 사용하기에 적합한 5mm NMR 튜브로 옮깁니다.샘플을 자석에 넣습니다. lock 명령을 사용하여 중수소 신호를 잠그고 시설 프로토콜에 따라 양성자 채널을 조정하고 일치시킵니다. 그런 다음 상단 shim 서브루틴을 사용하여 심을 조정하여 용매 신호 억제를 최적화합니다.다음으로, P-OPT 프로그램을 사용하여 양성자 펄스를 보정한다. 그런 다음 표준 샘플에 대해 15N 펄스를 보정합니다. shape tool 서브루틴을 사용하여 형태화된 펄스에 대한 올바른 감쇠를 판별하십시오.그런 다음 폴더 아이콘을 클릭하여 적절한 펄스 모양 파일을 엽니다. 형성된 펄스는 수집 파라미터의 펄스 파라미터 섹션에서 찾을 수 있습니다. 펄스 정의 파일을 로드한 후 파형 분석(Analyze Waveform)을 클릭한 다음 형상 통합(Integrate Shape)을 클릭합니다.보정된 양성자 90도 하드 펄스, 원하는 모양 펄스 길이 및 회전을 입력합니다. 그런 다음 보정된 90도 펄스에 대한 감쇠에 전력 레벨 변화를 추가하여 성형된 펄스의 전력 레벨을 계산합니다. 표준 양성자 15N HSQC를 기록하여 스윕 폭, 캐리어 주파수를 최적화하고 물 억제를 확인합니다.마지막으로 SW 및 TD 명령을 사용하거나 해당 대화상자에서 직접 스윕 폭과 간접 치수 증분 수를 조정합니다. 앞에서 설명한 대로 모양이 지정된 펄스를 보정합니다. 그런 다음 Acquisition Parameters 탭의 pulse parameters 섹션에 교정된 펄스 길이를 입력합니다.2시간 지연 지점 접근법을 사용하여 아미드 양성자 T2를 측정하려면 VD 목록 파일을 편집하여 시간 지연을 설정합니다. 첫 번째 지연은 0.01밀리초로 설정됩니다. 예상 최대 PRE와의 관계를 사용하여 두 번째 지연을 선택합니다.그런 다음 첫 번째 및 두 번째 지연 스펙트럼의 첫 번째 증분을 비교하고 신호가 초기 값의 40-50% 사이로 감쇠하도록 두 번째 지연을 조정하여 적절한 값을 결정합니다. 충분한 신호 평균화를 위해 기록할 복소점의 개수와 스캔 횟수를 결정합니다. 그런 다음 EXPT 명령을 사용하여 실험 시간을 계산하고 ZG 명령으로 실험을 시작합니다. 아스코르브산나트륨을 NMR 완충액에 용해시킨 후 pH를 원래 NMR 완충액과 일치하도록 조정합니다.그런 다음 아스코르브산을 스핀 라벨의 농도에 비해 10배 몰 초과로 NMR 튜브에 첨가하여 튜브의 가장자리 아래에 물방울을 놓습니다. 튜브의 뚜껑을 덮고 조심스럽게 뒤집어 섞습니다. 손으로 크랭크 된 원심 분리기에서 10-20 초 동안 200-400G에서 회전시켜 튜브 바닥에 샘플을 침전시킵니다.튜브를 호일로 감싼 후 최소 3시간 동안 반응을 진행하십시오. 그런 다음 상자성 샘플에 사용된 것과 동일한 매개변수를 사용하여 반자성 샘플에 아미드 양성자 T2를 기록합니다. 분자내 아미드 양성자 감마 PRE는 RNA 결합 단백질 EWSR1의 낮은 복잡성 도메인에서 유래된 자가 회합 본질적으로 무질서한 단편에 기록되었습니다.스핀 라벨 부착 지점에 근접한 순차적 근접의 잔류물은 상당히 넓어질 것으로 예상되며, 스펙트럼에서 검출가능하지 않다. 부착 지점으로부터 순차적으로 이격되었지만 향상된 감마를 보인 잔류물은 스핀 라벨에 공간적으로 가까웠다. 본질적으로 무질서한 단백질의 경우 퓌레를 기록하고 분석하면 분자 내 접촉 및 일시적인 상호 작용 표면에 대한 정보를 얻을 수 있습니다.PRE 측정을 동적 광 산란, 크기 배제 크로마토그래피, 분석 초원심분리 및 계산 방법과 같은 다른 생물물리학적 방법과 결합하면 더 깊은 통찰력을 얻을 수 있습니다. PRE 측정은 인구 밀도가 낮은 일시적인 상태를 특성화하는 데 도움이 됩니다. 이 접근법은 분자 인식, 알로스테릭 구조적 선택, 상 분리를 통한 막이 없는 세포 소기관 조립을 포함한 조립 과정과 같은 무수한 생물학적 과정에 중요한 상호 작용을 특성화하기 위해 확장될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

본 실험의 목적은 파악하고 물 속에 자기 조립 discotic amphiphiles의 크기, 모양과 안정성을 조절하는 것입니다. 수성 기반의 supramolecular 폴리머의 경우 제어와 같은 수준은 매우 어렵습니다. 우리는 반발하고 매력적인 상호 작용을 모두 사용하는 전략을 적용합니다. 이 시스템을 특성을 적용하여 실험적인 기법을 광범위하게 적용할 수 있습니다.

