Name: 시투에서 Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: 배우세요 생쥐 태아 뇌 조직 절편에서 축삭 성장과 성장원추 역학을 고해상도 영상으로 분석하는 방법을. 이 기술은 신경발생 및 축삭 가소성 메커니즘 연구에 필수적인 도구입니다.

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절차를 촬영해 주신 Maria Eugenia Bernis에게 감사드립니다. 또한 원고를 읽고 토론해 주신 Emily Burnside, Emily Handley, Thorben Pietralla, Max Schelski, Sina Stern에게도 감사드립니다. 우리는 뛰어난 기술 조수, 제시카 고니어, 블랑카 랜델, 안투안 팜에게 감사드립니다. 우리는 DZNE의 광학 현미경 시설 및 동물 시설의 귀중한 지원을 인정합니다. 이 연구는 Deutsche Forschungsgesellschaft (DFG), International Foundation for Research in Paraplegia (IRP) 및 Wings for Life (F.B)의 지원을 받았습니다. F.B.는 우수 클러스터 ImmunoSensation2, SFB 1089 및 1158의 회원이며 Roger De Spoelberch Prize를 수상했습니다.

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<li>Lowery, L. A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+trip+of+the+tip%3A+understanding+the+growth+cone+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The trip of the tip: understanding the growth cone machinery.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 10 (5), 332-343 (2009).</li>
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<li>Bradke, F., Dotti, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+local+actin+instability+in+axon+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The role of local actin instability in axon formation.</a> Science. 283 (5409), 1931-1934 (1999).</li>
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<li>Witte, H., Neukirchen, D., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+stabilization+specifies+initial+neuronal+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule stabilization specifies initial neuronal polarization.</a> Journal of Cell Biology. 180 (3), 619-632 (2008).</li>
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<li>Turney, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+growth+factor+stimulates+axon+outgrowth+through+negative+regulation+of+growth+cone+actomyosin+restraint+of+microtubule+advance%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Nerve growth factor stimulates axon outgrowth through negative regulation of growth cone actomyosin restraint of microtubule advance.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (3), 500-517 (2016).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+derived+from+radial+glial+cells+establish+radial+units+in+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex.</a> Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).</li>
<li>Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+neurons+arise+in+symmetric+and+asymmetric+division+zones+and+migrate+through+specific+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases.</a> Nature Neuroscience. 7 (2), 136-144 (2004).</li>
<li>Ferent, J., Zaidi, D., Francis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+control+of+radial+glia+proliferation+and+scaffolding+during+cortical+development+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular control of radial glia proliferation and scaffolding during cortical development and pathology.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 578341(2020).</li>
<li>Dent, E. W., Gupton, S. L., Gertler, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growth+cone+cytoskeleton+in+axon+outgrowth+and+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">The growth cone cytoskeleton in axon outgrowth and guidance.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (3), (2011).</li>
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<li>Azzarelli, R., Oleari, R., Lettieri, A., Andre, V., Cariboni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro%2C+ex+vivo+and+in+vivo+techniques+to+study+neuronal+migration+in+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Sciences%22%5BJournal%5D)">In vitro, ex vivo and in vivo techniques to study neuronal migration in the developing cerebral cortex.</a> Brain Sciences. 7 (5), (2017).</li>
<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li>
<li>Namba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pioneering+axons+regulate+neuronal+polarization+in+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pioneering axons regulate neuronal polarization in the developing cerebral cortex.</a> Neuron. 81 (4), 814-829 (2014).</li>
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<li>Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+confocal+imaging+of+migrating+neurons+in+organotypic+slice+culture+of+embryonic+mouse+brain+using+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Time-lapse confocal imaging of migrating neurons in organotypic slice culture of embryonic mouse brain using in utero electroporation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), (2017).</li>
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<li>Qu, X., Kumar, A., Bartolini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+microtubule+dynamics+at+excitatory+presynaptic+boutons+in+primary+hippocampal+neurons+and+acute+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Live imaging of microtubule dynamics at excitatory presynaptic boutons in primary hippocampal neurons and acute hippocampal slices.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100342(2021).</li>
<li>Tonnesen, J., Katona, G., Rozsa, B., Nagerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spine+neck+plasticity+regulates+compartmentalization+of+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spine neck plasticity regulates compartmentalization of synapses.</a> Nature Neuroscience. 17 (5), 678-685 (2014).</li>
<li>Buchsbaum, I. Y., Cappello, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+migration+in+the+CNS+during+development+and+disease%3A+insights+from+in+vivo+and+in+vitro+models%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Neuronal migration in the CNS during development and disease: insights from in vivo and in vitro models.</a> Development. 146 (1), (2019).</li>
<li>Rigby, M. J., Gomez, T. M., Puglielli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cell-axonal+growth+cone+interactions+in+neurodevelopment+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glial cell-axonal growth cone interactions in neurodevelopment and regeneration.</a> Frontiers in Neuroscience. 14, 203(2020).</li>
<li>Barnes, A. P., Polleux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+axon-dendrite+polarity+in+developing+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Establishment of axon-dendrite polarity in developing neurons.</a> Annual Review of Neuroscience. 32, 347-381 (2009).</li>
<li>Multiphoton Microscope Leica TCS SP8 MP. Microsystems. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/">http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/</a> (2021).</li>
<li>ZEISS Lattice Lightsheet 7. Zeiss. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.zeiss.com/microscopy/int/products/imaging-systems/lattice-lightsheet-7.html">http://www.zeiss.com/microscopy/int/products/imaging-systems/lattice-lightsheet-7.html</a> (2021).</li>
</ol>

