Name: 대식세포-섬유아세포 공동배양물의 정량화를 위한 영역 기반 이미지 분석 알고리즘 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: 학습하세요 대식세포와 섬유아세포 공동배양물의 정량화를 위한 영역 기반 이미지 분석 알고리즘을 사용하는 방법을. 이 기술은 세포 생물학 및 조직 재생 연구에서 신뢰할 수 있는 세포 계수와 세포 유형 식별을 제공합니다.

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이 연구는 부분적으로 국립 보건원 (R01 AR067247)과 델라웨어 INBRE 프로그램에 의해 부분적으로 자금을 지원했으며, 국립 보건원 (National Institutes of Health)과 델라웨어 주 (State of Delaware)의 국립 일반 의료 과학 연구소 (P20 GM103446)의 보조금으로 지원되었습니다. 원고의 내용이 반드시 자금 조달 기관의 견해를 반영하는 것은 아닙니다.

1. 세포 배양 및 이미지 획득
<ol><li>RAW264.7 대식세포를 10% 소 태아 혈청(FBS), 1% 페니실린-스트렙토마이신, 1.5 g/L 중탄산나트륨 및 5 μM β-메르캅토에탄올로 보충된 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)에서 37°C 및 5%CO2 에서 배양하였다.<ol>
<li>단배양 영상화를 위해, RAW264.7 세포를 1 mL의 배지와 함께 5 mL 세포 배양 플라스크에서 25,000 세포/cm2 의 밀도로 배양한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>NIH/3T3 세포를 10% 소 태아 혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 11로 보충된 DMEM에서 37°C 및 5%CO2에서 배양한다.</li>
	<li>공동배양 영상화를 위해, RAW264.7 대식세포와 NIH/3T3 섬유아세포를 25,000 세포/cm2의 총 밀도에서 다양한 비율로 함께 배양한다. 1 파트 RAW264.7 배지 (10 % FBS, 1 % 페니실린 스트렙토 마이신, 1.5 g / L 중탄산나트륨 및 5 μM β-mercaptoethanol로 보충 된 DMEM) 및 1 부 NIH / 3T3 배지 (10 % 우태아 혈청 및 1 % 페니실린 스트렙토 마이신으로 보충 된 DMEM)인 공동 배양 배지를 사용하십시오.</li>
	<li>시딩 후, 세포를 37°C 및 5%CO2 에서 인큐베이션하여 80% 세포 합류의 생존 가능한 세포 밀도에 도달한다.</li>
	<li>40x 목표물이 장착 된 반전 현미경이있는 이미지 셀. 모든 이미지를 회색조로 가져와 원시 '.czi'파일로 내보냅니다.<ol>
<li>다양한 이미지 품질로 이미지를 정확하게 평가하기 위한 알고리즘의 용량을 결정합니다. 다양한 초점의 이미지를 획득하여 '구근이 아닌' 이미지(그림 2)와 '구근' 이미지(그림 3)를 모두 생성합니다.</li>
		<li>MATLAB 분석 전에 원시 '.czi' 파일에 '일괄 변환' 기능을 사용하여 ImageJ를 사용하여 셀 이미지를 8비트 티프(.tiff) 이미지 형식으로 내보내고 변환합니다. 변환된 이미지를 로컬 폴더에 저장하고 이러한 이미지 파일을 관련 MATLAB 빈으로 수동으로 전송합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 이미지 분석 - "단일 문화"파일을 주로 활용 한 단일 문화.m
참고: 다음 단계는 MATLAB을 사용하여 수행되었습니다. MATLAB 프로토콜에는 "프로세스"(보충 코딩 파일 1), 알고리즘이 포함된 파일, "단문화.m"(보충 코딩 파일 2), 단배양 이미지 분석을 위해 실행할 파일, 그리고 ".m"(보충 코딩 파일 3), 공동 배양 이미지 분석을 위해 실행할 파일 등 세 개의 파일이 사용되coculture_modified.m습니다.
<ol><li>영역 기반 방법을 사용하여 상대적 높이 변화를 나타내는 셀의 이미지를 가져옵니다. 각 서브 이미지에 대해 'imshow()' 기능을 활용하여 각 서브 스텝에 대한 이미지 출력. 분석을 위해 이미지 파일을 복사하여 Bin에 붙여넣고 다음 명령에 파일 이름을 입력합니다. 실행 을 눌러 프로그램을 시작하십시오. imread('파일 이름.tiff')
	<ol>
<li>소스 함수8 을 사용하여 '재구성에 의한 열기' 다음에 '재구성에 의한 닫기'로 이미지를 분석하여 배경에서 전경을 확대합니다. 재구성으로 여는 첫 번째 명령을 사용하고 두 번째 및 세 번째 시퀀스를 사용하여 재구성으로 닫습니다. 'imopen()' '이메로데()' '재구성()'
</li>
	</ol></li>
	<li>백분위수 기반 식별 시스템을 사용하여 재구성된 이미지를 순수한 흑백 픽셀로 쌍화합니다. 이 시스템에서 셀은 '255'의 순수한 흰색 픽셀 값으로 변환되는 반면, 배경 및 외부(비셀룰러) 객체는 '0'의 순수한 검정색 픽셀 값으로 변환됩니다.<ol>
<li>주어진 이미지의 적어도 0.5%를 포함하는 가장 큰 픽셀 값인 '최대 관련 픽셀'과의 백분위수 차이를 사용하여 백그라운드에서 셀을 구별합니다.</li>
		<li>RAW264.7 대식세포에 대한 픽셀 값을 분석하고 평가한다. 이러한 값이 최대 관련 픽셀의 4.5% 내에 있으면 픽셀을 셀룰러로 표시합니다. 참고: 이 명령은 간단한 if 문을 사용하여 실행할 수 있습니다.</li>
		<li>그림 2에서 볼 수 있는 것과 같이 구근 셀 프로파일을 포함하는 이미지의 경우 다음과 같이 셀 중심에서 잘못된 이진화를 보정하는 반복 절차를 구현합니다('섬'이라고 함).</li>
		<li>전체 셀 커버리지에 대한 초기 추측치를 결정하고; 60%가 본 연구에 활용되었다. 이미지 내에 존재하는 셀의 수는 셀 커버리지에 의존해야 한다는 점에 유의한다-셀 수와 셀 커버리지 사이의 관계는 따라서 실험적으로 결정될 수 있다. 이 관계를 사용하여 변수 '알파'와 '카파'를 결정합니다. 참고: '알파'는 다음과 같은 상대적 높이 백분위수를 포함하는 3 x 1 벡터를 나타냅니다: 세포가 식별된 높이 백분위수, 배경이 식별된 높이 백분위수 및 강도 값이 세포 값보다 유의하게 낮은 섬-영역-일반적으로 상주하는 높이 백분위수. '카파'는 이미지에서 셀로 덮인 전체 영역을 나타냅니다.</li>
