Name: 생체 발광을 사용하여 마우스의 유방암 성장 및 전이성 콜로니 형성 모니터링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: 학습하세요 생체 발광을 이용한 마우스 유방암 종양 성장 및 전이성 콜로니 형성의 비침습적 실시간 모니터링 방법을. MCF-7, MDA-MB-468, MDA-MB-231 세포주를 활용한 이 기법은 항암제 효능 연구에 활용됩니다.

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Y.D.S. 연구소 회원들에게 감사드립니다. 예루살렘 하다사 메디컬 센터(Hadassah Medical Center)에 있는 Wohl Institute for Translational Medicine에 작은 동물 영상 시설을 제공해주신 것에 대해 감사드립니다. 이 연구는 이스라엘 암 연구 기금 (Israel Cancer Research Fund)의 연구 경력 개발 상 (Research Career Development Award) 의 지원을 받았다.

모든 마우스 실험은 히브리 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회-승인 프로토콜 MD-21-16429-5 하에 수행되었다. 또한, 히브리 대학은 실험실 동물 관리의 평가 및 인증을위한 협회 (AAALAC)의 인증을 받았습니다.
1. 세포주 정비
참고: 인간 유방암 세포주(MCF-7, MDA-MB-468 및 MDA-MB-231)가 이 프로토콜에 사용되었다.
<ol><li>모든 유방암 세포주를 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)에서 배양하고, 가습된 이산화탄소(5%CO2) 배양기에서 37°C에서 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신으로 보충하였다. 참고 : 정기적으로 세포 밀도를 확인하십시오. 70 % 합류율에 도달 할 때 향후 사용을 위해 분할하고 확장하십시오.</li>
</ol>2. 바이러스 준비
<ol><li>HEK293T 세포가 분리될 때까지 1mL의 트립신으로 치료하십시오.</li>
	<li>트립신 활성을 중화시키기 위해 DMEM (10% FBS) 10 mL를 첨가하고, 세포 현탁액을 새로운 15 mL 원심분리 튜브로 옮긴다.</li>
	<li>150 × g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 침전시킨다. 원심분리 후 상층액을 버리고 신선한 DMEM 배지 1 mL를 첨가한다.</li>
	<li>세포 농도를 결정하고 6 웰 플레이트에서 106 세포 / 웰× 1.2 종자.</li>
	<li>다음 날, 형질감염 시약, 무혈청 DMEM, 엔벨로프 플라스미드 (VSV-G), 렌티바이러스 패키징 플라스미드 (ΔVPR), 및 pLX304 루시페라제-V5 블라스트 플라스미드 또는 FUW GFP 플라스미드를 포함하는 필요한 모든 시약을 예열한다.</li>
	<li>1.5 mL 오토클레이브 원심분리 튜브에서, 50 μL의 무혈청 DMEM을 0.3 μg의 VSV-G 플라스미드, 1 μg의 ΔVPR, 및 1.2 μg의 pLX304 루시페라제-V5 블라스트 플라스미드 또는 FUW GFP 플라스미드와 혼합한다.</li>
	<li>이들 플라스미드를 배지와 완전히 혼합한 후, 형질감염 시약 5 μL를 첨가하고, 부드럽게 혼합하고, 혼합물을 실온에서 15분 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>인큐베이션 후, 상기 혼합물을 HEK293T 세포에 적가한다.</li>
	<li>24시간 후, 성장 배지를 2 mL의 (30% FBS) DMEM으로 교체한다. 다음날(형질감염 후 48시간)에, 바이러스("pLX304 루시페라제-V5 또는 FUW GFP 바이러스")를 함유하는 배지를 수확한다. 참고: 30% FBS를 사용하면 바이러스 생산 효율성이 향상됩니다.</li>
