Name: 마우스 일차 간 정현파 내피 세포의 분리 및 특성화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: 배우세요 마우스 간 정현파 내피 세포(LSEC) 분리 방법을 통해 세포 생물학 연구를 수행하는 기술입니다. 콜라게나제 관류와 CD146 자기 비드 선택을 사용하여 90% 이상의 순도와 94% 이상의 생존율을 확보합니다.

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이 연구는 NIH의 당뇨병 및 소화기 및 신장 질환의 국립 연구소 (1RO1DK122948 내지 SHI)와 NIH Silvio O. Conte 소화기 질환 연구 핵심 센터 P30 부여 메커니즘 (DK084567)에 의해 지원되었습니다. 일본 과학진흥회(JSPS) 해외연구펠로우십에서도 KF에 지원을 제공받았다. 우리는 또한 Gregory J. Gores 박사와 Steven Bronk 박사가 콜라게나제 관류 장치의 원래 설계 및 최적화에 대해 인정하고 싶습니다.

동물 프로토콜은 Mayo Clinic의 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받아 수행되었습니다. 여덟 주령의 C57BL/6J 수컷 마우스를 잭슨 연구소에서 구입하였다. 마우스는 온도 조절 12:12-h 밝은-어두움 사이클 시설에 수용되어 식이요법에 자유롭게 이용할 수 있었다.
1. 콜라겐 코팅 배양접시 또는 접시의 제조
<ol><li>0.02 mol/L 아세트산 50 mL를 만들려면H2O49.4 mL에 빙초산 0.6 mL를 첨가한다.</li>
	<li>0.02 mol / L 아세트산에 50 μg / mL 콜라겐 유형 I을 만드십시오. 희석은 로트의 농도에 달려 있습니다.</li>
	<li>10cm 배양 접시에 콜라겐 용액 3mL를 코팅하십시오. 실온 (RT)에서 1 시간 동안 인큐베이션한다. 참고 : 배양을 위해 다른 접시 또는 접시를 사용하는 경우 배양 면적에 따라 코팅 용액의 부피를 조정해야하며 일반적으로 6-10 μg /cm2를 사용하십시오.</li>
	<li>코팅된 표면으로부터 과량의 유체를 제거하고, 포스페이트 완충 식염수(PBS)로 3회 세척한다. 접시가 공기 건조되도록 허용하십시오.</li>
	<li>콜라겐 용액이 멸균되지 않은 경우, 멸균 조직 배양 후드에서 10분 동안 자외선(UV) 빛에 노출시켜 콜라겐이 코팅된 접시를 멸균한다.</li>
</ol>2. 장비 설정
<ol><li>도 1B와 같이 가열 및 가습된 재순환 관류 장치를 설치한다.</li>
	<li>관류 시스템을 5분 동안 10% 표백제를 사용하여 헹구고 또 다른 10분 동안 멸균수를 사용한다.</li>
	<li>콜라게나제 용액을 관류하기 전에 헹굼액을 가능한 한 많이 배출하십시오.</li>
	<li>콜라게나제 용액을 관류 시스템을 통해 주입하고( 도 1B에 도시된 바와 같이) 이를 37°C에서 예열한다. 속도 제어 다이얼에 표시된 대로 펌프 속도를 속도 1로 설정합니다(40mL/분과 같음).</li>
	<li>이 속도는 전체 절차에서 동일하게 유지하십시오. LSEC 분리 당일 동안 폐쇄 회로에서 실행되는 콜라게나제 용액을 재사용하십시오. 참고: 펌프 속도는 LSEC의 생물학적 상태를 교란시킬 수 있는 기계적 압력을 피하기 위해 1로 고정됩니다.</li>
</ol>3. 수술 절차
<ol><li>마우스의 무게를 재십시오.</li>
	<li>케타민 90 mg / kg 체중과 자일라진 10 mg / kg 체중을 복강 내 주사하십시오 (IP).</li>
	<li>마우스가 고통스러운 자극에 반응하지 않으면 그림 1B와 같이 마우스를 수술 표면에 고정시킵니다.</li>
	<li>마우스 복부에 70 % 에탄올을 뿌리십시오. 외과 용 가위를 사용하여 복부의 아래 부분부터 xiphoid 과정까지 ~ 5cm 길이의 절개를하십시오.</li>
	<li>다음으로, 복부의 양쪽에있는 작은 홍채 가위를 사용하여 복부 장기를 완전히 노출시키는 두 개의 측면 절단을하십시오.</li>