		<li>알고리즘을 실행하여 (i) 섬의 일부를 채우기 위해 알파와 카파의 초기 추정치를 사용하여 이미지를 분석하고 (ii) 사후 분석 셀 수 및 커버리지를 사용하여 카파를 다시 계산합니다. 카파 값이 초기 추측의 10% 이내이면 다음 단계로 진행하십시오. 참고: RAW264.7 및 NIH/3T3 세포를 포함하는 이미지의 경우 알파는 [4.3, 5.5, 10]인 것으로 확인되었습니다. 즉, 최대 관련 픽셀과 4.3%의 차이로 셀이 식별되는 높이 백분위수가 결정되고, 최대 관련 픽셀과 5.5%의 차이가 배경이 식별되는 높이 백분위수를 결정하였다. 최대 관련 픽셀과 10%의 차이로 섬이 일반적으로 상주하는 높이 백분위수가 결정됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>이미지의 이진화에 이어서, 이진화된 이미지(12,13,14)에 대한 Hough 변환을 수행하는 오픈 소스 서클 찾기 알고리즘을 사용하여 평균 셀 영역을 자동으로 결정한다. 다음 명령을 사용하여 이미지 내에 있는 모든 중심 위치와 원의 반지름의 벡터를 가져옵니다. '[중심, 반경] = 임파인더서클(A, [최소반경, 최대반경])' 이 명령의 'A'는 선택한 이미지이며 [최소반경, 최대 반경]은 알고리즘이 감지하려고 시도하는 반경 범위입니다. 참고: 평균 세포 면적을 결정하기 위한 이 절차는 대식세포 세포의 형태가 세포(10) 사이에서 원형이고 일관적이었다고 가정한다. 실험 데이터로부터, 대식세포의 반경은 40x 배율에서 가장 일반적으로 30 내지 50 픽셀 사이인 것으로 관찰된다. 이 픽셀 범위는 원 찾기 알고리즘에 허용되는 범위로 정의됩니다. 반경은 다른 세포 유형에 따라 크게 다를 수 있으며 실험 분석을 사용한 결정이 필요합니다.<ol>
<li>반지름 출력을 사용하여 평균화하여 평균 셀 면적을 계산합니다. 정확한 영역 식별을 위해 최소 10개의 세포를 분석합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>평균 셀 영역을 사용하여 이미지 내의 총 셀 수를 결정합니다.<ol>
<li>이미지 매트릭스를 반복하고 셀 픽셀의 총 수를 계산합니다. 셀 픽셀 수를 이미지 내의 총 픽셀 수로 나누어 전체 셀 커버리지를 결정합니다. 셀 픽셀 수를 셀의 평균 영역으로 나누어 이미지 내의 총 셀 수를 결정합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. "coculture_modified.m" 파일을 주로 활용한 이미지 분석 - 공동 문화
참고: 다음 단계는 MATLAB을 사용하여 수행되었습니다.
<ol><li>영역 기반 방법을 사용하여 상대적 높이 변화를 나타내는 셀의 이미지를 가져옵니다. 각 서브 이미지에 대해 'imshow()' 기능을 활용하여 각 서브 스텝에 대한 이미지 출력. 분석을 위해 이미지 파일을 복사하여 Bin에 붙여넣고 다음 명령에 파일 이름을 입력합니다. 실행 을 눌러 프로그램을 시작하십시오. 'imread('filename.tiff')'
	<ol>
<li>소스 기능(10 )을 사용하여 '재구성에 의한 열기' 다음에 '재구성에 의한 닫힘'으로 이미지를 분석하여 배경으로부터 전경을 확대한다. 재구성을 통해 여는 첫 번째 명령을 사용하고 두 번째 및 세 번째 시퀀스를 사용하여 재구성으로 닫습니다. 'imopen ()' '이메로데()' '재구성()'
</li>
	</ol>
</li>
	<li>RAW264.7 및 NIH/3T3 세포를 함유하는 공동배양물을 두 개의 선택적 이진화를 사용하여 분석하고, 두 세포 유형 사이의 높이 차이를 이용함으로써 얻는다.<ol>
<li>RAW264.7 및 NIH/3T3 세포의 이미지를 사용하여 실험적으로 파라미터 'phi'를 결정하고, phi는 두 세포 유형 간의 비례 높이 차이를 나타냅니다. 초기 phi 값을 추측하고 세포 수 및 커버리지가 RAW264.7 및 NIH/3T3 공동 배양에 특정한 수동 카운트와 밀접하게 일치할 때까지 반복합니다. 참고 :이 연구에 사용 된 phi의 값은 3.2 인 것으로 나타났습니다. Phi는 도 4C에서 볼 수 있듯이 RAW264.7 세포만을 포함하는 것처럼 보이도록 이미지를 선택적으로 필터링하는 데 사용됩니다.</li>
		<li>RAW264.7 세포 수 및 총 세포 커버리지를 단일 배양 이미지와 유사한 방식으로 결정하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>phi 파라미터 없이 유역-형질전환된 이미지를 다시 분석하여, 대식세포와 섬유아세포를 모두 검출한다. 단계 2에 설명된 표준 임계값 지정 및 영역 기반 정량화 방법을 사용하여 얻은 RAW264.7 세포 픽셀을 선택적으로 뺀 NIH/3T3 섬유아세포 데이터를 획득한다.<ol>
<li>전체 이미지가 분석되면 RAW264.7 픽셀 수에서 총 셀 픽셀 수를 빼서 NIH/3T3 픽셀의 총 수를 결정합니다. NIH/3T3 및 RAW264.7 셀의 커버리지를 각 셀라인의 셀 픽셀 수로 나누어 총 이미지 픽셀 수로 나눕니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Young, D., Glasbey, C., Gray, A., Martin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+sizing+of+cells+in+microscope+images+by+template+matching+and+edge+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Fifth+International+Conference+on+Image+Processing+and+its+Applications%2C+1995%22%5BJournal%5D)">Identification and sizing of cells in microscope images by template matching and edge detection.</a> Fifth International Conference on Image Processing and its Applications, 1995. , 266-270 (1995).</li>
<li>Zhu, R., Sui, D., Qin, H., Hao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extended+type+cell+detection+and+counting+method+based+on+FCN%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+-+2017+IEEE+17th+International+Conference+on+Bioinformatics+and+Bioengineering+%28BIBE%29%22%5BJournal%5D)">An extended type cell detection and counting method based on FCN.</a> Proc. - 2017 IEEE 17th International Conference on Bioinformatics and Bioengineering (BIBE). , 51-56 (2018).</li>
