Name: 체외에서 생분해성 임플란트 재료를 연구하기 위한 직접 및 간접 배양 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 49 s
Description: 학습하세요 생분해성 임플란트 재료의 세포적합성을 평가하기 위한 직접 배양, 직접 노출 배양, 노출 배양 방법을 통해 다양한 세포-재료 상호작용을 연구하고 안전한 생체의료용 임플란트 개발에 기여하세요.

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저자들은 미국 국립 과학 재단 (NSF CBET 상 1512764 및 NSF PIRE 1545852), 국립 보건원 (NIH NIDCR 1R03DE028631), 캘리포니아 대학 (UC) 리젠트 교수 개발 펠로우십, 연구 종자 보조금위원회 (Huinan Liu) 및 UC-Riverside 논문 연구 보조금 (Jiajia Lin)의 재정 지원에 감사드립니다. 저자들은 SEM/EDS를 사용하기 위해 UC-Riverside의 CFAMM(Advanced Microscopy and Microanalysis) 중앙 시설(CFAMM)과 XRD 기기 사용을 위한 페리 청 박사를 높이 평가합니다. 저자는 또한 부분 편집을 위해 Thanh Vy Nguyen과 Queenie Xu를 높이 평가합니다. 저자는 또한 비디오에 대한 내레이션을 녹음 한 Cindy Lee에게 감사하고 싶습니다. 이 기사에서 표현 된 의견, 결과 및 결론 또는 권장 사항은 저자의 의견이며 국립 과학 재단 또는 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 견해를 반드시 반영하지는 않습니다.

저자는 이해 상충이 없습니다.

상이한 세포 배양 방법이 생체내 적용의 다양한 양태에 대해 관심있는 생체재료의 시험관내 세포적합성을 평가하는데 사용될 수 있다. 이 기사에서는 세 가지 시험관 내 배양 방법, 즉 직접 배양, 직접 노출 배양 및 노출 배양을 보여 주어 생분해 성 임플란트 재료가 인체 내부에서 사용되는 다양한 생체 내 시나리오를 모방합니다. 직접 배양 방법은 주로 임플란트 재료에 직접 부착되고 주위하는 새로 시딩된 세포의 거동을 평가하기 위해 사용된다. 직접 노출 배양 방법은 임플란트 재료가 확립 된 세포 및 조직과 직접 접촉하는 생체 내 시나리오를 모방합니다. 노출 배양 방법은 임플란트 재료로부터의 분해 생성물 및 국소 미세 환경의 변화가 임플란트 재료와 직접 접촉하지 않는 확립된 세포 및 조직에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지를 보여주기 위해 사용될 수 있다.
직접 배양에서, 직접 및 간접 접촉 조건 둘 다하에서 새로...

수십 년 동안 생분해 성 물질은 정형 외과1,2, dental3,4 및 craniomaxillofacial5 응용 분야와 같은 생물 의학 응용 분야에서 광범위하게 연구되고 사용되었습니다. 영구 임플란트 및 재료와 달리 생분해 성 금속, 세라믹, 폴리머 및 그 복합체는 생리 환경에서 다양한 화학 반응을 통해 시간이 지남에 따라 체내에서 점차 분해됩니다. 예를 들어, 마그네슘 (Mg) 합금1,6,7 및 아연 (Zn) 합금8,9와 같은 생분해 성 금속은 뼈 고정 장치의 유망한 재료입니다. 그들의 생분해성은 뼈 치유 후 임플란트를 제거하기 위해 이차 수술의 필요성을 제거 할 수 있습니다. 인산칼슘 시멘트(CPCs)와 같은 생분해성 세라믹은 경피적 척추성형술에서 골다공증 척추 압박 골절의 치료에 대한 흥미로운 잠재력을 보여주었다10. CPC는 골절 된 척추 신체에 기계적 지원을 제공하고 골절이 치유 된 후 점차적으로 저하됩니다.