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성장 원뿔이 어떻게 주변 환경을 감지하고 반응하여 동시 축삭 확장과 지침을 조정하는지는 여전히 논쟁의 문제입니다 3,18. 2D 기질에 대한 선구적인 연구는 축삭 형성, 성장 및 탐색 2,10,11,12,19 동안 성장 원뿔 역학을 유도하는 힘을 생성하는 근본적인 분자 메커니즘을 엿볼 수있었습니다. 보다 최근에, 3D 행렬에 대한 연구는 3차원이 성장 원뿔의 거동과 결과적으로 축삭 성장 8,9에 얼마나 많은 영향을 미치는지 밝혀냈다. 그럼에도 불구하고, 생체 내에서 성장 콘 역학을 지시하는 복잡한 메커니즘은 철저히 조사되어야 한다.
IUE 또는 EUE 뇌로부터의 유기형 슬라이스 배양물의 제조는 널리 활용되고 잘 문서화되어 있다. 그것은 과학자들이 살아있는 뇌 조직20,21에서 뉴런의 발달과 행동에 대한 통찰력을 얻을 수있게 해주는 황금 표준이되었습니다. 실제로이 기술은 다양한 고해상도 이미징 기술과 함께 성공적으로 활용되어 특정 분자 과정 및 형태 학적 사건을 현장에서 시각화했습니다. 이러한 연구들은 축삭 형성 및 연장 19,22, 피질 뉴 런 이동19,22,23,24, 센트로솜 역학 25,26, 미세소관 역학(27), 뿐만 아니라 시냅스 전후 구획(28,29)의 기능적 역학을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
이 프로토콜은 실험 신경 생물학의 격차를 해결하고, 현장에서 피질 뉴런을 개발하는 성장 원뿔 역학을 시각화하고, 생체 외 급성 뇌 슬라이스 배양 및 얻은 데이터를 분석하는 도구를 시각화합니다.
급성 뇌 슬라이스 배양은 (1) 일부 연습을 통해 생성하기 쉽기 때문에이 프로토콜을 확립하기 위해 활용되었습니다. (2) 고해상도 라이브 셀 이미징을 허용할만큼 충분히 투명하면서도 준 생리적 환경에 매립 된 성장 원뿔을 연구 할 수있는 접근 가능한 시스템을 제시한다. (3) 무수한 트랜스제닉 마우스 라인과의 사용을 위해 확장될 수 있고; (4) IUE 또는 EUE와 결합하여 형광 리포터 및 세포 골격 프로브와 함께 기능 체계의 손실 / 이득 하에서 생체 내에서 성장 원뿔 및 축삭 돌기의 성능을 평가하는 분자 도구를 제공 할 수있는 거의 무한한 잠재력을 제공합니다.
이 방법론은 EUE와 IUE의 맥락에서 설명되었습니다. 여전히 매우 신뢰할 수 있는 방법이지만, EUE는 전달 방법으로 IUE로 얻은 것에 비해 무질서한 RG 네트워크를 나타내는 뇌 절편의 발생률이 증가하였다(도 4C). RG 어레이의 교란은 뉴런 이동과 축삭 신장패턴 30,31에 강하게 영향을 미칩니다. 이들은 주어진 시간에 분석을 위해 축삭을 찾을 위치와 탐색하는 환경의 유형을 예측하는 주요 매개 변수입니다. RG 네트워크가 크게 파괴 된 뇌 조각은 일반적으로 피질 뉴런 층화가 손상됩니다. 이것은 차례로 혼란스러운 궤적을 가진 축삭을 생성합니다. 따라서 RG 네트워크의 구조적 무결성을 제어하는 것이 좋습니다. 흥미롭게도, 열악한 구조적 완전성은 배아 뇌의 나이 증가와 관련이 있습니다. 실제로, 젊은 E12.5-E13.5 배아에서 그러한 효과는 전형적으로 관찰되지 않았다19.
현재 프로토콜은 철저하고 간단합니다. 그럼에도 불구하고 최적의 결과를 얻기 위해 특별한주의와주의를 기울여야하는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 이들은 프로토콜에서 명백하게 언급되었으며, (1) 희소 표지를 얻기 위해 전기천공에 사용되는 DNA의 양을 튜닝하는 것을 포함한다; (2) 뇌의 추출 동안 손상을 피하기; (3) 뇌 케이싱 동안 아가로스의 온도를 조절하는 단계; (4) 주어진 나이의 두뇌에 대한 아가로스의 이상적인 비율을 해결하는 단계; (5) 형광단의 선택, 그 경험은 다음과 같습니다. 프로토콜 최적화 동안, 계내 이미징에서 살아있는 세포에서 여러 형광단의 성능을 시험하였다. 단량체성 GFP 변이체는 LifeAct- 및 Lyn-태깅된 플라스미드의 제조를 위해 EGFP 및 NeonGreen-태깅된 플라스미드를 이 프로토콜에 대해 선택하였다(도 5A,B). 또한, RFP 변이체 mScarlet을 테스트하고 이 설정에 매우 적합한 것으로 나타났습니다(데이터는 표시되지 않음). 다량체 tRFP (이량체) 및 ZsGreen (사량체) (도 5C 및 보충 비디오 1, 오른쪽)을 또한 시험하였다. 이러한 빠른 폴딩 초휘 형광단은 DNA 전달 후 신속한 형광 신호 생성이 필요한 경우에 권장됩니다.
슬라이스 배양을 사용하는 일반적인 관행은 다른 두뇌의 조각을 사용하여 제어 및 실험 조건을 테스트하는 것입니다. 이것은 원치 않는 변동성의 고유 한 원인을 나타냅니다. 여기서, 동종 뉴런과 리포터의 발현을 독립적으로 변형시켜 동정할 수 있는 발현 시스템이 사용되었다. 이 시연에서(도 5C), 형광단 중 어느 하나를 발현하는 뉴런 사이에는 차이가 없었다. 그러나, 일례로서, Cre 민감성 유전자를 보유하는 트랜스제닉 마우스 라인과 결합된 이러한 플라스미드 믹스는 야생형으로 남아있는 tRFP(Dre-sensitive) 뉴런으로 표지될 것이다. 대조적으로, ZsGreen (또한 Cre-sensitive)은 재결합 된 뉴런을 라벨링합니다. 따라서 두 개의 서로 다른 유전자형의 성장 원뿔과 표현형도 동일한 뇌 조각에서 동시에 나란히 연구 될 수 있습니다.
분석을 위해 축삭과 성장 원뿔의 국소화는 중요한 고려 사항입니다. 피질 뉴런은 심실 영역 (VZ)에서 피질 플레이트 (CP)쪽으로 방사상으로 이동하면서 편광됩니다. 이 과정 동안, 뉴런은 선도적 인 과정 (미래의 덴드라이트)과 축삭이 될 후행 과정을 형성하고, 결국 중간 영역 (IZ)에서 선구적인 축삭에 합류하여 축삭 관 (32)을 확립합니다. 따라서, 축삭 성장 원뿔을 포획하기 위해, CP를 빠져나가는 축삭 및 축삭 다발과 이미 연관된 초기 생성 축삭을 포함하는 IZ의 축삭 섬유에 대한 이미징이 수행되었다; 또는 결국, IZ를 횡단하고 그 아래로 확장되는 섬유에서(그림 7).
이 프로토콜은 유기형 슬라이스 내에서 뉴런의 초해상도 이미징을 수행하는 것을 가능하게 합니다. 역사적으로 광산란은 두꺼운 표본을 이미징 할 때 직면 한 중요한 문제였습니다. 지난 이십 년 동안 광학 기술의 광범위한 발전으로 두꺼운 시편의 이미징이 가능해졌습니다. 여기에서는 성장 원뿔과 같은 작은 구조물을 더 잘 시각화하기 위해 긴 작동 거리 목표를 사용했습니다. 불가피하게,이 프로토콜은 역행 액틴 흐름 또는 미세 소관 역학과 같은보다 상세한 이벤트를 캡처하지 않습니다. 더 낮은 NA(Numerical Aperture)를 필요로 하는 긴 작동 거리 목표는 두꺼운 조각의 정보를 보존합니다. 그러나 더 짧은 작업 거리의 목표와 함께 사용하도록 이 프로토콜을 조정할 수도 있었습니다. 이를 위해서는 구조적 무결성을 유지하기 위해 조각을 유리 바닥 접시로 부드럽게 옮겨야했습니다. 그러나이 방법을 사용하면 가스 교환 손실로 인해 생존율 ~ 15 시간이 단축되었습니다 (데이터는 표시되지 않음). 2D 문화권과 달리 3D의 성장 원뿔은 더 큰 부피를 차지하며 z축에서 이동 아티팩트 보정이 필요합니다. 상세한 사건을 이미지화하는 능력을 높이려면 현대 공초점 기술을 활용해야합니다. 따라서, 고감도 공초점 현미경(33)에서 이용가능한 z-Galvo와 같은 고속 스캐닝 z-스택 모터를 사용하는 것이 좋다.
참고로, 이 프로토콜은 세 가지 주요 제한 사항을 제시합니다. 첫째, 생체내에서 임의의 주어진 플라스미드의 발현 수준/발현 세포의 수를 조절하는 것은 종종 도전적이다. 이것은 동일한 플라스미드 농도를 유지하는 경우에도 모든 슬라이스 사이의 가변성을 도입한다. 따라서, 사용된 발현 벡터에서 조절 요소의 선택은 주의해서 미리 결정되어야 한다. 둘째, 멤브레인 인서트를 사용하여 상세한 이벤트를 이미징하는 것은 현재 실현 가능하지 않습니다. 이 두 번째 제한은 이전 단락에서 제안 된 방법 론적 업데이트로 극복 될 수 있습니다. 마지막으로, 성장 원뿔은 매우 감광성이며 빠르게 광표백 될 수 있습니다. 따라서 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 5 분 동안 성장 원뿔을 자주 이미징하면 종종 성장 원뿔이 붕괴 될 수 있습니다. 이와 관련하여, 광시트 현미경 생성 장치의 새로운 발전은 뇌 슬라이스(34)의 장기 이미징을 위해 적응될 수 있다.
이와 같은 프로토콜은 새로운 연구 길을 열어 성장 원뿔이 복잡한 생체 내 환경을 향해 읽고 반응하는 데 필요한 것을 더 잘 이해할 수있게하고, 더 중요한 것은이 정교한 상호 작용의 메커니즘을 풀기 위해 구상됩니다.