	<li>임의의 HEK293T 세포 잔기를 피하기 위해, 바이러스 함유 배지를 0.45 μm 시린지 필터 또는 원심분리기를 통해 5분 동안 150 × g 에서 통과시키고, 상청액을 수집한다. 참고: 장기간 보관하려면 바이러스의 작동 분취량을 -80°C에서 유지하십시오.</li>
</ol>3. GFP와 루시퍼라아제를 안정적으로 발현하는 세포 확립 ("GFP + Luc+ 세포")
<ol><li>세포를 감염시키기 전날, 6 웰 플레이트에 웰 당 8 개의 × 10 개의5 개의 세포를 시드하십시오.</li>
	<li>하룻밤 동안 배양한 후, 성장 배지를 8 μg/mL의 폴리브렌을 함유하는 신선한 배지로 교체한다. 200 μL의 FUW GFP 바이러스를 세포에 적가한다.</li>
	<li>선택사항: 바이러스 효율을 향상시키기 위해, 플레이트를 560 × g 에서 30분 동안 원심분리(37°C)한다(스핀 감염).</li>
	<li>세포를 48시간 동안 인큐베이션하고, GFP 발현을 형광 현미경으로 검증한다.</li>
	<li>GFP 발현 세포를 형광 활성화 세포 분류 (FACS) (GFP+)에 의해 정렬한다 (도 1A).</li>
	<li>GFP 분류된 세포를 단계 3.2에 기재된 바와 같이 pLX304 루시페라제-V5 블라스트 바이러스로 감염시킨다.</li>
	<li>세포를 감염 후 30시간 후에 블라스티시딘(10μg/mL)으로 처리하여 pLX304 루시페라제-V5 블라스트 발현 세포(GFP+, Luc+ 세포)를 풍부하게 합니다. 그런 다음 이틀마다 블라스티시딘을 함유 한 신선한 배지로 교체하십시오. 추가적으로, 대조군으로서, 나이브 세포를 동일한 블라스티시딘 함유 배지로 치료한다. 참고 : 감염된 세포와 대조 세포 간의 명확한 차이는 블라스티시딘 치료 며칠 후에 관찰되어야합니다. 이 효과는 세포주에 의존적이며 보통 ~ 8-10 일이 걸립니다. 열악한 생존율은 낮은 바이러스 생산 수율을 나타낼 것이다. 그렇다면 낮은 효율로 새로운 바이러스 배치를 생산하면 향후 실험에 영향을 줄 수 있습니다.</li>
</ol>4. 체외 루시퍼라아제 활성 검증
<ol><li>MCF-7, MDA-MB-468, 및 MDA-MB-231 GFP+ Luc+ 세포를 15 cm 플레이트에서 80% 컨플루언시로 성장시킨다. 단계 2.1-2.2에 기재된 바와 같이 트립신화에 의해 세포를 수확한다.</li>
	<li>각 웰 (0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4 × 104)에서 증가하는 세포 수를 검정색 96-웰 플레이트에 시드한다. 참고: 검은색 96웰 플레이트는 흰색 또는 투명 플레이트가 자동 발광 신호를 생성하므로 루시퍼라제 수준을 측정하는 데 더 적합합니다. 대조군으로서, PBS로부터의 자가발광이 없는지 확인하기 위해 하나의 웰에 인산완충식염수(PBS)를 단독으로 사용한다.</li>
	<li>모든 웰을 100 μL의 DMEM으로 채우고 16-24 h 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>PBS 중의 루시페린 용액을 30 mg/mL의 스톡으로부터 1.5 mg/mL 농도로 준비한다. 루시페린 용액의 스톡을 분취액하고 -20°C에서 보관한다.</li>
	<li>세포를 PBS로 1회 부드럽게 세척하고, 각 웰에 루시페린 용액 100 μL를 첨가하고, 2분 동안 기다린다. 마지막으로, 생체발광을 이용하여 모든 유방암 세포에서 루시퍼라제 활성을 측정한다. 참고: 동물 실험 전에 시험관내 GFP 및 루시퍼라제 발현을 검사하는 것이 중요합니다. 또한 빈 웰은 배경을 뺀 데 사용됩니다.</li>
</ol>5. GFP+ Luc+ 세포에 쥐 주입하기