일부 다당류 및 폴리에스테르와 같은 생분해성 폴리머도 생물 의학 응용 분야에서 널리 탐구되었습니다. 예를 들어, 생분해성 다당류로서의 키토산 하이드로젤은 감염을 예방하고 피부 조직을 재생시키는 능력을 나타내었다11. 폴리-L-락트산(PLLA), 폴리(글리콜산)(PGA) 및 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA)은 조직 공학 응용을 위한 2D 또는 3D 다공성 스캐폴드를 제조하기 위한 폴리에스테르로 널리 연구되어 있다12,13,14. 또한, 복합 재료는 금속, 세라믹 및 폴리머의 두 개 이상의 단계를 통합하여 광범위한 생물 의학 응용 분야에 고급 기능을 제공합니다15,16,17. 예를 들어, PLGA 및 인산칼슘 복합체는 두개골 뼈 결함 복구와 같은 용도를 위해 생분해성 스캐폴드를 제조하는데 사용될 수 있다18. 이러한 생분해성 스캐폴드와 임플란트는 세포와 조직의 성장을 지원하고 촉진한 다음 시간이 지남에 따라 신체에서 점진적으로 분해될 수 있습니다.
보충 표 1에 나타낸 바와 같이, 상이한 생분해성 물질은 다양한 분해 메카니즘, 생성물 및 비율을 가질 수 있다. 예를 들어, 마그네슘 합금, 예컨대 Mg-2 wt% Zn-0.5 wt% Ca(ZC21)1, Mg-4 wt% Zn-1 wt% Sr (ZSr41)19, 및 Mg-9 wt% Al-1 wt% 아연 (AZ91)20, 물과 반응하여 분해되고, 이들의 분해 생성물은 주로 Mg2+ 이온, OH-이온, H2 가스, 및 광물 증착을 포함한다. 생분해성 금속의 분해 속도는 다양한 조성, 기하학적 및 분해 환경에 따라 다릅니다. 예를 들어, Cipriano et al.19는 ZSr41 와이어 (Ø1.1 × 15mm)가 85 %의 질량을 잃는 반면 동일한 기하학적 구조를 가진 순수한 Mg 와이어는 47 일 동안 쥐 경골에 이식 된 후 40 % 질량을 잃었다고보고했습니다. 하이드록시아파타이트(HA) 및 β-트리칼슘 포스페이트(β-TCP)와 같은 생분해성 세라믹 물질은 용액 구동 세포외 액체 용해를 통해 분해되거나 작은 입자로 분해된 후 세포외 액체 용해 및 세포 매개 재흡수 과정을 통해 분해될 수 있습니다. 이들 인산칼슘계 세라믹의 분해 생성물은 Ca2+ 이온, (PO4)3-이온, OH-이온, 및 미네랄 침착21을 포함할 수 있다. 인산 칼슘 세라믹의 분해 속도는 결정 구조에 의해 크게 영향을받습니다. 예를 들어, Van Blitterswijk et al.22는 40 vol.% 미세 기공을 가진 HA가 질량을 잃지 않는 반면, 40 vol.% 미세 기공을 가진 β-TCP는 토끼의 경골에 3 개월 동안 이식 된 후 30 ± 4 % 질량을 잃었다고보고했다. PLGA14,23과 같은 중합체는 물의 존재 하에 에스테르 결합의 가수분해로 인해 분해될 수 있고, 분해 생성물은 주로 락트산 및 글리콜산을 포함한다. PLGA 50/50의 경우 한 달이 걸리고 PLGA 95/5가 완전한 성능 저하를 달성하는 데 몇 달이 걸릴 수 있습니다24.
세포 반응 및 세포 적합성 테스트는 생물 의학 응용 분야에서 이러한 생분해성 임플란트 재료를 평가하고 스크리닝하는 데 중요합니다. 그러나 ISO 10993-5:2009 "의료기기의 생물학적 평가-시험관내 세포독성에 대한 Part 5 시험"과 같은 국제 표준화기구 (ISO)의 현재 표준은 처음에는 시험관 내 Ti 합금 및 Cr-Co 합금과 같은 비분해성 생체 물질의 세포 독성을 평가하기 위해 설계되었습니다. 특히, ISO 10993-5:2009는 추출물의 시험관내 세포독성 시험, 직접 접촉 및 간접 접촉 시험만을 다룹니다. 추출물 시험에서, 추출물은 표준 시간 및 온도 조건 중 하나 하에서 혈청 및 생리 식염수로 배양 배지와 같은 추출 유체에 샘플을 침지함으로써 제조된다. 수집된 추출물 또는 희석액은 세포 독성을 연구하기 위해 세포 배양물에 첨가된다. 직접 접촉 시험을 위해, 샘플과 세포 사이의 직접 접촉은 시험 샘플을 확립된(adherd) 세포층 상에 배치함으로써 달성된다. 간접 접촉 시험에서, 혈청 및 용융된 한천을 함유하는 배양 배지는 확립된 세포를 덮기 위해 피펫팅된다. 이어서, 샘플을 필터 유무에 관계없이 응고된 한천 층 상에 놓는다.