<li>Choudhry, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+method+for+automated+colony+and+cell+counting+by+digital+image+analysis+based+on+edge+detection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High-throughput method for automated colony and cell counting by digital image analysis based on edge detection.</a> PLoS One. 11 (2), 0148469(2016).</li>
<li>Torre, V., Poggio, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+edge+detection%5BTitle%5D)+AND+%22MIT+Artificial+Intelligence+Lab+Memo+768%22%5BJournal%5D)">On edge detection.</a> MIT Artificial Intelligence Lab Memo 768. , 1-9 (1984).</li>
<li>Fuller, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+vital+fluorescent+staining+method+for+monitoring+bacterial+transport+in+subsurface+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Development of a vital fluorescent staining method for monitoring bacterial transport in subsurface environments.</a> Applied and Environmental Microbiology. 66 (10), 4486-4496 (2000).</li>
<li>Meyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographic+distance+and+watershed+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Processing%22%5BJournal%5D)">Topographic distance and watershed lines.</a> Signal Processing. 38 (1), 113-125 (1994).</li>
<li>Image Processing Toolbox Documentation. MATLAB_Marker-controlled watershed segmentation. MathWorks. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.mathworks.com/help/images/marker-controlled-watershed-segmentation.html">https://www.mathworks.com/help/images/marker-controlled-watershed-segmentation.html</a> (2022).</li>
<li>Bala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+watershed+image+segmentation+technique+using+MATLAB%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Scientific+and+Engineering+Research%22%5BJournal%5D)">An improved watershed image segmentation technique using MATLAB.</a> International Journal of Scientific and Engineering Research. 3 (6), 1206-1209 (2012).</li>
<li>Glaros, T., Larsen, M., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+and+fibroblasts+during+inflammation%2C+tissue+damage+and+organ+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience+%28Landmark+Edition%29%22%5BJournal%5D)">Macrophages and fibroblasts during inflammation, tissue damage and organ injury.</a> Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 14, 3988-3993 (2009).</li>
<li>Witherel, C., Abebayehu, D., Barker, T., Spiller, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+and+fibroblast+interactions+in+biomaterial-mediated+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Macrophage and fibroblast interactions in biomaterial-mediated fibrosis.</a> Advanced Healthcare Materials. 8 (4), 1801451(2019).</li>
<li>Urello, M., Kiick, K., Sullivan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+growth+factor+gene+delivery+with+collagen-triggered+wound+repair+cascades+using+collagen-mimetic+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering+%26+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Integration of growth factor gene delivery with collagen-triggered wound repair cascades using collagen-mimetic peptides.</a> Bioengineering & Translational Medicine. 1 (2), 207-219 (2016).</li>
<li>Image Processing Toolbox Documentation. MATLAB_Detect and measure circular objects in an image. MathWorks. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.mathworks.com/help/images/detect-and-measure-circular-objects-in-an-image.html">https://www.mathworks.com/help/images/detect-and-measure-circular-objects-in-an-image.html</a> (2022).</li>