	<li>정맥 주사 (IV) 카테터의 외피를 동물의 등 아래에 두어 복부를 들어 올리고 평평하게하십시오.</li>
	<li>규칙적인 곡선 드레싱 포셉을 사용하여 창자와 위를 동물의 왼쪽으로 부드럽게 당깁니다.</li>
	<li>5-0 수술 봉합사를 노출 된 왼쪽 신장 바로 아래의 열등한 정맥 카바 (IVC) 아래에 놓습니다. 봉합사에 느슨한 히치를 묶으십시오.</li>
	<li>또 다른 5-0 수술 봉합사를 간 포털 정맥 (PV) 주위에 놓고 간 PV에서 비장 정맥 분기점 바로 위에 놓습니다. 봉합사에 느슨한 히치를 묶으십시오.</li>
	<li>PV 봉합사를 장력으로 사용하여 20 G IV 카테터를 1cm 아래의 간 PV에 삽입하여 좌우 간 PV로 분기합니다.</li>
	<li>카테터를 정맥 위로 밀어 올리지만 분기 영역 아래에 두십시오. 혈액이 물방울이 떨어지기 시작할 때까지 카테터 아래로 이동하게하십시오.</li>
	<li>수술 영역 위에 위치한 정맥 내 (IV) 병에 완충액 A (표 1) 중 일부를 넣고 IV 라인을 사용하여 카테터에 부착하십시오. 시스템에 공기 유입을 피하면서 이 용액으로 간을 씻어내십시오.</li>
	<li>신장 아래의 열등한 정맥 카바 주위의 봉합사를 묶으십시오. 이것은 간이 복고풍 퍼퓨즈를 할 수있게 해줍니다.</li>
	<li>IVC를 봉합사 아래로 잘라 동물이 피를 흘릴 수 있도록하십시오. 참고 :이 단계는 간 혼잡을 피하기 위해 신속하게 수행되어야합니다.</li>
	<li>IV 카테터를 PV 봉합사로 고정하십시오.</li>
	<li>일단 관류하면 위장, 창자, 비장 및 간장에 붙어있는 다른 찌꺼기를 잘라냅니다.</li>
	<li>횡격막과 흉강에서 주요 혈관을 잘라냅니다. 동물에서 간을 제거하고 관류 트레이에 놓습니다.</li>
	<li>조심스럽게 IV 라인을 제거하고 재순환 챔버에서 콜라게나제 용액을 연결하십시오. 참고: 3.16-3.18단계는 5분 이내에 수행해야 하므로 간이 완충액 A로 너무 오래 관류되지 않도록 주의하십시오. 간으로 기포가 들어가지 않도록 주의하십시오.</li>
	<li>캡슐이 얼룩덜룩 해지고 끈적 끈적하게 보일 때까지 간이 관류하도록하십시오 (10-15 분 이상, 콜라게나제의 다른 제트에 따라 기간이 다릅니다).</li>
	<li>간이 관류하는 동안, 부검 가방에 넣기 전에 동물이 죽었는지 확인하십시오.</li>
	<li>소화가 끝나면 챔버에서 간을 제거하고 약 20mL의 무혈청 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM)가있는 10cm 페트리 접시에 넣으십시오.</li>
	<li>두 개의 피펫 팁으로 간을 부드럽게 떼어 내고 담즙 나무를 버리십시오.</li>
	<li>간 현탁액을 70 μm 세포 스트레이너를 통해 50 mL 원뿔형 튜브로 여과한다.</li>
	<li>세포 현탁액을 RT에서 2분 동안 50 x g 에서 원심분리한다. 비실질 간 세포를 함유하는 상층액을 수집한다. 참고: 간세포는 펠릿 내에 침전되며, 이는 앞서 기술된 바와 같이 구배 원심분리를 사용하여 추가로 정제될 수 있다15.</li>
</ol>4. 비실질간세포와 LSECs 정제의 분리
참고: 제조 지침에 따라 면역자기 비드를 사용하여 CD146+ LSEC를 정제하십시오.
<ol><li>상층액을 4°C에서 5분 동안 300 x g 에서 원심분리한다.</li>
	<li>세포 펠릿을 수집하고 1 mL의 분리 완충액에 재현탁시키고(표 1), 제조자의 지시에 따라 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 번호를 결정한다.</li>
	<li>세포 현탁액을 4°C에서 10분 동안 300 x g 에서 원심분리하고, 상청액을 완전히 흡인한다.</li>
	<li>펠렛을 총 세포 10,7개당 90 μL의 분리 완충액으로 재현탁시킨다.</li>
