Name: 나노 입자 추적 분석의 2018 지침 세포 밖 소포 연구에 대한 최소한의 정보를 충족하기위한 재현성 향상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: 학습하세요 NanoSight LM10을 사용한 나노입자 추적 분석(NTA)으로 세포 밖 소포의 크기와 농도를 정확하게 정량화하는 방법을. 이 프로토콜은 초보 연구자도 재현 가능한 결과를 얻을 수 있도록 설계되었습니다.

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이 연구는 캔자스 주에서 중서부 비교 줄기 세포 생물학 연구소 (MICSCB), 존슨 암 연구 센터 (Johnson Cancer Research Center)에서 MLW 및 NIH R21AG066488에서 LKC로 지원되었습니다. OLS는 MICSCB로부터 GRA 지원을 받았습니다. 저자는이 프로젝트에 사용 된 리포솜을 제공 한 Santosh Aryal 박사와 Weiss 및 Christenson 연구소의 회원들에게 도움이되는 대화와 피드백을 제공합니다. 홍 박사 그는 기술 지원에 감사드립니다. MLW는 Betti Goren Weiss에게 그녀의 지원과 조언에 감사드립니다.

<ol><li>Lotvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions%3A+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).</li>
<li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Consortium, E. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EV-TRACK%3A+transparent+reporting+and+centralizing+knowledge+in+extracellular+vesicle+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research.</a> Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).</li>
<li>Gardiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+used+for+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles%3A+results+of+a+worldwide+survey%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945(2016).</li>
<li>Maas, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possibilities+and+limitations+of+current+technologies+for+quantification+of+biological+extracellular+vesicles+and+synthetic+mimics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics.</a> Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).</li>
<li>Danaei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+particle+size+and+polydispersity+index+on+the+clinical+applications+of+lipidic+nanocarrier+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Impact of particle size and polydispersity index on the clinical applications of lipidic nanocarrier systems.</a> Pharmaceutics. 10 (2), 57(2018).</li>
<li>Kestens, V., Bozatzidis, V., De Temmerman, P. J., Ramaye, Y., Roebben, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+particle+tracking+analysis+method+for+the+size+determination+of+nano-+and+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanoparticle+Research%22%5BJournal%5D)">Validation of a particle tracking analysis method for the size determination of nano- and microparticles.</a> Journal of Nanoparticle Research. 19 (8), 271(2017).</li>
<li>Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+evaluation+of+nanoparticle+tracking+analysis+%28NTA%29+by+NanoSight+for+the+measurement+of+nanoparticles+and+protein+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Critical evaluation of nanoparticle tracking analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates.</a> Pharmaceutical Research. 27 (5), 796-810 (2010).</li>
<li>Hole, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interlaboratory+comparison+of+size+measurements+on+nanoparticles+using+nanoparticle+tracking+analysis+%28NTA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanoparticle+Research%22%5BJournal%5D)">Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA).</a> Journal of Nanoparticle Research. 15 (12), 2101(2013).</li>
<li>Malvern analytical Ltd. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22NanoSight+LM10+Operating+Manual-P550H%22">NanoSight LM10 Operating Manual-P550H</a>. , (2013).</li>
<li>Kim, A., Ng, W. B., Bernt, W., Cho, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+size+estimation+of+nanoparticle+tracking+analysis+on+polydisperse+macromolecule+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Validation of size estimation of nanoparticle tracking analysis on polydisperse macromolecule assembly.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2639(2019).</li>
<li>Gollwitzer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+techniques+for+size+measurement+of+nanoparticles+in+cell+culture+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Methods%22%5BJournal%5D)">A comparison of techniques for size measurement of nanoparticles in cell culture medium.</a> Analytical Methods. 8 (26), 5272-5282 (2016).</li>
<li>vander Pol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+size+distribution+of+exosomes+and+microvesicles+determined+by+transmission+electron+microscopy%2C+flow+cytometry%2C+nanoparticle+tracking+analysis%2C+and+resistive+pulse+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (7), 1182-1192 (2014).</li>
</ol>

저자 중 누구도 이해 상충이 없습니다.