뉴런은 신경계의 기본 계산 단위를 나타내는 고도로 양극화 된 세포입니다. 그들은 입력 및 출력 부위의 구획화에 의존하는 정보를 수신하고 방출합니다 : 수상 돌기와 축삭, 각각1. 개발 중에 축삭은 목적지에 도달하기 위해 믿을 수 없을 정도로 복잡한 환경을 탐색하면서 확장됩니다. 축삭 네비게이션은 발달 축삭의 끝에 위치한 감각 구조 인 성장 원뿔에 의해 안내됩니다. 성장 원뿔은 환경 신호를 감지하고 세포 골격 2,3의 역동적 인 공간 재구성으로 변환하는 역할을합니다. 생성 된 형태 - 기계적 반응은 성장 원뿔이 트리거링 큐에서 연장되거나 후퇴하도록 지시하여 특정 축삭 기동으로 이어집니다.
축삭 확장 및 성장 원뿔 역학에 대한 현재의 이해는 2 차원 (2D) 기질 2,4,5,6,7에 대한 축삭 성장을 평가하는 연구에서 비롯됩니다. 이러한 선구적인 연구는 성장 원뿔과 성장 기질 사이의 정교한 상호 작용을 확인하고 접착성 및 강성과 같은 기질 특성에 의존하는 현저한 차이를 밝혀 냈습니다 8,9. 이러한 통찰력에 의해 주도 된 세포 외 환경 단서는 축삭 성장을 지시하는 가설을 세웠으며, 성장 원뿔 세포 골격은이 성장을실행하는 2,10,11,12. 주목할 만하게, 뉴런은 비접착성 기질(예를 들어, 폴리리신, 폴리오르니틴)13에서 축삭돌기를 연장할 수 있다. 더욱이, 기질 강성은 세포 접착제 복합체(8)와 무관하게 축삭 성장 속도에 영향을 미칠 수 있다. 따라서 2D 기질에서 성장 원뿔 역학을 연구하는 것만으로는 축삭 성장 원뿔과 생체에서 발견되는 것과 같은 생리 학적으로 관련된 3D (3D) 환경의 상호 작용으로 인해 발생하는 힘의 균형을 정확하게 모델링 할 수 없습니다.
2D 분석의 한계를 극복하기 위해, 축삭 성장 및 성장 원뿔 역학은 3D 행렬 8,9에서 연구되었다. 이러한 매트릭스는 더 많은 생리적 맥락을 제시하지만 축삭 성장의 세포 내재적 메커니즘을 연구 할 수 있습니다. 그것은 다양한 조건 및 약리학 적 치료법에서 단일 세포 방식으로 성장 콘 검사를 가능하게합니다9. 이러한 3D 환경에서 축삭은 뚜렷한 세포골격 역학을 나타내며 2D 배양 뉴런9에서 관찰된 것보다 빠르게 성장했습니다. 이 우아한 연구는 성장 원뿔 세포 골격의 재구성과 결과적으로 그 행동에 대한 추가 차원의 영향을 입증했습니다.
3D 매트릭스가 2D 표면에 비해 네이티브 유사 뉴런 발달 및 축삭 성장을 지원하는 명백한 이점에도 불구하고 중추 신경계 (CNS) 조직에서 관찰 된 역학의 복잡성을 반영 할 수없는 단순화 된 합성 스캐폴드로 남아 있습니다. 여기서, 전자궁 및 자궁 전기천공 에 의한 리포터 플라스미드의 전달은 뇌 유기형 슬라이스 배양 및 계내 살아있는 초분해능 영상화와 결합하여 생리학적 맥락 내에서 성장 원뿔 역학을 분석하였다. 이 방법론은 생체 내 환경의 3 차원성과 물리 화학적 구성의 복잡성을 경험하면서 축삭 발달을 시각화 할 수있게합니다. 마지막으로, 일반적으로 라이센스가 부여되고 공개적으로 사용 가능한 소프트웨어를 사용하여 축삭 성장 및 성장 원뿔 역학을 측정하기위한 사용자 친화적 인 절차가 설명됩니다.