	<li>총 세포 10,7개당 10μL의 CD146 마그네틱 비드를 첨가한다. 잘 섞어서 4°C에서 15분 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>세포를 세척하기 위해, 107 세포 당 1-2 mL의 분리 완충액을 첨가하고, 300 x g 에서 10분 동안 원심분리한 다음, 상청액을 완전히 흡인시킨다.</li>
	<li>최대 10개의9개 세포를 500 μL의 분리 완충액에 재현탁시킨다(표 1). 참고: 셀 번호가 높을수록 버퍼 볼륨을 적절하게 확장하십시오.</li>
	<li>분리 컬럼을 준비하고 3 mL의 분리 버퍼로 헹구십시오.</li>
	<li>세포 현탁액을 70 μm 예비 분리 필터로 적층된 컬럼 상에 적용한다.</li>
	<li>컬럼을 3 mL의 분리 완충액으로 3회 세척한다. 참고: 컬럼을 세척할 때 컬럼 저장소가 비어 있는 즉시 분리 버퍼를 추가해야 합니다.</li>
	<li>분리기에서 컬럼을 제거하고 15 mL 원심분리 튜브 상에 놓는다. 5 mL의 분리 완충액을 컬럼 상에 피펫팅한다.</li>
	<li>자성 비드가 표지된 세포를 회수하려면 플런저를 컬럼으로 단단히 밀어 세포를 플러시합니다.</li>
	<li>4°C에서 5분 동안 300 x g 에서 원심분리기. LSECs는 현미경 검사 및 하류 분석을 위해 준비된다.</li>
</ol>5. LSECs 면역표현형 및 유세포측정에 의한 순도 평가
<ol><li>제조업체의 지침에 따라 자동 셀 카운터를 사용하여 분리된 LSEC의 세포 번호를 확인합니다.</li>
	<li>세포를 300 x g 에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 완전히 흡인시킨다.</li>
	<li>1 x 106 세포/튜브를 취하여 90μL의 염색 완충액으로 재현탁하십시오(표 1).</li>
	<li>마우스 FcR 블록 10 μL/튜브 및 1 μL의 생존력 염료를 첨가하고, 4°C에서 10분 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>세포를 염색 완충액으로 1:50에 희석된 CD45, CD146 및 스타빌린-2 항체의 조합으로 착색시킨다. 4°C에서 20분 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>세포를 5 mL의 염색 완충액으로 세척하고, 300 x g 에서 10분 동안 원심분리한 다음, 상청액을 완전히 흡인시킨다.</li>
	<li>세포를 300 μL의 염색 완충액으로 재현탁시키고 유세포 분석기를 통해 실행한다.</li>
</ol>6. LSEC의 문화와 시험
<ol><li>시드 1 x 10 6 세포/웰을6 -웰 플레이트에 넣고 5% 태아 소 혈청(FBS), 1% 내피 세포 성장 보충제 및 1% 프리모신 용액으로 구성된 내피 세포 성장 배지로 배양합니다.</li>
	<li>분리된 LSEC를 광 현미경으로 검사합니다. 10x 배율로 밝은 필드 이미지를 획득하십시오.</li>
</ol>7. 주사 전자 현미경에 의한 LSECs 형태학 및 fenestrae 검사
<ol><li>세포 배양 인서트(3 μm 공극 크기)를 콜라겐 용액으로 미리 코팅한다.</li>
	<li>단리된 LSECs(120,000 세포)를 내피 세포 성장 배지와 함께 삽입하여 37°C의 가습 분위기에서 24-웰 플레이트에서 배양하였다. 세포가 정착하고 2 시간 동안 부착되도록하십시오.</li>
	<li>세포 고정을 위해, 37°C에서 예열된 트럼프의 고정제의 등가 부피를 세포 배양 배지에 첨가한다.</li>
	<li>10 분 동안 배양 한 후, 희석 된 50 % 희석 된 트럼프의 고정제를 희석되지 않은 트럼프의 고정제로 대체하십시오.</li>
	<li>세포를 트럼프 고정제에서 2 시간 동안 고정시킨 다음, 1 % 오스뮴 테트록사이드에서 1 시간 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>샘플 탈수, 임계점 건조 장치에서 건조, 장착, 스퍼터 코팅 및 주사 전자 현미경을 사용한 검사를 진행하십시오.</li>
</ol>

