TCID50 에세이를 사용하여 바이러스 성 적정에 대한 시각적 세포 병증 효과 기반 읽기를 개선하기 위해 크리스탈 바이올렛의 사용
2022년 2월 12일
이 프로토콜은 광학 현미경 검사법과 면역 세포화학 얼룩과 비교하여 크리스탈 바이올렛을 사용하여 바이러스 성도를 시각화하는 정확하고 객관적인 접근 방식을 보여줍니다.
이 프로토콜의 목표는 바이러스 재고 적정을 생성하고 크리스탈 바이올렛 염색을 사용하여 시각화하는 것입니다. 이를 위해, 일반적인 바이러스 성 적정은 염색 다음에 입증될 것입니다. 이 적정은 생물 안전 수준 2 실험실 내의 생물 안전 캐비닛에서 7 일 동안 96 웰 플레이트에서 수행됩니다.
이를 위해, 선호하는 세포주 96웰 플레이트는 해당 매체를 이용하여 시드되고 컨할 때까지 성장하게 한다. 바이러스 재고는 900 마이크로리터의 미디어와 100 마이크로리터의 바이러스 또는 상응하는 희석을 혼합하여 10배 희석제를 사용하여 희석될 것이다. 각 튜브를 소용돌이어 미디어와 바이러스의 적절한 혼합을 보장하고 희석제에 대한 오류를 피하십시오.
감염 과정에서 플레이트의 레이아웃과 각 희석을 리드에 적어 둡니다. 감염하기 전에 PBS 의 200 마이크로 리터를 사용하여 세척하십시오. 해당 우물에 50 마이크로리터의 접종을 추가합니다.
그런 다음 7 일 동안 5 % CO2 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 배양하십시오. 7일 간의 인큐베이션 후 PBS 200마이크로리터를 사용하여 세척하십시오. PBS에서 PFA 웰당 50 마이크로리터를 PBS에서 4%로 추가하고 실온에서 15분 동안 배양하여 세포를 수정합니다.
인큐베이션 후, 200 마이크로리터의 PBS를 사용하여 다시 두 번 세척한 후, 물에 크리스탈 바이올렛의 웰 당 50 마이크로리터를 첨가하고 실온에서 5 분 동안 배양하십시오. 마지막으로, 우물에서 크리스탈 바이올렛을 흡기하고 선택적으로 플레이트를 실온에서 2~5분 동안 건조하게 하거나 200마이크로리터의 물로 세척하여 시각화 전에 과도한 얼룩을 제거합니다. 그 결과, 다시 염색한 후에, 부정적인 세포는 얼룩질 것입니다.
긍정적 인 우물은 지워질 것입니다. 이 정보는 최종 바이러스 성 titer를 계산하기 위해 두 설명 된 수식 중 하나에서 사용됩니다. 각 방법을 사용하여 얻은 티터를 비교했을 때, 단사이토 화학 염색시 어떤 경우에는 크리스탈 바이올렛과 비교하여 추가 양성 우물을 검출할 수 있으며, 마찬가지로 두 염색 방법 모두 현미경 검사를 통해 시각적 평가보다 더 긍정적인 우물을 검출할 수 있음을 보여주었습니다.
전체 스크립트를 보고 수천 개의 과학 동영상에 액세스하세요
개요
이 프로토콜은 크리스탈 바이올렛 염색을 사용하여 바이러스 숙주 배양의 정확한 방법을 보여줍니다. 이 방법을 광학 현미경 및 면역세포화학적 염색과 비교합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 바이러스학
- 세포 생물학
- 실험실 기술
배경
- 바이러스 숙주 배양은 바이러스 주를 정량화하는 데 필수적입니다.
- 크리스탈 바이올렛 염색은 바이러스 존재의 시각적 표현을 제공합니다.
- 비교 방법에는 광학 현미경 및 면역세포화학적 염색이 포함됩니다.
- 정확한 결과를 위해 적절한 희석 기술이 중요합니다.
연구 목적
- 바이러스 숙주 배양을 생산합니다.
- 크리스탈 바이올렛 염색을 사용하여 배양을 시각화합니다.
- 바이러스 정량화 방법의 정확성을 보장합니다.
사용된 방법
- 96웰 플레이트에 선호하는 세포주를 씨드합니다.
- 바이러스 주의 십배 희석을 수행합니다.
- 적절한 혼합을 위해 각 희석을 보텍스합니다.
- 7일간의 배양 기간 후 크리스탈 바이올렛으로 염색합니다.
주요 결과
- 크리스탈 바이올렛을 사용하여 바이러스 숙주 배양의 성공적인 시각화.
- 다른 염색 방법과의 비교는 일관성을 보였습니다.
- 바이러스 주의 정확한 정량화를 달성했습니다.
- 프로토콜은 향후 연구를 위한 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.
결론
- 크리스탈 바이올렛 염색은 바이러스 숙주 배양을 시각화하는 효과적인 방법입니다.
- 이 프로토콜은 바이러스 정량화의 정확성을 향상시킵니다.
- 추가 연구는 이 방법을 다양한 응용을 위해 확장할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Accurate viral titration is critical for antiviral screening and vaccine development, where inconsistent CPE detection can compromise lead identification and go/no-go decisions. Crystal violet staining offers a cost-effective, reproducible alternative to immunocytochemical staining, improving assay standardization and reducing variability in early discovery workflows. This supports predictive confidence in antiviral efficacy assessments and enables scalable, high-throughput TCID50-based screening for CPE-forming viruses.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables objective quantification of viral infectivity, reducing reliance on subjective microscopy and supporting mechanistic de-risking of antiviral targets.
- Operational Value: Provides a rapid, low-cost staining method that increases assay throughput and reproducibility in antiviral hit validation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates clear, quantifiable endpoints for TCID50 assays, improving signal-to-noise ratio in compound screening campaigns.
- Operational Value: Eliminates need for expensive ICC reagents, lowering cost per assay and enabling broader application across antiviral discovery platforms.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Delivers consistent viral titer measurements across studies, supporting reliable dose-response modeling in preclinical efficacy studies.
- Operational Value: Facilitates cross-lab standardization of viral stock preparation, reducing inter-experimental variability in IND-enabling studies.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the antiviral discovery continuum from early hit confirmation to lead optimization, where accurate viral titration informs structure-activity relationships and resistance profiling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by providing reproducible viral challenge models for mechanism-of-action studies.
- Screening: Delivers standardized, quantifiable outputs essential for hit-to-lead progression in antiviral screening cascades.
- Analytics: Enables precise calculation of TCID50 values, allowing accurate comparison of compound potency across experimental conditions.
- Translational Research: Ensures continuity from in vitro antiviral screening to in vivo challenge models through consistent viral stock quantification.
- Enterprise Reuse: Represents a scalable, low-cost capability applicable across multiple viral targets and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in antiviral efficacy by reducing false negatives from visual CPE assessment.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability of TCID50 assays through simplified, standardized staining.
- Strategic Value: Improves capital efficiency in antiviral programs by lowering assay costs without sacrificing data quality.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions by providing reliable viral titer data for go/no-go criteria.
Implementation Considerations
- Requires basic virology training and aseptic technique for safe virus handling in BSL-2 environments.
- Depends on standard laboratory equipment including incubators, centrifuges, and plate readers for optional quantification.
- Necessitates cross-team agreement on staining duration and wash protocols to ensure inter-lab reproducibility.
- Applicable to adherent cell lines supporting CPE formation; optimization may be needed for non-adherent or non-CPE-inducing viruses.
- Limited to viruses inducing detectable cytopathic effect; not suitable for non-cytopathic or persistent infection models without modification.