<li>Atherton, T., Kerbyson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+invariant+circle+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Image+and+Vision+Computing%22%5BJournal%5D)">Size invariant circle detection.</a> Image and Vision Computing. 17, 795-803 (1999).</li>
<li>Maitra, M., Kumar Gupta, R., Mukherjee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+counting+of+red+blood+cells+in+blood+cell+images+using+Hough+transform%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Computer+Applications%22%5BJournal%5D)">Detection and counting of red blood cells in blood cell images using Hough transform.</a> International Journal of Computer Applications. 53 (16), 18-22 (2012).</li>
<li>Uslu, F., Icoz, K., Tasdemir, K., Doğan, R. S., Yilmaz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-analysis+based+readout+method+for+biochip%3A+Automated+quantification+of+immunomagnetic+beads%2C+micropads+and+patient+leukemia+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Image-analysis based readout method for biochip: Automated quantification of immunomagnetic beads, micropads and patient leukemia cell.</a> Micron. 133, 102863(2020).</li>
<li>Uslu, F., Icoz, K., Tasdemir, K., Yilmaz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+quantification+of+immunomagnetic+beads+and+leukemia+cells+from+optical+microscope+images%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Signal+Processing+and+Control%22%5BJournal%5D)">Automated quantification of immunomagnetic beads and leukemia cells from optical microscope images.</a> Biomedical Signal Processing and Control. 49, 473-482 (2019).</li>
<li>Anderl, J., Redpath, S., Ball, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neuronal+and+astrocyte+co-culture+assay+for+high+content+analysis+of+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A neuronal and astrocyte co-culture assay for high content analysis of neurotoxicity.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1173(2009).</li>
<li>Holt, D., Chamberlain, L., Grainger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+signaling+in+co-cultures+of+macrophages+and+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Cell-cell signaling in co-cultures of macrophages and fibroblasts.</a> Biomaterials. 31 (36), 9382-9394 (2010).</li>
<li>Boddupalli, A., Zhu, L., Bratlie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+implant+acceptance+and+wound+healing%3A+material+selection+and+implant+location+modulate+macrophage+and+fibroblast+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Methods for implant acceptance and wound healing: material selection and implant location modulate macrophage and fibroblast phenotypes.</a> Advanced Healthcare Materials. 5 (20), 2575-2594 (2016).</li>
<li>Wang, Z., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generalizing+cell+segmentation+and+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Generalizing cell segmentation and quantification.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 189(2017).</li>
<li>Zou, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+validation+of+image+segmentation+quality+based+on+a+spatial+overlap+index%5BTitle%5D)+AND+%22Academic+Radiology%22%5BJournal%5D)">Statistical validation of image segmentation quality based on a spatial overlap index.</a> Academic Radiology. 11 (2), 178-189 (2004).</li>
</ol>

