경골 내 골육종 세포 주사 동위원소 골육종 및 폐 전이 마우스 모델 생성
2021년 10월 28일
본 프로토콜은 동위원소 골육종 및 폐 전이 병변을 지닌 마우스 모델을 생성하기 위해 경막내 골육종 세포 주사를 기술한다.
이 프로토콜은 원발성 골육종 및 폐 전이 병변을 지닌 마우스 모델을 생성하는 기술을 기술한다. 골육종 세포의 경골 내 주사에 의해,이 모델은 종양 골육종의 임상 발달 특성을 가장 잘 모방합니다. 골육종 세포의 정확한 수는 미세 부피 주사기를 사용하여 경골에 직접 주입되어 동일한 종양 형성 속도와 종양 부피를 허용합니다.
골육종 세포 주사 당일, PBS로 세포를 두 번 세척하십시오. 세포를 1.5 밀리리터의 0.25 % 트립신으로 3 분 동안 트립신화하십시오. 그런 다음 6 밀리리터의 10 % 혈청 함유 MEM 배지를 첨가하십시오.
세포를 15밀리리터 원심분리 튜브에 수집한다. 20 마이크로리터의 세포 현탁액을 세포 계수 플레이트의 챔버 내로 흡인하고, 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 농도를 계산한다. 세포를 실온에서 다섯 분 동안 800배 g에서 원심분리한다.
상층액을 피펫으로 흡인하고, 세포 펠릿을 밀리리터 당 8.5 밀리그램 기저막 매트릭스에 재현탁시킨 다음, 얼음 위에 놓는다. 마우스를 수핀 위치에 놓습니다. 엄지와 검지 손가락을 사용하여 마우스의 발목을 잡고 경골의 주사 부위를 70 % 에탄올 면봉으로 소독하십시오.
각 마우스의 발목 관절을 바깥쪽으로 돌려 경골과 비골을 움직이고 근위 경골 고원이 피부를 통해 보일 때까지 무릎 관절을 적절한 위치로 구부립니다. 바늘을 한 밀리리터 주사기에 부착하고 바늘 끝을 경골의 축과 평행한 주사 부위쪽으로 향하게하십시오. 경피적으로 바늘을 삽입하여 경골의 원위 끝쪽으로 경골 플랫폼을 통해 구멍을 뚫습니다.
이전에 얼음 위에 놓인 골육종 세포 현탁액을 미세 부피 주사기에 적재하고, 경골의 한 밀리리터 주사기를 골육종 세포가 로딩된 마이크로볼륨 주사기로 교체한다. 많은 압력을 가하지 않고 각 흉선 마우스의 경골에 약 10 마이크로 리터의 골육종 세포 현탁액을 천천히 주입하십시오. 그런 다음 주사 부위에서 미세 부피 주사기를 제거하고 면봉으로 약 30 초 동안 부위를 누릅니다.
마우스를 깨끗한 케이지에 다시 넣고 10 분 동안 회복을 관찰하십시오. 이 그림은 경골 내 골육종 세포 주사 및 이의 단리된 형태로부터 개발된 동위원소 골육종을 갖는 마우스 모델을 묘사한다. 종양 부피의 점진적인 증가는 매주 관찰됩니다.
루시페라아제 표지된 골육종 세포의 주사 후 첫 번째부터 여섯 번째 주까지 얻은 X선 이미지는 부피의 점진적인 증가를 보였다. 또한, 마우스 경골을 주사한 후 얻어진 이미지는 생체내에서 동위원소 골육종 성장을 보였다. 골육종 세포의 경골내 주사에 의해 유발된 폐 전이를 생체발광 라이브 이미징 시스템을 사용하여 생체내에서 성공적으로 추적하였다.
입체현미경으로 관찰한 결과, 분리된 폐 조직에서 전이성 콜로니가 드러났다. 파라핀 포매된 폐 조직에 대한 HE 염색은 전이성 병변을 보였다. 바늘은 슬개골 인대를 통해 관절 캡슐에 경피적으로 삽입되어 주사기를 회전시켜 경골 플랫폼을 통해 디지털 경골 쪽으로 구멍을 뚫어야합니다.
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개요
본 프로토콜은 원발성 골육종 및 폐 전이 병변을 가진 마우스 모델을 제작하는 기술을 설명합니다. 골육종 세포를 경골 내로 주입함으로써, 이 모델은 종양 골육종의 임상적 발달 특성을 가장 잘 모방합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 종양학
- 동물 모델
배경
- 골육종은 어린이와 청소년에게 흔히 발생하는 뼈암입니다.
- 골육종의 전이 과정을 이해하는 것은 효과적인 치료법을 개발하는 데 매우 중요합니다.
- 종양의 거동과 치료 반응을 연구하기 위해서는 동물 모델이 필수적입니다.
- 경골 내 주사는 국소적인 종양 성장 및 전이 연구를 가능하게 합니다.
연구 목적
- 골육종 연구를 위한 신뢰할 수 있는 마우스 모델을 구축하기 위함입니다.
- 원발성 종양과 그 전이의 특성을 조사하기 위함입니다.
- 통제된 환경에서 치료 전략의 테스트를 용이하게 하기 위함입니다.
사용된 방법
- 마이크로볼륨 주사기를 이용한 골육종 세포의 경골 내 주입.
- 주입 전 PBS를 이용한 세포 세척.
- 주입 준비를 위한 세포의 트립신 처리.
- 주입 후 종양 형성률 및 부피 모니터링.
주요 결과
- 모델 간에 일관된 종양 형성률이 달성되었습니다.