<table><tbody><tr><td>Adson 집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>11006-12</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21202</td><td>염소 안티 마우스</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A21236</td><td>염소 안티 마우스</td></tr><tr><td>Anti-Vimentin 항체</td><td>sigma-Aldrich</td><td>V2258-.2ML</td><td>단클론 마우스, 클론 LN-6, 복수 유체</td></tr><tr><td>B27 보충제</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td>17504044</tr><tr><td>Betadine</td><td>B. Braun</td><td>3864154</td><td></td></tr><tr><td>Biozym Sieve GP Agarose</td><td>Biozyme</td><td>850080</td><td></td></tr><tr><td>Braunol, Spr&uuml; hflasche</td><td>B. Braun</td><td>3864073</td><td></td></tr><tr><td>부프레노르핀(Temgesic)</td><td>GEHE Pharma</td><td>345928</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>시그마-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>DMZ 무선 전극 풀러</td><td>Zeitz</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>전기 면도기</td><td>Andes</td><td>NA</td><td>ProClip UltraEdge Super 2-Speed model</td></tr><tr><td>Enrofloxacin (Baytril)</td><td>Bayer</td><td>3543238</td><td>2,5% (wt/vol)</td></tr><tr><td>Eppendorf microloader 피펫 팁</td><td>FischerScientific</td><td>10289651</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252-5G</td><td>염료 함량 &ge; 85 %</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Fiji 2.1.0</td><td>NIH</td><td>NA</td><td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td></tr><tr><td>Fine Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-09</td><td>ToughCut/Straight/9cm</td></tr><tr><td>FluoroDish 세포 배양 접시</td><td>세계 정밀 기기</td><td>FD5040-100</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount 수성 장착 매체</td><td>시그마-Aldrich</td><td>F4680-25ML</td><td></td></tr><tr><td>포도당</td><td>MedPex</td><td>3705391</td><td>5%</td></tr><tr><td>GlutaMAX 보충제</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>시그마-알드리치</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>14025092 칼슘, 마그네슘, 페놀 없음 레드</td></tr><tr><td>호스 세럼</td><td>Pan-Biotech</td><td>P30-0711</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 9.7.2</td><td>Bitplane</td><td>NA</td><td>https://imaris.oxinst.com/products/imaris-for-neuroscientists</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Virbac</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>등장성 식염수 해결책</td><td>B. Braun</td><td>8609261</td><td>0.90%</td></tr><tr><td>Leica VT1200 S vibratome</td><td>Leica</td><td>14048142066</td><td></td></tr><tr><td>LSM 880 with Airyscan</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Metacam</td><td>Venusberg Apotheke</td><td>8890217</td><td>5 mg/ml</td></tr><tr><td>Mice</td><td>Janvier Labs</td><td>NA</td><td>C57BL/6JRj</td></tr><tr><td>Micro-Adson Junps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11018-12</td><td></td></tr><tr><td>마이크로피펫 보관 용기</td><td>World Precision Instruments</td><td>E210</td><td>&nbsp; 16.16.27</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td>NA</td><td>https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/p/excel/cfq7ttc0k7dx?activetab=pivot:overviewtab</td></tr><tr><td>밀리셀 세포 배양 삽입</td><td>EMD Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td>30&nbsp; mm, 친수성 PTFE, 0.4&nbsp; &마이크로; m</td></tr><tr><td>Moria Perforated Spoons</td><td>Fine Science Tools</td><td>10370-18</td><td></td></tr><tr><td>Moria Spoon</td><td>Fine Science Tools</td><td>10321-08</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium, 마이너스 페놀 레드</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12348017</td><td></td></tr><tr><td>Neuropan-2 supplement</td><td>Pan-Biotech</td><td>P07-11010</td><td></td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Abcam</td><td>ab138478</td><td></td></tr><tr><td>Olsen-Hegar 바늘 홀더 가위,</td><td>미세 과학 도구</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>p-Tub-alpha-1-Dre</td><td>Addgene</td><td>133925</td><td></td></tr><tr><td>p-Tub-alpha-1-iCre</td><td>Addgene</td><td>133924</td><td></td></tr><tr><td>p-Tub-alpha-1-LifeAct-GFP</td><td>Addgene</td><td>175437</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>시그마-알드리치</td><td>P3813-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-lox-Lyn-ZsGreen</td><td>Addgene</td><td>175438</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen</td><td>Addgene</td><td>175257</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PicoNozzle Kit v2</td><td>World Precision Instruments</td><td>5430-ALL</td><td></td></tr><tr><td>플래티넘 핀셋</td><td>하버드 장치</td><td>45-0487</td><td>1mm / 3mm</td></tr><tr><td>QIAGEN 맥시 키트</td><td>QIAGEN</td><td>12162</td><td></td></tr><tr><td>반사 상처 클로저 클립</td><td>세계 정밀 기기</td><td>500344-10</td><td>7mm</td></tr><tr><td>Sekundenkleber Pattex Mini Trio</td><td>Lyreco</td><td>4722659</td><td></td></tr><tr><td>Square wave electroporation system ECM830</td><td>Harvard 기구</td><td>W3 45-0052</td><td></td></tr><tr><td>멸균 거즈</td><td>Braun Askina</td><td>9031216</td><td></td></tr><tr><td>멸균 윤활제 눈 연고</td><td>Bayer Vital</td><td>PZN1578675</td><td></td></tr><tr><td>멸균 수술용 장갑</td><td>Sempermed</td><td>14C0451</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Roth</td><td>4621.2</td><td></td></tr><tr><td>Supramid 5-0 수술용 실크 봉합사</td><td>B. Braun</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>얇은 벽 유리 모세관</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW100-4</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 스프링 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>&micro; -Slide 8 Well Glass Bottom</td><td>Ibidi</td><td>80827</td><td></td></tr></tbody></table>

시투에서 axon growth and growth cone dynamics in acute ex vivo embryonic brain slice cultures 시각화

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

뉴런 발달 동안, 축삭은 피질 환경을 탐색하여 최종 목적지에 도달하고 시냅스 연결을 설정합니다. 성장 원뿔 - 축삭 발달의 원위 끝에 위치한 감각 구조 -이 과정을 실행합니다. 성장 원뿔의 구조와 역학을 연구하는 것은 축삭 발달과 신경 회로를 형성 할 수있는 주변 중추 신경계 (CNS)와의 상호 작용을 이해하는 데 중요합니다. 이것은 근본적인 연구 및 전임상 적 맥락에서 부상을 입은 후 축삭을 신경 회로에 재통합하는 방법을 고안 할 때 필수적입니다. 지금까지 성장 원뿔 역학에 대한 일반적인 이해는 주로 2 차원 (2D)으로 배양 된 뉴런에 대한 연구에 기반을두고 있습니다. 의심 할 여지없이 성장 원뿔 구조 역학 및 자극에 대한 반응에 대한 현재의 지식에 근본적이지만, 2D 연구는 손상되지 않은 CNS 조직에서 신경 성장 원뿔에 의해 마주 치는 생리적 3 차원 (3D) 환경을 잘못 나타냅니다. 최근에는 콜라겐 젤이 이러한 한계 중 일부를 극복하기 위해 사용되어 3D에서 신경 발달을 조사 할 수있었습니다. 그러나 합성 2D 및 3D 환경 모두 CNS 조직 내에서 신호 전달 신호가 부족하여 축삭 현상의 확장 및 경로 찾기를 지시합니다. 이 프로토콜은 유기형 뇌 조각을 사용하여 축삭과 성장 원뿔을 연구하는 방법을 제공하며, 축삭 발달은 생리 학적으로 관련된 물리적 및 화학적 단서를 만난다. utero 및 ex utero electroporation에서 미세 조정되어 초분해능 현미경과 함께 형광 리포터를 드물게 전달함으로써이 프로토콜은 축삭 및 성장 원뿔 역학의 시각화를위한 방법론 적 파이프 라인을 제시합니다. 또한, 장기 및 라이브 셀 이미징 데이터의 분석에 대한 상세한 툴킷 설명이 포함되어 있습니다.