나노입자(11)의 크기 및 농도를 추정하기 위해 이용가능한 몇 가지 방법이 있다. 여기에는 동적 광 산란 (DLS), 원심 침강 및 단일 입자 레벨 분석 - 전자 현미경, NTA, 원자력 현미경 및 조정 가능한 저항 펄스 감지를 포함하여 집단으로부터 크기 추정치를 생성하는 앙상블 방법이 포함됩니다. 이 중 DLS와 NTA는 이상적인 매질에서의 브라운 운동을 기반으로 한 비파괴 크기 및 농도 측정 방법으로 널리 사용됩니다. DLS는 빛의 산란에 의존하며 강도는 입자 부피의 제곱에 비례합니다. 따라서, DLS는 큰 입자, 응집체, 또는 다분산 집단의 존재에 대해 NTA보다 더 민감하다.
NTA는 연속적인 비디오 프레임에서 측정된 개별 파티클의 경로 길이로부터 확산 계수를 계산합니다. NTA의 주요 한계는 DLS 및 기타 측정 방법과 비교하여 평가할 수있는 좁은 범위의 입자 농도이므로 개별 입자 경로 길이는 현미경 및 추적 소프트웨어의 기능의...

EV 및 기타 나노미터 크기의 입자에 대한 정확하고 반복 가능한 분석은 연구 및 산업 전반에 걸쳐 수많은 과제를 제시합니다. EV 연구의 복제는 부분적으로 데이터 수집과 관련된 필요한 매개 변수를보고하는 데 균일 성이 없기 때문에 어려웠습니다. 이러한 결함을 해결하기 위해 ISEV는 EV 연구원을위한 생화학적, 생물 물리학 적 및 기능적 표준의 최소 세트로 산업 지침을 제안하고 일반적으로 MISEV20141이라고하는 입장 성명서로 발표했습니다. EV 연구의 속도가 빨라지면서 업데이트 된 지침이 필요했으며 "MISEV2018 : ISEV의 입장 진술"은 MISEV2014 지침2를 확장했습니다. MISEV2018 논문에는 테이블, 제안된 프로토콜의 개요 및 특정 EV 관련 특성을 문서화하기 위해 따라야 할 단계가 포함되어 있습니다. 실험의 해석 및 복제를 용이하게하기위한 추가 조치로서 EV-TRACK은 EV 생물학 및 발표 된 결과에 사용 된 방법론에 대한보다 투명한보고를 가능하게하는 크라우드 소싱 지식 기반 (http://evtrack.org)으로 개발되었습니다3. 표준화 된 방법보고에 대한 이러한 권장 사항에도 불구하고이 분야는 게시 된 결과를 복제하고 확인하는 것과 관련하여 계속 어려움을 겪고 있습니다.
이 논문은 국립 보건원 (National Institutes of Health)과 국립 과학 재단 (National Science Foundation)의 품질 평가 도구 노력에 부합하여 ISEV가 실험실간에 결과를 복제하는 목적으로 데이터 평가 도구를 적용 할 수 있도록 방법과 세부 사항에 대한 표준화 된보고가 필요하다고 제안합니다. 보고된 세포 공급원, 세포 배양 절차 및 EV 분리 방법은 EV 집단의 특성을 정의하는 중요한 요소이다. NTA 기기 중에는 검출 설정, 담체 유체의 굴절률, 다분산성에 기여하는 이종 입자 집단, 표준화 된 보고 요구 사항 부족, 관찰자 내 및 관찰자 간 측정 결과 부재와 같은 요인으로 인해 실험실 간의 NTA 비교가 어렵거나 불가능 해집니다.
2006 년부터 사용중인 NTA는 현재 EV 연구원의 약 80 %가 사용하는 나노 입자 크기 및 농도 측정을위한 인기있는 방법입니다4. MISEV2018 지침에는 두 가지 형태의 단일 베시클 분석이 필요하며 그 중 NTA는 인기있는 옵션 중 하나입니다. NTA는 광범위한 접근성, 샘플 당 저렴한 비용 및 간단한 창립 이론 (Stokes-Einstein 방정식)으로 인해 EV 특성화에 계속 공통적으로 사용되고 있습니다. NTA에 의한 EV 평가는 레이저 광 산란 및 브라운 운동 분석을 사용하여 입자 크기 분포 및 농도 추정치를 생성하며, EV의 굴절률에 의해 결정된 검출의 하한을 갖는다. 