ISO 표준은 시험관 내에서 생분해성 물질을 평가하기 위해 적용될 때 몇 가지 한계를 보여주었습니다. 비분해성 물질과는 달리, 생분해성 물질의 분해 거동은 동적이며, 상이한 시간 또는 다양한 환경 조건(예를 들어, 온도, 습도, 배지 조성 및 세포 유형)에서 변할 수 있다. 추출물 시험은 물질의 분해 생성물의 세포독성만을 평가하고, 샘플 분해의 동적 과정을 반영하지 않는다. ISO 표준의 직접 및 간접 접촉 테스트는 확립 된 세포와 샘플 간의 상호 작용 만 특성화합니다. 더욱이, 간접 접촉 시험에서, 물질 및 세포는 생체내 환경을 반영하지 않고 생분해성 물질의 동적 분해를 포착하지 않는 상이한 미세환경에 있다.
이 기사의 목적은 현재 ISO 표준에 설명 된 방법의 위에서 언급 한 한계를 해결하기 위해 다양한 생분해 성 임플란트 재료에 대한 세포 적합성 테스트 방법을 소개하고 논의하는 것입니다. 이 기사에서 제시된 방법은 임플란트 재료의 동적 분해 거동과 생체 내에서 세포 - 물질 상호 작용의 다양한 상황을 고려합니다. 특히, 이 기사에서는 세 가지 세포 적합성 테스트 방법, 즉 생분해성 폴리머, 세라믹, 금속 및 의료용 임플란트 적용을 위한 복합 소재를 포함한 다양한 생분해성 물질에 대한 직접 배양, 직접 노출 배양 및 노출 배양을 제공합니다.
직접 배양 방법에서, 배양 배지에 현탁된 세포는 샘플에 직접 시딩되고, 따라서 새로 시딩된 세포와 임플란트 사이의 상호작용을 평가한다. 직접 노출 배양에서, 샘플은 체내에서 확립된 숙주 세포와의 임플란트의 상호작용을 모방하기 위해 확립된 세포층 상에 직접 배치된다. 노출 배양에서, 샘플은 각각의 웰 인서트에 배치된 다음, 확립된 세포와 함께 배양 웰에 도입되며, 이는 임플란트와 직접 접촉하지 않을 때 임플란트 분해에 의해 유도되는 국소 환경의 변화에 대한 확립된 세포의 반응을 특성화한다. 직접 배양 및 직접 노출 배양 방법은 동일한 배양 웰에서 임플란트 물질과 직접 또는 간접적으로 접촉하는 세포를 평가한다. 노출 배양물은 동일한 배양 웰에서 규정된 거리 내에서 임플란트 물질과 간접적으로 접촉하는 세포를 특성화한다.
이 기사는 다양한 생분해성 물질에 대한 세포 적합성 테스트 및 모델 세포, 즉 골수 유래 중간엽 줄기 세포 (BMSCs)와의 상호 작용에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 프로토콜에는 세포의 수확, 배양, 파종, 고정, 염색 및 이미징과 함께 다양한 생분해성 임플란트 재료 및 광범위한 세포 유형에 적용되는 배양 후 재료 및 배지의 분석이 포함됩니다. 이들 방법은 시험관내에서 세포 반응 및 세포 적합성 측면에서 상이한 생의학적 응용을 위한 생분해성 물질을 스크리닝하는데 유용하다.