설명된 방법 워크플로우로 얻은 대표적인 결과가 표시됩니다. E15.5 마우스가 본 시연에 사용되었지만, 이 프로토콜은 E11에서 E17 후반까지 거의 모든 배아 연령에 쉽게 적응할 수 있다. 이 프로토콜에서, 엑테로 전기천공(EUE; 도 2A, 2C-I) 또는 우테로 전기천공(IUE; 도 2B, C, 및 2J-Q)는 측심실을 감싸는 전구 뉴런 내로 플라스미드를 전달하는데 사용되었다. 이 선조는 미래의 피질 투영 뉴런 (CPN)15,16의 원천입니다. 플라스미드 믹스는 성장 원뿔에서의 전반적인 거동 및 액틴 역학을 각각 평가하기 위해 막 표적화 (Lyn)-mNeonGreen (도 1A) 또는 LifeAct-enhanced (E)GFP (도 1B) 중 어느 하나의 희소 뉴런 특이적 발현을 유도하기 위해 제조되었다. 또한, 개별 뉴런을 터보(t)-RFP 또는 조안투스 sp.(Zs) 녹색 형광 단백질(ZsGreen)(도 1C)로 표지하기 위한 플라스미드 믹스가 포함되었다. 이것은 독립적 인 이웃 뉴런으로부터의 성장 원뿔 행동의 모니터링을 용이하게합니다.
전기 천공 된 배아로부터의 뇌 해부는 고품질의 조각을 얻기 위해 신중하게 수행되어야하는 중요한 단계이며 네이티브 뇌 구조를 보존합니다. 해부 기구 및 비브라톰을 미리 준비하고 조심스럽게 에탄올 멸균하였다(도 3A,B). 다음으로, 전기 천공 된 배아의 머리를 조심스럽게 해부하고 뇌를 추출했습니다. 여기에서, E15 (도 3C-F) 및 E12.5 (도 3G-J)에서 EUE를 실시한 배아로부터의 뇌의 대표적인 해부가 도시되어 있다. 뇌는 즉시 아가로스 매트릭스에 싸여 슬라이스하고, 배양을 위해 바닥 유리 접시 내의 PTFE 멤브레인 인서트에 배치됩니다 (그림 3K-M).
뇌 조각의 건강 상태는 신뢰할 수있는 결과를 보장하기 위해 통제를위한 중요한 포인트입니다. 모든 오염에 대한 육안 검사가 매일 수행되었습니다. 또한, 일단 배양이 마무리되면, 뇌 조각은 고정되고 면역조직화학을 실시한다. 여기서, 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)을 사용하여 전체 세포 조직 및 비멘틴 염색을 조절하여 신경교 조직을 드러냈다; 특히, 방사형 글리아교(RG) 스캐폴드. 전형적으로, IUE 또는 EUE로부터 유래된 성공적으로 배양된 뇌 절편은 DAPI 및 정점 지향된 피알-접촉 과정(17 )을 갖는 RG의 다소 조직화된 어레이에 의해 밝혀진 바와 같이 정상적인 세포 분포를 나타낸다(각각 도 4A, B). 때때로, 배양된 뇌 절편에서 RG 스캐폴딩에서 현저한 교란이 관찰되며, 특히 EUE 전기천공으로부터 유래된 것들에서 관찰된다(도 4C). 극도로 혼란스러운 RG 스캐폴드를 가진 뇌 조각은 손상된 신경 이동 및 결함이있는 축삭 성장 (도시되지 않음)을 보여줍니다. 따라서, RG 스캐폴드를 제어하는 것은 신뢰할 수 있는 뇌 조각으로부터 얻은 데이터를 정렬하는 쉬운 사후 배양 방법이다.
Lyn-mNeonGreen-발현 플라스미드 믹스를 갖는 IUE 또는 EUE로부터 유래된 뇌 조각은 유사한 희소 뉴런 표지를 초래한다. Lyn-mNeonGreen과 그의 성장 원뿔의 동적 거동을 발현하는 대표적인 피라미드형 CPN이 예로서 도시되어 있다(도 5A 및 보충 비디오 1, 왼쪽 상단). 또한, 뉴런은 액틴 프로브를 발현하는 플라스미드를 사용하여 표지하여 축삭 성장 원뿔의 액틴 역학을 분석 하였다 (도 5B 및 보충 비디오 1, 왼쪽 하단). 계내 실험은 또한 이중 Cre/Dre 형광단-발현 플라스미드 설계로 수행되었다(도 1C 및 보충 비디오 1, 오른쪽). 이 플라스미드 내의 tRFP 또는 ZsGreen 형광단은 이웃 뉴런에서 각각 Dre 또는 Cre 재조합효소에 의해 특이적으로 그리고 개별적으로 활성화될 수 있다(도 5C). 이 실험 라인업은 이웃 변형 뉴런 (주어진 기능 손실 또는 이득)이있는 제어 뉴런의 성장 원뿔을 나란히 분석 할 수있게합니다. 이것은 제어 및 실험 조건을 테스트하기 위해 다른 슬라이스를 사용함으로써 발생하는 변동성을 회피합니다.
기록된 동영상으로부터 생성된 키모그래프를 분석하였고, 이로부터 시간에 따른 돌출 활성 및 성장 길이와 같은 동적 성장 파라미터를 쉽게 얻을 수 있다(도 6A). 타임랩스의 시간적 분해능을 간단히 조정하면 2시간 동안 축삭 신장 속도를 측정할 수 있습니다(그림 6A). 더욱이, 시간에 따른 성장 원뿔 부피의 변화-일반적인 성장 콘 동적 활성의 척도-허가된 소프트웨어를 사용하여, 이 경우 용이하게 수득될 수 있다(도 6B 및 도 6E, F). 이것은 액틴 디딜 방아의 속도와 성장 원뿔 탐험 활동 중 filopodia / lamellipodia의 균형을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig01.jpg"> 도 1: 프로토콜에 사용된 플라스미드의 스킴 . (A) pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen. (B) p-Tub-alpha-1-LifeAct-GFP. (C) pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-pA-lox-ZsGreen-pA. 플라스미드 성분 및 형광단의 기원에 관한 관련 정보는 박스에서 발견된다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig02.jpg"> 그림 2: E15.5 마우스의 ex utero 및 utero electroporation의 워크플로우. (A) 전 utero 전기 천공을위한 수술소의 설치. (B) utero electroporation 에 있는 수술소의 설치. (C) 마취된 마우스의 복강 밖으로 당겨진 자궁 뿔. (D) 자궁 자루에서 배아의 추출. (e) 대각선 절개를 통한 완전한 척수 횡단에 의한 배아 희생; 참수는 피했다. (F) 홀더에 배아를 배치하고 DNA / Fast Green 혼합물을 좌측 심실에 주입합니다. (G, H) 배아의 머리를 백금 핀셋 전극 사이에 놓고 음극 (빨간색 화살표)을 피질 위에 60 ° 각도로 놓습니다. (I) 절차 중 배아의 미끄러짐을 방지하기 위해 배아의 팔 (검은 화살표)을 홀더 외부에 배치합니다. (J) 머리를 노출시키기 위해 자궁 자루 내부의 배아의 회전. (케이, L) DNA / Fast Green 혼합물을 자궁 벽을 통해 배아의 측심실에 주입합니다. (M) 배아의 머리를 백금 핀셋 전극 사이에 놓고 음극(빨간색 화살표)을 피질 위에 60° 각도로 놓습니다. (N) 달리기 잠금 봉합사 를 통해 봉합 된 근육 절개. (O) 중단된 봉합사를 통해 피부 절개를 봉합한다. (p) 수술 상처 클립을 사용하여 상처의 확보 및 베타 딘을 사용하여 소독. (Q) 원적외선 온난광으로 회복 케이지에 마우스를 배치합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig03.jpg"> 그림 3 : E15.5 및 E12.5 뇌의 추출 및 유기형 슬라이스 배양 절차. (A) 뇌 추출 절차에 사용되는 도구. (B) 유기형 배양소의 설치. (C-F) E15.5 뇌의 추출. (G-J) E12.5 뇌의 추출. 