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

우리는 세포 높이를 기준으로 세포를 정확하고 효율적으로 계산하는 일반적인 영역 기반 절차를 설계하여 공동 배양 시스템에서도 세포의 얼룩없는 정량을 가능하게했습니다. 이 절차의 중요한 단계에는 세포가 분화 될 수있는 상대적 강도 시스템의 구현이 포함되었습니다. 상대 높이 분석의 사용은 두 가지 목적을 달성했습니다 : 상대 매개 변수가 주어진 셀 유형 및 매개 변수에 대해 일정하고 모든 이미지에 대해 절대 밝기 / 대비 수준을 입력 할 필요가 없기 때문에 외부 매개 변수의 필요성이 불필요하게 렌더링되었습니다. 또한, 백분위수 기반 시스템을 사용하여 동일한 이미지 내에서 여러 세포 유형을 분석할 수 있었으며, 서로 다른 세포 유형이 이미지 내의 고유한 높이에 상주하는 경우에 한해 분석할 수 있었습니다.
백분위수 기반 시스템은 평균과 반대되는 최대 픽셀 값과의 차이로 정의되었습니다. 이것은 평균 강도 값에 기초한 알고리즘의 왜곡을 방지하기 위해 수행되었으며, 이는 이미지에 존재하는 세포...