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모든 저자는 공개 할 충돌이 없습니다.

현재 원고에서, 우리는 두 단계 콜라게나제 관류 및 후속 자기 활성화 세포 분류 (MACS)로 구성된 마우스 간으로부터의 LSEC 분리를위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 다음의 세 단계로 구성된다: (1) 칼슘이 없는 완충액으로 PV를 통한 관류, 이어서 간세포 분산을 달성하기 위한 콜라게나제 함유 완충액; (2) 저속 원심분리를 통한 간세포의 배제; 및 (3) 항-CD146 자기 비드를 사용하는 비실질 세포 (NPCs)로부터의 LSECs의 MACS-기반 양성 선택. 전체 절차는 3 시간 이내에 완료 될 수 있습니다. 또한 모든 소모품 공급을 포함하여이 절차의 비용은 마우스 당 약 150 USD이며,이 LSEC 분리 방법이 전반적으로 효율적이고 비용 효율적임을 시사합니다. 우리는 1 차 마우스 간세포의 분리를 위해 단계 (1)과 (2)를 사용하며, 이는 현재 원고의 범위를 벗어납니다.
문맥 캐뉼레이션 및 간 관류에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다 : (i) 카테터 위치...

간 정현파 내피 세포 (LSECs)는 간 정현파 벽을 따라 늘어서 있으며 간에서 가장 풍부한 비 실질 세포입니다1. LSECs는 fenestrae의 존재와 고전적인 기저막 또는 횡격막 2,3의 부족에 의해 신체의 다른 모세관 내피 세포와 구별됩니다. 따라서 LSEC는 지질 및 지단백질을 포함한 다양한 순환 거대 분자를 제거하기 위해 투과성과 내시성 능력을 향상시키는 독특한 표현형 및 구조적 특성을 가지고 있습니다. LSECs는 실질 세포와 비실질 세포, 예컨대 성상 세포 및 면역 세포 사이의 누화에서 중추적인 역할을 한다. LSECs는 성상 세포와 쿠퍼 세포를 정지 상태로 유지함으로써 간 항상성을 유지하는 데 중요합니다4. LSECs는 순환하는 백혈구 5,6의 부착 및 내피 이동을 매개함으로써 간 면역 세포 집단의 조성을 조절한다. 허혈-재관류 손상(IRI)8, 비알콜성 지방간염(NASH)9 및 간세포암(HCC)을 포함하는 급성 및 만성 간 손상(7) 동안, LSECs는 기저막(10)의 탈지 및 형성을 특징으로 하는 모세관화로 알려진 표현형 변화를 겪는다. LSECs의 이러한 표현형 변화는 LSECs 기능 장애 및 전구혈전성, 전염증성 및 프로섬유형성 특성의 획득과 관련이 있다.
마우스 간으로부터 LSECs를 분리하기 위한 몇몇 방법이 개발되었다11. 일부 기술은 비실질 및 실질 세포를 분리한 후 밀도 구배 원심분리를 통해 비실질 분획으로부터 LSEC를 정제하는 것에 의존한다. 이 방법의 한계는 LSEC 단리의 최종 단계에서 대식세포를 오염시키는 존재이며, 이는 단리된 LSEC(12)의 순도에 영향을 미칠 수 있다. 이 프로토콜은 마우스 간 콜라게나제 관류 및 CD146+ 자기 비드의 양성 선택에 기초하여 LSECs를 정제하기 위한 비실질 세포의 양성 선택이다. 이 방법을 사용하여 분리된 LSEC는 높은 순도와 보존된 형태학 및 생존력을 보여줍니다. 이러한 LSEC는 투과성 및 접착 분석뿐만 아니라 관심 경로에 대한 다운스트림 연구를 포함한 기능 연구에 최적입니다. 또한, 임상 연구 및 발견 과학 모두에서 큰 데이터 세트를 생성하는 것에 대한 관심이 증가함에 따라, 비알콜성 지방간염(NASH) 또는 기타 질환을 앓고 있는 건강한 간과 병든 간에서 분리된 이러한 고품질 LSEC를 개별적으로 풀링하거나 사용할 수 있어 다중 오믹스 데이터 생성 및 건강과 질병 간의 비교13,14 . 또한, 단리된 LSEC는 LSEC에서 활성화된 신호전달 경로를 해독하고 다양한 유해한 자극 하에서 그리고 다양한 치료적 개입에 반응하여 다른 간세포와의 세포간 통신을 해독하기 위해 오가노이드와 같은 이차원 및 입체내 시험관내 모델을 개발하는 데 사용될 수 있다.