점선은 절개 위치를 강조 표시합니다. 빨간색 화살표는 집게로 당기는 방향을 가리 킵니다. (K) 3% 저용융 아가로스를 함유하는 3cm 접시에 뇌를 임베딩하고, 뇌 아래에 1-2mm 아가로스 간격 간격을 남긴다. (L) 150 μm 뇌 슬라이스의 수집. (M) 파라핀 필름 (파란색 화살표)을 사용하여 35mm 접시에 고정화 된 PTFE 막 인서트에 뇌 조각을 배치합니다. 빨간색 별 표시는 비브라톰(L)에서 주어진 뇌 조각 수집과 PTFE 막(M)으로의 전달을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig04.jpg"> 그림 4: 건강한 유기형 슬라이스에서 보존된 방사상 신경교세포 구조. E17.5 뇌 조각의 공초점 이미지는 IUE (A) 및 EUE (B, C)에 이어 RG 배열 (vimentin; 녹색)과 전체 세포 조직 (DAPI; 자홍색)을 나타냅니다. RG 어레이에서 때때로 EUE(C)로 인해 발생할 수 있는 강한 교란에 유의하십시오. 배율은 주 그림의 빨간색 점선 프레임(배율 막대, 10μm)에 해당합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig05.jpg"> 그림 5: 급성 유기형 슬라이스에서 성장 원뿔 역학의 현장 시각화. (A, B) 뉴런과 그에 상응하는 성장 원뿔은 각각 Lyn-mNeonGreen 및 LifeAct-GFP로 표지되어 있습니다. Lyn-mNeonGreen의 레드 스타 마킹 성장 원뿔은 뉴런을 발현합니다. 블루 별표 표시 성장 원뿔 LifeAct-GFP 발현 뉴런. (c) tRFP (마젠타) 및 ZsGreen (녹색) 및 이들의 상응하는 성장 원뿔을 함유하는 이중 플라스미드 시스템으로 표지된 이웃 뉴런. 영상화된 성장 원뿔(오른쪽)은 캡처된 프레임 밖(왼쪽)이었고, 성장 콘을 획득한 직후에 획득된 시간-경과; 배율 막대, 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig6v2.jpg"> 도 6: 축삭 성장 속도 및 성장 원뿔 부피의 분석. (A) ImageJ를 사용하여 생성된 Lyn-mNeonGreen을 발현하는 뉴런에 대한 축삭 추적(상단) 및 그에 상응하는 키모그래프(아래). (B) 이미지 분석 소프트웨어를 이용한 성장 원뿔의 z-스택 비디오의 재구성 (상단) 및 표면 측정 도구를 사용하여 강조 표시된 동일한 성장 원뿔 (아래). (C) 여러 축삭에 대한 시간에 따른 성장 속도의 변화를 보여주는 그래프. (d) 축삭돌기의 평균 성장 속도는 (C)에서 정량화된다. (e) 시간에 따른 원뿔 부피의 성장 부피의 변화를 보여주는 그래프. (f) 성장 원뿔의 평균 부피는 (E)에서 정량화되고; 스케일 바, 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig6v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig07.jpg"> 그림 7: 피라미드 피질 뉴런의 방사상 이동 및 신경 분극. 발아 심실 영역(VZ)에서 피아 표면쪽으로 방사상으로 이동하는 피라미드형 피질 뉴런(분홍색)의 발달을 보여주는 다이어그램. 방사형 신경교 과정 (회색)에 의해 유도되고, 편광 된 뉴런을 이동시키는 것은 중간 영역 (IZ)을 향해 아래쪽으로 계속 확장되는 선도적 인 과정, 미래의 덴드라이트 및 후행 과정 인 미래 축삭을 확립합니다. 파선 된 빨간색 상자는 성장 원뿔이 이미지화 된 피질 영역을 나타냅니다. 특히 IZ, 심실 하부 영역 (SVZ) 또는 결합 축삭 번들 (녹색)에서. 이 그림은 웹 기반 도구 BioRender.com 을 사용하여 작성되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>플라스 미드</td>
			<td>농도(μg/μL)</td>
			<td>사용 목적</td>
		</tr>
<tr>
<td>pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen</td>
			<td>0.25</td>
			<td rowspan="3">막 표적 단백질 (Lyn)의 라벨링</td>
		</tr>
<tr>
<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>p-욕조-알파-1-iCre</td>
			<td>0.08</td>
		</tr>
<tr>
<td>p-Tub-alpha-1-LifeAct-GFP</td>
			<td>0.125</td>
			<td>성장 원뿔에 필라멘트 액틴 (F-actin) 라벨링</td>
		</tr>
<tr>
<td>pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-lox-Lyn-ZsGreen</td>
			<td>1</td>
			<td rowspan="5">이웃 뉴런의 두 집단에 대한 독립적 인 라벨링</td>
		</tr>
<tr>
<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>p-욕조-알파-1-iCre</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
<tr>
<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>p-욕조-알파-1-드레</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 프로토콜에 사용된 플라스미드의 목록. 각각의 활용된 플라스미드의 이름, 농도 및 의도된 용도.
보충 비디오 1 : 급성 유기형 조각에서 성장 원뿔 역학의 현장 시각화. Lyn-mNeonGreen (왼쪽 위)과 LifeAct-GFP (왼쪽 아래)로 표시된 성장 원뿔의 역학. 이웃하는 성장 원뿔은 tRFP (마젠타; 오른쪽 상단) 및 ZsGreen (녹색; 오른쪽 하단)을 함유하는 이중 플라스미드 시스템으로 차별적으로 표지된다. 이미징 간격, 2.5초. 스케일 바, 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/Supplementary_Video_1.mp4" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 프로토콜은 현장 축삭 성장 및 성장 원뿔 역학 을 연구하는 간단하고 강력한 방법을 보여줍니다. 생체외 생리학적으로 관련된 급성 뇌 조각을 준비하는 방법을 설명하고 사용자 친화적인 분석 파이프라인을 제공합니다.