물에 Supramolecular 폴리머의 크기, 모양과 안정성을 제어

이 기사에서는 전자 상자성 공명 연구를 위한 5층 리간드 게이트 채널의 위치 지정 스핀 라벨링 및 재구성 방법에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 모든 멤브레인 단백질에 적용할 수 있습니다. 여기에 설명된 재구성 방법은 정의된 지질 시스템에서 거시적 및 단일 채널 전류의 패치 클램프 측정에도 사용할 수 있습니다.

사이트 감독 스핀 라벨 및 펜타 머 리간드 - 게이 티드 이온 채널의 EPR 분광 연구

여기에서는 Tau 단백질을 사례 연구로 사용하여 핵 자기 공명 분광법(NMR)으로 본질적으로 무질서한 단백질의 다중 인산화를 식별하는 방법을 설명합니다. 재조합 Tau는 데이터 수집 및 분석 전에 kinase에 의해 동위원소로 농축되고 in vitro에 변형됩니다.

본질적으로 무질서 단백질의 여러 인산화의 식별을위한 핵 자기 공명 분광학

원자 해상도 supramolecular 단백질 어셈블리의 구조 생물학 현상의 다양 한에서 그들의 중요 한 역할 때문에 높은 관련성의 이다. 여기, 우리는 매직-각도 회전 하는 고체 핵 자기 공명 분광학 (매스 SSNMR)에 의해 불용 성 및 비 결정 고분자 단백질 어셈블리에 고해상도 구조 연구를 수행 하는 프로토콜을 제시.

고체 핵 자기 공명 분광학에 의해 고분자 어셈블리의 원자 규모 구조 연구

우리는 빠른 필드 사이클 이완을 사용하여 동적 핵 편광에 의해 과분극 13C 농축 화합물의 스핀 격자 이완 시간의 자기장 의존성을 측정하는 프로토콜을 제시한다. 구체적으로, 우리는[1-13C] pyruvate로 이것을 입증했습니다, 그러나 프로토콜은 그밖 과극화한 기판으로 확장될 수 있었습니다.

과분극[1-13C] 피루바테의 스핀 격자 이완 자기장 의존도 측정

여기서, 솔루션 NMR 분광법에 의한 15N이완 분산 프로파일의 수집 및 분석을 위해 실험실에서 구현된 프로토콜에 대한 자세한 설명이 제공된다.

15 Μs-ms 타임스케일에 단백질 형성 역학의 조사를 위한 N CPMG 이완 분산

여기에서는 용액에서 단백질-글라이칸 상호 작용을 특성화하는 것을 목표로 하는 일련의 NMR 실험의 획득, 처리 및 분석을 자세히 설명하는 프로토콜을 제시합니다. 가장 일반적인 리간드 기반 및 단백질 기반 방법론이 요약되어 있으며, 이는 의심할 여지 없이 구조 당생물학 및 분자 인식 연구 분야에 기여합니다.

글라이칸-단백질 상호 작용 해체: 핵 자기 공명(NMR)을 위한 구조

핵 자기 공명(NMR) 분광법은 잔류물 특이적 방식으로 구조적 단백질 역학을 특성화할 수 있습니다. 당사는 피코초에서 나노초의 시간 척도에 민감한 NMR 15NR1 및 R2 이완 및 {1H}-15N 이종 핵 오버하우저 효과(hetNOE) 실험을 기록하기 위한 실습 프로토콜을 제공합니다.

단백질의 피코초에서 나노초까지의 구조 역학 조사를 위한 NMR 15N 이완 실험

전자 상자성 공명 (EPR) 분광학은 자유 래 디 칼을 측정 하는 명확한 방법입니다. 선택적 스핀 프로브를 사용 하 여 다른 세포질 격실에서 자유 래 디 칼의 검출에 대 한 수 있습니다. 우리는 치료, 저장 및 전송 EPR 측정용 샘플을 용이 하 게 하는 생물 학적 샘플을 수집 하는 실용적이 고 효율적인 방법을 제시.

사용 주위 온도 77 K에서 생물학 견본에서 전자 상자성 공명

여기, 우리는 새로운 형광 얼룩 polyacrylamide 젤에서 총 단백질 검출에 대 한 기술 개요는 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 프로토콜 활용 Ag+를 감지 하는 실버 이온 전용 형광 턴 온 프로브-단백질 복합물, 전통적인 발은 얼룩의 특정 한계를 제거 하 고.

Polyacrylamide 젤에 단백질의 형광은 얼룩

배우세요 상자성 이완 향상 NMR 분광법을 사용하여 본질적으로 무질서한 단백질의 약하고 일시적인 상호작용을 검출하고 특성화하는 방법을. 이 기술은 원자 해상도로 동적 상태를 식별하고 정량화하여 생물학적 과정을 이해하는 데 도움을 줍니다.

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