알려진 점도 및 온도의 유체 샘플을 사용할 때, EV의 궤적은 두 차원에서 평균 제곱 변위를 결정하기 위해 추적됩니다. 이것은 입자 확산 계수가 계산되고 변형된 스토크스-아인슈타인 방정식 5,6,7에 의해 구체 등가 유체역학 직경으로 변환될 수 있게 한다. NTA의 입자-입자간 분석은 다른 특성화 방법들보다 EV들의 이질적인 집단에서 응집체 또는 더 큰 입자들에 의한 간섭이 적다7. 몇 개의 더 큰 입자가 사이징 정확도에 미치는 영향은 거의 없지만, 미세한 양의 크고 높은 광산란 입자가 존재하면 소프트웨어 EV 검출 및 추적 감소로 인해 더 작은 입자의 검출이 현저하게 감소합니다8. 측정 기술로서, NTA는 일반적으로 더 큰 입자 또는 입자의 응집체에 편향되지 않는 것으로 간주되지만 개별 입자 분석(9)을 통해 다중 크기 집단을 해결할 수 있다. 입자에 의한 광산란의 사용으로 인해 NTA 분석의 한계 중 하나는 EV와 비교하여 유사한 굴절 및 크기 특성을 가진 먼지, 플라스틱 또는 분말과 같은 미립자가 이러한 특성화 방법으로 실제 EV와 구별 될 수 없다는 것입니다.
NanoSight LM10 (나노 입자 크기 분석기) 및 LM14 (레이저 모듈)는 2006 년부터 판매되었으며이 기기의 새로운 모델이 개발되었지만이 특정 모델은 많은 핵심 시설에서 발견되며 신뢰할 수있는 작업으로 간주됩니다. 크기와 농도의 고해상도 측정을 위해 NTA 설정을 적절하게 최적화하려면 교육이 필요합니다. 최적의 비디오 녹화에 필요한 두 가지 중요한 설정은 (1) 카메라 레벨과 (2) 감지 임계값입니다. 이는 작업자가 샘플의 특성에 따라 설정해야 합니다. NTA 분석의 주요 제약 조건 중 하나는 107 ~ 10 9 입자 / mL 사이의 샘플 농도를 권장하는 것이며,이 샘플 희석을 달성하기 위해서는10이 필요할 수 있습니다. 인산염 완충 식염수, 0.15M 식염수 또는 초순수와 같은 희석에 사용되는 용액은 크기가 220μm 미만인 입자가 거의 없어 NTA 측정에 영향을 줄 수 있습니다. 희석에 사용되는 용액의 NTA 특성화는 분석되는 나노입자 샘플과 동일한 카메라 레벨 및 검출 임계값에서 수행되어야 한다. EV 샘플 희석에 사용되는 희석제에 존재하는 나노입자의 크기 및 농도는 EV의 NTA 분석을 포함하는 간행물에 거의 포함되지 않는다.
이 프로토콜은 선택된 카메라 레벨, 검출 임계값 및 샘플의 기계적 필터링을 사용하여 평가된 합성 EV 유사 리포좀의 NTA 분석을 사용하여 NTA 데이터 세트에 대한 카메라 레벨, 검출 임계값 또는 샘플 여과의 체계적인 영향을 분석합니다. 리포솜은 보충 파일 S1에 기재된 바와 같이 합성되었다. 합성 리포좀은 4°C에서 보관시 크기 균일성, 물리적 특성 및 안정성 때문에 본 실험에 사용되었다. EV의 실제 샘플이 사용될 수 있었지만, 저장 중 EV의 이질성과 안정성은이 연구와 해석을 복잡하게 만들 수 있습니다. (A) 리포솜과 (B) EV의 NTA 보고서의 유사성은 이 논문에서 리포솜에 대해 밝혀진 체계적인 효과가 EV 특성화에도 적용될 가능성이 높다는 것을 나타낸다(그림 1). 이러한 결과는 중요한 소프트웨어 설정에 대한 완전한 보고와 희석제, 희석 및 여과와 같은 샘플 처리에 대한 설명이 NTA 데이터의 재현성에 영향을 미친다는 개념을 지원합니다.