시투에서 Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures 시각화

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones ...

축삭이 복잡한 중추 신경계 매트릭스를 탐색하는 방법은 신경 생물학의 근본적인 질문입니다. 이 프로토콜은 고해상도 이미징으로 생리적 환경에서 축삭 성장 및 성장 원뿔 역학에 대한 연구를 가능하게합니다. 이 프로토콜은 마우스 배아 뇌에서 DNA의 전달을 위한 사용자 친화적인 종단 간 파이프라인, 고품질 유기형 슬라이스를 위한 준비 및 이미지 획득 및 분석을 위한 단계별 가이드를 기술한다.원래 배아 중추 신경계에서 축삭 역학을 연구하기 위해 설계되었지만,이 프로토콜은 외상 또는 병리학 적 상태 후 축삭 가소성의 유기형 배양 및 시각화를 허용하도록 조정할 수 있습니다. 프로토콜 자체는 비교적 간단합니다. 그러나 뇌 구조의 첫 번째 라벨링 및 보존을 달성하는 것이 중요한 포인트입니다.따라서 전기 천공, 뇌 해부 및 슬라이싱 단계는 특별한주의가 필요합니다. 절차를 시연하는 것이 도움이 될 것이며, 박사 과정 학생은 Bracket의 실험실 출신입니다. 임신 한 여성 마우스를 마취 한 후 절개하여 따뜻한 식염수 또는 포셉에 담근 면봉을 사용하여 자궁 뿔을 모두 꺼내 배아 사이의 공간을 조심스럽게 움켜 잡으십시오.그런 다음 젖은 거즈에 배아를 놓습니다. 절단 후 자궁낭을 열고 각 배아를 제거하십시오. 배아를 얼음 위에 포도당이 보충된 HBSS가 들어있는 10센티미터 접시에 넣습니다.ex utero electroporation의 경우, 배아를 집어 들고 홀더에 넣으십시오. 그런 다음 배아 두개골을 통해 DNA 빠른 녹색 믹스가 들어있는 유리 모세관을 측심실에 조심스럽게 삽입하고 두 세 마이크로 리터의 DNA 플라스미드 믹스를 각 심실에 주입하십시오. 다음으로, 백금 핀셋 전극 사이에 배아의 머리를 적절한 각도로 잡고 원하는 뇌 영역을 목표로하고 음극은 DNA 전달이 의도 된 영역을 향하게합니다.자궁 전기 천공에서 자궁 뿔을 뽑아 내고 이전에 입증 된 것처럼 젖은 거즈에 배아를 놓은 후 손가락 끝을 사용하여 람도이드와 처진 봉합사가 위치 할 때까지 자궁 내부의 배아를 부드럽게 회전시킵니다. 그런 다음 자궁 벽과 배아 두개골을 통해 DNA 빠른 녹색 믹스가 포함 된 유리 모세관을 측심실에 조심스럽게 삽입하고 DNA 플라스미드 믹스의 두 세 마이크로 리터를 심실 당 최대 두 마이크로 리터로 원하는대로 하나 또는 양쪽 심실에 주입하십시오. 주사 후, 백금 핀셋 전극 사이에 배아의 머리를 적절한 각도로 잡고 원하는 뇌 영역을 목표로 삼고 음극이 DNA 전달이 의도 된 영역을 향하게하십시오.필요한 모든 배아가 전기 천공되면 식염수에 적신 면봉을 사용하여 자궁 뿔을 복강 안쪽으로 부드럽게 다시 놓습니다. 5-0 봉합사를 사용하여 근육과 피부 절개를 봉합 한 다음 봉합사 클립을 사용하여 상처를 고정시키고 베타 딘으로 상처를 소독하여 상처를 소독하십시오. 마우스를 복구 케이지에 다시 넣고 시술 후 적어도 20 분 동안 원적외선 온열 등을 사용하여 따뜻함을 유지하십시오.배아의 머리를 해부 현미경으로 고정하십시오. 그런 다음 머리 바닥에서 코쪽으로 시작하는 중간 선을 따라 절단하여 두개골의 피부를 제거하십시오. 두개골의 피부를 옆으로 껍질을 벗기면 뇌가 절제되기에 충분한 간격을 만듭니다.다음으로, 뇌를 제거하여 후각 전구 아래에서 시작하여 뇌간을 향해 이동하는 멸균 해부 가위의 닫힌 끝을 삽입한다. 그런 다음 뇌 줄기를 자르고 뇌 주위의 많은 느슨한 수막 조각을 다듬습니다. 구멍이 뚫린 숟가락을 사용하여 뇌를 집어 들고 마른 티슈 페이퍼에 숟가락 바닥을 닦아 과도한 액체를 제거하십시오.그런 다음 얼음 위의 아가로스 접시에 뇌를 넣으십시오. 다음으로, 더 작은 숟가락을 사용하여 아가로오스를 10 초 동안 섞어서 냉각시킨 다음 뇌를 접시 중앙으로 기동하여 등쪽을 위로 수평으로 놓고 모든 방향에서 아가로오스로 완전히 덮여 있는지 확인하십시오. Vibratome 워크 스테이션에서 아가로스 블록을 부드럽게 집어 들고 티슈 페이퍼에 닦아 바닥을 말립니다.그런 다음 뇌의 로스트랄 쪽이 위를 향하게하는 표본 홀더의 접착 된 영역에 블록을 놓고 표본 홀더를 얼음 위에 놓습니다. 접착제를 한 분 동안 말리십시오. 15도 각도로 코로나 조각으로 뇌를 자릅니다.그런 다음 깨끗한 주걱을 사용하여 뇌 조각을 수집하고 Parrafin을 사용하여 35 밀리미터 유리 바닥 접시에 고정 된 PTFE 멤브레인 위에 놓습니다. 멤브레인 당 최대 다섯 개의 뇌 조각을 수집하십시오. 다음으로, 200 마이크로리터 피펫을 사용하여 슬라이스를 반건조시킨 채로 남겨둔 멤브레인 상의 슬라이스 주위에서 과량의 HBSS 글루코스 용액을 제거한 다음, 500 마이크로리터의 미리 예열된 슬라이스 미디어를 멤브레인 아래의 공간에 직접 첨가하고, 슬라이스를 섭씨 35도에서 5% 이산화탄소로 인큐베이션한다.축삭 성장을 이미징하려면 중간 세포 밀도가 낮은 피질 영역을 찾습니다. 성장 원뿔 역학을 이미징하는 동안, 피질의 바로 그 영역 또는 심실 하부 영역에서 성장 원뿔을 찾으십시오. 다음으로 Z 스택 크기를 정의합니다.큰 Z 스택에서 축삭 성장을 하려면 스텝 크기를 두 마이크로미터로 설정하고 더 작은 Z 스택에서 원뿔을 성장시키려면 스텝 크기를 한 마이크로미터로 설정합니다. 데이터 분석을 위해 파일을 클릭한 다음 열고 이미지를 선택하여 피지에서 이미지 파일을 엽니다. 이미지를 클릭하여 시간 경과의 최대 강도 투영을 구한 다음 스택, Z 투영 및 최대 강도 투영을 가져옵니다.시간 경과를 통과하고 성장하는 축삭을 찾으십시오. 일단 위치하면, 성장하는 축삭을 통해 선을 그립니다, 첫 번째 프레임의 축삭의 끝에서 시작하여 전체 시간 경과를 통해 축삭을 따라갑니다. 다음으로, 플러그인 kymo를 다시 슬라이스하여 넓게 노래하십시오.이미지로 이동하여 키모그래프의 배율을 설정한 다음 속성을 설정합니다. 거리를 마이크로 미터, 픽셀 너비 및 시간을 초 또는 분 단위로 설정 한 후 픽셀 높이로 이동하여 분석하고 측정을 클릭하십시오. 성장 원뿔의 볼륨을 측정하려면 파일을 클릭하고 열고 관심 있는 파일을 선택하여 이미지 분석 소프트웨어에서 이미지 파일을 엽니다.그런 다음 첫 번째 단계에서 새 서피스 추가 마법사를 선택하고 알고리즘 설정에서 관심 영역만 세그먼트를 선택한 다음 두 번째 단계에서 모든 프레임의 전체 성장 원뿔에 맞게 프레임을 자릅니다. 다음으로 세 번째 단계에서 임계 값을 절대 강도로 유지하고 네 번째 단계에서 전체 성장 원뿔 영역이 임계 값인지 확인하십시오. 그런 다음 다섯 번째 단계에서 필터 유형에서 복셀 LMG의 수를 선택합니다.실행 단추를 선택하여 모든 생성 단계를 수행하고 새 서피스 추가 마법사를 종료합니다. 마지막으로 마법사 창 맨 위에 있는 통계 탭에서 세부 정보 탭에서 특정 값과 볼륨을 선택합니다. 전형적으로, utero 또는 ex utero electroporation에서 파생 된 성공적으로 배양 된 뇌 조각은 정상적인 세포 분포와 정점 지향적 인 필로 접촉 과정을 가진 방사형 신경교의 조직 된 배열을 보여줍니다.때때로 방사형 신경교 스캐폴딩 및 배양된 뇌 조각에서 ex utero electroporation 표시된 교란이 관찰되어 이 조절 염색이 권장됩니다. Lyn-mNeonGreen을 발현하는 대표적인 피질 피질 돌출 뉴런과 그 성장 원뿔의 역동적 인 행동이 여기에 나와 있습니다. 추가적으로, 뉴런은 액틴 프로브를 발현하는 플라스미드를 사용하여 표지하여 축삭 성장 원뿔의 액틴 역학을 분석하였다.계내 실험은 또한 플라스미드 설계를 발현하는 이중 cre dre 형광단으로 수행되었으며, 여기서 tRFP 또는 ZsGreen 형광단은 이웃 뉴런에서 각각 dre 또는 cre 재조합효소에 의해 특이적으로 그리고 개별적으로 활성화될 수 있었다. kymographs에서, 여러 축삭에 대한 성장 속도 및 시간에 따른 성장 원뿔 부피와 같은 동적 성장 매개 변수를 쉽게 얻을 수 있습니다. 이것은 액틴 디딜 방아의 속도와 성장 원뿔 탐험 활동 중 filopodia와 lamellapodia 사이의 균형을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.희소 한 라벨링을 달성하기 위해 뇌 구조를 유지하고 플라스미드 농도를 미세 조정하는 것이 중요합니다. 이것은 피질에서 축삭과 성장 원뿔의 정확한 시각화에 중요합니다. 선택된 혈장 및 유전 적 배경에 따라이 프로토콜을 통해 사용자는 뉴런이나 성장되는 환경을 수정하여 광범위한 연구를 수행 할 수 있습니다.이 기술은 현장에서 뉴런에 대한 고해상도 접근을 가능하게함으로써, 신경 과학자들이 형태 학적 및 분자 수준에서 성장 원뿔과 중추 신경계 메트릭 사이의 동적 상호 작용을 조사 할 수있게합니다.