<table><tbody><tr><td>10 mL 혈청학적 피펫</td><td>VWR</td><td>490019-704</td><td></td></tr><tr><td>12-웰 조직 배양 처리 플레이트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원뿔형 튜브(폴리프로필렌)</td><td>VWR</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>18 G 바늘</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>25&frac12; G 바늘</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>4&prime;,6-diamidino-2-phenylindole dilactate (DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 원뿔형 튜브(폴리프로필렌)</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m 나일론 스트레이너</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-105-0135</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Flour 488-phalloidin</td><td>Life technologies</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>생물 안전 캐비닛</td><td>LABCONCO</td><td>Class II, Type A2</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>Rotor F-35-6-30, Centrifuge5430</td><td></td></tr><tr><td>Clear Fused Quartz Round Dish</td><td>AdValue Technology</td><td>FQ-4085</td><td></td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터</td><td>SANYO</td><td>MCO-19AIC</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell Freezer 용기</td> 온도 <td>감소를 조절하도록 설계된</td><td>Corning</td><td>432000</td> 폼 용기</tr><tr><td>Cryovial</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5000-1020</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s 변형 된 독수리' s 매체 (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>EDX 분석 소프트웨어</td><td>Oxford Instruments</td><td>AztecSynergy</td><td></td></tr><tr><td>에너지 분산 X선 분광법 (EDX)</td><td>FEI</td><td>50mm2 X-Max50 SDD</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td></td><td></td>SH30910</tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드</td><td>VWR</td><td>100496-496</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>3520</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 소프트웨어</td><td>National Institutes of Health 및 광학 및 컴퓨터 계측 연구소(LOCI, University of Wisconsin)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>유도 결합 플라즈마 선광 방출 분광법(ICP-OES)</td><td>PerkinElmer</td><td>Optima 8000</td><td></td></tr><tr><td>광학 현미경</td><td>VWR</td><td>VistaVision</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신 (P/S)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.,</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>VWR</td><td>model SB70P</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>VWR</td><td>97062-730</td><td></td></tr><tr><td>스캐닝 전자 현미경 (SEM)</td> <td>FEI</td><td>Nova NanoSEM 450</td><td></td></tr><tr><td>수술 블레이드</td><td>VWR</td><td>76353-728</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 플라스크</td><td>VWR</td><td>T-75, MSPP-90076</td><td></td></tr><tr><td>Transwell 인서트</td><td>Corning</td><td>3460</td><td></td></tr><tr><td>트립신-에틸렌 디아민 테트라 아세트산 용액 (트립신 -EDTA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>X선 회절 기기 (XRD)</td><td>PANalytical</td><td>Empyrean Series 2</td><td></td></tr></tbody></table>

체외에서 생분해성 임플란트 재료를 연구하기 위한 직접 및 간접 배양 방법

Direct and Indirect Culture Methods for Studying Biodegradable Implant Materials In Vitro

지난 수십 년 동안 생분해 성 물질은 정형 외과, 치과 및 두개골 안면 임플란트와 같은 생물 의학 응용 분야를 위해 광범위하게 탐구되었습니다. 생분해성 물질을 생체의학 응용을 위해 스크리닝하기 위해서는 시험관내 세포 반응, 세포 적합성 및 세포독성 측면에서 이들 물질을 평가할 필요가 있다. 국제 표준화기구 (ISO) 표준은 생체 재료 평가에 널리 활용되었습니다. 그러나 대부분의 ISO 표준은 원래 비분해성 물질의 세포 독성을 평가하기 위해 확립되었으므로 생분해 성 물질 스크리닝에 제한된 가치를 제공합니다. 
이 기사에서는 세 가지 다른 배양 방법, 즉 직접 배양 방법, 직접 노출 배양 방법 및 생분해성 폴리머, 세라믹, 금속 및 그 복합체를 포함한 생분해 성 임플란트 재료의 시험관 내 세포 적합성을 평가하기위한 노출 배양 방법을 소개하고 논의합니다. 연구에 따르면 배양 방법은 동적 분해가 계면과 지역 환경에서 시공간 차이를 유도하기 때문에 생분해성 물질에 대한 세포 반응에 영향을 미친다는 사실이 밝혀졌습니다. 구체적으로, 직접 배양 방법은 임플란트에 직접 시딩된 세포의 반응을 드러낸다; 직접 노출 배양 방법은 임플란트와 접촉하는 확립 된 숙주 세포의 반응을 해명합니다. 노출 배양 방법은 임플란트와 직접 접촉하지는 않지만 임플란트 분해로 인한 국소 환경의 변화에 의해 영향을받는 확립 된 숙주 세포를 평가합니다. 
이 기사에서는 생분해성 임플란트 물질의 시험관내 세포 적합성 및 골수 유래 중간엽 줄기 세포 (BMSCs)와의 상호 작용을 연구하기 위한 이러한 세 가지 배양 방법의 예를 제공합니다. 또한 수확, 계대, 배양, 종자, 고정, 염색, 세포 특성화 및 배양 후 배지 및 재료 분석 방법을 설명합니다. 이 기사에서 설명된 시험관내 방법은 생체내 환경의 상이한 시나리오를 모방하여, 다양한 생체의학적 응용을 위한 상이한 생체재료의 시험관내 세포적합성 시험의 적용가능성 및 관련성을 넓힌다.