<ol><li>5 × 106 (MCF-7 및 MDA-MB-468) 또는 2 × 106 (MDA-MB-231) GFP+ Luc+ 세포를 각각 200 μL 또는 100 μL PBS 내로 옮긴다.</li>
	<li>주사하기 전에 멸균 된 생물학적 후드를 5 % 소독제 용액으로 청소 하십시오 (자료 표 참조). 이어서, 마우스를 2-3분 동안 1 L/min의 기류 속도로 4% 이소플루란을 함유하는 여과된(0.2 μm) 공기로 마취시킨다. 주: 적절한 마취를 확인하는 것이 필수적입니다. 마우스의 발가락을 꼬집고 어떤 반응을 찾으십시오.</li>
	<li>마취 된 마우스 머리 위에 원뿔을 수핀 위치에 놓습니다. 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 수의사 연고를 눈에 바르십시오.</li>
	<li>면봉을 사용하여 에탄올로 유선의 위 마우스의 복부 부위를 닦고 포셉으로 4번째 유선을 들어 올립니다.</li>
	<li>바늘 27 G x 3/4 (0.4 x 19 mm)를 지방 패드 아래에 넣고 세포 현탁액 100 μL를 천천히 주입하십시오. 참고: 피부 아래에 둥근 팽창이 나타납니다. 또한, 부적절한 주사는 동일한 실험군에서 종양 성장 속도 또는 종양의 부재에 편차를 초래할 수 있다.</li>
	<li>주사 절차가 끝나면 마우스를 후드에서 꺼내 새 케이지로 옮깁니다. 그들이 의식으로 돌아갈 때까지 생쥐를 모니터링하십시오. 주: 사용된 바늘과 주사기가 모두 날카로운 상자에 버려졌는지 확인하십시오.</li>
</ol>6. GFP+ Luc+ 마우스의 루시퍼라제 수준 측정
<ol><li>생체 발광 검출 전에 왼손으로 목을 잡고 의식이있는 마우스를 억제하십시오. 그런 다음 손을 왼쪽으로 기울이면 마우스가 위쪽으로 향하게되고 하체가 수핀 위치에 있습니다.</li>
	<li>바늘 크기가 27G x 3/4(0.4 x 19mm)인 1.0 mL 주사기를 사용하여 왼쪽 아래 복부 사분면의 마우스 복부 표면에 복강내(i.p.) 루시페린(30mg/mL) 100μL를 주입합니다. 참고 : 바늘 끝은 내장 장기에 침투 할 수 있으므로 복벽에서 3-5mm 이상 삽입해서는 안됩니다. 또한, 마취 된 마우스의 체내에서 루시페린 분포가 의식이있는 마우스보다 느리기 때문에 마취없이 i.p. 주사를 수행하는 것이 좋습니다. 따라서, 의식이있는 마우스에서 루시퍼라제 수준을 모니터링하는 것이 더 빠른 절차입니다.</li>
	<li>마우스를 마취 없이 7분 동안 유지한 다음, 종양 동역학을 측정하기 전에 마취 챔버 내에서 3분 동안 유지하였다. 참고 : 배양 시간은 실험, 세포주 및 종마다 다릅니다. 따라서 실험을 시작하기 전에 배양 시간을 교정하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>단계 5.2-5.3에 기재된 바와 같이 마우스를 마취시킨다.</li>
	<li>인큐베이션 중에 소프트웨어(재료 테이블)를 열고 이미징 시스템을 초기화한 다음 초기화 버튼을 클릭합니다. 참고 : 카메라가 식히고 -90 °C에 도달하는 데 ~ 10 분이 걸립니다. 추가적으로, 배경 대조군으로서, 순진한 마우스(즉, 루시퍼라제 유전자를 발현하지 않는 세포를 주입한 GFP+ 마우스)에서 루시퍼라제 수준을 측정한다.</li>
	<li>다음 설정을 사용하여 자동 노출 설정을 유지하십시오 : 노출 시간 자동, 60 초; 비닝 매체, F / 정지 1; 차단된 여기 필터; 방출 필터가 열려 있습니다. 초기화 가 끝나면 이미징 마법사를 선택| 생체 발광을 클릭하고 다음 |를 클릭하십시오. 필터 | 열기 이미지 제목에서 마우스 를 선택합니다.</li>
	<li>필드 뷰에서 스테이지 C(10cm)와 피사체 높이: 1.50cm를 선택합니다.</li>
	<li> 이미지 설정 스테이지를 C로 클릭하고 획득 버튼을 클릭하기 전에 마우스가 적절한 수핀 위치의 스테이지에 배치되어 있는지 확인합니다.</li>