소프트웨어는 이미지 분석 기술 중에 일상적으로 구현되어 결과가 정확하고 효율적이며 편향되지 않도록합니다. 세포 기반 분석의 경우, 일반적인 문제는 세포의 오인입니다. 부적절한 초점 및 대비 설정이 있는 이미지는 셀 블러링으로 이어질 수 있으며, 여기서 개별 셀의 경계는1을 식별하기 어려워집니다. 기공, 거품 또는 기타 바람직하지 않은 물체와 같은 외래 이미지 기능이 있으면 계산 프로세스가 느려지고 잘못 식별되어 계산 절차가 방해받을 수 있습니다. 또한 셀 카운팅은 번거로울 수 있으며 수백 번의 반복실험을 계산하는 데 매우 시간이 많이 걸릴 수 있습니다. 더욱이, 수동 카운팅 동안 내재된 주관적 편향이 존재하며, 따라서 세포 식별에 관한 의사 결정은 종종 부정확하다2. 자동화 된 소프트웨어는 조사자 편향의 영향을 줄이는 잘 정의 된 식별 기준에 따라 정확한 탐지를위한 인간 능력을 훨씬 뛰어 넘는 물체를 포함하여 세포를 외부 물체와 신속하고 정확하게 구별함으로써 이러한 모든 문제를 우회 할 수있는 흥미로운 잠재력을 제공합니다. 자동화 된 소프트웨어를 사용하여 세포를 식별하는 일반적인 기술은 세분화 및 임계 값3의 두 가지 주요 방법을 포함합니다. 여기에서는 널리 접근 가능한 소프트웨어 프레임 워크 내에서 빠르고 정확하며 저렴한 셀 카운팅을 가능하게하는 일반화 가능한 영역 기반 프로토콜을 시연합니다.
에지 검출과 같은 세분화 기술은 이미지 내에서 강도 차이를 활용하여 개별 세포를 분리하려고 합니다. 셀을 이미지의 나머지 부분과 구별하는 강도 변화는 대부분 밝기의 급격한 변화로 구성됩니다4. 에지 감지에는 정규화 필터링 단계와 강도 변화가 감지되는 차별화 단계가 포함됩니다. 분화 과정은 고강도 변화의 이미지 내에서 가장자리와 윤곽선을 식별하며, 이러한 가장자리와 윤곽선은 세포 존재와 상관 관계가 있습니다. 노이즈가 있는 이미지는 디노이징 알고리즘(denoising algorithm)4을 통해 실행될 수 있지만, 엣지 검출 기술은 배경 노이즈가 낮은 이미지를 분석하는 데 이상적으로 사용된다. 이 과정은 세포 경계가 명확하고 쉽게 구별 될 수 있고 세포 존재, 셀 블러, 외래 물체 또는 정의 된 내부 세포 구조 1,2와 관련이없는 밝기 윤곽선에 의해 방해받지 않을 때 최적으로 기능합니다. 이미지가 특히 시끄러운 경우, 세포는 형광 염색 또는 형광 단백질 2,5로의 형질감염을 통해 추가로 구별될 수 있다. 이것은 세분화 기술의 정확성을 크게 향상 시키지만 이미징을 위해 세포 배양을 준비하기 위해 추가 비용과 추가 시간 투자가 필요합니다.
임계 값 지정 기술은 이미지를 전경과 배경의 두 가지 범주로 나누고 셀은 전경에 할당됩니다3. 이러한 기술은 색상/대비 변경을 활용하여 객체의 겉보기 높이를 정의합니다. 배경보다 일상적으로 '키가 큰'객체는 세포로 쉽게 식별 할 수 있습니다. 유역 변환은 표면을 밝은 픽셀을 전경으로 연결하고 어두운 픽셀을 배경으로 하는 표면을 6,7로 연결하여 이러한 방식으로 작동합니다. 높이 기반 식별을 통해, 임계 기술은 동일한 초점 평면 내에 존재하는 경우 원하는 물체와 노이즈를 일상적으로 구별 할 수 있습니다. 영역 기반 정량화와 함께 사용할 경우 유역 변환은 에지 감지와 같은 일반적인 세분화 기술이 부정확할 수 있는 환경에서 개체 그룹을 정확하게 식별할 수 있습니다.
유역 변환은 일반적으로 세분화 기술과 결합하여 더 깨끗한 분석을 위해 이미지를 준비하므로 셀 카운팅의 정확도가 높아집니다. 이 과정에서 유역 변환은 세분화 전에 잠재적 인 관심 영역을 강조하는 데 사용됩니다. 유역 변환은 이미지의 전경에서 세포를 식별함으로써 독특한 이점을 제공하며, 이는 배경의 고르지 않은 패치와 같은 세포에 대한 잠재적 인 오탐을 제거하여 세분화 분석의 정확성을 향상시킬 수 있습니다. 그러나 셀 기반 이미지를 유역 변환에 적용하려고 할 때 어려움이 발생할 수 있습니다. 높은 세포 밀도를 가진 이미지는 세포의 응집체가 개별 구성 요소가 아닌 단일 그룹으로 식별되는 과소 세분화로 어려움을 겪을 수 있습니다. 잡음 또는 급격한 강도 변화의 존재는 또한 알고리즘이 세포를 과도하게 분리하여 과도하고 부정확한 셀 카운트를 초래하는 과분화를 초래할 수 있다8.
여기서는, 도 1에 도시된 바와 같이, 영역 기반 정량화 알고리즘 내에 임계 분석의 성분을 통합함으로써 유역 변환의 주요 단점을 최소화하는 방법을 상세히 설명한다. 특히, 이 알고리즘은 오픈 소스 및/또는 널리 이용가능한 소프트웨어로 구현되었으며, 이 셀 카운팅 프레임워크의 적용은 값비싼 시약이나 복잡한 세포 준비 기술 없이도 가능했다. RAW264.7 대식세포는 결합 조직 유지 및 상처 치유 과정을 조절하는데 있어서 그들의 중요한 역할로 인한 방법을 입증하기 위해 사용되었다9. 또한, NIH/3T3 섬유아세포는 조직 유지 및 복구에 중요한 역할을 하기 때문에 분석되었습니다. 섬유아세포는 종종 대식세포와 공존하고 지지하며, 공배양 연구에서 이러한 표현형적으로 구별되는 세포 유형을 구별할 필요성을 발생시킨다.
높은 생존 가능한 셀 밀도 (VCD)를 갖는 이미지로부터의 셀 카운트는 셀에 의해 덮인 면적과 단수 셀에 의해 점유된 평균 면적을 계산함으로써 안정적이고 효율적으로 정량화될 수 있었다. 세포 식별을 위한 세분화와 반대로 역치의 사용은 또한 공동 배양물에서 상이한 세포 유형이 동시에 분석되는 실험과 같은 더 복잡한 분석을 가능하게 했다. 상처 치유 부위 내에서 RAW264.7 대식세포와 공국소화하는 것으로 종종 발견되는 NIH/3T3 섬유아세포는 대식세포10의 초점면과 구별되는 초점면에서 성장하는 것으로 밝혀졌다. 따라서 분석되는 셀 유형에 따라 배경과 전경을 정의하기 위해 여러 임계값 알고리즘이 실행되어 동일한 이미지 내에서 두 개의 서로 다른 셀 유형을 정확하게 계산할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Axio Observer 7 도립 현미경</td><td>Zeiss</td><td>1028290770</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-메르캅토에탄올</td><td>Life Technologies</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>세포 스크레이퍼</td><td>CellTreat</td><td>229310</td><td></td></tr><tr><td>Dublecco의 변형 독수리 매체</td><td>Fisher Scientific</td><td>12430047</td><td></td></tr><tr><td>Dublecco의 PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB Software</td><td>MathWorks</td><td>2021A</td><td></td></tr><tr><td>NIH/3T3 셀</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL - 1658</td><td></td></tr><tr><td>페니실린&ndash; 스트렙토마이신</td><td>시그마 Aldrich</td><td>P4333-20ML</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7 세포</td><td>ATCC</td><td>ATCC TIB - 71</td><td></td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>시그마 Aldrich</td><td>S6014-25G</td><td></td></tr><tr><td>T75 세포 배양 플라스크</td><td>코닝</td><td>CLS3814-24EA</td><td></td></tr></tbody></table>