이 논문의 목적은 NTA 설정(온도, 카메라 레벨 및 검출 임계값)과 샘플 준비에 따라 수집된 결과가 변경된다는 것을 입증하는 것입니다: 체계적이고 크기 및 농도의 유의한 차이가 얻어졌다. NTA는 MISEV2018 특성화 사양을 충족하는 데 널리 사용되는 옵션 중 하나이므로 이러한 결과는 재현성을 보장하기 위해 샘플 준비 및 NTA 설정을 보고하는 것이 중요하다는 것을 보여줍니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63059/63059fig01.jpg"> 그림 1: 리포좀과 EV를 비교하기 위한 대표적인 NTA 보고서. (A) 리포솜: 2020년 3월 12일 NTA에 특징지어지는 여과되지 않은 샘플. (B) EVs: 2021년 8월 26일에 NTA에 특징지어지는 여과되지 않은 샘플. 약어: NTA = 나노입자 추적 분석; EVs = 세포밖 소포. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63059/63059fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>자동 피펫터</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 튜브, 원뿔형, Nunc 15 mL</td><td>Thermo Sci.</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>렌즈 클리너</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>렌즈 종이</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoSight LM-10</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoSight LM-14 레이저 모듈</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanosight NTA 소프트웨어 Ver. 3.2</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>종이 타월</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁, 1-200 &micro; L, 여과, 멸균, 낮은 바인딩 BioExpress</td><td></td><td>P -3243-200X</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁, 50-1,000 &마이크로; L, 여과, 멸균</td><td>BioExpress</td><td>P-3243-1250</td><td></td></tr><tr><td>식염수, Dulbecco의 인산염 완충 (Ca 또는 Mg 없음)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>표준, 라텍스 전송- 100 nm (3 mL)</td><td>Malvern</td><td>NTA4088</td><td></td></tr><tr><td>표준, 라텍스 전송- 50 nm&nbsp; (3mL)</td><td>Malvern</td><td>NTA4087</td><td></td></tr><tr><td>주사기 필터, 33 mm, .22 &micro; m, MCE, Sterile</td><td>Fisher 브랜드</td><td>09-720-004</td><td></td></tr><tr><td>주사기, TB, 1mL, 슬립 팁</td><td>Becton Dickinson</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>폐액 용기</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