	<li>도어를 닫고 획득 단추를 클릭한 다음 이미지가 화면에 나타날 때까지 기다립니다. 참고: 자동 노출 옵션을 사용하면 신호에 따라 강한 신호가 5-20초가 걸립니다. 약한 신호는 약 60 초가 소요됩니다.</li>
	<li>다른 마우스에 대해 이 단계를 반복합니다.</li>
	<li>폐 전이를 감지하려면 두꺼운 검은 판지 종이를 사용하여 원발성 종양의 강한 신호를 덮고 폐의 복부 측면 만 카메라 쪽으로 노출시킵니다. 위에서 설명한 것과 동일한 매개 변수를 사용하여 이미지를 캡처합니다.</li>
</ol>7. 생체 발광 및 형광을 이용한 생체 외 이미지 획득
<ol><li>데시케이터에서 이산화탄소(CO2) 흡입을 사용하여 마우스를 안락사시키고 오토클레이브 가위와 포셉을 사용하여 마우스를 해부한다.</li>
	<li>0.9% 식염수를 사용하여 마우스를 관류시키고, 장기를 수확하고, 1x PBS로 헹구어 장기로부터 혈액 얼룩을 제거한다.</li>
	<li>헹굼 된 장기를 페트리 접시에 옮겨 생체 발광 기계의 무대에 놓습니다. 단계 6.2-6.6에 설명된 것과 동일한 생체발광 설정을 적용한다. 참고: 루시퍼라아제 신호의 감소로 인해 이 단계는 시간 제한이 있습니다. 따라서, 마우스를 안락사시킨 후, 즉시 생체 발광에 의해 장기를 시각화한다.</li>
	<li>GFP 이미지의 경우, 생체 발광 대신 형광 GFP 필터를 사용하여 단계 6.3에서 설명한 것과 동일한 설정을 적용합니다.</li>
	<li>스테레오 현미경을 사용하여 폐 이미지를 촬영하여 GFP+ 콜로니의 존재를 검사합니다.</li>
</ol>8. 생체 발광 데이터 분석
<ol><li>소프트웨어를 두 번 클릭하고 파일 메뉴에서 열기를 선택합니다.</li>
	<li>모든 파일을 열고 최소화하십시오. 모든 유닛이 래디언스(광자)인지 확인하십시오. 또한 모두에 적용을 클릭하여 모든 이미지에 대해 동일한 매개 변수를 유지합니다.</li>
	<li>보기 메뉴에서 도구 팔레트를 선택하면 새 창이 열립니다.</li>
	<li>도구 팔레트 창에서 ROI 도구 탭을 선택하고 유형에서 평균 Bkg ROI를 선택합니다.</li>
	<li>ROI 도구에서 원을 선택하고 마우스의 흉부 영역에 작은 원을 그립니다.</li>
	<li>원을 두 번 클릭하고 백그라운드 ROI 탭에서 향후 ROI를 위해 BKG로 사용 옵션을 선택한 다음 완료를 클릭합니다.</li>
</ol>9. 총 플럭스 측정
<ol><li>공구 팔레트 창에서 ROI 도구 탭을 선택하고 유형에서 ROI 측정을 선택합니다.</li>
	<li> ROI 도구에서 원을 선택하고 마우스의 원발성 종양에 큰 원을 그립니다.</li>
	<li>ROI 복사를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 ROI 붙여넣기를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하여 각 마우스의 모든 개별 파일에 넣습니다.</li>
	<li>ROI 도구 탭에서 ROI 측정을 클릭하면 ROI 측정이라는 새 창이 열립니다. 이 탭에서 측정 유형을 광도(광자)로, 이미지 속성을 모든 채워진 값으로 유지합니다.</li>
	<li>파일을 측정 파일 (*.txt) 또는 Csv(*.csv) 형식으로 내보냅니다.</li>
	<li>스프레드시트에서 내보낸 데이터를 열고 총 플럭스(p/s) 와 주 값을 가져옵니다. 참고: 이 단계는 다른 그룹을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어 , 비히 클로 치료받은 마우스와 약물로 치료받은 마우스.</li>
	<li>시간이 Y축을 따라 X축과 총 플럭스(p/s)를 따라 표시되는 XY 플롯을 생성합니다. 매주 각 표본 그룹에 대한 총 플럭스(p/s) 매개 변수를 취하고 비모수 스튜던트 t-검정을 사용하여 유의한 차이를 확인합니다.</li>
</ol>