- 동일한 종양 부피가 관찰되어 재현성이 입증되었습니다.
- 모델에서 폐 전이가 성공적으로 확립되었습니다.
- 해당 모델은 골육종 진행의 임상적 특징을 반영합니다.
결론
- 경골 내 주사 방법은 골육종 모델링에 효과적입니다.
- 이 모델은 향후 치료 연구에 활용될 수 있습니다.
- 본 연구 결과는 골육종의 생물학적 특성과 치료법을 이해하는 데 기여합니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
경골 내 주입을 통해 생성된 정위성 골육종 모델은 재현 가능한 종양 형성과 폐 전이를 가능하게 하여, 표적 검증 및 치료 효능 시험을 위한 임상적으로 유의미한 시스템을 제공합니다. 이 접근 방식은 면역 결핍 마우스에서 인간의 질병 진행 과정을 재현함으로써 기전적 리스크를 줄이는(de-risking) 것을 지원하며, 원발성 및 전이성 종양 부담의 종단적 모니터링을 가능하게 합니다. 생물 발광 및 X선 영상에 대한 이 모델의 민감도는 종양학 파이프라인의 전임상 go/no-go 결정에 필수적인 정량적 판독을 용이하게 합니다.
바이오제약 R&D에서의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 인간 골육종의 발암 및 폐 전이를 모방한 질병 관련 시스템에서 치료 가설의 검증을 가능하게 합니다.
- 운용적 가치: 일관된 종양 생착률과 측정 가능한 성장 역학을 제공하여 신뢰할 수 있는 표적 결합 및 경로 조절 연구를 지원합니다.
- 예측적 가치: 임상적 전이 패턴을 반영하여 전임상 모델 선택을 지원함으로써 표적 우선순위 선정의 신뢰도를 높입니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 과학적 가치: 하위 단계의 약물 스크리닝에 사용되는 검증된 생물학적 시스템을 구축하는 데 적합한 표준화된 정위성 종양을 생성합니다.
- 운영적 가치: 영상화를 통해 종양 부피와 전이 부담을 재현성 있게 정량화할 수 있어, 연구 간 분석 표준화를 지원합니다.
- 확장성: 배양 기간이 짧고 성장 속도가 빨라 화합물을 적시에 평가할 수 있으며, 리드 물질 발굴 캠페인에서 플랫폼을 신속하게 재사용할 수 있습니다.
중개 및 전임상 연구
- 중개적 연속성: 폐 전이가 지배적인 치명적 표현형으로 나타나는 임상적 골육종 진행 과정을 반영하여, 환자의 예후와 일치합니다.
- 기전적 위험 제거: 생리학적 맥락이 반영된 모델에서 종양 미세환경 상호작용 및 전이 유도 인자의 평가가 가능합니다.
- 치료제 평가: 후보 물질의 in vivo 효능 시험을 용이하게 하며, 종점 분석을 위해 원발성 종양과 전이 병변을 분리하여 확보할 수 있습니다.
파이프라인 및 워크플로 통합
이 모델은 타겟 검증부터 리드 화합물 발굴, 전임상 효능 평가에 이르는 신약 개발 연속 과정에 적합하며, 특히 골 친화성 및 전이 조절 약물 연구에 유용합니다.
- 발견 생물학: 정위성 면역결핍 숙주 시스템을 사용하여 골육종 드라이버 및 전이 억제제에 대한 가설 검증을 지원합니다.
- 스크리닝: 종양 성장 및 전이에 대한 치료 효과의 비교 분석이 가능한 정량적 영상 기반 결과물(생물발광, X-ray)을 제공합니다.
- 분석: 종양 부담 및 전이 발생률에 대한 종단적이고 정량화 가능한 지표를 제공하여 교차 기능적 데이터 해석을 돕습니다.
- 중개 연구: 임상적으로 유의미한 전이 패턴을 통해 초기 기전 연구 결과를 전임상 검증으로 연결합니다.
- 기업적 재사용: 골육종 종양학 프로그램을 위한 재사용 가능한 플랫폼을 구축하여 프로젝트 간의 모델 재개발 비용을 절감합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 폐로의 전이성 확산을 포함하여 골육종 진행의 전체 스펙트럼을 모델링함으로써 예측 신뢰도를 높입니다.
- 운영적 가치: 표준화된 세포 준비, 주입 기술 및 영상 기반 모니터링을 통해 재현성을 보장합니다.
- 전략적 가치: 전이에 민감한 엔드포인트를 통해 효과가 없는 후보 물질을 조기에 발견함으로써 자본 효율성을 개선합니다.
- 포트폴리오 영향: 종양-기질 상호작용 및 전이 가능성에 대한 기전적 통찰력을 제공하여 위험 조정된 추진 결정에 정보를 제공합니다.
실행 시 고려 사항
- 정위 주입 기술 및 면역결핍 마우스 모델 취급에 관한 전문 지식이 필요합니다.
- 마이크로볼륨 주사기, 기저막 매트릭스 및 생물 발광/X선 영상 시스템의 사용 가능 여부에 따라 달라집니다.
- 재현성 있는 결과를 위해 세포 준비, 주입 부피 및 종료 시점 기준에 대한 팀 간 표준화가 필수적입니다.
- 다른 골육종 세포주에 적용할 경우 매트릭스 농도 및 주입 부피의 최적화가 필요할 수 있습니다.
- 실제적인 제한 사항으로는 주입 정밀도에 따른 모델의 가변성과 IACUC 기준을 준수하는 종양 크기 종료 시점의 설정 등이 있습니다.