대식세포-섬유아세포 공동배양물의 정량화를 위한 영역 기반 이미지 분석 알고리즘

Area-based Image Analysis Algorithm for Quantification of Macrophage-fibroblast Cocultures

세포의 정량화는 광범위한 생물학적 및 생화학적 연구에 필요하다. 세포의 종래의 이미지 분석은 전형적으로 면역형광 염색 또는 형광 단백질로 형질감염 또는 에지 검출 기술과 같은 형광 검출 접근법을 이용하는데, 이는 종종 이미지 배경에서 노이즈 및 다른 비이상성으로 인해 오류가 발생하기 쉽다. 
우리는 대식세포와 섬유아세포, 조직 재생 중에 종종 공국소화되는 다양한 표현형의 세포를 정확하게 계산하고 구별할 수 있는 새로운 알고리즘을 설계했습니다. MATLAB은 배경과의 높이 차이에 따라 별개의 세포 유형을 차별화하는 알고리즘을 구현하는 데 사용되었습니다. 기본 알고리즘은 세포 크기 / 구조 및 고밀도 시딩 조건의 변화를 설명하기 위해 영역 기반 방법을 사용하여 개발되었습니다. 
세포 구조에서 비이상성은 주어진 세포 유형에 대한 실험 데이터를 사용하여 계산된 세포 커버리지와 같은 내부 파라미터를 활용하는 이차적이고 반복적인 알고리즘으로 설명되었다. 마지막으로, 영상 내의 상대적 높이 차이의 평가에 기초하여 다양한 세포 유형이 선택적으로 배제되는 격리 알고리즘을 사용하여 공동 배양 환경의 분석이 수행되었다. 이 접근법은 단배양된 세포에 대해 5% 오차 한계 내에서 그리고 공동 배양된 세포에 대해 10% 오차 한계 내에서 세포를 정확하게 계수하는 것으로 밝혀졌다.

비구근성 RAW264.7 대식세포의 분석은 25,000 세포/cm2에서 단독배양 환경에서 수행되었다. 세포 배양물을 촬영하고 ImageJ에서 8비트 티프로 변환한 후 MATLAB에서 처리한 대표적인 이미지를 촬영하였다. 공정 전반에 걸친 알고리즘 출력은 대표 이미지에 대해 도 2 에 기록되고 문서화되었다. 이 이미지에서 알고리즘은 226개의 셀을 계산했으며, 이 이미지 카운트는 241개의 셀을 식별한 수동 카운트(6.2% 오류)와 비교하여 검증되었습니다. RAW264.7 셀 카운트의 적어도 10개의 이미지에 대한 알고리즘 출력은 4.5 내지 1.9%의 평균 오차를 가±다.
구근 RAW264.7 대식세포의 분석은 반복적 알고리즘을 사용하여 수행되었다. 대부분의 이미지에서 관찰 된 구근 효과는 주로 세포가 부착 된 기판의 초점 평면보다 약간 높은 초점 평면에 초점을 맞춘 결과였습니다. 따라서 대부분의 이미지는 ...

우리는 세포 수를 식별하기 위해 일반화 가능한 영역 기반 이미지 분석 접근법을 활용하는 방법을 제시합니다. 상이한 세포 집단의 분석은 적응형 알고리즘 내에서 별개의 세포 유형 사이의 유의한 세포 높이 및 구조 차이를 이용하였다.

Quantification of cells is necessary for a wide range of biological and biochemical studies. Conventional image analysis of cells typically employs either ...