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</ol>

모든 저자는 이해 상충이 없다고 공개했습니다.

동물 기반 실험은 암 연구 7,8,9에 필수적이며, 실제로 많은 프로토콜이 개발되었습니다 3,6,10,11,12,13,14. 그러나, 이들 연구의 대부분은 실험의 끝에서만 생물학적 효과를 결정하고, 따라서 종양 성장 동역학 또는 전이 콜로니화에 대한 영향은 결정되지 않은 채로 남아있다. 여기서, 우리는 GFP 및 루시퍼라아제를 발현하는 세포를 유방...

유방암은 전 세계적으로 빈번한 유형의 암으로, 미국에서 매년 약 250,000 건의 새로운 사례가 진단됩니다1. 높은 발생률에도 불구하고 새로운 항암제 세트는 유방암 환자 결과를 크게 개선했습니다2. 그러나 많은 환자들이 질병 재발과 전이성이 환자의 이환률과 사망률의 주요 원인 인 중요한 장기로 전이되어전이성 확산을 경험하기 때문에 이러한 치료법은 여전히 부적절합니다. 따라서, 유방암 연구의 주요 과제 중 하나는 원위 전이의 형성을 조절하는 분자 메커니즘을 규명하여 이들의 발달을 억제하는 새로운 수단을 개발하는 것이다.
암 전이는 세포가 원발성 종양에서 분리되어 혈액 순환을 통해 이웃 조직을 침범하는 역동적 인 과정입니다. 따라서, 세포가 유사한 전이성 캐스케이드를 겪는 동물 모델은 이러한 과정(3,4)을 지배하는 메카니즘의 식별을 용이하게 할 수 있다. 추가적으로, 이러한 생체내 모델은 유방암 치료제(5,6)를 개발하는데 필수적이다. 그러나, 이들 동위원소 모델은 효과가 종결시에 결정되기 때문에 실제 종양 성장 동역학을 나타낼 수 없다. 따라서 우리는 종양 발생과 전이성 식민지화를 실시간으로 탐지하는 루시페라아제 기반 도구를 확립했습니다. 추가적으로, 이들 세포는 GFP를 발현하여 전이성 콜로니를 검출한다. 이 접근법은 비교적 간단하며 어떠한 침습적 절차도 수반하지 않는다3. 따라서, 루시퍼라아제와 형광 검출을 결합하는 것은 유방암 치료제 및 질병 관리의 전임상 연구를 진전시키는 데 유용한 전략이다.

<table><tbody><tr><td>1.7 mL 에펜도르프 튜브</td><td>Lifegene</td><td>LMCT1.7B-500</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro; L 팁</td><td>Lifegene</td><td>LRT10</td><td></td></tr><tr><td>1000 &마이크로; L 팁</td><td>Lifegene</td><td>LRT1000</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 튜브</td><td>Lifegene</td><td>LTB15-500</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; L 팁</td><td>Lifegene</td><td>LRT200</td><td></td></tr><tr><td>6 웰 세포 배양 플레이트</td><td>COSTAR</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>96 웰 플레이트 BLACK 플랫 바텀</td><td>바 Naor</td><td>BN30496</td><td></td></tr><tr><td>자동 세포 카운터</td><td>Thermofisher</td><td>A50298</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria III 분류기</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Microlance 3 바늘 27 G (3/4 '')</td> <td>BD</td><td>302200</td><td></td></tr><tr><td>BD Plastipak 주사기 1 mL x 120</td><td>BD</td><td>303172</td><td></td></tr><tr><td>Corning 100 mm x 20 mm 스타일 접시</td><td>CORNING</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Corning 150 mm x 20 mm 스타일 접시</td><td>CORNING</td><td>430599</td><td></td></tr><tr><td>Countess 세포 계수 챔버 슬라이드</td><td>Thermofisher</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), 고포도당, 글루타민</td> <td>없음Biological Industries</td><td>01-055-1A</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse 80i microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>eppendorf Centrifuge 5810 R</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EP5820740000</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Biological Industries</td><td>04-127-1A</td><td></td></tr><tr><td>FUW GFP</td><td></td><td></td><td>Yossi Buganim 박사의 연구실(예루살렘 히브리 대학교)에서 기증함</td></tr><tr><td>HEK293T</td><td></td><td></td><td>Lior Nissim 박사의 연구실(예루살렘 히브리 대학교)에서 기증</td></tr><tr><td>Isoflurane, USP Terrell</td><td>Piramal</td><td>NDC 66794-01-25</td><td></td></tr><tr><td>IVIS 스펙트럼 생체 내 이미징 시스템</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민 용액</td><td>생물학 산업</td><td>03-020-1A</td><td></td></tr><tr><td>라이브 이미지 소프트웨어</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>생물 발광 측정</td></tr>: <tr><td>MCF-7</td>, <td>ATCC</td>, <td>ATCC, HTB-22</td><td></td></tr>, <tr><td>MDA-MB-231</td>, <td>ATCC</td><td>, ATCC, HTB-26</td><td></td></tr>, <tr><td>MDA-MB-468</td>, <td>ATCC</td>, <td>ATCC, HTB-132</td><td></td></tr>, <tr><td>파스퇴르 피펫,</td><td>NORMAX</td><td>2430-475</td><td></td></tr>, <tr><td>PBS,</td><td>Hylabs,</td><td>BP655/500D,</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-dR8.2-dvpr</td>, <td>Addgene</td><td>#8455</td><td>제공: David M. Sabatini' s lab (Whitehead institute, Boston, USA)</td></tr><tr><td>pCMV-VSV-G</td><td>Addgene</td><td>#8454</td><td>제공: David M. Sabatini' s lab (Whitehead institute, Boston, USA)</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 솔루션</td><td>생물학 산업</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시 90mm(90x15)</td><td>MINI PLAST</td><td>820-090-01-017</td><td></td></tr><tr><td>피펫 10ml</td><td>Lifegene</td><td>LG-GSP010010S</td><td></td></tr><tr><td>피펫 25ml</td><td>Lifegene</td><td>LG-GSP010050S</td><td></td></tr><tr><td>피펫 5ml</td><td>Lifegene</td><td>LG-GSP010005S</td><td></td></tr><tr><td>pLX304 Luciferase-V5 blast plasmid</td><td>Addgene</td><td>#98580</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#107689</td><td></td></tr><tr><td>Prism 9</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>시약 저장소</td><td>Bar Naor</td><td>BN20621STR200TC</td><td></td></tr><tr><td>SMZ18 Stereo microscopes</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Bio-Lab</td><td></td><td></td>190359400</tr><tr><td>주사기 필터</td><td>Lifegene</td><td>LG-FPV403030S</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue 0.5% 용액</td><td>생물학 산업</td><td>03-102-1B</td><td></td></tr><tr><td>트립신 EDTA 용액 B (0.25%), EDTA (0.05%)</td> <td>생물 산업</td><td>03-052-1A</td><td></td></tr><tr><td>진공 구동 필터</td><td>SOFRA LIFE SCIENCE</td><td>SPE-22-500</td><td></td></tr><tr><td>Virusolve</td><td></td><td>소독제</td><td></td></tr><tr><td>VivoGlo Luciferin, In Vivo Grade</td><td>Promega</td><td>P1043</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE HP DNA 형질주입 시약</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#6366236001</td><td></td></tr></tbody></table>