도 4는 상이한 배양 방법을 이용한 직접 및 간접 접촉 조건하에서의 BMSCs의 대표적인 형광 이미지를 나타낸다. 도 4A, B는 ZC21 마그네슘 합금1과 동일한 24시간 직접 배양 후 직접 및 간접 접촉 조건 하에서의 BMSC를 보여준다. ZC21 합금은 97.5 wt % 마그네슘, 2 wt % 아연 및 0.5 wt % 칼슘으로 구성됩니다. ZC21 합금 샘플과 직접 접촉하지 않은 셀은 샘플과 직접 접촉하는 셀보다 더 잘 퍼집니다. 도 4C,D에 나타난 바와 같이, 직접 및 간접 접촉 조건 하에서의 세포는 모두 Fe3+ 이온에 의해 가교된 히알루론산(HyA) 하이드로젤에 24시간 직접 노출된 후 정상적인 형태를 나타낸다. 그러나, 간접 접촉 조건...

우리는 생분해성 임플란트 재료의 시험관내 세포 적합성을 평가하기 위해 직접 배양, 직접 노출 배양 및 노출 배양의 세 가지 방법을 소개합니다. 이러한 시험관 내 방법은 상이한 생체내 세포-임플란트 상호작용을 모방하고 다양한 생분해성 물질을 연구하는데 적용될 수 있다.

Over the past several decades, biodegradable materials have been extensively explored for biomedical applications such as orthopedic, dental, and ...

시험관 내에서 생분해성 임플란트 물질을 연구하기 위한 직접 및 간접 배양 방법. 지난 수십 년 동안 생분해 성 물질은 정형 외과, 치과 및 두개골 악안면 임플란트와 같은 생물 의학 응용 분야를 위해 광범위하게 탐구되었습니다. 생분해성 물질을 생물의학 응용을 위해 스크리닝하기 위해, 시험관내 세포 반응, 세포 적합성 및 세포독성 측면에서 이들 물질을 평가할 필요가 있다.국제 표준화기구 (International Organization for Standardization)의 표준은 생체 재료 평가에 널리 활용되었습니다. 그러나 대부분의 ISO 표준은 원래 비 분해 성 물질의 스타일 독성을 평가하기 위해 수립되었으므로 생분해 성 물질 스크리닝에 제한된 가치를 제공합니다. 이 비디오에서는 생분해성 임플란트 재료의 시험관내 세포 적합성을 평가하기 위한 세 가지 배양 방법, 즉 직접 배양 방법, 직접 노출 배양 방법 및 노출 배양 방법을 소개하고 논의합니다.구체적으로, 직접 배양 방법은 새로 시딩된 세포와 임플란트 사이의 상호작용을 평가한다. 직접 노출 배양은 체내에서 확립된 세포와 임플란트 사이의 상호작용을 모방한다. 노출 배양은 확립 된 세포와 임플란트가 서로 직접 접촉하지 않고 재료가 분해되는 동일한 환경에서 상호 작용을 특징으로합니다.이 비디오는 생분해성 임플란트 물질의 시험관내 세포 적합성 및 골수 유래 중간엽 줄기 세포와의 상호작용을 연구하기 위해 이러한 세 가지 배양 방법을 사용하는 예를 제공한다. 이 비디오에 설명된 시험관내 방법은 생체내 환경의 상이한 시나리오를 모방하여, 다양한 생체의학 응용을 위한 상이한 물질의 시험관내 세포적합성 시험의 적용성 및 관련성을 넓힌다. 우리는 세포 및 조직 수확을 위해 리버 사이드 캘리포니아 대학의 기관 동물 관리 및 사용 공동체가 승인 한 프로토콜을 따릅니다.세포 배양 준비. 이 비디오에 설명된 세 가지 배양 방법은 일반적으로 부착되는 상이한 세포 유형에 적용 가능하다. 여기서, 래트 이유식으로부터 수확된 BMSCs는 래트 이유식으로부터 골수 유래 중간엽 줄기세포를 수확하는 세포 배양 제제의 예로서 도입될 것이다.