나노 입자 추적 분석의 2018 지침 세포 밖 소포 연구에 대한 최소한의 정보를 충족하기위한 재현성 향상

Improving Reproducibility to Meet Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 Guidelines in Nanoparticle Tracking Analysis

나노입자 추적 분석(NTA)은 2006년부터 세포밖 소포(EV) 연구에 사용되는 여러 특성화 방법 중 하나였습니다. 많은 사람들은 NTA 기기와 소프트웨어 패키지를 최소한의 교육만으로 쉽게 활용할 수 있으며 크기 교정이 사내에서 가능하다고 생각합니다. NTA 획득 및 소프트웨어 분석이 모두 EV 특성화를 구성하므로 세포 밖 소포 연구를위한 최소 정보 2018 (MISEV2018)에서 다룹니다. 또한, EV 실험의 견고성을 향상시키기 위해 EV (EV-TRACK)의 투명한보고 및 중앙 집중화 지식에 의해 모니터링되었습니다 (예 : 통제되지 않은 요인으로 인한 실험 변동 최소화).
방법 및 제어에 대한보고를 장려하려는 노력에도 불구하고 많은 출판 된 연구 논문은 원래의 NTA 관찰을 재현하는 데 필요한 중요한 설정을보고하지 못합니다. 음성 대조군 또는 희석제의 NTA 특성화를보고하는 논문은 거의 없으며, 인산염 완충 식염수 또는 초순수 증류수와 같은 상업적으로 이용 가능한 제품이 미립자가 없다고 분명히 가정합니다. 마찬가지로, 긍정적 인 통제 또는 크기 표준은 입자 크기를 확인하기 위해 연구자에 의해보고되는 경우는 거의 없습니다. Stokes-Einstein 방정식은 입자 변위를 결정하기 위해 샘플 점도와 온도 변수를 통합합니다. 따라서 전체 샘플 비디오 수집 동안 안정적인 레이저 챔버 온도를 보고하는 것은 정확한 복제를 위한 필수적인 제어 측정입니다. 샘플 또는 희석제의 여과는 또한 일상적으로 보고되지 않으며, 만약 그렇다면, 필터의 특이성(제조자, 막 물질, 기공 크기) 및 저장 조건은 거의 포함되지 않는다. 국제 세포밖 소포 학회 (ISEV)의 허용 가능한 실험 세부 사항에 대한 최소한의 표준에는 EV의 특성화를위한 잘 문서화 된 NTA 프로토콜이 포함되어야합니다. 다음 실험은 NTA 분석 프로토콜이 개별 연구자에 의해 수립되어야 한다는 증거를 제공하며, 단일 소포 특성화에 대한 MISEV2018 요구 사항을 충족하기 위한 옵션 중 하나로 NTA 특성화를 사용하는 출판물 방법에 포함되어야 한다는 증거를 제공합니다.

표 1 은 리포좀 샘플(18개의 여과 및 18개의 여과되지 않은) 및 대표적인 DPBS 희석제에 대한 NTA 비디오의 결과를 함유한다. 두 그룹에 걸친 비교는 이 백서의 카메라 레벨 또는 감지 임계값에 관계없이 완료되었습니다. 여과된 샘플은 평균 입경이 108.5nm, 입자 모드가 86.2nm, 농도가 7.4 ×10,8 입자/mL였다. 대조적으로, 여과되지 않은 샘플은 평균 입자 직경이 159.1 nm, 입자 모드가 105.7 nm, 농도가 7.6 × 108 입자 / mL였습니다. 카메라 레벨 또는 검출 역치에 관계없이 필터링되고 필터링되지 않은 샘플에 대한 평균 및 모드 값은 통계적으로 유의하였다(p&lt;0.05). 여과된 샘플과 여과되지 않은 샘플 사이의 농도 차이는, 카메라 레벨 또는 검출 역치에 관계없이, 유의하지 않았다(p=0.86).
<table fo:font-size="8px" fo:keep-together.within-page="1" f...

나노입자 추적 분석(NTA)은 세포밖 소포를 특성화하기 위해 널리 사용되는 방법이다. 이 백서에서는 NTA 실험 파라미터 및 제어와 실험실 간 재현성을 위해 MISEV2018 및 EV-TRACK이 제안한 지침을 보완하는 데 필요한 샘플 및 희석제의 균일한 분석 및 특성화 방법을 강조합니다.

Nanoparticle tracking analysis (NTA) has been one of several characterization methods used for extracellular vesicle (EV) research since 2006. Many ...