생체 발광을 사용하여 마우스의 유방암 성장 및 전이성 콜로니 형성 모니터링

Monitoring Breast Cancer Growth and Metastatic Colony Formation in Mice using Bioluminescence

유방암은 빈번한 이질적인 악성 종양이며 주로 먼 장기 전이로 인해 여성의 사망률의 두 번째 주요 원인입니다. 암세포가 유선지방 패드에 주입되는 널리 사용되는 동위원소 마우스 모델을 포함하여 여러 동물 모델이 생성되었다. 그러나, 이들 모델은 종양 성장 동역학 및 전이성 콜로니화를 모니터링하는 것을 도울 수 없다. 생쥐에서 실시간으로 암세포를 모니터링하는 최첨단 도구는 종양 생물학에 대한 이해를 크게 향상시킬 것입니다. 
여기서, 루시퍼라아제와 녹색 형광 단백질(GFP)을 안정적으로 발현하는 유방암 세포주가 확립되었다. 구체적으로, 이 기술은 시험관 내에서 루시퍼라제 활성을 측정하고 이어서 비비만 당뇨병-중증 복합 면역결핍(NOD-SCID) 마우스의 유선지방 패드에 암세포를 이식함으로써 개시되는 두 개의 순차적 단계를 포함한다. 주사 후, 종양 성장 및 전이성 콜로니화 둘 모두는 비침습적 생체발광 이미징 시스템에 의해 실시간으로 모니터링된다. 이어서, 폐에서 GFP 발현 전이의 정량화는 관찰된 생체발광 결과를 검증하기 위해 형광 현미경에 의해 검사될 것이다. 루시퍼라아제와 형광 기반 검출 도구를 결합한 이 정교한 시스템은 유방암 치료제 및 질병 관리에 사용할 수 있는 큰 잠재력을 가지고 있는 생체 내 암 전이를 평가합니다.

우리는 GFP 및 루시퍼라제 벡터를 발현하는 유방암 세포주 (MDA-MB-231, MCF-7 및 MDA-MB-468)를 생성하였다. 구체적으로, 이것은 순차적 감염에 의해 달성되었다. 먼저, 유방암 세포주를 형광 GFP를 발현하는 렌티바이러스 벡터로 감염시켰다. GFP 양성 세포(GFP+)를 감염 2일 후(도 1A, B) 분류하고 pLX304 루시페라제-V5 벡터에 감염시켰다. 이어서, 블라스티시딘을 사용하여 루시퍼라아제를 선택하여 지시된 (GFP+, Luc+) 세포를 생성하였다. 시험관내 루시퍼라제 활성을 검증하기 위해, 루시퍼라제 활성 수준의 세포 수 의존적 증가를 입증하였다(도 1C). 또한, 루시퍼라제 활성과 세포 수 사이에 선형 상관관계가 발견되었다(도 1D...