in-situ-visualization-axon-growth-growth-cone-dynamics-acute-ex-vivo

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 주변 신경 가지의 재배와 시간 경과 영상을위한 중간 회임 마우스 배아의 organotypic 조각을 준비하는 방법을 제시한다.

의 Organotypic 슬라이스 문화 GFP - 표현 주변 신경 가지의 실시간 이미징을위한 마우스 배아를

이 프로토콜은 주동이의 철새 스트림에서 출생 후의 두뇌와 neuroblast 마이 그 레이션의 고해상도 시간 저속 영상에 최적화된 organotypic 슬라이스 분석을 설명합니다.

출생 후의 두뇌에의 연결을 마이 그 레이션의 고해상도 시간 경과 이미징을위한 Organotypic 슬라이스 분석

이 비디오는 형질전환 마우스 배아의 안구 운동 절편의 생체 외 배양 및 이미징을 보여줍니다. 배아는 분리되어 아가로스에 박혀 있습니다. 비브라톰을 사용하여 안구 운동 핵과 눈을 포함하는 절편을 얻습니다. 슬라이스는 배양에서 유지되고 형광 현미경을 사용하여 이미지화됩니다.

Transgenic Mouse Embryos의 안구 운동 절편의 Ex Vivo Culture and Imaging of Oculomotor Embryos

Source:&lt;span style='background-color:#f9f9f9;color:#1155cc;'&gt;Wiegreffe, C., et. al.,  배아 마우스 뇌의 유기형 슬라이스 배양에서 이동하는 뉴런의 타임랩스 공초점 이미징 자궁에서 Electroporation. J. Vis. 특급. (2017) 이 비디오는 심실하 영역에서 피질 뉴런 방사상 이동을 관찰하기 위한 타임랩스 컨포칼 현미경을 보여줍니다. 형질도입된 마우스 배아 뇌 절편에서 방사형 신경교골(radial glial scaffolds)을 통해 피질 플레이트(cortical plate)로.

transducted mouse embryonic brain slices에서 피질 뉴런 요골 이동의 타임랩스 이미징

Neuroblast 이주는 출생 후 신경에 근본적인 이벤트입니다. 우리는 급성 뇌 조각의 시간 경과 영상을 사용하여 생체 내 출생의 일렉트로 그들의 이주 이후의 시각화하여 neuroblasts를 효율적으로 표시하기위한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 비디오 추적하여 neuroblast 역학의 정량 분석​​에 대한 설명을 포함한다.

마우스 급성 뇌 조각의 Neuroblast 마이그레이션의 생체 내 출생 일렉트로 및 시간 경과 영상

신경 전구 세포의 유사 분열은 신경의 중요한 매개 변수입니다. 신경 전구 세포의 유사 분열에 대한 우리의 이해의 대부분은 고정 된 조직의 분석을 기반으로합니다. 배아 뇌 조각의 라이브 영상은 통제 된 환경에서 높은 공간적 해상도로 유사 분열을 평가하기 위해 다양한 기술입니다.

개발 마우스 배아의 피질 유사 분열의 라이브 영상

생화학적 분석과 결합된 광학 현미경 기술은 네트린 의존성 축삭돌기 분지화에서 SNARE 매개 외세포작용의 관여를 밝힙니다. 이러한 기술의 조합을 통해 축삭돌기 분지 및 세포 모양 변화를 제어하는 분자 메커니즘을 식별할 수 있습니다.

결합 된 방법론을 활용하여 축삭 분기 및 신경 세포 형태 형성 동안 플라즈마 멤브레인 배달의 역할을 정의합니다

이 프로토콜은 방사형으로 이동하는 피질 뉴런의 직접 관찰에 대한 지침을 제공합니다. utero electroporation, organotypic 슬라이스 문화, 그리고 시간 경과 공 촛점 이미징은 결합 뉴런에 관심 유전자의 overexpression 또는 downregulation의 효과를 직접적이고 동적으로 연구하고 개발하는 동안 그들의 차별을 분석합니다.

배아 마우스 두뇌의 organotypic 슬라이스 문화에서 마이 그 레이션 뉴런의 저속 공 촛점 이미징<em&gt; Utero에서</em&gt; 일렉트로 포 레이션

여기, 우리 confocal 현미경 검사 법 및 라이브 이미징 기술을 위해 적당 한 마우스 배아에서 electroporated 뇌 organotypic 슬라이스 문화를 생성 하는 저렴 하 고 안정적인 방법을 제공 합니다.

전 Utero Electroporation 및 마이그레이션 GABAergic 수의 라이브 이미징 배아 마우스 두뇌의 Organotypic 조각 문화

여기, 우리가 모터 뉴런 프로젝션과 유전자 변형 Hb9::GFP 마우스 배아에서 축 삭 arborization 시각화에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 모터 뉴런에 대 한 immunostaining, 후 우리는 후속 정량 분석에 대 한 이미지 배아를 빛 시트 형광 현미경 검사 법 사용. 이 프로토콜은 중앙 신경 조직에 있는 다른 신경 탐색 프로세스에 적용 됩니다.

모터 축 삭 탐색 및 빛 시트 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 마우스 배아에서 축 삭 Arborization의 정량화의 시각화

ex vivo 슬라이스 분석은 oculomotor 신경 성장을 실시간으로 심상화할 수 있게 합니다. 슬라이스는 E10.5 IslMN:GFP 배아를 아가로오스에 포함시키고, 진동을 슬라이스하고, 스테이지 탑 인큐베이터에서 성장시킴으로써 생성됩니다. 축색 유도 경로의 역할은 배양 배지에 억제제추가에 의해 평가됩니다.

배아 GFP 발현 마우스에서 전 Vivo Oculomotor 슬라이스 배양 Oculomotor 신경 파생의 시간 경과 화상 진찰을 위한

배우세요 생쥐 태아 뇌 조직 절편에서 축삭 성장과 성장원추 역학을 고해상도 영상으로 분석하는 방법을. 이 기술은 신경발생 및 축삭 가소성 메커니즘 연구에 필수적인 도구입니다.

시투에서 Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures 시각화

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