<table><tbody><tr><td>2.0인치 20 G 정맥 내 (IV) 카테터</td><td>Terumo, SOmerset, NJ, USA</td><td>SR-OX2051CA</td><td></td></tr><tr><td>2&ndash; 중앙에 구멍이 있는 3인치 향수 트레이</td><td>맞춤형; 집에서 제작</td>405/520 생존 염료 Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany 130-110-205 4인치 정규 곡선 드레싱 펜치 Fisher Brand FS16-100-110 5-0 Perma-Hand 실크 봉합사 Ethicon, Raritan, NJ, USA A182H Anti-stabilin-2 (Mouse) mAb-Alexa Fluor <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&아틸데; 488</td><td>MBL International, Woburn, MA, USA</td><td>D317-A48</td><td></td></tr><tr><td>BSA stock</td><td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-mouse</td><td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td><td>130-118-407</td><td></td></tr><tr><td>CD146 (LSEC) MicroBeads, mouse</td><td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td><td>130-092-007</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45-Viogreen, anti-mouse</td><td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td><td>130-110-803</td><td></td></tr><tr><td>Collagen type I</td><td>Corning, Corning, NY, USA</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase II</td><td>Gibco, Waltham, MA, USA</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>내피 세포 성장 배지</td><td>ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA</td><td>211-500</td><td></td></tr><tr><td>FcR 차단 시약, 마우스</td><td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, 독일</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 소프트웨어, 버전 10.6</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hardened Fine scissors</td><td>F.S.T, Foster city, CA, USA</td><td>14091-11</td><td></td></tr><tr><td>Heated (37 &deg; C) 및 10psi의 속도로 산소 주입이 장착된 가습 재순환 관류 장치.</td><td></td><td></td><td>맞춤형; 자체 제작</td></tr><tr><td>Hitachi S 4700 주사 전자 현미경</td><td>Hitachi Inc, Pleasanton, CA, USA</td><td>SEM096</td><td></td></tr><tr><td>LS 컬럼</td><td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS 사전 분리 필터 (70 &mu; m)</td><td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td><td>130-095-823</td><td></td></tr><tr><td>MACS 헹굼 버퍼</td><td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td><td>130-091-222</td><td></td></tr><tr><td>MACS Smart Strainer (70 &mu; m)</td><td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td><td>130-098-462</td><td></td></tr><tr><td>MACSQunt 유세포 분석기</td><td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>밀리셀 세포 배양 인서트</td><td>Millipore Sigma, Burlington, MA, USA</td><td>PITP01250</td><td></td></tr><tr><td>Nexcelom</td><td>bioscience, Lawrence, MA, USA</td><td>Cellometer Auto T4 Plus</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare, Chicago, IL, USA</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>수술용 가위</td><td>F.S.T, Foster city, CA, USA</td><td>14001-12</td><td></td></tr><tr><td>Very small curved dressing typs</td><td>F.S.T, Foster city, CA, USA</td><td>11063-07</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 일차 간 정현파 내피 세포의 분리 및 특성화

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

간 정현파 내피 세포 (LSECs)는 순환과 간 실질 사이의 계면에 위치한 특수 내피 세포입니다. LSECs는 fenestrae의 존재와 기저막의 부재를 특징으로하는 뚜렷한 형태를 가지고 있습니다. LSEC는 대사 조절 장애, 염증, 섬유증, 혈관 신생 및 발암을 포함하여 간에서 많은 병리학 적 장애에서 필수적인 역할을합니다. 그러나 LSEC의 격리 및 특성화에 대해서는 거의 발표되지 않았습니다. 여기에서, 이 프로토콜은 건강한 및 비알콜성 지방간 질환(NAFLD) 마우스 둘 다로부터 LSEC의 분리에 대해 논의한다. 이 프로토콜은 마우스 간 및 자기 비드의 콜라게나제 관류에 기초하여 LSECs를 정제하기 위한 비실질 세포의 양성 선택이다. 이 연구는 유세포 분석기에 의해 특정 마커를 사용하여 LSEC를 특성화하고 주사 전자 현미경으로 특징적인 표현형 특징을 식별합니다. 이 프로토콜에 따라 분리된 LSEC는 접착 및 투과성 분석을 포함한 기능적 연구뿐만 아니라 관심 있는 특정 경로에 대한 다운스트림 연구에 사용될 수 있습니다. 또한, 이들 LSEC는 개별적으로 풀링되거나 사용될 수 있으며, RNA-seq 벌크 또는 단일 세포, 프로테오믹 또는 포스포-프로테오믹스, 시퀀싱(ATAC-seq)을 이용한 트랜스포제-접근 가능한 크로마틴에 대한 어세이 등을 포함하는 다중 오믹스 데이터 생성을 가능하게 한다. 이 프로토콜은 LSEC가 건강 및 질병에서 다른 간 세포와의 통신을 연구하는 조사관에게 유용하며 급성 및 만성 간 손상의 병원성 메커니즘에서 LSEC의 역할에 대한 심층적 인 이해를 가능하게합니다.

실험 회로도 및 장비 설정 : 이 프로토콜에서, 마우스 간을 폐쇄 관류 회로를 사용하여 소화시킨 다음, 비실질 세포 및 간세포를 2분 동안 50 x g 에서 저속 원심분리에 의해 분리하였다. 일차 LSECs는 비실질 분획으로부터 선별된 CD146 자기 비드를 사용하여 단리하였다. 실험 회로도를 도 1A에 나타내었다. 캐뉼러를 PV를 통해 배치하고, 열등한 베나 카바는 간을 통한 콜라게나제의 단방향 관류를 보장하기 위해 묶었다(도 1B). 사내 관류 챔버에는 37-40 °C의 따뜻하고 가습 된 장치 공기를 보장하기 위해 가열 및 가습 시스템이 장착되어 있습니다. 관류된 콜라게나제는 폐쇄된 시스템을 통해 순환하며, 격리 하루 동안 두세 마리의 마우스에 재사용되어 단리를 보다 비용 효율적으로 만들 수 있다.
유세포...