여기에서, 우리는 다양한 유방암 세포주에서 루시퍼라제 및 녹색 형광 단백질 발현을 수반하는 비침습적 모니터링 방법을 설명한다. 이 프로토콜은 마우스에서 실시간으로 종양 형성 및 전이성 콜로니화를 모니터링하는 기술을 제공한다.

Breast cancer is a frequent heterogeneous malignancy and the second leading cause of mortality in women, mainly due to distant organ metastasis. Several ...

이 정교한 비침습적 도구를 사용하여 마우스의 종양 성장 동역학 및 전이성 콜로니화를 실시간으로 모니터링할 수 있으며, 이는 유방암 치료 및 질병 관리에 큰 잠재력을 가지고 있습니다. 루시퍼라아제와 형광 검출을 결합하는 것은 유방암 진행 및 질병 관리에 대한 전임상 연구를 진행하는 데 유용한 전략입니다. 이것은 항암제 연구에 적용될 수 있습니다.이 프로토콜은 유방암에만 국한되지 않으며 폐 및 췌장과 같은 다른 암종에도 적용될 수 있습니다. MCF-7, MDA-MB-468, 및 MDA-MB-231 GFP 및 루시페라아제 양성 세포를 16센티미터 플레이트에서 개별적으로 80% 컨플루언시로 성장시킴으로써 시작한다. 트립신화에 의해 세포를 수확한 후, 각 웰에 점점 더 많은 수의 세포를 검정색 96-웰 플레이트에 시드한다.그런 다음 모든 웰을 100 마이크로리터의 DMEM으로 채우고 섭씨 37도, 5 % CO2 인큐베이터에서 16 ~ 24 시간 동안 배양하십시오. PBS 중의 루시페린 용액을 밀리리터 당 1.5 밀리그램의 농도로 준비하고, 용액을 영하 20도에서 보관하십시오. 인큐베이션 후, 각 웰에 루시페린 용액 100 마이크로리터를 첨가하기 전에 PBS로 세포를 한 번 부드럽게 세척한다.두 분 동안 기다린 다음, 생체발광을 이용하여 모든 유방암 세포에서 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 마우스를 주입하기 전에, 5백만 MCF-7 및 MDA-MB-468 세포를 PBS 200 마이크로리터 및 2백만 MDA-MB-231 GFP 및 루시페라아제 양성 세포로 100 마이크로리터 PBS로 옮긴다. 마취된 마우스를 수핀 위치에서 머리 위에 원뿔을 올려 주사할 준비를 한다.다음으로, 면봉을 이용하여 에탄올로 유선위 마우스의 복부 부위를 닦아내고, 네 번째 유선의 포셉을 들어 올린 후 지방 패드 아래에 27게이지 바늘을 삽입하여 준비된 세포 현탁액 100 마이크로리터를 천천히 주입한다. 주사 후, 마우스를 후드에서 꺼내어 의식으로 돌아갈 때까지 관찰중인 새로운 케이지로 옮깁니다. 생체 발광 검출 전에 왼손으로 목을 잡고 손을 왼쪽으로 기울여 의식이있는 마우스를 제지하여 마우스의 얼굴을 위쪽으로 향하게하고 하체가 수핀 위치에 있습니다.1 밀리리터 주사기를 사용하여 마우스의 왼쪽 아래 복부 사분면에 복강내 30 밀리리터 루시페린 100 마이크로 리터를 주입하십시오. 마우스를 마취 없이 일곱 분 동안 유지하고, 종양 동역학을 측정하기 전에

monitoring-breast-cancer-growth-metastatic-colony-formation-mice

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

뼈 전이의 실험 마우스 모델은 루시페라제 내유 종양 세포를 표현 intracardiac 배달 아래 설립되었습니다. 종양 개발 및 osteolytic 병변을 발생은 bioluminescence과 마이크로 중부 표준시 이미징과 길이 방향 감시했다.

Bioluminescence 및 마이크로 중부 표준시 이미징과 함께 종양의 Metastases 및 Osteolytic 조직 손상을 모니터링

hypoxia inducible 인자 - 1α 활동 Bioluminescence 이미징은 유방암 뇌 전이의 마우스 모델에서 종양 intracranial hypoxia 개발을 모니터에 적용됩니다.