이 그림의 개략도는 쥐 이유식에서 BMSC를 수확하는 단계를 보여줍니다. 피부와 근육 및 결합 조직을 제거하여 안락사 된 쥐에서 대퇴골을 해부하십시오. 대퇴골 뼈를 세포 배양 배지를 함유하는 15 mL 원뿔형 튜브에 넣는다.세포 추출을 수행 할 때까지 얼음 위에 원뿔형 튜브를 놓습니다. 뼈를 생물학적 안전 캐비닛의 페트리 접시로 옮깁니다. 수술 블레이드를 사용하여 뼈의 끝을 자르고 25 1/2 게이지 바늘이있는 주사기를 사용하여 세포 배양 배지로 골수를 세척하여 골수를 50 mL 원뿔형 튜브로 플러시합니다.세포 현탁액을 70 마이크로미터 필터를 사용하여 여과한 다음, 5분 동안 126배 중력에서 원심분리하여 세포 펠릿 흡인물을 상청액 배지 밖으로 꺼내고 10 mL의 신선한 배지로 보충한다. 부드럽게 위아래로 피펫하여 10 mL 혈청학적 피펫을 사용하여 세포를 재현탁시켰다. 서스펜션을 T-75 플라스크의 내부 바닥에 직접 피펫하고 매체를 추가하여 최대 25 밀리리터의 부피를 가져옵니다.세포를 섭씨 37도, 가습 분위기 5%이산화탄소 및 95%공기의 표준 멸균 세포 배양 환경에서 배양기에서 배양한다. 사흘에서 칠일 후, 오래된 배지를 열망하고 신선한 배지로 보충하여 부착되지 않은 세포를 헹구십시오. 세포 통과, 동결 또는 실험에 사용할 준비가 될 때까지 세포를 새로운 배지로 계속 배양하고 먹이십시오.샘플 준비 및 살균. 세포 배양 전에 모든 샘플을 멸균하거나 소독하십시오. 다른 샘플 유형에 대한 살균 또는 소독 방법은 재료의 다른 특성에 따라 다릅니다.일반적으로 자외선을 사용하여 시험관 내 연구를 위해 생분해 성 금속을 소독하십시오. 세포 배양 방법. 이 그림의 개략도는 직접 배양 방법의 단계를 보여줍니다.본 비디오에서 BMSCs는 배양방법을 예시하기 위한 예로서 12-웰 조직 배양 처리된 플레이트의 웰 내부에 놓인 마그네슘 유래 플레이트 상에서 배양되었다. 90%confluent 플라스크를 사용하여 혈구분석기를 사용하여 세포 현탁액 중의 세포 농도를 결정한다. 신선한 배지를 사용하여 세포 현탁액을 시험관 내에서 세포 연구에 필요한 처방 된 세포 농도로 희석하십시오.샘플을 12-웰 조직-배양 플레이트의 중앙에 놓는다. 배양 플레이트를 PBS 2 mL 및 DMEM 2 mL로 순차적으로 헹구어 멸균 조건하에서 삼투압을 교정한다. 희석된 세포 현탁액 3 mL를 각 웰에 관심 있는 샘플 상에 첨가한다.세포를 표준 세포 배양 조건 하에서 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하였다. disfigure의 개략도는 직접 노출 배양의 단계를 보여줍니다. 다양한 세포 유형 및 의도된 적용에 대한 실험 설계에 기초하여 필요한 농도의 세포로 세포 현탁액을 준비한다.배양 플레이트를 PBS 2 mL 및 DMEM 2 mL로 순차적으로 헹구어 멸균 조건하에서 삼투압을 교정한다. 희석된 세포 현탁액 3 mL를 각 웰에 첨가한다. 세포를 표준 세포 배양 조건 하에서 가습 배양기에서 24시간 동안 또는 세포가 50% 내지 80%컨플루언스에 도달할 때까지 배양한다.24시간 헹구고, PBS로 웰 플레이트에 세포를 헹구고 피펫을 이용하여 부유하는 죽은 세포를 제거하였다. 소독 또는 멸균된 샘플을 부착된 세포 위에 직접 놓는다. 각 웰에 신선한 배지 3mL를 넣습니다.세포를 또 다른 24시간 동안 표준 세포 배양 조건 하에서 배양한다. 이 도면의 개략도는 노출 배양 방법의 단계를 보여줍니다. 세포 준비를 위한 초기 단계는 직접 노출 배양과 동일하다.