여기서 우리는 원발성 마우스 간 정현파 내피 세포 (LSEC) 분리를위한 프로토콜을 개략적으로 설명하고 시연합니다. 이 프로토콜은 간 콜라게나제 관류, 저속 원심분리에 의한 비실질 세포 정제 및 CD146 마그네틱 비드 선택을 기반으로 합니다. 우리는 또한 표현형과 유세포 분석기 및 주사 전자 현미경을 사용하여 이러한 분리 된 LSEC를 특성화합니다.

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

여기에서, 우리는 원발성 마우스 간 정현파 세포 분리 또는 LSEC 단리의 우리의 프로토콜을 시연한다. 이 프로토콜은 간 콜라게나제 관류 및 비실질 세포 정제를 위한 저속 초원심분리 및 CD146 마그네틱 비드 선택으로 구성됩니다. 우리의 LSEC 분리 방법은 매우 효율적이며 건강하고 병든 마우스 간에도 적용 할 수 있습니다.절연된 LSEC는 고순도를 표시하고 구조와 기능을 보존합니다. 이 프로토콜을 사용하여 분리된 LSEC는 기능 및 분자 연구 및 다중 오믹스 데이터 생성에 최적입니다. 이 프로토콜은 간에서 세포 간 통신을 연구하는 데 도움이 될 것입니다.10 센티미터 배양 접시에 세 밀리리터의 콜라겐 용액을 코팅하여 시작하십시오. 그런 다음 접시를 실온에서 한 시간 동안 인큐베이션하십시오. 한 시간 후, 코팅된 표면으로부터 과량의 유체를 제거한다.PBS로 접시를 세 번 씻고 공기 건조하게하십시오. 가열 및 가습 재순환 관류 장치를 설치하십시오. 5 분 동안 10 % 표백제를 사용하여 관류 시스템을 헹구십시오.그런 다음 시스템을 다시 멸균수로 10 분 동안 헹구십시오. 콜라게나제 용액으로 관류하기 전에 헹굼액을 가능한 한 많이 배출하십시오. 관류 시스템을 통해 콜라게나제 용액을 주입하여 섭씨 37도까지 예열하십시오.속도 제어 다이얼에서 펌프 속도를 속도 하나로 설정하십시오. 전체 절차에서 속도를 동일하게 유지하십시오. 절차를 위해 마우스의 무게를 측정하십시오.그런 다음 수술 표면에 고정하십시오. 마우스 복부에 70 % 에탄올을 뿌리십시오. 외과 용 가위를 사용하여 복부의 아래 부분에서 xiphoid 과정까지 약 다섯 센티미터의 절개를하십시오.그 후, 복부의 양쪽에있는 작은 홍채 가위를 사용하여 복부 장기를 완전히 노출시키는 두 개의 측면 절단을하십시오. IV 카테터의 칼집을 동물의 등 아래에 두어 복부를 들어 올리고 평평하게하십시오. 규칙적인 곡선 드레싱 포셉을 사용하여 창자와 위를 동물의 왼쪽으로 부드럽게 당깁니다.그런 다음 노출 된 왼쪽 신장 바로 아래의 열등한 정맥 카바 또는 IVC 아래에 5-0 개의 외과 봉합사를 놓습니다. 봉합사에 느슨한 히치를 묶으십시오. 다음으로, 간 포털 정맥 주위에 또 다른 5-0 개의 외과 봉합사를 놓습니다.봉합사를 간 문맥 정맥의 비장 정맥 분기 지점 바로 위에 놓습니다. 다시 말하지만, 봉합사에 느슨한 히치를 묶으십시오. 포털 정맥 봉합사를 장력으로 사용하여 20 게이지 IV 카테터를 간 포털 정맥에 삽입하여 좌우 간 포털 정맥으로 분기하는 한 센티미터 아래에 삽입하십시오.그런 다음 카테터를 정맥 위로 밀어 올리지 만 분기 영역 아래에 보관하십시오. 혈액이 물방울이 떨어지기 시작할 때까지 카테터 아래로 이동하게하십시오. IV 카테터를 포털 정맥 봉합사로 고정하십시오.IV 라인을 사용하여 버퍼 A가있는 IV 병을 카테터에 부착하십시오. 그런 다음 시스템에 공기가 들어 가지 않도록하면서이 용액으로 간을 씻어 내십시오. 신장 아래의 IVC 주위의 봉합사를 묶으십시오.그 후, IVC를 봉합사 아래로 잘라 동물이 피를 흘릴 수 있도록하십시오. 일단 관류하면 위장, 창자, 비장 및 간장에 붙어있는 다른 entrails를 잘라냅니다. 그런 다음 횡격막과 흉강에서 주요 혈관을 잘라냅니다.동물에서 간을 제거하고 관류 트레이에 놓습니다. 조심스럽게 IV 라인을 제거하고 재순환 챔버에서 콜라게나제 용액을 연결하십시오. 