이 방법은 연구자가 간단하고 효과적인 지역 기반 분석을 사용하여 세포의 공동 배양을 분석하고 계산하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술은 널리 이용 가능한 소프트웨어를 사용하여 구현하기가 비교적 쉽고 공동 배양 설정 내에서 다양한 세포 유형을 식별하는 안정적이고 정확한 수단을 제공합니다. 이 방법은 세포의 특정 공동 배양이 조직 재생을 돕기 위해 어떻게 시너지 효과를 발휘하는지에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.이 방법은 또한 단일 배양 바이오마커 연구를 검증하기 위해 사용될 수 있다. 시작하기 위해, 미가공 264.7 대식세포를 섭씨 37도에서 배양하고, 단배양을 위해 5%이산화탄소를 FBS, 페니실린-스트렙토마이신, 중탄산나트륨 및 베타-메르캅토에탄올로 보충된 DMEM 한 밀리리터에서 25, 000 세포 센티미터 평방 평방 당 25의 밀도로 5밀리리터 세포 배양 플라스크에서 배양한다. NIH/3T3 세포를 10%FBS 및 1%페니실린-스트렙토마이신으로 보충된 DMEM에서 배양한다.공동 배양 영상화를 위해, 원시 264.7 대식세포 및 NIH/3T3 섬유아세포를 하나의 부분 원료 264.7 배지 및 한 부분 NIH/3T3 배지를 포함하는 공동 배양 배지를 사용하여 센티미터 평방 당 25, 000 세포의 다양한 비율 및 총 밀도로 함께 배양한다. 시딩 후, 세포를 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 인큐베이션하여 80%세포 합류의 생존 가능한 세포 밀도에 도달한다. 40X 목표가 장착된 반전 현미경을 사용하여 세포 이미지를 획득하려면 알고리즘의 용량을 결정하여 다양한 이미지 품질을 가진 이미지를 정확하게 평가합니다.다양한 초점으로 이미지를 획득하여 비 구근 이미지와 구근 이미지를 모두 생성하고 원시 czi 파일로 내보냅니다. 영역 기반 방법을 사용하여 셀의 이미지를 가져오려면 분석할 이미지 파일을 복사하여 Bin에 붙여넣고 명령을 실행하여 파일 이름을 입력합니다. 실행을 눌러 프로그램을 시작합니다.재구성을 통해 이미지를 분석한 다음 소스 함수를 사용하여 재구성하여 닫음으로써 각 명령을 실행하여 배경에서 전경을 확대합니다. 백분위수 기반 식별 시스템을 이용하여 재구성된 이미지들을 이진화시키기 위해, 주어진 이미지의 적어도 0.5%를 포함하는 가장 큰 픽셀 값을 갖는 최대 관련 픽셀로부터의 백분위수 차이를 사용하여 백분위수 차이를 사용하여 백그라운드로부터 셀들을 구별한다. 원시 264.7 대식세포의 픽셀 값을 분석 및 평가하여 값이 최대 관련 픽셀의 4.5% 내에 있는지 확인합니다.그런 다음 픽셀을 셀룰러로 표시합니다. 전구 세포 프로파일을 포함하는 이미지의 경우, 세포 중심에서 잘못된 이진화를 수정하기 위한 반복적인 절차를 구현하십시오. 전체 셀 커버리지에 대한 초기 추측값을 결정합니다.알고리즘을 실행하고 알파와 카파의 초기 추정치를 사용하여 이미지를 분석하여 섬의 일부를 채 웁니다. 그런 다음 사후 분석 셀 수와 커버리지를 사용하여 카파를 다시 계산하십시오. 이미지의 이진화 후 평균 셀 영역을 결정하려면, 명령을 실행하여 이미지 내에서 발견되는 모든 중심 위치와 원의 반경의 벡터를 구하십시오.반경 출력을 사용하여 평균화하여 평균 셀 면적을 계산하고 최소 10개의 셀을 분석하여 정확한 면적 식별을 보장합니다. 앞에서 설명한 대로 명령을 사용하여 이미지 분석을 수행합니다. 그런 다음 원시 264.7 및 NIH / 3T3 세포의 이미지를 사용하여 매개 변수 phi를 실험적으로 결정하여 원시 264.7 및 NIH / 3T3 세포를 포함하는 공동 배양 분석을 수행하십시오.초기 phi 값을 추측하고 세포 수 및 커버리지가 원시 264.7 및 NIH/3T3 공동 배양에 특정한 수동 카운트와 밀접하게 일치할 때까지 반복합니다. 단일 배양 이미지에 대해 이전에 설명된 바와 같이 총 세포 커버리지에서 원시 264.7 세포 카운트를 결정한다. phi 파라미터 없이 유역 형질전환 이미지를 다시 분석하여 대식세포와 섬유아세포를 모두 검출한다.이전에 설명된 표준 임계값 지정 및 영역 기반 정량화 방법을 사용하여 얻은 원시 264.7 셀 픽셀을 선택적으로 빼서 NIH/3T3 섬유아세포 데이터를 획득합니다. 비구근 생 264.7 대식세포의 분석이 수행되었고 알고리즘 출력이 기록되었다. 알고리즘을 이용한 이미지의 평균 면적 계산은 226개의 세포를 계수하는 반면, 수동 카운트는 6%의 근사 오차 값을 갖는 241개의 세포를 식별하였고, 구근 생 264.7 대식세포의 분석도 수행되었다.알고리즘 카운팅 알고리즘을 이용한 이미지의 평균 면적 계산은 12%의 대략적인 오차 값을 갖는 252개 세포의 수동 카운트에 의해 검증된 221개의 세포를 미가공 264.7 대식세포 및 NIH/3T3 섬유아세포를 모두 함유하는 공동배양물의 분석을 수행하였다. 원시 264.7 대식세포 카운트에 대한 알고리즘 출력은 137개였고, 수동 카운트는 대략 오차 값이 11%인 155개의 세포를 식별하여 세포 계수 알고리즘의 견고성을 결정하기 위해 5개의 원시 264.7 대식세포 이미지를 자동 세포 식별 및 수동 사용자 카운트로 계수하였다. 주사위 계수는 5개의 이미지에 걸쳐 0.85의 평균 파라미터로 얻어졌다.이 프로토콜 내의 중요한 단계는 백분위수 기반 파라미터를 사용하는 것이며, 이는 단일배양 및 공동배양 이미지 모두에서 강력한 세포 검출을 가능하게 한다. 이 프로토콜은 분자 생물학 기술을 사용하여 공동 배양 시스템에서 특정 세포 집단 및 바이오마커 개발을 정의하는 바이오마커를 평가하기 위해 추가 분석을 위해 관심있는 세포를 확인하는 데 사용될 수 있습니다.

area-based-image-analysis-algorithm-for-quantification-macrophage

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

세포 구조를 정상화 접착제 micropatterns는 약물 효과의 검출에 감도를 증가 재현성을 개선하고 자동화된 이미지 수집 및 분석을 단순화하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 기술은 기존의 세포 배양 지원을 수행하고 결과적으로 과도한 휴대 전화의 변화로 고통 받고 약물 / siRNA 심사 assays를 도움이 될 것입니다.

Micropatterned 세포를 사용하여 약물의 영향 향상된 시각화 및 정량 분석

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성인 간세포의 혼합 차 문화에서 Macrophages을 분리하는 간단하고 효율적인 방법

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대식세포-섬유아세포 공동배양물의 정량화를 위한 영역 기반 이미지 분석 알고리즘

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