이 프로토콜은 NanoSight LM10의 초보 운영자를 위해 개발되었습니다. 단계별 지침을 따르면 정확하고 재현 가능한 결과를 얻을 수 있습니다. 이 기술은 사용자의 기술 수준에 관계없이 여러 평가판 실행에서 일관된 결과를 보장하는 데 도움이 됩니다.나노입자 특성화, 특히 정량화는 세포밖 소포 연구 분야에서 계속 도전이 되고 있다. 이 프로토콜은 현탁액 중 나노 입자의 일관된 크기 및 농도 분석을 허용합니다. 먼저 레이저 모듈의 유리 표면을 양질의 렌즈 클리너와 렌즈 용지로 청소하십시오.모듈을 조립하기 전에 O 링 씰이 플로우 셀 커버의 홈에 제대로 장착되어 있는지 확인하십시오. 그런 다음 흐름 셀 커버를 레이저 모듈에 올려 놓고 전기 접점이 올바른 방향에 있는지 확인하십시오. 그런 다음 스프링이 장착 된 네 개의 엄지 나사를 흐름 셀 플레이트를 통해 놓고 개별적으로 조이지 않고 레이저 모듈의 나사를 맞 춥니 다.플로우 셀 커버에 균일한 압력을 가하면서 엄지 나사를 대각선으로 교대로 조여서 꼭 맞을 때까지 조입니다. 슬립 잠금 어댑터로 두 밀리리터의 튜버큘린 주사기를 DPBS 한 밀리리터로 세 번 플러시합니다. 주사기를 나머지 포트에 삽입하기 전에 첫 번째 투베르쿨린 주사기로부터 플런저를 제거하고 폐기하여 보이드 희석제 또는 샘플 저장소로서 작용한다.그런 다음 두 번째 주사기를 한 밀리리터의 DPBS로 채우고 흐름 셀 덮개의 입구 포트에 부착하십시오. DPBS가 레이저 모듈에 천천히 주입될 때 챔버에서 공기가 정화될 수 있도록 출구 주사기 포트를 상승된 상태에서 기울어진 레이저 모듈을 잡으십시오. 한 밀리리터의 공기를 입구 포트에 주입하여 레이저 모듈에서 나머지 DPBS를 플러시합니다.플러시를 두 번 반복합니다. 마지막 플러시 후 레이저 모듈을 가능한 한 완전히 비우고 초점을 맞추고 포지셔닝을 위해 모듈을로드하십시오. 소프트웨어를 엽니다.왼쪽 위 모서리 상자의 캡처 탭에서 카메라 시작을 클릭합니다. 다섯 분 후에 카메라가 자동으로 꺼지면 카메라 시작을 클릭하여 다시 시작합니다. 동일한 탭에서 카메라 레벨을 14 ~ 16으로 조정하여 레이저 라인을 밝게하고 입자 식별 및 초점을 단순화하십시오.헤드 피스의 왼쪽에 있는 상단 슬라이더를 안팎으로 이동하면 이미지가 카메라에서 아이피스로 전환됩니다. 시야각에서 지문 및 중심이라고 하는 밀도가 증가한 영역을 찾고 지문을 세로로 초점을 맞춥니다. 시야각에서 레이저 라인의 중앙에 배치한 다음 상단 슬라이더를 움직여 컴퓨터 화면에서 관찰된 대로 빛을 카메라로 전환합니다.컴퓨터 화면의 이미지는 현미경 접안 렌즈의 뷰에서 나온 거울 이미지입니다. 초점을 조정하여 초점 노브로 화면에서 움직이는 개별 파티클의 이미지를 선명하게 합니다. 샘플을 로드하려면 한 밀리리터의 샘플을 헹구어 낸 한 밀리리터의 투베르쿨린 주사기에 넣고 주사기를 유동 세포 덮개의 입구 포트에 부착하십시오.출구 포트에 부착된 열린 주사기에서 유체가 분명해질 때까지 플런저를 계속 전진시키십시오. 레이저 모듈에서 공기를 정화할 수 있도록 모듈을 기울여야 합니다. 카메라 뷰에서 초점을 레이저 라인의 오른쪽으로 이동하여 균일한 수의 입자 영역으로 이동합니다.수직 방향을 조정하여 빛의 수평 밴드를 중앙에 맞추고 가장 많은 수의 파티클이 뷰에 표시될 때까지 초점을 다시 맞춥니다. 모든 후속 조치에 대해 초점의 위치를 일관되게 유지하십시오. 카메라 뷰의 오른쪽 상단에서 어두운 정보 기호가 간헐적으로 켜고 끄는 지점으로 카메라 레벨을 조정합니다.