캡슐이 모델링되고 끈적 끈적하게 보일 때까지 간이 관류하도록하십시오.이 작업은 일반적으로 10~15분 정도 걸립니다. 소화되면 챔버에서 간을 제거하고 약 20 밀리리터의 무혈청 DMEM이있는 10 센티미터 페트리 접시에 놓습니다. 두 개의 피펫 팁으로 간을 부드럽게 떼어 내고 담즙 나무를 버리십시오.그 후, 간 현탁액을 70 마이크로미터 세포 스트레이너를 통해 50 밀리리터 원뿔형 튜브로 여과하십시오. 세포 현탁액을 실온에서 두 분 동안 50배 G에서 원심분리한다. 이어서, 비실질 간 세포를 함유하는 상청액을 수집한다.상층액을 섭씨 네 도에서 5분 동안 300배 G에서 원심분리한다. 그 후, 세포 펠릿을 수집하고 한 밀리리터의 분리 완충액에 재현탁시킨다. 제조업체의 지침에 따라 자동 셀 카운터를 사용하여 셀 번호를 확인합니다.다음으로, 세포 현탁액을 원심분리한다. 상청액을 완전히 흡인하고 펠렛을 10 백만 세포 당 90 마이크로리터의 분리 완충액으로 재현탁시킨다. 총 세포 1천만 개당 10마이크로리터의 CD146 마이크로비드를 첨가한다.잘 섞어서 섭씨 네 도에서 15 분 동안 배양하십시오. 세포를 세척하려면 10 백만 세포 당 1 ~ 두 밀리리터의 분리 버퍼를 추가하십시오. 용액을 300배 G에서 10분 동안 원심분리한다.그 후, 상청액을 완전히 흡인하고 500 마이크로 리터의 분리 완충액에 최대 10 억 개의 세포를 재현탁하십시오. 다음으로, 분리 컬럼을 세 밀리리터의 분리 완충액으로 헹구어 준비한다. 세포 현탁액을 70마이크로미터 예비 분리 필터로 적층된 컬럼 상에 적용한다.세 밀리리터의 분리 버퍼로 컬럼을 세 번 세척하십시오. 그 후, 컬럼을 분리기에서 제거하고 15 밀리리터 원심분리 튜브 위에 놓습니다. 컬럼에 다섯 밀리리터의 격리 버퍼를 피펫합니다.자성 비드 표지된 세포를 회수하려면, 플런저를 컬럼 내로 단단히 밀어 세포를 플러시한다. 마지막으로, 세포를 섭씨 네 도에서 5분 동안 300배 G에서 원심분리한다. 단리된 LSECs 순도 및 표면 마커를 유세포 분석기로 평가하였다.게이팅된 LSEC 및 싱글 트에 대한 데이터 분석 및 게이팅 전략은 순방향 분산 및 측면 분산 데이터를 기반으로 합니다. 단리된 LSECs를 생존성 염료 및 CD45, CD146 및 스타빌린-2 항체의 조합으로 염색하였다. 생존 가능한 LSECs를 CD45 음성 집단에 게이팅하고, CD146 및 스타빌린-2 발현에 대해 분석하였다.이 데이터로부터, 분리된 LSECs가 94% 이상의 생존력과 90% 이상의 순도를 가짐을 확인하였다. 분리된 세포의 LSEC 특이적 표현형을 광 현미경 및 주사 전자 현미경을 사용하여 추가로 확인하였다. 분리된 LSECs를 여섯 시간 동안 완전 성장 배지에서 배양하고 광 현미경으로 조사하였다.SEM 이미지의 흰색 화살표는 LSEC fenestrae를 나타내며, 이는 LSEC의 특징적인 형태학적 특징입니다. 간 조직의 완전한 관류를 보장하는 중요한 단계는 카테터에 공기가 유입되는 것을 피하고 콜라게나제 소화의 최적 타이밍을 피하면서 적절한 카테터 테이프 위치입니다. 우리의 프로토콜을 사용하여 획득 한 고품질 LSEC는 LSEC 기능의 분자 메커니즘의 식별을 용이하게하고 간, 건강 및 질병에서 세포 간 통신에서의 역할에 대한 우리의 이해를 향상시킬 것입니다.

isolation-characterization-mouse-primary-liver-sinusoidal-endothelial

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

뇌 미세혈관 내피 세포(BMEC)는 혈액과 중추신경계(CNS), 이른바 혈액-뇌-장벽(BBB)을 분리하는 고도로 조절되는 장벽을 형성하는 특정 접합 단백질에 의해 상호 연결되어 있습니다. 이 프로토콜에서 논의된 바와 같이 1차 쥐 뇌 미세혈관 내피 세포의 분리는 BBB의 상세한 체외 연구를 가능하게 합니다.

