병아리 배아에서 인간 줄기 세포 스페로이드의 거동을 조사하기 위한 무표지 이종이식 모델

요약

여기에서는 인간 세포 스페로이드를 병아리 배아에 이식하고 식별하는 방법을 설명합니다. 이 이종이식 모델은 배아 미세환경을 세포 이동, 분화 및 열대성을 분석하기 위한 교육 신호의 소스로 사용하며 특히 1차 및/또는 이종 세포 집단 연구에 적합합니다.

초록

이종이식편은 in vivo에서 인간 세포의 행동을 조사하는 데 유용한 방법입니다. 특히, 배아 환경은 성체 이종이식 모델에는 종종 없는 고유한 지시 신호와 생식층 정체성을 통해 세포 이동, 분화 및 형태 형성에 대한 단서를 제공합니다. 또한, 배아 모델은 자가 조직과 비자기 조직을 구별할 수 없기 때문에 이식편에 대한 거부 반응의 위험과 숙주의 면역 억제의 필요성을 제거합니다. 본 논문은 인간 세포의 스페로이드를 닭 배아에 이식하는 방법을 제시하는데, 닭 배아는 접근이 용이하고 조작이 가능하며 37°C에서 발달합니다.

스페로이드는 이식을 위해 배아의 특정 영역을 선택할 수 있도록 합니다. 이식 후 세포는 숙주 조직에 통합되어 이동, 성장 및 분화를 추적할 수 있습니다. 이 모델은 이질적인 일차 세포 집단 및 암세포를 포함한 다양한 부착 집단을 활용할 수 있을 만큼 충분히 유연합니다. 이전 세포 라벨링의 필요성을 피하기 위해 인간 특이적 Alu 프로브의 혼성화를 통한 기증자 세포 식별을 위한 프로토콜도 설명되며, 이는 이질적인 세포 집단을 조사할 때 특히 중요합니다. 또한 DNA 프로브는 다른 공여자 종을 식별하기 위해 쉽게 조정할 수 있습니다. 이 프로토콜은 스페로이드를 준비하고, 닭 배아에 이식하고, 파라핀 절편을 위해 조직을 고정 및 처리하고, 최종적으로 DNA in situ hybridization을 사용하여 인간 세포를 식별하는 일반적인 방법을 설명합니다. 제안된 대조군, 결과 해석의 예 및 분석할 수 있는 다양한 세포 거동이 이 방법의 한계 외에도 논의될 것입니다.

서론

이종이식편은 in vivo에서 인간 세포의 행동을 조사하는 데 유용한 도구입니다. 이러한 모델은 인간 줄기세포의 생물학¹, 실시간 세포 현상 관찰², 종양 혈관 신생 및 전이 조사³ 와 같은 광범위한 과학 주제에 대한 귀중한 정보를 제공했습니다. 또한, 환자 특이적 이종이식편의 종양 형성을 포함한 암 생물학의 여러 측면이 연구되었습니다 ^4,5. 이러한 각 이종 이식 모델에는 장단점이 있으므로 각 모델은 특정 과학적 질문에 더 적합합니다. 병아리 배아는 외과적 조작이 가능한 접근 가능한 양수 모델이기 때문에 인기 있는 발달 생물학 모델입니다. 이종 이식편을 통해 연구자들은 정확한 운명 지도⁶를 만들거나 형질이 세포 자율적인지 아니면 환경에 의해 지시되는지를 탐구할 수 있었다 ^7,8. 유사한 이론적 근거로 병아리 배아를 인간 세포의 행동을 연구....

프로토콜

이 연구에 사용된 모든 생체 내 절차는 브라질 실험 동물 사용 지침(L11794)에 따라 동물 실험 및 연구를 위한 모든 관련 실험 지침을 준수했습니다. 닭 배아를 취급하는 데 사용되는 프로토콜은 모두 과학 실험에서의 동물 사용에 관한 윤리 위원회(리우데자네이루 연방 대학의 건강 과학 센터)의 승인을 받았습니다. 인간 세포의 사용은 Clementino Fraga Filho 대학병원 윤리위원회(번호 043/09 및 088/04)의 승인을 받았습니다. White Leghorn 닭(Gallus gallus)의 특정 병원균이 없는(SPF) 계란을 사용했습니다.