그 후, 샘플을 막 기공 크기가 0.4 마이크로미터인 웰 인서트에 넣고 샘플과 함께 웰 인서트를 세포와 함께 각 웰에 배치합니다. 세포를 또 다른 24시간 동안 표준 세포 배양 조건 하에서 배양한다. 세포의 배양 후 특성화.직접 배양 및 직접 노출 배양을 위해, 웰 플레이트 및 샘플 둘 다에 부착된 세포를 고정, 염색, 이미지 및 분석한다. 노출 배양을 위해, 웰 플레이트에 부착된 세포를 분석한다. 추가 분석을 위해 각 웰로부터 배양 후 배지를 상응하는 15 mL 원뿔형 튜브로 수집한다.추가 분석을 위해 배양 후 모든 샘플을 수집한다. PBS를 사용하여 샘플 및 웰 플레이트 둘 다에 부착된 세포를 세 번 헹구십시오. 4% 파라포름알데히드 1mL를 각 웰 플레이트에 넣습니다.뚜껑을 다시 웰 플레이트에 올려 놓고 PFA가 20 분 동안 반응하도록하십시오. 20 분 후에 PFA를 흡인하고 폐기물 병에 분배하십시오. PBS를 사용하여 웰 플레이트를 세 번 헹구어 PFA를 제거하고 폐기물을 폐기물 병으로 옮깁니다.염색제의 작업 재고를 준비하십시오 제조업체의 지시에 따라. 희석된 알렉사 플루오르 488 Phalloidin 염색제 200 내지 400 마이크로리터를 각 웰에 첨가하여 웰 플레이트 및 샘플 상의 세포를 덮는다. 우물 플레이트를 알루미늄 호일로 감싸서 빛에 노출을 방지하고 Alexa Fluor 488 Phalloidin이 실온에서 20 분 동안 반응하도록하십시오.Alexa Fluor 488 Phalloidin 염색제를 수집하여 해당 폐기물 병에 분배하십시오. PBS를 사용하여 벽 플레이트를 세 번 헹구어 과량의 알렉사 플루오르 488 팔로이드인을 제거하고 사용된 PBS를 상응하는 폐병에 분배한다. 희석된 DAPI 200 내지 400 마이크로리터를 각 웰에 첨가하여 웰 및 샘플 상의 세포를 덮는다.웰 플레이트를 알루미늄 호일로 감싸고 DAPI가 실온에서 다섯 분 동안 반응하도록 하십시오. PBS를 사용하여 웰 플레이트를 세 번 헹구고 사용된 PBS를 상응하는 폐병에 분배한다. 염색 후, 형광현미경을 이용하여 세포를 이미지화하였다.가능할 때마다 형광 이미지 외에도 세포의 위상차 이미지를 찍으십시오. 샘플을 지속적으로 분해함으로써 야기되는 가능한 변화를 피하거나 감소시키기 위해 염색 직후에 가능한 한 빨리 또는 염색 직후에 세포를 이미지화한다. 직접 배양 및 직접 노출 배양을 위해, 두 가지 유형의 세포를 이미지화하고 평가한다.하나는, 샘플과 직접 접촉하는 샘플 상의 세포이고, 두 개는, 도면에 나타낸 바와 같이, 샘플과 직접 접촉하는 샘플을 둘러싸는 웰 플레이트 상에 부착된 세포이다. 노출 배양의 경우, 여기에 표시된 바와 같이, 세포의 형광 이미지를 촬영할 때 이미지 가이드를 사용하여 샘플의 동적 분해 구배에 대한 반응에서 세포의 반응이 다른지 여부를 결정하십시오. 중앙에서 3.5mm 떨어진 내부 링 및 중심에서 7mm 떨어진 외부 링 내의 영역에 위치한 세포를 개별적으로 이미지 및 분석합니다.각 샘플에 대해, 그리고 배양 플레이트 내에 있는 동안, 세포가 미리 정의된 거리에서 샘플과 간접 접촉하거나 간접 접촉하는 각각의 관심 영역으로부터 적어도 다섯 개의 이미지를 랜덤하게 취한다. 단계 4.3으로부터 수득된 모든 세포 이미지로부터, 이미지 분석을 위해 세포 확산 면적 및 종횡비를 측정함으로써 세포 형태를 정량화한다. 각 이미지 영역의 셀 수를 계산합니다.직접 및 간접 접촉 조건 하에서의 세포 부착 밀도를 단위 면적당 셀 수로 계산한다. 배지 및 샘플의 사후 배양 분석. 