유방암 뇌 전이의 종양 Hypoxia 역학 생체내의 Bioluminescence 이미징에서는 마우스 모델에서

근원:마리나 아란테스 라디키1, 빅터 카를로스 멜로1,빅토리아 파스 마차도1, 마르시아 크리스티나 올리베이라 다 로샤1, 자클린 바즈 데 올리베이라1, 루아나 크리스티나 카마르고1,2, 루이스 알렉상드르 뮐만1, 리카르도 벤테스 아제베도1, 소니아 나이르 바오1, 주앙 파울로 피게이로 롱고11브라질리아 대학교 생물과학연구소, 2브라질리아대학교 심리학연구소 기초심리과정학과이 비디오는 루시페라아제 발현 유방 선암종 세포를 암컷 마우스에 주입하고 생물발광 신호를 모니터링하여 시간 경과에 따른 원발성 및 전이성 종양 성장을 평가함으로써 생체 내에서 종양 진행을 추적하는 절차를...

암컷 마우스 모델에서 유방 종양 진행의 생물발광 이미징

생물 발광 영상은 종양과 전이를 지역화 잘 알려진 도구이지만, 이러한 이미지의 정량화는 종종 복잡한 계산 및 특정 장비를 필요로한다. 우리는 더 계산을 요구하지 않으며, 종양 부담과 치료 반응이 마우스 모델에서 관찰 할 수 있도록 정확한 획득 상태에 기초하여, 사용하기 쉬운 luminoscore 방법을 설명한다.

마우스 림프종 모델의 모니터링 종양의 진행과 치료 효과에 대한 생물 발광 기반 종양 정량 방법

동소 유방암 차 종양 모델 원발 종양의 외과 적 제거가 기재되어 자발적 전이를 생성하는 마우스의 수명을 연장한다. 종양 성장 및 진행 모니터링하고 루시퍼 형광 이미징에 의해 정량화된다.

자발적 유방암 전이의 동소 이식 마우스 모델

Murine orthotopic 유 방 암 모델 및 과격 한 유 방 절제술 모델 인간의 유방암 암 진행을 모방 하기 위해 종양 부담 척도를 생물 발광 기술을 소개 합니다.

Murine Orthotopic 전이성 유방암 암 모델을 생성 하 고 수행 Murine 과격 한 유 방 절제술

이 프로토콜은 이중 생물 발광 이미징에 의해 종양 진행 및 혈관신생을 실시간으로 모니터링하는 종양 베어링 마우스 모델의 확립을 설명합니다.

종양 진행 및 혈관 신생의 이중 생물 발광 이미징

이 작업은 녹색 형광 단백질 및 생물 발광 신호의 검출뿐만 아니라 정량적 분자 검출 기술의 통합에 의해 종양 하중을 정확하게 평가하기 위한 고급 프로토콜을 미리 설정합니다.

정형외 유방암 모델을 사용하여 삼중 음성 유방암 을 연구

기술된 접근법은 실험적인 꼬리 정맥 전이 실험과 생체 내 살아있는 동물 화상 진찰을 결합하여 폐에 있는 전이 수 그리고 크기의 정량화 이외에 유방암 전이 대형 및 성장의 실시간 감시를 허용합니다.

꼬리 정맥 전이 검사의 결합된 사용 및 생체 내 실시간 생체 내 이미징을 결합하여 폐암 전이성 식민지화 및 폐의 부담을 정량화

이 원고는 전이성 캐스케이드의 모든 단계에서 개입할 수 있는 orthotopically 주입된 유방 종양의 자발적 폐 전이의 확립 및 종단 성장 모니터링을 위한 방법론을 설명합니다.

생체 내 Orthotopically injected breast tumor cells의 자발적 폐 전이를 측정하기 위한 이미징

여기에서는 동물 모델에서 RNA 올리고머를 운반하는 자성 산화철 나노입자를 전이성 유방암으로 생체 내 전달하기 위한 프로토콜을 설명하여 발암성 핵산의 치료적 침묵을 위한 임상적으로 실행 가능한 접근 방식을 제공합니다.

Murine Breast Cancer Metastases의 나노약물 축적 모니터링

학습하세요 생체 발광을 이용한 마우스 유방암 종양 성장 및 전이성 콜로니 형성의 비침습적 실시간 모니터링 방법을. MCF-7, MDA-MB-468, MDA-MB-231 세포주를 활용한 이 기법은 항암제 효능 연구에 활용됩니다.

생체 발광을 사용하여 마우스의 유방암 성장 및 전이성 콜로니 형성 모니터링

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