1. 세포 스페로이드의 제조

참고: 세포 스페로이드는 부착되어 있는 한 다양한 세포 유형으로 준비할 수 있습니다. 이 프로토콜의 경우, 앞서 설명한 바와 같이 인간 지방 유래 기질 세포(ADSC)를 분리했습니다(^21,27)가 사용됩니다(그림 2A). 교반 하에서 37°C....

결과

조직학적 절편에서 Alu-positive ADSC의 식별
Alu 염기서열은 인간 게놈의 ~10%를 구성하는 반복적인 요소이므로 종 특이적 방식으로 인간 세포를 식별하기 위한 훌륭한 표적입니다⁴³. DNA 프로브를 사용한 현장 혼성화는 1차 인간 세포 29,30,40,44,45,46을 포함한 조직학적 섹션에서 게놈 요소를 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 실험 섹션을 검토하기 전에 A.......

토론

여기에 설명된 프로토콜(그림 1)은 병아리 배아를 모델로 사용하여 생체 내에서 인간 세포의 주요 집단의 행동을 스크리닝하기 위한 실현 가능한 옵션을 제시합니다. 이 논문은 세포 스페로이드의 형성(그림 2), 병아리 배아로의 스페로이드 이식(그림 3), 표본 처리 및 현장 교잡(그림 4), 전염색체 중배엽에 이식된 인간 ADSC의 대표적인 결과(그림 5) 및 관련 실험(그림 6 및 7)에 대해 설명합니다), 첫 번째 인두궁 영역에 이식된 인간 ADSC와 병아리 전뇌세포에 이식된 인간 원발성 교.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Animals
Gallus gallus eggs	Granja Tolomei	SPF-free	White leghorn chicken
시약
Alcian Blue 8GX	Sigma-aldrich	A5268
AluFw 프라이머	Sigma-aldrich	OLIGO	5'-CGA GGC GGG TGG ATC ATG AGG T-3'
AluRev 프라이머	시그마 - 알드리치	올리고	5 '-TTT TTT GAG ACG GAG TCT CGC-3'
황산 알루미늄	그마 알드리치	368458	핵 빠른 적색 용액 준비
안티 Digoxigenin-AP, Fab 단편	Roche	11093274910	항체 등록 ID : AB_514497
Anti-Human Natural Killer 1 항체 (HNK1, CD57)	개발 연구 Hybridoma Bank	3H5	항체 등록 ID : AB_2314644
안티 마우스, 염소 IgM-HRP	산타 크루즈 Biotechnology	sc-2973	항체 등록 ID: AB_650513
Anti-mouse, goat IgG (H+L)-HRP	Novex	G-21040	항체 등록 ID: AB_2536527
Anti-Smooth Muscle Actin/ACTA2 항체	Dako	M085129	항체 등록 ID:
AB_2811108 Aquatex	Merck	1085620050	수성 장착제
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate p-toluidine salt (BCIP)	Sigma-aldrich	B8503-100MG
차단 시약	Roche	11096176001
Citric acid	VETEC	238	SSC 완충액 준비
콜라겐 분해 효소 유형 IA	Sigma-aldrich	SCR103
dCTP, dGTP, dATP, dTTP 세트	Roche	11969064001
Denhardt 용액 50X	Invitrogen	750018	혼성화 완충액 준비용
덱스트란 황산염 나트륨 염	Thermo Scientific	15885118	혼성화 완충액 준비용
DIG RNA 라벨링 혼합물	Roche	11277073910	Dig-11-dUTP
DMEM 저포도당	시그마-알드리치	D5523
3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride(DAB)	함유시그마 알드리치	D5905-50TAB
N, N- 디메틸 포름 아미드 (DMF)	시그마 알드리치	227056	NBT 및 BCIP 용액 준비
용 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)	시그마 알드리치	E6758	트립신 용액 준비
용 Entellan 새로운	Merck	107961	비수성 장착 매체
에탄올	Proquí mios	N/A
소 태아 혈청	ThermoFisher	12657029	56°에서 비활성화; C 사용 전
포름 알데히드 37 % 용액	Proqu í mios	N/A
포름아미드	Vetec	V900064
빙하 아세트산	Proquí mios	N / A
인도 잉크	Pelikan 221143
L- 글루타민 용액 (200 mM)	Gibco	25030-149
염화 마그네슘	Merck	8147330100	NTM 완충 제 용