나노입자 추적 분석 또는 NTA의 경우 지속 시간을 30초 또는 60초로 설정하고 비디오 수를 다섯 개로 설정합니다. 기존 기본 파일 이름을 변경하려면 새 파일 이름으로 생성된 데이터에 대한 새 저장소 사이트의 탭을 클릭합니다. 그런 다음 목표 온도 상자를 선택하여 원하는 온도를 입력하고 스크립트 생성을 클릭하여 표준 측정을 재사용하십시오.샘플이 로드되고 실험을 실행할 준비가 되면 스크립트 만들기 및 실행을 클릭합니다. 설정된 보고서 세부 정보 팝업 화면에서 연산자, 샘플 및 희석제에 대한 필요한 정보로 필드를 채웁니다. 원하는 필드가 모두 채워지면 설정 확인을 클릭하여 스크립트를 시작합니다.각 비디오 캡처 전에 플런저를 수동으로 진행하라는 프롬프트를 찾습니다. 약 0.05 밀리리터의 샘플을 레이저 챔버에 주입하십시오. 파티클이 고정되면 [확인]을 클릭합니다. 다섯 번째 비디오 캡처를 완료하면 프로세스 상자와 함께 설정 확인 상자가 나타납니다.프레임이 비디오 화면 하단에서 수동으로 진행되면 화면에 파티클을 만드는 파란색 십자선의 수를 기록하고 샘플 처리를 위한 감지 임계값을 설정합니다. 완료에 대한 대화 상자 알림이 표시되기 전에 결과가 히스토그램에서 비디오가 자동으로 처리될 때까지 기다린 다음 확인을 누르십시오. 내보내기 설정 상자가 나타나면 내보내기를 클릭하여 결과를 저장합니다. 현재 실험에 나열된 다섯 개의 캡처 비디오를 모두 강조 표시합니다.그런 다음 선택한 파일 처리를 클릭하고 프로세스 상자에 설정 확인 상자가 나타날 때까지 기다렸다가 깜박여 감지 임계값을 변경 한 다음 감지 임계 값을 원하는 수준으로 조정하고 설정으로 이동하여 확인을 클릭하십시오. 비디오는 결과 히스토그램에서 자동으로 처리되며 완료에 대한 대화 상자 알림이 표시됩니다. 클릭 OK.In 리포좀 샘플 및 대표적인 DPBS 희석제에 대한 대표적인 분석, 나노트래킹 분석, 또는 NTA의 결과가 도시되어 있다. 여과된 샘플은 밀리리터 당 108 나노미터의 평균 입자 직경 및 7.4배 10 내지 8번째 입자의 농도를 가졌다.대조적으로, 여과되지 않은 샘플은 밀리리터 당 159 나노미터의 평균 입자 직경 및 7.6 배 10 내지 8 번째 입자의 농도를 가졌다. 결합된 카메라 레벨에서, 검출 임계값이 두 개에서 다섯으로 증가함에 따라, 평균 및 모드 입자 크기는 여과된 샘플의 입자 크기가 유의하게 감소하는 것으로 나타났다. 결합된 카메라 레벨에서의 입자 농도는 검출 임계값이 증가함에 따라 감소하였다.여과된 샘플과 여과되지 않은 샘플 사이의 입자 농도에서 유의한 차이는 검출되지 않았다. 결합된 검출 임계값에서, 카메라 레벨이 12에서 14로 증가함에 따라, 필터링된 샘플의 평균 및 모드 입자 크기의 감소가 주목되었다. 결합 감지 임계값의 입자 농도는 카메라 레벨이 12에서 14로 증가함에 따라 증가했습니다.여과된 샘플과 여과되지 않은 샘플 사이에 유의한 차이는 관찰되지 않았다. 4.1~5.2단계는 올바른 보기 영역을 찾는 데 중요합니다. 여러 시험 실행에서 일관된 결과를 얻는 것은 이러한 반복 가능한 기술에 달려 있습니다.동적 광산란은 주로 입자의 표면 전하 인 제타 전위를 얻기 위해 나노 입자 추적 분석의 동반자로 자주 사용됩니다. 나노입자 분석을 위해, NTA는 세포밖 소포 연구에 유용한 입자의 정량화의 매우 귀중한 방법이다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