자기 고정 전에 포스트 컬처 미디어를 수집하십시오.사전 보정된 pH 측정기를 사용하여 수집 직후 각 웰에서 배양 후 배지의 pH 값을 측정한다. pH 측정의 이전 단계에 따라, 이온 농도의 최적 측정을 위해 바람직한 희석 계수를 사용하여 배지를 수집하고 희석하십시오. ICP-OES로 약칭된 유도적으로 결합된 플라즈마-광학 방출 분광계를 사용하여 배양 후 배지에서 관심있는 이온의 농도를 측정한다.시험관내 세포 연구 후, 생분해성 샘플은 치수, 질량, 표면 형태학, 미세구조 및 조성에서 변화할 수 있다. 샘플의 배양 후 분석은 샘플의 분해 메커니즘을 이해하는 데 도움이됩니다. 세포 배양 후, 샘플의 사진을 찍어 샘플 치수, 색상, 형태학 및 기타 가시적 특성의 가능한 변화를 보여줍니다.배양 후 샘플을 건조 또는 탈수시키고 샘플 질량, 치수 및 부피를 측정하여 질량, 치수 및 부피의 변화를 정량화한다. 주사 전자 현미경을 사용하여 샘플의 미세 구조와 형태를 특성화하십시오. 에너지 분산 x선 분광법 및 x-선 굴절을 사용하여 샘플에서 분해 생성물의 조성과 위상을 특성화하십시오.FTIR 또는 ATR을 사용하여 시료 표면에서의 화학적 결합을 검출하십시오. 대표적인 결과. 여기서, 도면은 다양한 배양방법을 이용한 직간접 접촉 조건 하에서 골수유래 줄기세포의 대표적인 형광 이미지를 나타낸 것이다.이 도면은 정량화된 세포 부착 밀도에 대한 예시적인 데이터를 나타낸다. 도 A에 나타난 바와 같이, 24시간 직접 노출 배양에서, ZC21과 직접 접촉하는 BMSCs는 다른 어떤 그룹보다 유의하게 더 큰 세포 부착 밀도를 갖는다. 도 B에 나타난 바와 같이, 직접 노출 배양의 간접 접촉 조건에서, BMSC 부착 밀도는 마그네슘 그룹보다 ZC21 그룹에 대해 유의하게 더 높다.그러나, 대조군만을 대상으로 한 T64 세포와 비교하여 유의한 차이는 보이지 않는다. 여기서, 도 A는 직접 노출 배양 및 직접 배양 후의 배양 후 배지의 pH 값을 나타낸다. 직접 노출 배양의 경우, 배지의 pH 값은 모든 샘플에 대해 8.3 내지 8.4 범위이다.직접 배양에서, 배지의 pH 값은 그룹에 걸쳐 7.9 내지 8의 범위이다. 도 B는 배양 후 배지 내의 마그네슘 이온 농도를 나타낸다. 직접 노출 배양 및 직접 배양 둘 다에서, ZC21 및 마그네슘 그룹에서의 마그네슘 이온 농도는 다른 대조군보다 유의하게 높다.이 그림은 사흘 노출 배양 후 ZSr41 및 순수 마그네슘에 대한 XRD 패턴을 보여줍니다. 마그네슘, 산화아연 및 히드록시아파타이트와 같은 상이한 조성물의 결정상이 관찰되었다. 여기서, 도 A는 산화마그네슘이 코팅된 마그네슘에 대한 표면원소 조성의 SEM 이미지 및 EDX 맵의 오버레이, BMSCs로 24시간 직접 배양한 후 마그네슘 기판과 유리의 조절을 나타낸 것이다.도 B는 샘플 표면의 정량적 표면 원소 조성을 나타내며, 이는 세포 배양 동안 형성된 상이한 침착을 나타낸다. 결론. 이 비디오에서는 다양한 실험 설계 및 의도 된 응용 프로그램을 기반으로 생분해 성 임플란트 재료의 세포 적합성을 평가하기위한 세 가지 시험관 내 방법을 소개했습니다. 물질과 다양한 종류의 세포 간의 상호작용은 직접 배양법, 직접 노출 배양 방법 및 노출 배양 방법을 통해 조사할 수 있었다.이 비디오는 다양한 의료용 임플란트 응용 분야의 세포 거동에 대한 분해 생성물과 함께 생분해 성 물질의 효과를 연구하는 주요 시험관 내 방법을 제시했습니다.

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