말레 산	시그마 알드리치	M0375-500G	MAB 완충 제
Methanol	Proquí mios
Normal Goat Serum	Sigma-aldrich	NS02L	56°C에서 비활성화; C 사용 전
4-니트로 블루 테트라졸륨 클로라이드(NBT)	로슈	11585029001
핵 고속 레드	시그마-알드리치	60700
파라플라스트 플러스	시그마-알드리치	P3558
페니실린 G 나트륨염	시그마-알드리치	P3032
인산염 완충 식염수(PBS)	시그마-알드리치	P3813
포스포몰리브딕산	Merck	100532
Proteinase K	Gibco BRL	25530-015
연어 정액 DNA	Invitrogen	15632011	혼성화 완충액 제제용
염화나트륨	Sigma-aldrich	S9888	SSC, MAB 및 NTM 완충액 제제용
스트렙토마이신 황산염	Sigma-aldrich	S6501
Taq 중합효소 키트	Cenbiot Enzimas	N/A
Tris-HCl	, Sigma-aldrich	T5941
Trypsin	Sigma-aldrich	T4799
Tween 20	Sigma-aldrich	P1379
Xylene	Proquí mios	N/A
Microscope and equipments
Axioplan upright microscope	Carl Zeiss Microscopy	N/A
Axiovision software	Carl Zeiss Microscopy	N/A
Cell incubator	ThermoForma	3110
Egg incubator- 50	eggs GP
구즈넥 램프	Biocam	N/A	계란 조작
피지 소프트웨어용; Cell Counter 플러그인	ImageJ	https://imagej.net/software/fiji/
Laminar flow hood	TROX	1385
Nanodrop Lite	Thermo Scientific	ND-LITE-PR
로터리 마이크로톰	Leica Biosystems	RM2125 RTS	절편
용 실체현미경	Labomed	Luxeo 4D	난자 조작용
멸균 오븐	REALIS	7261690	수술 재료의 sterelization
소모품
0.2 mL (PCR) 폴리프로필렌 원심분리기 튜브	Eppendorf	30124707
15 mL 폴리프로필렌 코니컬 원심분리기 튜브	Corning	CLS430791
1.5 mL 폴리프로필렌 원심분리기 튜브	Axygen	MCT-150-C
2 mL 폴리프로필렌 원심분리기 튜브	Axygen	MCT-200-C
50 mL 폴리프로필렌 원추형 원심분리기 튜브	Corning	CLS430829
Barrier (Filter) Tips, 200 μ L 크기	Invitrogen	AM12655	계란 조작
용 굴착 유리 블록 (염색 블록) 커버 유리	Hecht Karl	42020010
임베딩 카세트	Simport	M480	파라핀 블록 홀더로 사용
유리 커버 슬라이드, 24 x 40 mm	Kasvi	K5-2440
유리 파스퇴르 피펫 230 mm	NORMAX	5426023	유리 모세관 제조용
마이크로톰 블레이드	Leica Biosystems	HIGH-PROFILE-DISPOSABLE-BLADES-818
Parafilm M	Parafilm	P7793
플라스틱 페트리 접시 절편용, 30mm	Kasvi	K13-0035	계란 조작용
플라스틱 페트리 접시, 60mm	Prolab	0303-8	세포 스페로이드 준비용. 세포 부착을 위해 치료해서는 안 됩니다.
실란화 유리 슬라이드 (Starfrost)	Knittel Glass	198	주
사기 1 mL 절편, 바늘 26 G (0.45 x 13 mm)	Descarpack	32972	난자 조작 (알부민 흡인)
Surgical tools
Aspirator tube	Drummond	2-000-000	난자 조작
해부 가위	Fine Science Tools	14061-11	계란 조작용
마이크로핀셋(핀셋)	Fine Science Tools	00108-11	계란 조작 및 유리 모세관 준비용
바늘 홀더(조정 가능한 해부 바늘 척)	Fisherbrand	8955	계란 조작용
오일 숫돌, 10.000 그릿	N/A	/A	바늘 숫돌 숫돌 샤프닝용
쌍 페인트 브러시	N/A	N/A	파라핀 섹션 처리용. 모든 브랜드를 사용할 수 있습니다.
재봉 바늘	N/A	N/A	마이크로 메스로 날카롭게 하기 위해. 모든 브랜드를 사용할 수 있습니다.
멸균 일회용 메스 No. 23	Swann-Norton	110	절제용
외과용 메스 손잡이	Swann-Norton	914	절제용
Wecker 홍채 가위, 날카롭고 날카로운	Surtex	SS-641-11	계란 조작용

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