nanoparticle 추적 분석 (NTA)와 고분자 유전자 전달 나노 입자를 평가하기 위해 높은 처리량 유동 세포 계측법에 대한 프로토콜이 설명되어 있습니다. NTA는 nanoparticle 입자 크기 분포와 플라스미드 당 입자 분포를 특성화하기 위해 사용됩니다. 높은 처리량 유동 세포 계측법은 유전자 전달 biomaterials의 라이브러리에 대한 양적 transfection 효율 평가를 할 수 있습니다.

고분자 유전자 배달에 대한 평가는 Nanoparticle 추적 분석 및 높은 처리량 유동 세포 계측법에 의해 나노 입자

이 기사에서는 전혈에서 엑소좀을 분리하고 반자동 기기를 사용한 나노 입자 추적에 의한 추가 분석 방법을 제시합니다. 제시된 기술은 액체 현탁액의 입자를 시각화하고 분석하기 위한 매우 민감한 방법을 제공합니다.

엑소 정량화 및 크기 측정을위한 혁신적인 방법

세포 외 소포는 응고, 면역 반응, 암 또는 약물 전달이나 재생 의학의 잠재적 치료제를 포함하여 생리 학적 및 병리학 적 과정에 중요한 역할을한다. 이 프로토콜은 조정 가능한 저항 펄스 감지 기능을 사용하여 다양한 유체 절연 및 비 절연 외 소포의 정량화 및 크기 특성화하기위한 방법을 제시한다.

정량화 및 조정 가능한 저항 펄스 감지 기능을 사용하여 세포 외 소포의 크기 프로파일 링

이 프로토콜에서 우리는 형광 기반 나노-추적 분석 하 여 인간의 전체 혈액에서 세포 외 vesicles의 신속한 격리 및 특정 마커의 특성화에 대 한 완벽 한 워크플로우를 설명합니다. 제시 결과 재현성의 높은 레벨을 표시 하 고 셀 문화 supernatants 조정 될 수 있습니다.

나노-추적 분석 인 혈에 있는 단일 Extracellular Vesicles의 빠른 형광 기반 특성

exosome 마약 배달 사업자의 새로운 세대입니다. 우리는 높은 수율 및 순도 siRNA 전달 exosome 격리 프로토콜을 설립. 우리는 또한 exosomes에 놓여있는지 이라는 일반적인 siRNA를 캡슐화 하 고 siRNA 로드 exosomes 암 세포에서의 세포질 통풍 관을 조사.

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질병 및 악성 세포에 대 한 엑 소 좀 유래 바이오 마커의 임상 번역은 신속 하 고 정확한 정량 방법의 결여에 의해 방해 된다. 이 보고서는 작은 부피의 혈 청 또는 혈장 샘플에서 특정 엑 소 좀을 정량화 하는 저 배율 어두운 영역 현미경 이미지의 사용을 설명 합니다.

종양 유래 엑 소 솜을 정량화 하는 나노 플라즈마-강화 된 산란 및 저 배율 현미경 이미징 사용

여기서 설명된 프로토콜은 나노입자 추적 분석(NTA)을 통해 수성 물질에서 구형 나노 입자, 보다 구체적으로 금 나노 입자의 유체역학적 직경을 측정하는 것을 목표로 한다. 후자는 브라우니아 운동으로 인한 입자의 움직임을 추적하고 유체 역학 직경을 얻기 위해 스토크스 - 아인슈타인 방정식을 구현하는 것을 포함한다.

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우리는 마우스 perigonadal 지방 조직 및 인간 혈장에서 분리된 세포외 소포의 크기 분포 및 총 입자 농도를 추정하기 위하여 새로운 나노 입자 추적 분석 계기를 사용하는 방법을 보여줍니다.

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본 프로토콜은 표면 항원 및 단백질 화물의 후속 프로파일링과 함께 말초 혈액 및 고형 조직으로부터 세포외 소포를 추출하는 방법을 설명한다.

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최신 세대의 EV 특성화 도구는 여러 파라미터에 대한 단일 EV 분석이 동시에 가능합니다. 나노유세포분석은 표지 없이 45nm보다 큰 모든 생물학적 입자를 측정하고 다양한 형광 표지 기술로 아집단의 특정 특성을 식별합니다.

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