차 설치류 뇌 미세 혈관 내피 세포의 분리

혈관 내피 세포는 많은 중요한 심혈관 질환에서 중요한 역할을 합니다. 이 기사에서는 특별한 장비를 사용하지 않고 쥐 대동맥에서 내피 세포를 분리하고 확장하는 간단한 방법을 설명합니다. 당사의 프로토콜은 내피 세포 생리병리학에서 메커니즘을 식별하는 효과적인 수단을 제공합니다.

분리 및 마우스 대동맥 내피 세포의 차 문화

동일한 공여자로부터 인간 간세포와 비실질 간 세포를 분리하는 기술에 대해 설명합니다. 다양한 간 세포 유형은 기능적 간 모델 및 조직 공학의 기초를 구축합니다. 이 새로운 방법은 높은 수율과 생존력으로 간 세포를 분리하는 것을 목표로 합니다.

차 인간 간세포의 분리 및 비 실질 간 세포의 주요 집단 대응을위한 프로토콜

이 프로토콜은 이미징 또는 분자 생물학 실험을 수행하기 위해 마우스 관상 동맥 내피 세포를 분리하는 방법을 공유하기 위해 준비되었습니다.

마우스 관상 내피 세포의 분리

이 프로토콜의 목표는 간에서 높은 생존 능력 및 hepatocytes 및 정현파 내 피 세포의 높은 수익률을 얻을 것입니다. 이 유형 IV 콜라 솔루션 hepatocytes 및 정현파 내 피 세포 차등 원심 분리 뒤 문맥을 통해 간 perfusing에 의해 수행 됩니다.

Hepatocytes에서 마우스 간 사인 내 피 세포의 정화 관류

여기, 우리는 건강 하 고 기능적인 기본 마우스 hepatocytes의 격리에 대 한 프로토콜을 제시. 비 방사성 라벨 기판 간 초기 단백질 합성을 탐지 하기 위한 지침에에서 에너지 대사 항상성의 맥락에서 단백질 합성을 기본 메커니즘을 이해할 수 있도록 제공 되었다.

비 방사성 L-azidohomoalanine 라벨 방법에 의해 초기 단백질 합성 분석에 대 한 기본 마우스 Hepatocytes의 절연

Microvascular 내 피 세포 골격 근육 (MMEC)의 근육 모세 혈관의 안 벽을 형성 하 고 둘 다 조절 근육 조직과 혈액 사이 (면역) 세포의 마이그레이션 및 체액/분자의 교환. 기본 murine MMEC의 격리, 여기에 설명 된 대로 "myovascular 단위"의 종합 체 외 조사 수 있습니다.

기본 Murine 골격 근육 Microvascular 내 피 세포의 고립

여기서 제시된 것은 변형된 콜라게나아제 관류 기술을 사용하여 성인 마우스 간으로부터 마우스 간세포의 분리를 위한 프로토콜이다. 또한 3D 콜라겐 샌드위치 설정에서 간세포의 장기 배양뿐만 아니라 담즙 카나리아 형성 및 치료에 대한 반응을 연구하기 위한 세포골격 성분의 면역 라벨링이 기술된다.

체외에서 담즙 관내 형성에서 세포골격의 역할을 연구하기 위해 1 차 마우스 간세포의 격리 및 3D 콜라겐 샌드위치 문화

원발성 간세포는 시험관 내에서 간 반응과 신진 대사를 연구하는 데 유용한 도구입니다. 상업적으로 이용가능한 시약을 이용하여, 마우스 원발성 간세포 단리를 위한 개선된 시간- 및 노동-효율적인 프로토콜이 개발되었다.

마우스 원발성 간세포 분리를 위한 개선된 시간 및 노동력 효율적인 프로토콜

이 기사에서는 신생아 마우스에서 일차 폐 내피 세포를 분리하고 배양했습니다.

일차 마우스 폐 내피 세포의 분리

이 프로토콜은 전체 췌장에서 마우스 내피 세포를 분리하는 방법을 설명합니다.

마우스 췌장 내피 세포의 분리

배우세요 마우스 간 정현파 내피 세포(LSEC) 분리 방법을 통해 세포 생물학 연구를 수행하는 기술입니다. 콜라게나제 관류와 CD146 자기 비드 선택을 사용하여 90% 이상의 순도와 94% 이상의 생존율을 확보합니다.

마우스 일차 간 정현파 내피 세포의 분리 및 특성화

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